CN106581762A - 一种3d打印生物墨水、制备方法及3d打印成型方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种3D打印成型方法，所述方法可以在打印之前配制预凝聚的生物墨水，利用生物墨水的温度响应性打印成模型，可以提供无支架3D生物打印技术。打印之后还可以对模型缓慢冷冻之后快速升温脱出水分，可以形成含有生物细胞的多孔的结构模型，生物细胞可以通过这种多孔结构获得营养和代谢通道，有利于通过3D打印获得更大更厚的组织结构。另外，本发明还提供了专用于上述3D打印成型方法的3D打印生物墨水以及制备方法。

Description

一种3D打印生物墨水、制备方法及3D打印成型方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是3D生物打印技术领域，特别涉及一种3D打印生物墨水、制备方法及打印成型方法。
背景技术
3D打印可以快速高效的制造出个性化的产品，因而逐渐被引入到生物医疗行业，以期通过3D打印技术用于组织和器官移植。《生物3D打印的最新研究及应用》(粉末冶金工业，第25卷第4期，2015年8月，张洪宝等)中对3D生物打印技术的应用划分成不同层次进行了介绍，此处引用作为参考。较高层次的3D生物打印的基本方法是，将活细胞接种到生物相容的且最后可生物降解的支架中，然后在生物反应器中进行培养，使得细胞依托支架形成的空间成长生成所需组织。例如，CN 106085949 A公开了一种基于3D打印成型的重建尿道假体的方法；通过细胞诱导因子分化为类上皮细胞、类平滑肌细胞，然后转化成细胞液滴，该细胞液滴有细胞和培养液水凝胶混合而成，制成可供医用3D打印机使用的生物墨水；选择胶原与藻酸盐混合的水凝胶作为支架材料的支架墨水；通过电脑控制细胞或细胞聚集体，细胞与凝胶间的比例及喷嘴的喷射位置和力度，以电控升降平台控制喷头升降，3D打印机两个喷头逐层交替打印尿道切面。通过体外培养脂肪源性干细胞，诱导其分化成尿路上皮细胞和平滑肌细胞，然后转化成细胞液滴，结合3D打印，在体外重建尿道，然后再将重建的尿道移植到患者身上去。亦即，上述现有3D生物打印技术中用到的3D生物打印材料为两种：一种是包含细胞的生物墨水，一种是用作支架的支架材料。
现有技术关于3D打印的研究方向基本上就是寻找合适的生物墨水和支架材料，例如：CN 104399119 A公开了一种基于3D生物打印制备高力学性能软骨的方法，其通过蚕丝纤维和明胶溶液制备含软骨干细胞的生物墨水，以PCL材料形成支架(PCL是一种半结晶型聚合物，由ε-己内酯用钛催化剂、二羟基或三羟基引发剂开环聚合制得结构为[CH2-(CH2)4-COO]n的聚酯)。其中生物墨水中含有磷酸缓冲液、藻朊酸钠、明胶、甲基丙烯酸酐溶液、二水合硫酸钙、蚕丝纤维以及UV光引发剂，通过藻朊酸钠与钙离子形成离子键、明胶与甲基丙烯酸酐形成共价键提高凝胶的力学性能，打印完成之后通过UV光照射成型。再比如：CN105238132 A中公开了一种用于3D打印的生物墨水，其组成成分包括具有交联功能的水溶性合成聚合物、具有交联功能的水溶性天然高分子、能自发形成特殊超微结构的生物活性组分、交联引发剂和溶剂，进一步还包括生物活性组分；墨水最后同样通过UV光照射固化成型。CN 105885436 A公开了一种用于3D打印的生物墨水材料及其制备方法和应用，该现有技术其实提供的是支架材料，该支架材料利用生物大分子、预交联剂、促凝剂作为支架墨水材料，打印出来后经过水洗、交联剂予以定型获得抗原性、排斥反应小且具有生物可降解性的软组织支架。
以上介绍的均为包含支架的3D生物打印技术的背景情况，CN 103249567 A中公开的用于制造组织的装置、系统和方法中，对于3D生物打印的各种材料的组分进行了详细的罗列，其中特别提及现有技术也有无支架3D生物打印技术的尝试，但是无支架技术存在很多限制，例如难以获得复杂的几何形状、难以形成提供组织生产所需养分的血管网络等。因此，该现有技术提供的均为包含支架的3D生物打印解决方案。
事实上正是由于上述原因，现有的3D生物打印技术只能打印很薄的一层组织，因为较厚组织里面没有血管等营养通道，内部的细胞难以获得营养物质，代谢产物无法排出，因而较厚的3D打印组织难以持续成长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种3D打印生物墨水、制备方法及3D打印成型方法，以减少或避免前面所提到的问题。
具体来说，本发明提供了一种3D打印生物墨水、制备方法及3D打印成型方法，其可以打印获得含有生物细胞的无支架支撑的模型，并且还可以进一步获得多孔的模型，可以为细胞生产提供营养和代谢通道，有利于通过3D打印获得更大更厚的组织结构。
为解决上述技术问题，本发明提出了一种3D打印成型方法，包括如下步骤：
步骤A：提供一种由水凝胶和生物细胞构成的3D打印生物墨水，在低于相转变的温度条件下，加入大豆分离蛋白溶液搅拌均匀，然后加入硫酸钙溶液均匀混合成备用的3D打印材料；
步骤B：控制3D生物打印机的墨水仓温度低于相转变温度，打印台面温度为37摄氏度，通过3D打印喷头将所述3D打印材料打印成模型。
优选地，所述步骤A中，所述生物细胞在制备所述3D打印生物墨水之前，对所述生物细胞进行保护处理：将所述生物细胞与浓度为10％的甘油以及浓度为10％的淀粉溶液均匀混合静置2-3小时。
优选地，上述方法还可以进一步包括如下步骤：
步骤C：将所述模型置于温控箱内，缓慢降低所述温控箱内的温度至0度以下，使所述模型中的水分完全结冰；
步骤D：快速升高所述温控箱内的温度至37摄氏度，使所述模型中的水凝胶完全固化，从而获得含有生物细胞的多孔的结构模型。
优选地，所述步骤C中，以每小时4-5度的速度缓慢降低所述温控箱内的温度至零下15至零下20度。
优选地，所述步骤D中，向所述温控箱内输送37度的干燥热风，使所述模型中的冰快速转换成气体从所述模型逸出，从而在所述模型上形成多孔结构。
优选地，所述相转变温度范围为20-33摄氏度。优选地，25-32摄氏度。更优选地，28-31摄氏度。
优选地，所述方法进一步包括，在获得所述含有生物细胞的所述多孔的结构模型之后，在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使所述血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将所述模型置于营养溶液中进行培养，通过所述血管内皮细胞生长出血管，所述模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。
优选地，所述方法进一步包括：在获得所述含有生物细胞的所述多孔的结构模型之后，将所述模型通过激光均匀打出贯通的平行通孔，用于将模型中的孔洞连通起来，然后在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使所述血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将所述模型置于营养溶液中进行培养，通过所述血管内皮细胞生长出血管，所述模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。
另外，本发明还提供了一种专用于上述3D打印成型方法的3D生物打印墨水，由水凝胶和生物细胞构成，所述水凝胶由如下组分构成：交联透明质酸、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)(PCIPAAm)、聚甲基乙烯基醚(PMVE)、聚乙二醇-聚氧化乙烯(PEG-PEO)以及去离子水。
进一步地，本发明还提供了一种上述3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数1％-5％的交联透明质酸、质量分数3％-5％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数1-3％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％-5％的聚乙二醇-聚氧化乙烯与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述3D打印生物墨水。
本发明的3D打印成型方法在打印之前配制预凝聚的生物墨水，利用生物墨水的温度响应性打印成模型，可以提供无支架3D生物打印技术。打印之后还可以对模型缓慢冷冻之后快速升温脱出水分，可以形成含有生物细胞的多孔的结构模型，生物细胞可以通过这种多孔结构获得营养和代谢通道，有利于通过3D打印获得更大更厚的组织结构。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现通过本发明的具体实施方式进行详细说明。
正如背景技术部分所述，现有3D生物打印技术无论选择怎样的生物墨水或者支架材料，均难以克服打印获得的组织缺乏营养和代谢通道的缺陷。因此，本发明提供了一种新的3D打印方法，其可以通过3D打印获得含有生物细胞的无支架支撑的模型，并且还可以进一步获得多孔的模型，可以为细胞生产提供营养和代谢通道，有利于通过3D打印获得更大更厚的组织结构。
具体来说，本发明提供你一种3D打印成型方法，包括如下步骤：
步骤A：提供一种由水凝胶和生物细胞构成的3D打印生物墨水，在低于相转变温度的条件下，加入大豆分离蛋白溶液搅拌均匀，然后加入硫酸钙溶液均匀混合成备用的3D打印材料。
其中，所述3D打印生物墨水可以是任何一种现有的由水凝胶和生物细胞构成的3D打印生物墨水，优选所述3D打印生物墨水为其性状适合于采用3D生物打印机进行打印的生物墨水。
特别优选，所述3D打印生物墨水为专用于本发明的3D打印成型方法的材料，其由水凝胶和生物细胞构成，所述水凝胶由如下组分构成：交联透明质酸、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(N,N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)、聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)(PCIPAAm)、聚甲基乙烯基醚、聚乙二醇-聚氧化乙烯(PEG-PEO)以及去离子水。
在一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数1％的交联透明质酸、质量分数3％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数1％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％的PEG-PEO与余量为质量分数86％的去离子水。
在另一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数5％的交联透明质酸、质量分数5％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数5％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数5％的PEG-PEO与余量为质量分数72％的去离子水。
在又一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数3％的交联透明质酸、质量分数4％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数2％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚甲基乙烯基醚、质量分数4％的PEG-PEO与余量为质量分数79％的去离子水。
在还有一个具体实施例中，所述水凝胶可以采用如下组分构成：质量分数1％的交联透明质酸、质量分数4％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数2％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数4％的聚甲基乙烯基醚、质量分数5％的PEG-PEO与余量为质量分数80％的去离子水。
进一步地，本发明还提供了一种上述3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数1％-5％的交联透明质酸、质量分数3％-5％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％-5％的聚乙二醇-聚氧化乙烯(PEG-PEO)与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述3D打印生物墨水。
特别的，本发明的打印方法中，3D打印材料在进行3D打印之前，控制温度低于相转变温度，此时溶液是处于一种低粘稠度的凝胶状态，近似胶体，通过加入大豆分离蛋白溶液搅拌，然后加入少许硫酸钙溶液，例如添加原液(3D打印材料)体积10％的浓度为5％的大豆分离蛋白溶液，加入原液体积1％-2％的浓度为5-8％的硫酸钙溶液，通过硫酸钙离子中和胶体吸附的电荷使胶体引发凝聚。需要强调的是，此过程需要在打印之前15-30分钟之内配置，以防止胶体凝聚固化难以打印。
需要特别强调的是，本发明的步骤A优选在打印之前15-30分钟之内配置完成，并在随后的15-30分钟通过打印喷头打印完成，否则配置的生物墨水容易凝聚固化堵塞喷头。
另外，适用于本发明的生物细胞可以是任何一种脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人的细胞或其组合，其类型取决于所生产的细胞构建体、组织或器官的类型。例如所述细胞可以包括并不限于为收缩性细胞或肌肉细胞、结缔组织细胞、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、胃肠道细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、间皮细胞、间质细胞、内胚层源细胞、中胚层源细胞、外胚层源细胞及其组合。在一个优选实施例中，所述细胞为干细胞，包括但不限于胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞等。其中生物细胞的添加量根据不同组织、生长速度的不同进行添加。
应当说明的是，本发明特别优选的水凝胶具有温度响应性，其相转变温度范围为20-33摄氏度，当低于相转变温度时，溶液处于低粘稠近似胶体状态。在高于相变温度时，比如34-37摄氏度，甚至到40摄氏度，水凝胶会发生相变，逐渐凝聚固化。加入大豆蛋白溶液和硫酸钙溶液时，必须保持温度在相变温度范围内进行。由于水凝胶具有温度响应性，后续混合而成的生物墨水亦具有温度响应性。优选相转变温度为25-32摄氏度。更优选为28-31摄氏度。
步骤B：控制3D生物打印机的墨水仓控制温度低于相转变温度，打印台面控制温度为37摄氏度，利用生物墨水的温度响应性，通过3D打印喷头将所述生物墨水打印成模型。本步骤中，3D打印机可以采用现有任何一种适合于生物体3D打印的打印机，其中前述备用的3D打印材料置于墨水仓中，温度保持低于相转变温度，使3D打印材料的性状稳定便于打印且不易堵塞喷头，而打印机的3D打印喷头可以设置位于温控箱内，并在温控箱内的打印台面上打印形成模型。此时，控制温控箱内的温度为37摄氏度，使得模型能够固化定型。
应当说明的是，本发明特别优选的生物墨水在前述步骤中添加了大豆分离蛋白溶液和硫酸钙溶液进行了预凝聚，打印成模型后凝聚固化。温度的变化和时间的调控使生物墨水具备两种凝聚过程，通过打印喷头打印到温控箱打印台面上时，每次打印的小液滴很容易形成固定的结构，因而本发明的上述特别优选的生物墨水可以无需打印一层之后覆盖一层支架材料进行支撑，提供了一种无支架3D生物打印技术。也就是通过本发明的上述3D打印成型方法的步骤A和步骤B，可以在水凝胶基础上直接获得无需支架支撑的3D打印模型，可以省掉支架的打印时间，无需更换打印头，可以节约打印时间和成本。
当然，本发明并不排除可以通过现有的3D打印机逐层交替打印生物墨水和支架材料形成模型的技术方案，即，为了形成复杂的模型结构，在一个优选实施例中，本步骤进一步包括在温控箱内通过3D打印喷头将所述生物墨水和支架材料逐层交替打印成所述模型，用以通过支架材料对生物墨水提供支撑。其中，所述支架材料可以选自任何一种现有的适用于3D打印的支架材料，包括并不限于纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合。
进一步地，本发明还可以通过如下的额外步骤，在上述步骤A和步骤B的基础上，对模型进行后续处理，以生成一种多孔的模型结构。
步骤C：将所述模型置于温控箱内(如果模型直接打印在温控箱内，则可以省略将模型置入温控箱的步骤)，缓慢降低所述温控箱内的温度至0度以下，使所述模型中的水分完全结冰。本步骤的作用是通过降温使模型中的水结成冰，从最大密度的水体积膨胀10％，将凝聚的凝胶模型内部撑大形成含冰的孔洞。应当特别提及的是，降温的过程需要十分缓慢，确保模型内的水由液态缓慢凝结，模型结构中的水均匀分散凝结成冰，尽量保持模型的内部结构，否则降温过快会使得模型整体结构破坏，冰融化之后难以保持组织形态。优选在本步骤中，以每小时4-5度的速度缓慢降低所述温控箱内的温度至零下15至零下20度。
需要特别说明的是，当温度降低至零度以下，如果不做保护处理，生物细胞内含有的水分也会结冰，形成的冰晶会损伤细胞的基本结构导致生物细胞丧失活性。因此，要进行步骤C的冷冻过程，需要在前述的步骤A中，在将生物细胞制备成3D打印生物墨水之前，对生物细胞进行保护处理：将生物细胞与浓度为10％的甘油以及浓度为10％的淀粉溶液均匀混合静置2-3小时。本步骤的作用是利用淀粉溶液的胶体将生物细胞包裹起来，利用甘油降低生物细胞内的水分的冰点，在步骤C的缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤，保证生物细胞存活。在一个具体实施例中，浓度10％的甘油和浓度为10％的淀粉溶液甘油的添加量可以分别为生物细胞质量的1-1.5倍和0.5-0.8倍。
另外，本发明的降温过程也不会造成模型坍塌。本发明生物墨水具有两种凝聚过程，一种是3D打印材料的温度响应性凝聚、一种是加入大豆蛋白和硫酸钙后的时间调控性凝聚。3D生物材料在降温过程中，水分结冰之前可以很好的攀附在大豆蛋白和硫酸钙凝聚形成的骨架上，不至于坍塌。
步骤D：快速升高所述温控箱内的温度至37摄氏度，使所述模型中的水凝胶完全固化，从而获得含有生物细胞的多孔的结构模型。本步骤中，模型缓慢降温至零下15至零下20度之后，在模型体积通常不大的情况下，模型中的水已经全部凝结，此时可以通过快速升温至生物体活性温度的37度，使模型中的水凝胶再次固化，同时模型中的冰融化，在凝胶固化的过程中水分脱出，固化的凝胶结构中含冰的孔洞会保留下来，从而形成了含有生物细胞的多孔结构。
特别的，本步骤中的升温过程与前述的降温过程不同，需要尽快提升模型温度使得结构尽快固化，避免固化缓慢导致孔洞消失。在一个优选实施例中，本步骤中，可以向所述温控箱内输送37度的干燥热风，使所述模型中的冰快速转换成气体从所述模型逸出，从而在所述模型上形成多孔结构。干燥热风可以很快提升温控箱内的温度至37度，同时干燥热风排出了温控箱内的水分，降低了水汽分压，进一步加快了水分转换成气体的速度，因而本实施例可以达到使模型尽快固化形成多孔结构的效果。
在模型上获得的含有生物细胞的多孔结构之后，可以将模型置于营养溶液中进行培养，由于多孔结构为生物细胞提供了获得营养和代谢的通道，因而模型内部的细胞同外部细胞一样均可以获得足够的营养生长，可以通过本发明的这种3D打印方法获得更大更厚的组织结构。
为了避免组织结构生长闭合之后，内部细胞容易缺失养分、代谢不畅而死亡，在另一个优选实施例中，在获得含有生物细胞的多孔的结构模型之后，在所述多孔结构中注入血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将模型置于营养溶液中进行培养，通过血管内皮细胞生长出血管，模型中原有的细胞生长成所需的组织，生长出的血管进一步为所需的组织提供养分和代谢通道。进一步地，为了避免多孔结构内部的孔隙不连通，导致生长的血管难以贯通的缺陷，在又一个优选实施例中，可以在获得含有生物细胞的多孔的结构模型之后，将所述模型通过激光均匀打出贯通的平行通孔，用于将模型中的孔洞连通起来。激光打孔获得的通孔直径有限，仅适合于将孔洞连通便于血管内皮细胞以及营业液进入内部孔洞，其后依照上述方式操作，在多孔结构中注入血管内皮细胞，使血管内皮细胞附着在结构孔隙骨架上，之后将模型置于营养溶液中进行培养，通过血管内皮细胞生长出血管。随着血管和组织的生长，激光打孔获得的这些贯通的通孔会被撑大一些，当然，要获得足够厚度和体积的组织，还是主要需要倚靠前述实施例中获得的多孔的结构模型。
本领域技术人员应当理解，虽然本发明是按照多个实施例的方式进行描述的，但是并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案。说明书中如此叙述仅仅是为了清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体加以理解，并将各实施例中所涉及的技术方案看作是可以相互组合成不同实施例的方式来理解本发明的保护范围。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种3D打印成型方法，包括如下步骤：
步骤A：提供一种由水凝胶和生物细胞构成的3D打印生物墨水，在低于相转变的温度条件下，加入大豆分离蛋白溶液搅拌均匀，然后加入硫酸钙溶液均匀混合成备用的3D打印材料；
步骤B：控制3D生物打印机的墨水仓温度低于相转变温度，打印台面温度为37摄氏度，通过3D打印喷头将所述3D打印材料打印成模型。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A中，所述生物细胞在制备所述3D打印生物墨水之前，对所述生物细胞进行保护处理：将所述生物细胞与浓度为10％的甘油以及浓度为10％的淀粉溶液均匀混合静置2-3小时。
3.如权利要求2所述的方法，进一步包括如下步骤：
步骤C：将所述模型置于温控箱内，缓慢降低所述温控箱内的温度至0度以下，使所述模型中的水分完全结冰；
步骤D：快速升高所述温控箱内的温度至37摄氏度，使所述模型中的水凝胶完全固化，从而获得含有生物细胞的多孔的结构模型。
4.如权利要求3所述的3D打印成型方法，其特征在于，所述步骤C中，以每小时4-5度的速度缓慢降低所述温控箱内的温度至零下15至零下20度。
5.如权利要求3所述的3D打印成型方法，其特征在于，所述步骤D中，向所述温控箱内输送37度的干燥热风，使所述模型中的冰快速转换成气体从所述模型逸出，从而在所述模型上形成多孔结构。
6.如权利要求1所述的3D打印成型方法，其特征在于，所述相转变温度范围为20-33摄氏度，优选地为25-32摄氏度，更优选为28-31摄氏度。
7.一种专用于权利要求1-6之一所述的3D打印成型方法的3D打印生物墨水，由水凝胶和生物细胞构成，其特征在于，所述水凝胶由如下组分构成：交联透明质酸、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、聚甲基乙烯基醚、聚乙二醇-聚氧化乙烯以及去离子水。
8.如权利要求7所述的3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：将质量分数1-5％的交联透明质酸、质量分数3％-5％的聚(N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚(N、N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数1-3％的聚(2-羧基-N-异丙基丙烯酰胺)、质量分数3％-5％的聚甲基乙烯基醚、质量分数3％-5％的聚乙二醇-聚氧化乙烯与余量的去离子水共混，搅拌30min，静置1～6小时制成所述水凝胶；将所述水凝胶与所述生物细胞均匀混合成所述3D打印生物墨水。
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