CN108472413A - 包含蛋白质-聚合物缀合物的无有机溶剂组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供蛋白质‑聚合物缀合物，以及用于产生由包含该缀合物的水凝胶形成的生物相容性支架的方法以及该支架用于组织再生的用途。本发明提供用于制备该缀合物的改进的工艺，其中本发明的缀合物优选地在避免极性有机溶剂的环境友好的工艺中生产。

Description

包含蛋白质-聚合物缀合物的无有机溶剂组合物及其用途
发明领域
本发明涉及蛋白质-聚合物缀合物(conjugate)，涉及用于产生由包含该缀合物的水凝胶形成的生物相容性支架的方法以及该支架用于组织再生的用途。本发明公开用于制备该缀合物的改进的工艺，其中使用避免有机溶剂的环境友好的工艺生产本发明的改进的缀合物。
发明背景
包含蛋白质-聚合物缀合物的合成混杂材料(synthetic hybrid material)可以被用于组织再生和药物递送系统。这样的混杂生物材料将生物大分子与结构通用的合成聚合物结合，以产生交联的水凝胶网络(Lutolf,M.P.和J.A.Hubbell,Nat Biotechnol,2005.23(1):第47-55页)。这些混杂生物材料可以被用于通过平衡结构要素和生物功能要素来产生仿生细胞环境。对包括孔隙率、顺从性(compliance)、堆积密度(bulk density)、机械性质和降解性的结构性质的控制通过合成聚合物网络引导，而生物细胞信号传导通过并入生物大分子来控制，所述生物大分子可以包括蛋白质片段、生长因子或生物活性肽序列(Peppas,N.A.，等人，Annu Rev Biomed Eng,2000.2:第9-29页；Tsang,V.L.和S.N.Bhatia,Adv Drug Deliv Rev,2004.56(11):第1635-47页；Stile,R.A.，等人，JBiomater Sci Polym Ed,2004.15(7):第865-78页)。
在这方面，伤口敷料的生物化学特征和生物力学特征两者可以被用于引发重要的细胞重塑事件，包括细胞迁移、增殖和指导的分化。
这样的材料可以容易地被定制为具有被特定地设计用于指导重塑和形态发生朝向特定的组织工程学终点(tissue engineering end-point)的微架构、基质硬度和蛋白水解抗性(Pratt,A.B.,等人,Biotechnol Bioeng,2004.86(1):第27-36页)。
已经公开了用于组织工程学的若干生物合成的混杂材料，包括聚(乙二醇)(PEG)水凝胶骨架，其用Arg-Gly-Asp(RGD)粘附寡肽修饰并与包含纤溶酶或胶原酶降解底物的短寡肽交联，如由Hubbell和合作者描述的(Lutolf,M.P.,等人,Proc Natl Acad Sci U S A,2003.100(9):第5413-8页)。公布的申请US 20140273153公开了使用硫醇-烯和硫醇-炔化学来共价地修饰蛋白质和其他生物大分子的方法。West和合作者公开了蛋白水解敏感的PEG-肽生物材料(Mann,B.K.,等人,Biomaterials,2001.22(22):第3045-51页)。
Seliktar等人开发了一种方法，借此利用天然的生物分子和合成聚合物作为基质(蛋白质-聚合物加合物)的构建单元形成混杂生物材料。蛋白质用作聚合物网络的结构骨架，从而致使水凝胶经由蛋白质序列上的固有降解位点天然地是可生物降解的。蛋白质-聚合物水凝胶网络的大多数结构性质通过合成聚合物成分来控制。这些材料已经在临床前和临床环境中被严格地验证(Dikovsky,D.,H.Bianco-Peled和D.Seliktar,Biomaterials,2006.27(8):第1496-506页；Shapira-Schweitzer,K.和D.Seliktar,Acta Biomater,2007.3(1):第33-41页；Seliktar,D.,Ann N Y Acad Sci,2005.1047:第386-94页)。此生物材料的独特性质之一是它可以准独立地(quasi-independently)改变其生物化学性质和物理性质。此外，通过利用天然地可生物降解的蛋白质分子的固有性质，合成材料可以有益于伤口敷料和药物递送系统，并且可以被设计成控制其再吸收的速率。
本发明的发明人中的某些的WO 2005/061018、WO 2008/126092和WO 2011/073991公开了制备纤维蛋白原-PEG缀合物的工艺，所述工艺包括使用有机溶剂例如丙酮来分离缀合物。特别地，先前已知的这些缀合物的分离步骤利用环境不安全的极性有机溶剂。
具有包含最少或不包含可检测到的痕量的极性有机溶剂的合成生物材料-缀合物以及用于生产蛋白质-聚合物混杂材料而不使用这些环境不安全溶剂的工艺将是有利的。
发明概述
本发明提供了改进的水凝胶支架(hydrogel scaffold)，所述水凝胶支架包含细胞外基质蛋白与合成聚合物的缀合物。这些支架本身用作植入物或用作用于植入物的涂层。缀合物和用本发明的缀合物形成的水凝胶具有增强的生物相容性、增加的安全性和降低的引发不良反应的可能性。特别地，缀合物使用避免使用可能有害的极性有机溶剂的改进的工艺产生。此改进既是更环境友好的且产生更不太可能在体内引发不良反应的产物。
本发明的改进的支架利用定义的蛋白质与聚合物的摩尔比，所述摩尔比在受试者内提供受控的体内崩解速率。水凝胶的生物降解速率可以通过以下被预先确定：a)缀合物中使用的蛋白质和聚合物；b)交联度(degree of cross-linking)；以及c)蛋白质与聚合物的摩尔比。
根据一个方面，本发明提供了包含蛋白质-聚合物缀合物的组合物，所述蛋白质-聚合物缀合物包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中组合物大体上不含极性有机溶剂。根据某些实施方案，组合物包含小于200ppm、小于100ppm、小于50ppm、小于20ppm或小于10ppm的极性有机溶剂。根据另外的实施方案，组合物不包含可检测的极性有机溶剂残余物。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
现在首次公开了血浆蛋白质的混合物可以被有利地用于本发明的组合物和工艺中。不希望受任何理论或作用机制的束缚，可能的是，蛋白质的混合物在生物相容性和促进伤口愈合方面是有利的。根据某些实施方案，本发明的缀合物通过血浆蛋白质的未纯化的或部分纯化的混合物与聚合物之间的反应形成。根据可选择的实施方案，纤维蛋白原可以是纯化的纤维蛋白原。根据某些特定的实施方案，纯化的纤维蛋白原可以是哺乳动物来源的，包括但不限于牛纤维蛋白原。
根据某些实施方案，蛋白质选自由以下组成的组：纤维蛋白原、纤维蛋白、白蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、变性的纤维蛋白原、变性的白蛋白、明胶及其任何组合。根据某些实施方案，蛋白质是牛、猪或人类起源的。根据某些实施方案，蛋白质是部分纯化的。根据其他实施方案，蛋白质是高度纯化的。
根据某些实施方案，聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、羟基磷灰石/聚己内酯(HA/PLC)、聚乙醇酸(PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚亚丙基富马酸酯(polypropylene fumarate)(PPF)、聚乙二醇-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)、β-磷酸三钙(β-TCP)以及不可生物降解的聚四氟乙烯(PTFE)。
根据某些特定的实施方案，蛋白质是纤维蛋白原并且聚合物是聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)。
根据某些实施方案，本发明的组合物的特征在于在40:1至400:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。在另一个实施方案中，本发明的组合物的特征在于在100:1至250:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。在又一个实施方案中，本发明的组合物的特征在于在100:1至150:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。
在另外的方面中，本发明提供了包含交联的蛋白质-聚合物缀合物分子的水凝胶组合物，所述蛋白质-聚合物缀合物分子包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中所述合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
根据某些实施方案，本发明还提供了包含交联的缀合物分子的水凝胶组合物，其中缀合物分子在所述可聚合基团的聚合之后彼此共价地交联，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
根据特定的实施方案，本发明的水凝胶组合物大体上不含丙酮。根据其他实施方案，本发明的水凝胶组合物具有在0.05kPa至35kPa的范围内的剪切储能模量。
根据还又一方面，本发明还提供了用于制备蛋白质聚合物缀合物的改进的工艺，所述工艺避免使用极性有机溶剂。
根据示例性的实施方案，该工艺避免使用丙酮，并且产生的蛋白质-聚合物材料不包含痕量的丙酮。改进的工艺既是更生态友好的且更容易扩大规模以提供增加的工业适用性。
根据某些实施方案，生产蛋白质聚合物缀合物组合物的工艺包括以下步骤：(a)将至少一种变性的细胞外基质蛋白质在提供强的蛋白质变性的碱性条件和还原条件下溶解；(b)提供包含具有可聚合基团的合成聚合物的溶液；(c)将(a)的细胞外基质蛋白质溶液与(b)的包含合成聚合物的溶液在提供强的蛋白质变性的碱性pH和还原条件下混合，以在蛋白质的巯基和可聚合基团之间产生共价缀合物；以及(d)浓缩步骤(c)的粗反应混合物，而无需利用极性有机溶剂的浓缩工艺。
在某些实施方案中，根据步骤(d)的浓缩粗反应混合物通过离心进行。在某些特定的实施方案中，浓缩步骤在不除去未反应的聚合物的情况下进行。不受任何理论或作用机制的束缚，假定缺少除去未反应的聚合物可能是有利的。过量的未反应的聚合物(未与基质蛋白质缀合)可以提供另外的可聚合基团，从而改进缀合物的交联度以形成水凝胶。更明显地，浓缩缀合物而不沉淀避免了使用借助于极性有机溶剂的沉淀。
根据另一个方面，本发明提供了呈非交联形式的稳定的备用的液体制剂(stableready for use liquid formulation)，所述液体制剂包含如上文描述的蛋白质-聚合物缀合物组合物和至少一种聚合引发剂。换句话说，根据某些实施方案，产品可以是备用的稳定的前体溶液，也被称为预凝胶化的液体形式，其可以被活化以原位产生期望的水凝胶。使用所述聚合引发剂，典型地通过暴露于光来实现活化。
在某些实施方案中，至少一种聚合引发剂选自由以下组成的组：双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基氧化膦(BAPO)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、樟脑醌(CQ)、1-苯基-1,2-丙二酮(PPD)、Cp'Pt(CH3)3(Cp＝η5-C5H4CH3)、2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-l-丙酮(例如IRGACURETM 2959)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯甲酮(BP)、含黄素的化合物、以及三乙醇胺、N-乙烯基吡咯烷酮和曙红Y的组合。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
在某些实施方案中，所述备用的制剂避免使用极性有机溶剂。有利地，此备用的制剂仅需要在使用之前或在使用期间通过暴露于光来活化光引发剂。
根据某些实施方案，备用的制剂被保持在容器中，所述容器选自单个等分试样小瓶或预填充的注射器。根据某些实施方案，在引发聚合之前，备用的液体制剂在可见光保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。根据某些实施方案，备用的制剂在暴露于可见光后形成水凝胶。根据某些实施方案，在引发聚合之前，备用的液体制剂在UV保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。根据某些实施方案，备用的制剂在暴露于UV光后形成水凝胶。
根据某些实施方案，备用的制剂包含小于100ppm的乙醇。在某些当前优选的实施方案中，备用的制剂不包含可检测的乙醇残余物。根据某些其他实施方案，备用的制剂包含小于10ppm的丙酮。在某些当前优选的实施方案中，备用的制剂不包含可检测的丙酮残余物。
结合详述，本公开内容的这些和另外的优点将变得明显。
附图简述
图1呈现了与纯化的牛纤维蛋白原相比，包含纤维蛋白原与另外的血浆蛋白质的人类密封剂的凝胶电泳概况(gel electrophoresis profile)。
图2呈现了将源自新颖的稳定的单个小瓶制剂的凝胶化产物与源自两个小瓶制剂的水凝胶相比的水凝胶稳定性测试的结果，所述单个小瓶制剂包含光引发剂、PEG-纤维蛋白原缀合物分子和呈预凝胶化的形式的另外量的PEG-DA，所述两个小瓶制剂包含在一个小瓶中的光引发剂溶液和在单独的小瓶中的PEG-纤维蛋白原缀合物分子。
图3呈现了将源自新颖的稳定的单个小瓶制剂的水凝胶的凝胶化动力学与源自两个小瓶制剂的水凝胶的凝胶化动力学相比的凝胶化研究的结果，所述单个小瓶制剂包含光引发剂、PEG-纤维蛋白原缀合物分子和呈预凝胶化的形式的另外量的PEG-DA，所述两个小瓶制剂包含在一个小瓶中的光引发剂溶液和在单独的小瓶中的PEG-纤维蛋白原缀合物分子。
图4描绘了源自无有机溶剂程序和先前公开的涉及丙酮沉淀和乙醇添加的程序两者的水凝胶的固化动力学。
图5描绘了源自无有机溶剂程序和先前公开的涉及丙酮沉淀和乙醇添加的程序两者的水凝胶的作为频率的因素的粘弹性性质。
图6描绘了源自无有机溶剂程序和先前公开的涉及丙酮沉淀和乙醇添加的程序两者的水凝胶的作为应变的因素的粘弹性性质。
发明详述
本发明提供了改进的水凝胶支架，所述水凝胶支架包含细胞外基质蛋白质与合成聚合物的缀合物。本发明的缀合物具有增加的生物相容性，因为它们不包含极性有机溶剂残余物。本发明的对应的水凝胶是蛋白质-合成聚合物缀合物的交联形式并且可用作生物相容性植入物。
本发明还提供了改进的水凝胶支架组合物，所述水凝胶支架组合物包含相对低的蛋白质与合成聚合物的比率。本发明的蛋白质组分用作崩解剂，允许经由控制其生物降解性来精细调节水凝胶再吸收速率(hydrogel resorption rate)。蛋白质与合成聚合物的特定摩尔比基于植入物的期望的崩解速率和意图的用途来确定。
对于水凝胶支架的物理性质的进一步控制可以通过调节水凝胶网络中的交联密度来实现。本发明的蛋白质组分可以包含多个交联位点(cross-linking site)，所述交联位点可以在水凝胶植入物内被物理地或化学地活化。
根据一个方面，本发明提供了包含蛋白质-聚合物缀合物的组合物，所述蛋白质-聚合物缀合物包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中所述合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
根据某些实施方案，蛋白质选自由以下组成的组：纤维蛋白原、纤维蛋白、白蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、变性的纤维蛋白原、变性的白蛋白、明胶及其任何组合。每种可能性是本发明的单独的实施方案。根据某些实施方案，蛋白质是牛、猪或人类来源的。根据某些实施方案，聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、羟基磷灰石/聚己内酯(HA/PLC)、聚乙醇酸(PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚亚丙基富马酸酯(PPF)、聚乙二醇-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)、β-磷酸三钙(β-TCP)以及不可生物降解的聚四氟乙烯(PTFE)。每种可能性是本发明的单独的实施方案。在一个当前优选的实施方案中，蛋白质是纤维蛋白原并且聚合物是聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)。
本发明还涉及有利地低的蛋白质与合成聚合物的比率。在一个实施方案中，本发明的组合物的特征在于在40:1至400:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。在更优选的实施方案中，本发明的组合物的特征在于在100:1至250:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。在一个当前优选的实施方案中，本发明的组合物的特征在于在100:1至150:1之间的合成聚合物与蛋白质的摩尔比。
根据一个方面，本发明提供了包含蛋白质-聚合物缀合物的组合物，所述蛋白质-聚合物缀合物包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中组合物大体上不含极性有机溶剂。根据某些实施方案，组合物包含小于200ppm、小于100ppm、小于50ppm、小于20ppm或小于10ppm的极性有机溶剂。根据某些另外的实施方案，组合物不包含可检测的极性有机溶剂的残余物。每种可能性是本发明的单独的实施方案。
在另外的方面中，本发明提供了水凝胶组合物，所述水凝胶组合物是蛋白质-聚合物缀合物分子的交联形式。在某些实施方案中，水凝胶组合物包含交联的蛋白质-聚合物缀合物分子，所述蛋白质-聚合物缀合物分子包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中所述合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中所述组合物大体上不含有机溶剂。在一个特定的实施方案中，本发明的水凝胶组合物大体上不含丙酮。根据某些实施方案，本发明的水凝胶组合物的特征在于在0.05kPa至35kPa的范围内的剪切储能模量。根据特定的实施方案，本发明的水凝胶组合物的特征在于在2kPa至15kPa的范围内的剪切储能模量。
本发明还涉及在所述可聚合基团的聚合之后发生的蛋白质-聚合物缀合物的凝胶化。
本发明还提供了新的工艺，该工艺使得能够将合成聚合物有效共价附接至蛋白质并提取最终的蛋白质-聚合物缀合物，而不需要丙酮沉淀的步骤。本发明的新的无丙酮工艺(acetone–free process)是环境友好的工艺，产生无丙酮的蛋白质-聚合物缀合物，所述无丙酮的蛋白质-聚合物缀合物在凝胶化之后产生具有增加的生物相容性的无丙酮的水凝胶。
相比于先前公开的利用极性有机溶剂例如丙酮的工艺，本发明的工艺证实了有利的扩大规模(up-scaling)的生产潜力。现有技术工艺使用极性有机溶剂来沉淀缀合物并从反应产物中除去未反应的分子。例如，保持未结合至蛋白质的未反应的聚合物或改性聚合物可以通过丙酮沉淀除去。
因此，在某些实施方案中，在进一步加工之前，本发明的工艺不需要从反应混合物中提取或沉淀蛋白质-聚合物缀合物。因此，本发明的新的无丙酮的工艺产生更有效的生产工艺，产生用于患者的包含蛋白质-聚合物缀合物的更安全的水凝胶组合物。
根据某些实施方案，生产蛋白质聚合物缀合物组合物的工艺包括以下步骤：(a)将至少一种不饱和的细胞外基质蛋白质在提供强的蛋白质变性的碱性条件和还原条件下溶解；(b)提供包含具有可聚合基团的合成聚合物的溶液；(c)将(a)的细胞外基质蛋白质溶液与(b)的包含合成聚合物的溶液在提供强的蛋白质变性的碱性pH和还原条件下混合，以在蛋白质的巯基和可聚合基团之间产生共价缀合物；以及(d)浓缩步骤(c)的粗反应混合物，而无需利用极性有机溶剂的浓缩工艺。
在某些实施方案中，进行浓缩粗反应混合物，而不除去未反应的聚合物，具体地，无需使极性有机溶剂中的反应混合物沉淀。因此，改进的工艺避免使用任何有机溶剂作为合成程序的一部分。
不受理论或作用机制的束缚，假定避免除去未反应的聚合物有助于聚合并改进所得到的水凝胶的交联度。包含至少一个可聚合基团的未反应的聚合物可以在反应混合物暴露于光之后被活化并聚合，从而增加获得的水凝胶支架的交联度。在某些实施方案中，利用的光源在可见光范围内。在某些其他实施方案中，使用的光源在UV光范围内。
本发明还涉及本发明的水凝胶组合物的稳定的单个小瓶预交联的制剂。单个小瓶制剂是方便的备用的制剂，其包含蛋白质-合成聚合物缀合物和至少一种光引发剂，所述光引发剂被储存在防止其经历不希望的聚合的条件下直到使用。在某些实施方案中，至少一种聚合引发剂选自由以下组成的组：双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基氧化膦(BAPO)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、樟脑醌(CQ)、1-苯基-1,2-丙二酮(PPD)、Cp'Pt(CH3)3(Cp＝η5-C5H4CH3)、2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-l-丙酮(例如IRGACURETM 2959)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯甲酮(BP)、含黄素的化合物、以及三乙醇胺、N-乙烯基吡咯烷酮和曙红Y的组合。每种可能性是本发明的单独的实施方案。单个小瓶制剂产生同等稳定的水凝胶，证实了与经由将蛋白质-合成聚合物缀合物溶液与至少一种光引发剂试剂混合来新鲜制备的凝胶相比的相似的机械性质。不受理论或作用机制的束缚，假定本发明的备用的制剂由于光引发剂和缀合物分子组合物的预混合步骤提供了更精确的成分的组成，从而促进改进的使用者友好程序。在某些实施方案中，所述备用的单个小瓶制剂避免使用极性有机溶剂。在某些实施方案中，备用的制剂被保持在选自单个等分试样小瓶或预填充的注射器的容器中。
在某些实施方案中，在引发聚合之前，备用的液体制剂在可见光保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。在某些实施方案中，在引发聚合之前，备用的液体制剂在UV保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。在某些实施方案中，备用的液体制剂经历交联工艺，并且在借助于暴露于光的活化之后形成本发明的水凝胶。在某些实施方案中，活化通过暴露于可见光范围(例如400nm至700nm)来实现。在某些其他实施方案中，活化通过暴露于UV光来实现。在某些实施方案中，备用的制剂包含小于100ppm的乙醇。在某些当前优选的实施方案中，备用的制剂不包含可检测的乙醇的残余物。根据某些其他实施方案，备用的制剂包含小于10ppm的丙酮。在某些当前优选的实施方案中，备用的制剂不包含可检测的丙酮的残余物。
出乎意料地，如本文以下所例示的，发现基于人类纤维蛋白原密封剂的PEG-纤维蛋白原植入物在某些方面优于基于纯化的纤维蛋白原的PEG-纤维蛋白原植入物。然而可商购的纯化的纤维蛋白原典型地包含大于95％的纤维蛋白原，以密封剂产品的形式获得的纤维蛋白原典型地具有70％-80％的纯度。除了纤维蛋白原之外，密封剂产品还包含其他血浆蛋白质，包括但不限于白蛋白和纤连蛋白(Christoph Buchta等人，Biomaterials,26,31(2005),6233-6241)。出乎意料地，另外的蛋白质提供了高度生物相容性的更强健的产品。图1示出了一种这样的密封剂和纯化的纤维蛋白原的蛋白质概况(protein profile)。人们可以看出，除了纤维蛋白原之外，密封剂样品还包含蛋白质物质。令人惊讶地，衍生自密封剂的PEG-纤维蛋白原植入物在各种测量中胜过基于纯纤维蛋白原的PEG-纤维蛋白原植入物，这指示改进的生物利用度。
根据本发明的术语“体内”指的是在活的生物体例如植物或动物内、优选地在哺乳动物内、优选地在人类受试者内。如本文使用的，术语“受试者”指的是处于任何年龄的脊椎动物、优选地哺乳动物、更优选地人类(雄性或雌性)。
如本文使用的，措辞“离体”指的是来自生物体并在活的生物体外、优选地在脊椎动物、哺乳动物或人类的体外生长(或培养)的活的细胞。例如，来自人类例如人类肌细胞或人类主动脉内皮细胞并在身体外培养的细胞被称为离体培养的细胞。
如本文使用的，术语“蛋白质”和“多肽”可互换地使用，并且涵盖包含至少10个肽残基的任何天然存在的多肽以及其生物活性片段(例如诱导细胞粘附和/或细胞信号传导的片段)。生物活性片段可以通过本领域中已知的任何方法产生(例如，通过酶和/或化学试剂的裂解)。
蛋白水解敏感性片段可以通过本领域中已知的任何方法产生(例如，通过酶和/或化学试剂的裂解)。当蛋白质具有低的半胱氨酸含量时，蛋白质的硫醇化特别地适合于产生上述的物质组合物(composition-of-matter)，因为具有低的半胱氨酸含量的非蛋白质典型地具有很少的硫醇基团。通过使蛋白质硫醇化引入另外的硫醇基团产生可用于连接合成聚合物的另外的位点。几乎没有或没有半胱氨酸的蛋白质(例如胶原蛋白)迄今为止未曾适合于包含在聚合物-蛋白质缀合物分子中，所述聚合物-蛋白质缀合物分子包含被附接至蛋白质的半胱氨酸残基的合成聚合物。由于许多蛋白质具有低的半胱氨酸含量，所以蛋白质的硫醇化克服了聚合物-蛋白质缀合物分子的严重缺点。任选地，待被硫醇化的蛋白质包含小于5个半胱氨酸残基/100个氨基酸残基。任选地，蛋白质包含小于3个半胱氨酸残基/100个氨基酸残基，任选地小于2个半胱氨酸残基/100个氨基酸残基，并且任选地小于1个半胱氨酸残基/100个氨基酸残基。任选地，本发明的蛋白质是变性的。
如本文和权利要求中使用的，术语“硫醇”或“巯基”可互换地使用并指的是-SH基团。
不受任何特定的理论的束缚，据信变性的蛋白质典型地具有更多的可用于附接至合成聚合物的位点。蛋白质可以通过本领域中熟知的各种方法来变性。例如，蛋白质可以通过加热或暴露于变性剂例如尿素或盐酸胍(guanidinium chloride)来变性。如下文例示的，蛋白质可以在包含8M尿素的溶液中变性。
术语“聚合物”指的是主要包含多个重复单元的分子。措辞“合成聚合物”指的是由合成材料即非天然的、非细胞的材料制成的任何聚合物。应理解，上述的聚合物的名称指的是构成合成聚合物的大部分结构的重复单元，并不意指排除合成聚合物中的另外的官能团的存在。因此，例如，由聚乙二醇与两个丙烯酸酯基团组成的合成聚合物(即，PEG-二丙烯酸酯)在本文中被术语“聚乙二醇”和“PEG”所涵盖。
制备官能化的PEG分子的方法是本领域中已知的。例如，PEG-乙烯基砜可以任选地在氩气下通过使PEG-OH的二氯甲烷(DCM)溶液与NaH反应，并且然后与二乙烯基砜反应(任选地以摩尔比：OH 1:NaH 5:二乙烯基砜50，并具有0.2克PEG/ml的DCM)来制备。PEG-Ac可以任选地在氩气下通过使PEG-OH的DCM溶液与丙烯酰氯和三乙胺反应(任选地以摩尔比：OH1:丙烯酰氯1.5:三乙胺2，并具有0.2克PEG/ml的DCM)来制成。
如本文和权利要求中使用的，术语“交联”、“固化”或“聚合”可互换地使用，并且指的是借助于相邻的缀合物的聚合物的可聚合基团之间的共价相互作用，形成互相连接的蛋白质-聚合物缀合物分子。能够交联的示例性的可聚合官能团包括而不限于丙烯酸酯和乙烯基砜。本发明的蛋白质-聚合物缀合物分子的交联通过引发化学聚合反应的化合物来引发。
由于本发明的实施方案的缀合物分子易于交联以便形成支架，所以缀合物分子的交联可以在身体内部(即，体内)或在身体外部进行。例如，体内交联可以被用来产生具有身体内的空腔的精确形状的支架，所述空腔待用支架来填充。
各种交联方法是本领域中已知的。例如，交联可以通过照射(例如通过紫外光或通过可见光)、通过化学试剂(例如自由基供体)和/或热来实现。
根据本发明的任选的实施方案，交联是通过用紫外光照射(例如，在约365nm的波长)。根据某些其他实施方案，交联照射在可见光范围内。
如本文使用的，术语“约”指的是±10％。
任选地，添加光引发剂以有利于交联。添加光引发剂典型地将使得人们能够使用较低剂量的紫外光用于交联。
如本文和权利要求中使用的，术语“极性有机溶剂”指的是具有大偶极矩的有机溶剂，即包含在具有有区别的电负性的原子之间的键，例如氧结合至氢的键的溶剂。极性有机溶剂包括质子溶剂例如醇、氨、乙酸等，以及非质子极性溶剂例如丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)等两者。
如本文使用的，术语“大体上不含”极性有机溶剂意指极性有机溶剂的量不大于以ppm指定的预先确定的量，或甚至意指其通过常规检测手段(例如气相色谱法)是不可检测的。根据某些示例性的实施方案，相比于利用极性有机溶剂沉淀程序生产的对应的先前公开的材料，在本发明的蛋白质-聚合物缀合物组合物和水凝胶组合物中，极性有机溶剂的量被减少至少80％、优选地至少90％并且更优选地至少98％。另外，如本文使用的术语“大体上不含极性有机溶剂的工艺”指的是生产蛋白质-聚合物缀合物组合物或水凝胶组合物的工艺，该工艺不包括涉及极性有机溶剂的任何合成步骤。
如本文和权利要求中使用的，术语“没有(devoid of)”极性有机溶剂指的是不包含可检测的痕量的极性有机溶剂的组合物。如本文使用的，术语“光引发剂”描述了当暴露于光、更具体地紫外照射时引发化学反应(例如交联反应、聚合)的化合物。许多合适的光引发剂对于本领域技术人员将是已知的。示例性的光引发剂包括而不限于双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基氧化膦(BAPO)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、樟脑醌(CQ)、1-苯基-1,2-丙二酮(PPD)、有机金属络合物Cp'Pt(CH3)3(Cp＝η5-C5H4CH3)、2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-l-丙酮(例如IRGACURETM 2959)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯甲酮(BP)以及黄素。在某些实施方案中，三乙醇胺、N-乙烯基吡咯烷酮和曙红Y的组合可以被用作在可见光条件下的光引发剂。
如本文和权利要求中使用的，术语“非交联的”或“预交联的”可互换地使用，并且指的是在准备在例如通过暴露于光来活化光引发剂之后聚合的液体溶液中的试剂的混合物。
如本文和权利要求中使用的，术语“水凝胶”或“支架”可互换地使用，并且指的是包含彼此共价地交联的蛋白质-聚合物缀合物分子的二维或三维聚合物多孔基质。根据本发明的水凝胶可以被定制成具有一系列性质，这取决于蛋白质、聚合物及它们在水凝胶中的比率以及取决于可以添加的另外的材料，例如矿物溶液或聚集物、多糖、活性成分、赋形剂及更多。通过控制交联，本发明的支架可以以任何大小、结构或孔隙率形成二维或三维结构。本发明的支架可以被嵌入在另一个支架或凝胶中或在另一个支架或凝胶周围形成，或者其可以被连接至另外的材料以形成混杂支架或涂覆的支架。在本发明的某些实施方案中，本发明的支架可以被用于支持细胞生长、附着、铺展，并且因此有利于细胞生长、组织再生和/或组织修复。在本发明的可选择的实施方案中，支架可以被用作粘合剂，并且因此有利于组织修复。任选地，粘合剂不支持细胞生长。根据本发明的任选的实施方案，支架是可生物降解的。
如本文和权利要求中使用的，术语“单个小瓶制剂”、“单个等分试样小瓶”或“备用的”可互换地使用，并且指的是包含呈非交联形式的与光引发剂混合的聚合物-蛋白质缀合物分子的组合物，其可以在暴露于光之后被活化。在某些实施方案中，备用的制剂可以包含未反应的聚合物，该未反应的聚合物可以在暴露于光之后在交联工艺中与蛋白质-聚合物缀合物分子一起反应。在某些实施方案中，聚合的活化在暴露于UV光之后发生。在某些其他实施方案中，聚合的活化在暴露于可见光范围之后发生。
如本文使用的术语“生物相容的”指的是具有与活的组织的亲和力、低毒性以及在活体中几乎没有或没有不可接受的异物反应的材料。例如，本发明的蛋白质、合成聚合物、蛋白质-合成聚合物缀合物和水凝胶是生物相容的。
此术语“植入”指的是将本发明的组合物插入到受试者中，借此本发明的水凝胶组合物用于完全地或部分地替代已被损伤或除去的组织。植入的另一个方面还被认为意指使用组合物作为媒介物以将治疗剂运输至患者中的某个部位。在此方面中，还包括将选自以下的治疗剂并入到组合物或植入物中：生长因子、细胞因子、化学治疗药物、酶、抗微生物剂、抗炎剂。
可以使用外科手术工具例如解剖刀、匙、刮刀或其他外科手术装置，将本发明的支架植入到受试者中。将理解的是，体内形成组织还可以通过将支架缀合物分子施用至受试者并进一步使缀合物分子体内交联来实现。
如本文使用的，术语“可生物降解的”和“生物降解性”指的是能够被生物蛋白酶或其他生物分子降解(即分解)。生物降解性取决于降解底物(即生物材料或其部分)的可用性、生物降解材料(例如微生物、酶、蛋白质)的存在以及氧气(对于需氧生物体、微生物或其部分)、二氧化碳(对于厌氧生物体、微生物或其部分)和/或其他营养物的可用性。此外，材料例如本发明的支架的生物降解性还取决于材料结构和/或机械性质，即孔隙率、柔性、粘度、交联密度、疏水性/亲水性以及弹性，它们可能影响气体和营养物的通过和可用性。
支架的生物降解性至少部分地来自支架中的形成支架的骨架的蛋白质的生物降解性。支架的生物降解性可以通过选择提供特定水平的生物降解性的蛋白质来确定。此外，生物降解性可以通过选择可生物降解的或不可生物降解的合成聚合物来确定。生物降解性也受附接至每个蛋白质的合成分子的数目影响，因为大量附接的合成分子可以通过掩蔽裂解位点来降低生物降解性。
本发明的实施方案的水凝胶支架的生物降解性可以通过使用蛋白酶例如纤溶酶、胰蛋白酶、胶原酶、糜蛋白酶及类似蛋白酶，使这样的水凝胶经受酶促降解来确定。
添加合成聚合物将增加产生的支架的机械强度。如果合成聚合物是不可生物降解的，那么支架的生物降解性将降低。因此，支架的性质可以根据需要通过添加适当量的合成聚合物以与缀合物分子交联来改性。
应注意，技术人员可以在使缀合物分子交联之前除去未缀合的合成聚合物，并且然后添加相同的未缀合的合成聚合物以与缀合物分子交联。例如，可以合意的是除去其浓度不确定的未缀合的合成聚合物，并且然后添加以已知浓度的未缀合的合成聚合物。
通常，支架的生物学性质和机械性质将部分地通过支架中的蛋白质与合成聚合物的比率来确定。例如，具有高蛋白质含量的支架将呈现其中包含的蛋白质的生物学性质例如细胞信号传导，同时保留其中包含的合成聚合物的有利的机械性质特性。示例性的支架包含以在从25:1PEG/蛋白质至400:1PEG/蛋白质的范围内的摩尔比的PEG和纤维蛋白原。
除了生产成本低外，本发明的支架是高度可再现的、柔性的(可以容易地受到应力或拉伸)、呈现出可控的结构性质，并且适于可控的生物降解；这些特性使得该支架高度适合于体内或离体的组织工程学，所述组织例如骨、神经、软骨、心肌、皮肤组织、血管以及身体内的其他组织(软的和硬的)。例如，根据本发明的实施方案的支架和/或水凝胶可以被容易地放置到组织或器官内的间隙中，这之后，该支架和/或水凝胶可以填充空隙并随着支架降解掉而开始再生的过程。
在许多情况下，合意的是使活细胞在由用于组织工程学的支架填充的空间中生长。这通过使活细胞被接种(seed)在支架中来促进。本发明的实施方案的一个优点是支架可以使用温和条件来引发交联由液相(例如聚合物-蛋白质缀合物的溶液)形成。因此，活细胞可以被分散在缀合物分子中，导致其中嵌入有活细胞的支架，因为交联可以在不损害细胞的温和条件下进行。
因此，根据本发明的任选的实施方案，支架包括嵌入在其中的活细胞。任选地，具有嵌入在其中的活细胞的支架包括硫醇化的蛋白质。
适合于包括在本发明的实施方案中的示例性细胞能够形成组织，该组织包括而不限于干细胞例如胚胎干细胞、骨髓干细胞、脐带血细胞、间充质干细胞、成人组织干细胞；或分化的细胞例如神经细胞、视网膜细胞、表皮细胞、肝细胞、胰腺(胰岛)细胞、骨细胞、软骨细胞、弹性细胞、纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞以及造血细胞。
如本文使用的，术语“接种”指的是将细胞包封、捕集、平板接种(plating)、放置和/或滴落到本发明的支架中。将理解的是，接种在本发明的支架上或接种在本发明的支架内的细胞的浓度取决于使用的细胞的类型和使用的支架的组成(即，缀合物分子内的合成聚合物与蛋白质之间的摩尔比和使用的交联分子的百分比)。
将理解的是，细胞的接种可以在形成支架或由支架形成的水凝胶之后进行，或者通过在产生支架的交联之前将细胞与缀合物分子混合来进行。待接种在支架和/或水凝胶上的细胞的浓度取决于细胞类型和支架和/或水凝胶的性质，并且本领域技术人员能够在每种情况下确定合适的细胞浓度。
将理解的是，在将细胞接种在支架和/或水凝胶上后，任选地在组织培养基和生长因子的存在下培养细胞，以便保持细胞的活力。
可以在接种之后检查(例如使用倒置的显微镜)支架和/或水凝胶，以便评价细胞生长、铺展和组织形成，如在实施例部分中例示的。如本文和权利要求中使用的，术语“剪切储能模量(G')”指的是固体材料的机械性质，其定义材料中的剪切应力(力/单位面积)和剪切应变(成比例的变形-弹性)之间的关系。如本文使用的，术语“剪切损耗模量(G”)”指的是粘弹性材料的粘性性质，其与剪切储能模量一起定义复合剪切模量，该复合剪切模量被用于描述粘弹性固体材料的机械性质。
如本文使用的，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学领域、药理学领域、生物学领域、生物化学领域和医学领域的从业者已知的或者容易地由已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
应理解的是，为了清楚在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中以组合来提供。相反地，为了简洁在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各个特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供或如适当地在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。除非实施方案在没有那些要素下是无法实施的，否则在各个实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征。
呈现以下非限制性实施例以便更充分地例证本发明的某些实施方案。然而，它们决不应当被解释为限制本发明的宽范围。在不背离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变型和修改。
实施例
实施例1：比较实施例：根据先前公开的程序获得的纤维蛋白原-PEGDA水凝胶组合 物中的丙酮残余物的确定
进行化学分析以便确定根据先前公开的程序(WO 2005/061018、WO 2008/126092和WO 2011/073991)制备的水凝胶组合物中的丙酮含量。
利用采用火焰离子化检测方法的气相色谱法(GC-FID，Hewlett Packard 5890)以便确定产物中的丙酮含量。顶空(HS)样品注射(Head Space sample injection)和毛细管GC柱ZB-624(长度75m，I.D.0.53mm，膜厚度3.0微米)与分别作为载气和火焰气体的氦气和氢气(1ml/min的气体流量)一起使用。将液体样品(5ml)添加到卷曲密封玻璃顶空小瓶(crimp-seal glass headspace vial)(20ml)中。将样品小瓶放入自动进样器中，并相对于使用丙酮作为标准品以5个变化的浓度的校准曲线进行分析。HS注射程序包括在80℃和100℃的注射器温度(1ml样品体积)的30分钟温育。对于GC方法，使用35分钟的运行时间。在40℃(初始温度)5分钟后，温度在5分钟内升高至240℃。将注射端口温度和FID温度分别设定为190℃和300℃。基于人类来源和牛来源的纤维蛋白原-PEG DA的水凝胶两者中的以ppm计的测量的丙酮量总结在表1中：
表1
批号 人类密封剂[ppm] 牛纤维蛋白原[ppm]
1 293 63
2 292 639
3 120 276
4 54 481
5 25.5 133
6 30 90
7 27 123
8 14.1 -
9 29.4 -
10 29.4 -
11 151 -
12 100 -
13 182 -
14 94 -
平均值 103 258
实施例2：牛来源的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物(纯化的纤维蛋白原)的制备
用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)(Sigma)制备在具有8M尿素的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的牛纤维蛋白原(Bovogen Biologicals Pty Ltd,Melbourne,Australia)的7mg/ml溶液。以1-1.5:1的TCEP与纤维蛋白原半胱氨酸的摩尔比添加TCEP-HCl。用NaOH将溶液的pH校正至8.0。在将PEG-DA添加至溶解的纤维蛋白原溶液中之前，将PEG-DA溶解在10mMPBS和8M尿素(280mg/mL)中以实现完全溶解。PEG-DA与纤维蛋白原半胱氨酸的摩尔比是3:1(线性PEG-DA，10kDa)。使混合物在具有恒温夹套(thermostaticjacket)的反应容器中在25±1℃的温度反应持续3h，保护免受光。然后，溶液用相等体积的PBS稀释并且从反应容器转移到切向流过滤系统的样品储器中。
使用Ω型盒(Omega type cassette)(30kDa MW截止，Pall Corporation)实施切向流过滤技术以将修饰的蛋白质相对于10mM的PBS纯化并浓缩，下降至8-12mg/ml的浓度。
然后，溶液用PBS溶液中的PEG-DA进一步稀释以实现6-8mg/ml的蛋白质浓度和1:120(±20)的PEG-DA与蛋白质的摩尔比。然后，使溶液穿过高剪切流体处理器(Microfluidics M110-Y，USA)以实现均匀的粒度减小。
实施例3：人类来源的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物(未纯化的纤维蛋白原密封剂)的 制备
用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)(Sigma)制备在具有8M尿素的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的人类纤维蛋白原(TISSEEL-Protein Sealant,Baxter,USA)的7mg/ml溶液。以1-1.5:1的TCEP与纤维蛋白原半胱氨酸的摩尔比添加TCEP-HCl。用NaOH将溶液的pH校正至8.0。在将PEG-DA添加至溶解的纤维蛋白原溶液中之前，将PEG-DA溶解在10mMPBS和8M尿素(280mg/mL)中以实现完全溶解。PEG-DA与纤维蛋白原半胱氨酸的摩尔比是3:1(线性PEG-DA，10kDa)。使混合物在具有恒温夹套的反应容器中在25±1℃的温度反应持续3h，保护免受光。然后，溶液用相等体积的PBS稀释并从反应容器转移到切向流过滤系统的样品储器中。
使用Ω型盒(30kDa MW截止，Pall Corporation)实施切向流过滤技术以将修饰的蛋白质相对于10mM的PBS纯化并浓缩，下降至8-12mg/ml的浓度。
然后，溶液用PBS溶液中的PEG-DA进一步稀释以实现6-8mg/ml的蛋白质浓度和1:120(±20)的PEG-DA与蛋白质的摩尔比。然后，使溶液穿过高剪切流体处理器(Microfluidics M110-Y，USA)以实现均匀的粒度减小。
实施例4：使用两个小瓶制剂制备水凝胶
如实施例2或实施例3中制备的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液然后通过0.2μm过滤器过滤用于灭菌。将过滤的溶液在无菌条件下填充到小瓶中，并储存在低于-15℃的温度直到使用。
制备用于注射溶液的在70％乙醇和水中的10％w/v Irgacure 2959(BASF，Switzerland)的光引发剂储备溶液。将储备溶液通过0.2μm过滤器过滤用于灭菌。将过滤的光引发剂溶液在无菌条件下填充到小瓶中并且储存在低于-15℃的温度直到使用。
为了光固化(photo-cure)PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液并产生对应的交联水凝胶，将光引发剂储备溶液添加至如实施例2或实施例3中制备的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液中以实现0.1％w/v的Irgacure 2959的最终浓度并在暴露于UV光之前剧烈地混合。
实施例5：稳定的单个小瓶备用的预凝胶化制剂的制备
将如在实施例2或实施例3中制备的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液进一步与2959(BASF,Switzerland)混合，以实现0.1％(w/v)的2959的最终浓度，并且搅拌直到完全溶解。将包含光引发剂试剂的PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液通过0.2μm过滤器过滤用于灭菌。将过滤的溶液在无菌条件下填充到小瓶中，并且储存在低于-15℃的温度直到使用。
实施例6：来自单个小瓶制剂的水凝胶的机械稳定性和凝胶化动力学
使用流变仪AR-G2进行由两个小瓶制剂和单个小瓶制剂两者获得的水凝胶样品的流变学研究；TA仪器连接至以5mW/cm2的强度在365nm操作的紫外光源(例如S1000)。测量并记录0.2ml样品的剪切储能模量G'。使用Excel进一步处理数据，并分析最大G'值(G'最大)以及达到G'最大的时间。
另外，通过施加促进冷冻-解冻循环的交替的温度设定点来测试处于其预交联状态的水凝胶组合物的冷冻和解冻对凝胶的机械性质的影响。两个水凝胶制剂(两个小瓶和单个小瓶)在-20℃下温育，随后在2℃-9℃(标记为5℃)温育，如在表2中总结的。在两个小瓶制剂的情况下，单独地对两个小瓶进行冷冻和解冻循环，同时在混合PEG-DA-纤维蛋白原缀合物溶液和光引发剂溶液之后，测量形成的水凝胶的凝胶化时间和机械性质。
表2
结果：
(1)由两个小瓶制剂和单个小瓶制剂产生的凝胶的机械稳定性测试证实了同等稳定的水凝胶。这些结果证实，与新鲜混合的PEG-DA-纤维蛋白原溶液和光引发剂相比，单个小瓶中的光引发剂与预凝胶化的缀合物溶液的存在不损害材料的交联性质(图2)。此外，似乎冷冻-解冻循环对两种凝胶制剂的交联性质均没有可检测的影响，如图2中证实的。
(2)凝胶化动力学研究证实了对于两种测试的水凝胶的类似的凝胶化时间。测量的达到G'最大的凝胶化时间似乎受冷冻-解冻循环的轻微影响，并在第一次循环后呈现凝胶化时间的较小的减少(图3)。
实施例7：源自单个小瓶制剂或两个小瓶制剂的水凝胶的长期比较稳定性研究
通过比较用新鲜制备的溶液(时间零)和在-20℃储存至少一年(终点)之后获得的最大剪切储能模量(G'最大)来评估作为两个小瓶制剂或单个小瓶制剂储存的PEG-纤维蛋白原水凝胶溶液的长期稳定性。流变学测量细节在上文中描述(实施例6)。
表3
计算的‘％回收率’的值指的是相比于在时间零测量的初始G'最大值，在终点测量的相对G'最大值(％)。
结果证实了对于两个小瓶制剂和单个小瓶制剂两者在延长的储存之后高的％回收率值。源自单个小瓶制剂的水凝胶的回收率与源自两个小瓶制剂的水凝胶的回收率是可比较的，这验证了新颖的单个小瓶制剂的有利的稳定性，该稳定性使得能够形成在合适的储存(-20℃)下具有延长的保存期限的全功能备用的水凝胶。
实施例8：稳定的备用的预凝胶化单个小瓶无乙醇制剂的制备
将450mg Irgacure 2959(BASF，Switzerland)粉末添加到450ml PEG-纤维蛋白原溶液中，同时搅拌以获得0.1％(w/v)光引发剂备用的制剂。继续搅拌直到观察到粉末的完全溶解。然后，使溶液穿过高剪切流体处理器(Microfluidics M110-Y，USA)以实现均匀的粒度减小，并且穿过0.2μm过滤器(无菌过滤)。然后，将均匀且无菌的混合物分成3ml等分试样或分到注射器中以获得在方便的、使用者友好的容器中的备用的制剂。
实施例9：无乙醇的备用的制剂的长期稳定性研究及其产生的水凝胶形式的机械 性质
将根据实施例8制备的两个样品在-20℃储存持续六个月时间段。在六个月后，利用UV光源(l＝365nm，I＝5mW/cm2)(IlluminOss Medical Inc.,East Providence,RI)，将样品解冻并暴露于UV持续1分钟的持续时间。
在UV暴露之后，两个样品成功地交联并测量其机械性质。
使用装配有20-mm直径平行板几何形状的AR-G2平行板流变仪(TA instruments，New Castle，DE)进行GelrinC的流变学表征。使用3rad/s的角频率和2％应变进行时间扫描测量。
表4
结果证实，在延长的储存时间段之后，储存的预凝胶化制剂的完全回收。形成的水凝胶获得其初始的G'最大值，并且证实了无乙醇的新颖的单个小瓶制剂的稳定性。
实施例10：水凝胶机械性质和凝胶形成动力学的比较研究
源自无有机溶剂程序，也就是‘改进的工艺’和如在WO 2005/061018、WO 2008/126092和WO 2011/073991中公开的工艺，也就是‘先前的工艺’两者的水凝胶在类似的条件下在流变学性质和凝胶化动力学方面被研究。
流变学测量使用装配有20mm扁钢几何形状的AR-G2流变仪(TAInstruments，NewCastle，DE)在100mw/cm2或5mw/cm2的UVA照射强度进行，所述UVA照射强度通过光动力固化系统(photodynamic curing system)(Illuminoss 75，Illuminoss Inc.，Providence，RI)被施加在200μl样品上。在交联之前使用UV强度计测量照射强度。
压缩测试(杨氏模量)：使用无侧限压缩测试(unconfined compression test)来测量样品的杨氏模量(E)。压缩测量使用装配有用于温度控制的珀尔帖板(peltier plate)和20mm不锈钢几何形状的AR-G2仪器(TA instruments)的挤压/拉拔测试进行。使用以100mW/cm2的90秒照射，使样品(以体积计0.17ml)在圆柱形特氟隆模具(Teflon mold)(h＝6mm)中交联。在交联之前使用UV强度计测量照射强度。
a)固化工艺比较：剪切储能模量相对于时间
作为时间的函数的剪切储能模量(G')的流变学测量证实了，不涉及使用有机溶剂并且更具体地不包括用于凝胶制备的丙酮沉淀或乙醇添加的改进的工艺产生在固化工艺动力学方面与包括使用有机溶剂的工艺类似的水凝胶前体。光化学反应在暴露于100mW/cm2UVA光的90秒期间发生，并在测量开始后60秒开始(图4)。动力学概况证实了类似的趋势，这指示改进的无有机溶剂凝胶与先前公开的凝胶一样机械坚固，但具有改进的生物相容性和更有效的制备工艺两者，该制备工艺不涉及使用大量的环境不友好的有机溶剂。
b)对于源自改进的工艺(无有机溶剂)和先前公开的工艺两者的凝胶，测量最大剪切储能模量(G'最大)和达到G'最大的时间。固化动力学数据的分析示出，在改进的程序的情况下为了达到G'最大所需的时间类似于先前公开的程序中所需的时间(表5)。另外，对于两种材料，获得的G'最大值在统计学上也是无差异的(表6)，这表明改进的工艺产生在机械性质和动力学方面期望的凝胶，而不需要利用有机溶剂，这允许改进的制备工艺和生物相容性凝胶组合物。
表5
表6
c)对于由改进的工艺和先前公开的工艺两者获得的水凝胶进行粘弹性性质的测量。作为频率的函数(图5)和应变的函数(图6)的剪切储能模量(G')和剪切损耗模量(G”)的流变学测量证实，避免使用有机溶剂的改进的工艺产生与先前公开的水凝胶组合物类似的粘弹性性质，并且因此提供期望的粘弹性性质，同时具有增加的生物相容性和改进的制备工艺。
d)由改进的工艺和先前公开的工艺两者获得用于水凝胶的杨氏模量(E)测量。两种水凝胶样品的圆柱形样品的压缩测试分析被证实为在其弹性性质方面在统计学上无差异，如表7中所证实的。该结果支持以下发现：用于制备水凝胶的避免使用有机溶剂、更具体地丙酮和乙醇的改进的工艺保持有益的机械性质而不危害水凝胶产品的获得的弹性。
表7
具体实施方案的前述实施例将如此充分地揭示本发明的一般性质，以致其他人可通过应用现有的知识，容易地对于各种应用修改和/或调整这样的具体实施方案而不需要过度实验且不偏离一般理念，并且因此，这样的调整和修改应当并且意图被包含在公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于实施各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种可选择的形式而不偏离本发明。

Claims (27)

1.一种组合物，包含蛋白质-聚合物缀合物，所述蛋白质-聚合物缀合物包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中所述合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞外基质蛋白质选自由以下组成的组：纤维蛋白原、纤维蛋白、白蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、变性的纤维蛋白原、变性的白蛋白、明胶及其任何组合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞外基质蛋白质包括牛或猪来源的纤维蛋白原。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述细胞外基质蛋白质包括纯化或部分纯化的人类来源的纤维蛋白原。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述合成聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇(PEG)、羟基磷灰石/聚己内酯(HA/PLC)、聚乙醇酸(PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)、聚亚丙基富马酸酯(PPF)、聚乙二醇-二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)、聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)、β-磷酸三钙(β-TCP)以及不可生物降解的聚四氟乙烯(PTFE)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述合成聚合物是聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中合成聚合物与蛋白质的摩尔比在40:1至400:1之间。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中合成聚合物与蛋白质的摩尔比在100:1至250:1之间。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中合成聚合物与蛋白质的摩尔比在100:1至150:1之间。
10.一种生产蛋白质-聚合物缀合物组合物的工艺，包括以下步骤：
(a)将至少一种变性的细胞外基质蛋白质在提供强的蛋白质变性的碱性pH条件和还原条件下溶解；
(b)提供包含具有可聚合基团的合成聚合物的溶液；
(c)将(a)的所述细胞外基质蛋白质溶液与(b)的包含合成聚合物的所述溶液在提供强的蛋白质变性的碱性pH和还原条件下混合，以在所述蛋白质的巯基和所述可聚合基团之间产生共价缀合物；
(d)将步骤(c)的粗反应混合物浓缩，而无需利用极性有机溶剂的浓缩工艺，
从而生产没有极性有机溶剂的缀合物组合物。
11.一种水凝胶组合物，包含交联的蛋白质-聚合物缀合物分子，所述缀合物包含共价地结合至合成聚合物的细胞外基质蛋白质，其中所述合成聚合物包含至少一个可聚合基团，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
12.一种水凝胶，包含根据权利要求1至9中任一项所述的交联的缀合物，所述交联形式包含多个所述缀合物分子，其中所述缀合物分子在所述可聚合基团的聚合之后彼此共价地交联，并且其中所述组合物大体上不含极性有机溶剂。
13.如权利要求11和12中任一项所述的水凝胶组合物，其中所述水凝胶大体上不含丙酮。
14.如权利要求11和12中任一项所述的水凝胶组合物，其中所述水凝胶大体上不含乙醇。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的水凝胶组合物，具有在0.05kPa至35kPa的范围内的剪切储能模量(G')。
16.一种呈非交联形式的稳定的备用的液体制剂，所述液体制剂包含根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质-聚合物缀合物组合物和至少一种聚合引发剂。
17.根据权利要求17所述的备用的液体制剂，其中所述至少一种聚合引发剂选自由以下组成的组：双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)苯基氧化膦(BAPO)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、樟脑醌(CQ)、1-苯基-1,2-丙二酮(PPD)、Cp'Pt(CH3)3(Cp＝η5-C5H4CH3)、2-羟基-l-[4-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-l-丙酮(例如IRGACURETM2959)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯甲酮(BP)、含黄素的化合物、以及三乙醇胺、N-乙烯基吡咯烷酮和曙红Y的组合。
18.根据权利要求16所述的备用的液体制剂，其中所述液体制剂被保持在容器中，所述容器选自单个小瓶等分试样或预填充的注射器。
19.根据权利要求16所述的备用的液体制剂，其中在引发聚合之前，所述液体制剂在UV保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。
20.根据权利要求16所述的备用的液体制剂，其中在引发聚合之前，所述液体制剂在可见光保护的条件下以预凝胶化的形式被储存。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述液体制剂在暴露于光之后形成水凝胶。
22.根据权利要求21所述的备用的液体制剂，其中所述液体制剂在暴露于UV光之后形成水凝胶。
23.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述液体制剂大体上不含极性有机溶剂。
24.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述组合物包含小于10ppm的丙酮。
25.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述组合物不包含可检测的丙酮的残余物。
26.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述组合物包含小于100ppm的乙醇。
27.根据权利要求16至20中任一项所述的备用的液体制剂，其中所述组合物不包含可检测的乙醇的残余物。
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