JP2022513369A - 組換えバイオポリマーベース組成物及びバイオインクとしての使用 - Google Patents

Abstract

【課題】組換えバイオポリマーベース組成物及びバイオインクとしての使用を提供する。【解決手段】本発明は、エラスチン類似組換え体（ＥＬＲ）モノマーから合成される組換えバイオポリマーを含む組成物に係り、カイコのボンビクスモリに由来する“シルク”と呼ばれるシークエンスを含み、及び／又はＨＬＦと呼ばれ、ジッパーと呼ばれる天然タンパク質クラスに属するシークエンスを含む組成物に関わるものである。これらの組成物は、３Ｄプリンティング用のバイオインクとして有用である。さらに、本発明は、本発明の組成物を得るための方法、３Ｄバイオマテリアル、及びその組成物及びその組成物を含むバイオマテリアルの別の用途に関するものである。【選択図】 なし

Description

本発明は、エラスチン類似組換え体（ＥＬＲ）モノマーから合成される組換えバイオポリマーを含む組成物に係り、より詳しくは、カイコのボンビクスモリに由来する“シルク”と呼ばれるシークエンスを含み、及び／又はＨＬＦと呼ばれ、ジッパーと呼ばれる天然タンパク質クラスに属するシークエンスを含む組成物に関するものである。これらの組成物は、３Ｄプリンティング用のバイオインクとして有用である。さらに、本発明は、本発明の組成物を得るための方法、３Ｄバイオマテリアル、及びその組成物及びその組成物を含むバイオマテリアルの別の用途に関するものである。

３Ｄバイオプリンティング技術は、ステレオリソグラフィー、インクジェットベースのバイオプリンティング、レーザーベースのバイオプリンティング、押出ベースのバイオプリンティングがあり、後者の技術が最も広く使用されている。押出ベースのバイオプリンティングでは、カートリッジにヒドロゲルを入れ、表面に圧力をかけて押し出す。プリントされた構造は、ＣＡＭ－ＣＡＤ（コンピュータ支援製造－コンピュータ支援デザイン）ソフトウェア手段によって空間的及び時間的な動きをコントロールして材料を層状にデポジットさせて作っていく。
これまで、骨、心臓組織、軟骨、肝臓、肺、神経組織、皮膚及び膵臓組織などの組織を模倣するために、押出技術を用いて多くの研究が行われてきた（非特許文献１）。また、疾患及び薬物放出のインビトロモデリングを行うにも使用されている（非特許文献２）。
３Ｄバイオプリンティングで使用できるように材料が満たすパラメータは、プリントプロセス、特に、レオロジー特性（粘度、疑可塑性、粘弾性及び降伏強度）及び架橋機構などの物理化学的パラメータの影響を受けるプリンタ適性と、生物医学材料として使用することができる特性、すなわち、その分解速度論が細胞の細胞外マトリックス形成能力と一致しなければならないこと、及び分解生成物が毒にならないことに注目する生体適合性、がある。

バイオインクとして広範囲の材料が使用され、その中に、生体組織工学において長年使用されてきたものにヒドロゲル構造をもつものがある。バイオインクとして使用されるこれらのヒドロゲルは、天然ヒドロゲル〔例えば、アルギン酸、ゼラチン、アガロース、ヒアルロン酸、キトサン、脱細胞化細胞外マトリックス、ＤＮＡペプチド、及びコラーゲン、シルクフィブロイン及びフィブリンなどの構造タンパク質〕と、合成ヒドロゲル〔例えば、（ポリ乳酸・グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、プルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及びポリ（ε－カプロン酸）（ＰＬＣ）〕に分けられる。天然バイオポリマー、合成バイオポリマー、さらには両方の混合物に基づく種々の既存バイオインクがあるにも拘わらず、その使用を制限する欠点がある。特に、プリントされたマトリックスの機械的及び構造的特性に関して、ある場合には特に細胞での使用を制限する高親水性、プリントを妨げる高粘度、低形状性、急速ゲル化、及び架橋化の多くの欠点がある。まだ解決されていないもう一つの欠点は、細胞の相互作用を可能にする生体適合性又はバイオ活性ドメインがないことである。
ポリマーベースのバイオインクの前述の欠点を解決するために、いくつかの方策が挙げられる。
（１）主に物理的プロセス（イオン相互作用、水素結合又は疎水性相互作用）、化学プロセス（化学反応によって生成された共有結合）、又は両方の組み合わせに基づいて構造を安定化させるゲル化方法（非特許文献３）。
（２）通常、あるインクの構造的欠陥を別のインクの良好なプリンタ適性で補うために、ほぼ全ての既存バイオインクをそのまま混合物にした多成分又はハイブリッドインクの使用（非特許文献４）。
（３）大きな構造にしてプリントをサポートする犠牲インクの使用。
（４）サポートとして合成材料を使用。
現在までに、バイオインク組成物が市販されており、例えば、ゼラチンポリマーをベースとし、別の成長因子を組み合わせたＧｅｌ４Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｉｎｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）、ナノセルロースとアルギン酸をベースにしたＣＥＬＬＩＮＫ（ＣＥＬＬＩＮＫ）、ＰＥＧ／ゼラチン／ヒアルロン酸及びリン酸カルシウムをそれぞれベースにしたＢｉｏ１２７及びＢｉｏＧｅｌ（ＲｅｇｅｎＨＵ）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７及びメタクリレートをそれぞれベースにしたＢｉｏ１２７及びｂｉｏＧｅｌ（Ｂｉｏｂｏｔ）がある。このタイプのバイオインクの欠点は、これらを形成するゼラチンポリマーが、動物コラーゲンの加水分解から得られ、従って同じでないために、それらの製造バッチ毎の挙動を保証できないことにある。

Ｏｚｂｏｌａｔ，Ｉ．Ｔ．ら，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２０１６．２１（８）：ｐ．１２５７－１２７１ Ｖａｎｄｅｒｂｕｒｇｈ，Ｊ．ら，Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ，２０１７．４５（１）：ｐ．１６４－１７９ Ｊｕｎｇｓｔ，Ｔ．ら， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１６ １１６（３）：１４９６－１５３９ Ｃｈｉｍｅｎｅ，Ｄ．ら，Ａｎｎ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ．２０１６，４４（６）：２０９０－２１０２

新しいバイオインクとそのバイオプリンティング技術の開発に大きな進歩があるが、プリンタ適性や形状精度など、適切なバイオインクに必要な全ての要件を満たす新しいバイオマテリアルを見出す必要性は未だある。詳しくは、細胞でプリントのための保護環境を提供する迅速ゲル化又は固化能力を持つ新しいバイオマテリアル、ならびに低濃度で使用して、適切な生体力学的特性及び高空隙とするバイオマテリアルを開発することが望まれている。

本発明は、天然エラスチンに存在するドメインを有するモノマーを、毒性が無く、それ故にバイオインクとしての使用に適している“シルク”と呼ばれるシークエンスを含むモノマー、及び／又はジッパーと呼ばれる天然クラスのタンパク質に属するＨＬＦと呼ばれるシークエンスを含むモノマーに加えて形成される新しいＥＬＲ組換えバイオポリマーに関するものである。詳しくは、本発明は、このバイオポリマーを含み、主に３Ｄプリンティング用のバイオインクとして有用な組成物に関している。

本発明の組成物は、
モノマーＢ、Ｃ、Ｘ及びＹを含むバイオポリマー、又は
モノマーＢ、Ｃ及びＸ、並びにモノマーＢ、Ｃ及びＹを含む少なくとも２つのバイオポリマーを含むことを特徴とする。
ここで、
Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むアミノ酸シークエンス、
Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含むアミノ酸シークエンス、
Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンス、
Ｙは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスである。

本発明の組成物の使用は、
モノマーＢ、Ｃ及び少なくともモノマーＸ又はＹを含むバイオポリマーを含む組成物を、バイオインクとして、好ましくはバイオマテリアルの２Ｄ又は３Ｄプリンティングのバイオインクとして使用することを特徴とする。
ここで、
Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むアミノ酸シークエンスであり、
Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含むアミノ酸シークエンスであり、
Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンスであり、
Ｙは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスである。

ＥＬＲベースのバイオマテリアルは、本質的な生体適合性、生分解性、調節可能な機械特性によって特徴付けられるという事実により、組織エンジニアリングにおいて大きな可能性があることが証明されており、これらは、ミセル、ナノ粒子、ヒドロゲル、膜、あるいはナノファイバーなど幅広い自己組織化構造を作ることもできる。このポリマーは、今日では、遺伝子治療、ワクチン放出システム、表面バイオ機能化、及び組織エンジニアリング用途のヒドロゲルなど幅広いバイオメディカル用途に使用されている。ＥＬＲは、細胞の成長と増殖ができ、バイオロジーシステムにおける免疫応答を誘発しないので、移植ができる。組織エンジニアリング分野でこれらの材料は、軟骨及び椎間板の再生、血管移植及び眼と肝臓の組織に使用されてきた。

組み換えＤＮＡ技術による生成された、ＥＬＲのアミノ酸構造は、架橋又は自己集合能力を調節するようにデザインすることができ、ヒドロゲルに物理的及び／又は化学的に自己集合することによって、機械的な特性を改善され、その性状が、３Ｄバイオプリンタでのバイオインクとして使用するために好ましいものになる。さらに、シークエンスに他のタンパク質の融合や、細胞接着モチーフ（ＲＧＤ、ＲＥＤＶなど）、成長因子又はメタロプロテイナーゼのようなバイオ活性ドメインを導入して他の機能を付与し、最終構造の崩壊に好ましいようにすることができる。

本発明によると、生物学的な要件に加えて、本発明に記載したＥＬＲバイオポリマーは、バイオインクとして使用できる他の特殊性を有している。これらの材料は、このポリマーがある温度を超えたとき受ける急速な立体構造変化により、ポリマーがプリンタカートリッジ内で液体状態に保持され、加熱されたプレートにデポジットしたとき急速にゲル状態に変化するという３Ｄバイオプリンティングに利用できる温度応答能を有している。したがって、液体状態、低粘度で、針に与える負荷を小さくして注入して、デポジットを容易にし、細胞を膜破裂がないように保護する。この挙動は、転移温度Ｔｔと定義する逆温度転移（ＩＴＴ）であり、平均ポリマー極性に依存し、ＥＬＲバイオポリマーシークエンスに存在するアミノ酸組成を変化させることによって変えることができる。

バイオポリマー１のアクリルアミドゲル電気泳動である。左側レーンは分子量マーカー、右側レーンはバイオポリマー１である。分子量は、キロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー１の質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ、すなわち「マトリックス支援レーザー脱離／イオン化－飛行時間」）分析である。実験による分子量が９２８９７Ｄａ、理論分子量が９３１７５Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。狭いピークが１つだけ見られ、この分子の単分散性も観察される。 バイオポリマー１の赤外分光（ＦＴＩＲ－ＡＴＲ、又は“フーリエ変換赤外線－減衰全反射率”）分析である。デザインしたタンパク質バイオポリマーに存在するアミド基（約１７００ｃｍ^－１）の特徴的なシグナルが観測される。 バイオポリマー１の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析である。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、メチレン基ＣＨ（１．０～２．３；３．５～４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観測される。 バイオポリマー２のアクリルアミドゲル電気泳動である。右側レーンは分子量マーカー、左側レーンはバイオポリマー２である。分子量は、キロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー２のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析である。実験による分子量が１０１６６４Ｄａ、理論分子量が１０１６９６Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。 バイオポリマー２のＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析である。デザインされたタンパク質ポリマー中に存在するアミド基（約１７００ｃｍ－^１）の特徴的なシグナルが観測される。 バイオポリマー２の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を示している。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、メチレン基ＣＨ（１．０～２．３；３．５～４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観測される。 バイオポリマー３のアクリルアミドゲル電気泳動である。左側レーンは分子量マーカー、右側レーンはバイオポリマー３を示す。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー３のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析である。実験による分子量が１０３７９３Ｄａ、理論分子量が１０４１１９Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。 バイオポリマー３のＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析である。デザインしたタンパク質ポリマー中に存在するアミド基（約１７００ｃｍ^－１）の特徴的なシグナルが観察される。 バイオポリマー３の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を示す。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、及びメチレン基ＣＨ（１．０－２．３；３．５－４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観察される。 バイオポリマー４のアクリルアミドゲル電気泳動である。右側レーンは分子量マーカー、左側レーンはバイオポリマー４である。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー４のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析である。実験による分子量が１２２８８２Ｄａ、理論分子量が１２３３４５Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。 バイオポリマー４のＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析である。デザインしたタンパク質ポリマー中に存在するアミド基（約１７００ｃｍ^－１）の特徴的なシグナルが観測される。 バイオポリマー４の核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、及びメチレン基ＣＨ（１．０－２．３；３．５－４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観察される。 バイオポリマー５のアクリルアミドゲル電気泳動である。右側レーンは分子量マーカー、左側レーンはバイオポリマー５である。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー５のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析である。実験による分子量が１２０６１１Ｄａ、理論分子量が２０９２１Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。 バイオポリマー５のＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析である。デザインしたタンパク質ポリマー中に存在するアミド基（約１７００ｃｍ－^１）の特徴的なシグナルが観測される。 バイオポリマー５の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析である。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、及びメチレン基ＣＨ（１．０－２．３；３．５－４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観察される。 バイオポリマー６のアクリルアミドゲル電気泳動である。右側レーンは分子量マーカー、左側レーンはバイオポリマー６である。分子量は、キロダルトン（ｋＤａ）で示している。 バイオポリマー６のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析である。実験による分子量が１２５８５７Ｄａ、理論分子量が１２６３９３Ｄａであり、両者の差は測定誤差によるものである可能性がある。 バイオポリマー６のＦＴＩＲ－ＡＴＲ分析である。デザインされたタンパク質ポリマー中に存在するアミド基（約１７００ｃｍ^－１）の特徴的なシグナルが観測される。 バイオポリマー６の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析である。アミノ基ＮＨ（７．５～８．５ｐｐｍ）、メチル基ＣＨ_３（０．５～１．０ｐｐｍ）、メチレン基ＣＨ（１．０～２．３；３．５～４．５ｐｐｍ）に属する水素のシグナルが観測される。 １ｘＰＢＳを溶媒として異なる濃度（３００、２５０、２００、１８０、１５０、１２０ｍｇ／ｍｌ）で含む組成物を用いてプリントしたバイオマテリアルの写真である。カラムＡは前硬化バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、カラムＢはバイオポリマー４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）である。 本発明の異なる組成物を、１ｘＰＢＳを溶媒として濃度２５０ｍｇ／ｍｌでプリントした異なるバイオマテリアルの写真である。バイオマテリアルのプリンタ適性（カラムＡ）及びフィブリラー観察（カラムＢ）が明確に示されている。ＢＰは、バイオポリマーで、バイオポリマーの組合わせ割合は、重量割合を表している。 本発明の種々のバイオポリマーによって形成されたバイオインクについて、剪断速度（１／秒）を増加させて受けた粘度（１／秒あたりパスカル、Ｐａ．ｓで表す）である。 本発明の種々のバイオポリマーによって形成されたバイオインクについて、短時間の間隔で高剪断速度を受けた粘度変動の評価である。ステップ１：剪断速度が５ｓ－^１、ステップ２：剪断速度が１０００ｓ^－１、ステップ３：剪断速度が５ｓ－^１。 本発明の種々の分析したバイオインクの粘度に及ぼす温度の影響を示している。 １ｘＰＢＳを溶媒として用いたバイオポリマー４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を含むバイオインクでプリントした異なる構造の写真である。プリントされた構造の３日間にわたっての安定性を示している。 １ｘＰＢＳを溶媒として用いた前硬化バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）を含むバイオインクでプリントした異なる構造の写真である。プリントされた構造の２日間にわたっての安定性を示している。 １ｘＰＢＳを溶媒として用いたバイオポリマー４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）６０重量％と前硬化バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）４０重量％を組み合わせて含むバイオインクでプリントし異なる構造の写真である。プリントされた構造の４０日間にわたっての安定性を示している。 １ｘＰＢＳを溶媒として用いたバイオポリマー６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を含むバイオインクでプリントとした異なる構造の写真である。プリントされた構造の４０日間にわたっての安定性を示している。 ＲＧＤ接着シークエンスを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のバイオポリマー４（６０重量％）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の混合物（白ブロック）と、細胞接着シークエンスを含まないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のバイオポリマー３（６０重量％）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のバイオポリマー２（４０重量％）の混合物（黒ブロック）の３０分、２時間、４時間での早期細胞接着の分析を示すグラフである。 ＲＧＤ接着シークエンスを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のバイオポリマー４（６０重量％）とＳＥＱ ＩＤＮＯ：１５の前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の混合物（白ブロック）と、ＲＧＤ接着シークエンスを含まないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のバイオポリマー３（６０重量％）とＳＥＱ ＩＤＮＯ：１２のバイオポリマー２（４０重量％）の混合物（黒ブロック）をベースとしてプリントした表面での２１日間にわたる細胞増殖の分析である。 溶媒として１ｘＰＢＳを用い、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１４のバイオポリマー４（６０重量％）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の組み合わせて含むバイオインクでプリントした表面に、ＨＦＦ－１細胞を播種し７日間培養した顕微鏡写真である。 溶媒として１ｘＰＢＳを用い、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１４のバイオポリマー４（６０重量％）とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の組み合わせを含むバイオインクをプリントした表面に、ＨＦＦ－１細胞を播種し、７日間培養した顕微鏡写真である。システムの３次元性を確証するため異なる焦点面を示している。 バイオポリマー６と共にプリントされたヒト線維芽細胞ＨＦＦ－１の２１日間にわたっての生存率示している。プリントされた格子の生存率を、コントロール（プリントでなくデポジットさせた物）と比較している。 バイオポリマー６をヒト線維芽細胞ＨＦＦ－１と混合してプリントし、２１日間にわたる表面の顕微鏡写真である。スケールは５００μｍに相当する。

そこで、本発明の組成物は、ここに記載したバイオポリマーを含んでなり、ＩＴＴ特性の結果、Ｔｔ温度を以下では水和され無秩序の状態であり、Ｔｔを超えたとき秩序化された疎水性フォールディングに移行する。このユニークな特性を利用することで、温度制御された押出システムでデポジットできるポリマーフィラメントを生成することができるので、この組成物をバイオインクとして使用することが可能となる。フィラメントを高精度でデポジットさせ、時間的及び空間的に高精度の構造マトリックスの形成を可能にし、層毎に、高い汎用性、信頼性及び再現性をもった複雑な構造がデザインできるようになる。

本発明に記載する組成物の一部であるバイオポリマーは、種々のＥＬＲモノマーを、ゲル強化シークエンスを含むモノマー、好ましくはジッパーと呼ばれる天然クラスのタンパク質に属するＨＬＦと呼ばれるシークエンスを含むモノマーと、及び構造強化シークエンスを含むモノマー、好ましくはカイコ由来の“シルク”と呼ばれるシークエンスを含むモノマーと合わせて用いている。

記載したバイオポリマーを得るために本発明で用いられるＥＬＲモノマーは全て、同じエラスチンドメインＶＰＧＸＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を使用することをベースにしている。ここで、モノマー？Ｘは、アミノ酸Ｌ－プロリンを除く任意のアミノ酸であり、アミノ酸バリン、グルタミン酸及びイソロインが好ましい。モノマーＢは、本発明で使用されるＥＬＲモノマーの１つである。

モノマーＢは、親水性であり、生理学的温度の範囲内で転移しないようにデザインされた組成を有する。本発明の目的のために、モノマーＢは、ヘプタペプチドＶＰＧＸＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の繰り返しを含み、詳しくは、モノマーＢはヘプタペプチドＶＰＧＶＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）とＶＰＧＥＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）の繰り返しを含み、さらに詳しくは、モノマーＢはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（［（ＶＰＧＶＧ）_２（ＶＰＧＥＧ）（ＶＰＧＶＧ）_２］）を含む。

モノマーＣは、疎水性で、生理学的温度より低い温度で転移し、初期の物理的架橋を作るようにデザインした組成である。本発明の目的のために、モノマーＣは、ペプタペプチドＶＧＩＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の繰り返しを含み、詳しくは、本発明のバイオポリマー中のモノマーＣは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３の繰り返しを２～２５０含み、より詳しくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の繰り返しを４０～８０含み、さらにより詳しくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の繰り返しを６０含む。

モノマーＹは、本発明のバイオポリマーのゲル化を改善するために用いられるモノマーであり、このモノマーは、エラスチンドメインの両親媒性ポリマーシークエンスとカイコボンビクスモリに由来する“シルク”と呼ばれるシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；ＧＡＧＡＧＳ）の組み合わせを含む。本発明の目的のために、モノマーＹは、アミノ酸シークエンスＳＥＱ ＩＤＮＯ：８の繰り返しを含み、より好ましくは、モノマーＹは、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８の繰り返しを１～１５含み、より好ましくは繰り返しが５である。別のより好ましい実施形態で、モノマーＹは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で定義されたアミノ酸シークエンスを含む。

モノマーＸは、本発明のバイオポリマーの構造を改善するのに用いられるモノマーで、本発明のバイオポリマーを強化するシークエンスを含む。このモノマーＸは、ＨＬＦとして知られるアミノ酸シークエンスで、ジッパーと呼ばれる天然型タンパク質に属する“ジッパー”構造モチーフのアミノ酸シークエンスを含む。好ましくはこのジッパーモチーフは、天然のヒトジッパータンパク質のクラスに属している。本発明の目的のために、モノマーＸは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で定義されるアミノ酸シークエンスを含む。

従って、本発明に記載したバイオポリマーは、上記の種々のモノマーの繰り返しを含み、２Ｄ及び／又は３Ｄプリンティング用のバイオインクとして有用なバイオポリマーを生じる。

第１の態様で、本発明は、モノマーＢ、モノマーＣ、及び少なくともモノマーＸ、モノマーＹ又はその両方を形成するアミノ酸シークエンスを含むバイオポリマーを含む組成物に関するものである。

本明細書に挙げた実施例に示すように、上記したモノマーによって形成された少なくとも１つの組換えバイオポリマーを含む本発明の組成物は、その組成物が、好ましくは、シークエンス中にＥＬＲモノマー（Ｂ及びＣ）と共にモノマーＸとＹを組み合わせて含むバイオポリマーを、あるいはシークエンス中にＥＬＲモノマー（Ｂ及びＣ）と共にモノマーＸを含む第１のバイオポリマーと、シークエンス中にＥＬＲモノマー（Ｂ及びＣ）と共にモノマーＹを含む第２のバイオポリマーを組み合わせたバイオポリマーを含むとき、バイオインクとして使用するのに有用である。すなわち、ジッパードメインを含むモノマーＸのバイオポリマーに、他のモノマーを入れることで、形成された物理的ヒドロゲルの両親媒性相互作用ができ、ジッパードメインのシークエンスのジッパーに由来するコイルドコイル相互作用の形成によって安定化する。

この現象は、温度でＥＬＲモノマーの転移が加速され、その“ジッパー”相互作用の結果として強化されることで、物理的に観察される。従って、本発明の組成物がバイオインクとして使用されると、デポジット可能なフィラメントの形態での良好なプリンタ適性と、良好な短期安定性を示す。これに対して、実施例（実施例４参照）で観察されるように、組成物が、ＥＬＲモノマーにモノマーＸを加えたバイオポリマーを含んでいないと、この安定性は、相互作用の可逆性により経時的に保持できない。

さらに、シルクシークエンスを含むモノマーＹを本発明の組成物を形成する他のモノマーと共に導入すると、バイオポリマーを両親媒性物理的架橋してヒドロゲルの形態にする。このバイオポリマーは、シルクシークエンスに由来するβシート形成で安定化する。ＥＬＲモノマーとモノマーＹを含みモノマーＸがないこの組成物は、３Ｄプリンタのシリンジからの押し出しが均質でなく、フィラメントを形成せず、したがって、プリントされた形状を保持しないことから、信頼性の高いプリントができない（実施例４参照）。これに対し、実施例４で観察されたように、この組成物は、経時の安定性が高いことを示している。この場合、ＩＴＴ機構により起きる転移は、この補強相互作用が遅いので、デポジットしたポリマーをその構造に保持するために充分速くなく、それ故に、プリントステップ後のステップに有効である。

上記を考慮して、本発明の組成物は、それ故、モノマーＢ、Ｃ、Ｘ及び／又はＹを含むバイオポリマー、より好ましくは、本発明の組成物は、モノマーＢ、Ｃ、Ｘ及びＹを含むバイオポリマー、あるいはモノマーＢ、Ｃ、Ｘを含む第１のバイオポリマーとモノマーＢ、Ｃ、Ｙを含む第２バイオポリマーの組み合わせたバイオポリマーを含む。

上記したことを考慮して、本発明は、以下の要項をベースにしている。
－ ＥＬＲシークエンス（モノマーＢ）及びモノマーＣを含むモノマーを、シルク（モノマーＹ）及びジッパー（Ｘモノマー）シークエンスを含むモノマーと一緒にした組み合わせ；又は、ＥＬＲモノマーシルク（モノマーＹ）をシルクモノマー（モノマーＹ）と一緒に含むバイオポリマーと、ＥＬＲモノマー（モノマーＢ）とモノマーＣをジッパーモノマー（モノマーＸ）と一緒に含むバイオポリマーとの組み合わせ。これで、モノマーＸは、必要なプリンタ適性、すなわち、最初に構造を保持する能力を与え、一方、モノマーＹは、経時的な構造の保持に寄与する。

－ 本発明の組成物を形成するバイオポリマーの濃度（実施例３参照）は、いくつかの溶媒に溶解させることができ、粘度が低く、ニュートン挙動を示し（実施例４参照）、これにより、３Ｄプリンタでのプリントを容易にし、プリンタと、バイオインクと一緒になる溶液中の材料の両方に損傷を与える可能性がある高プリンティング圧がかかるのを回避し、より小さな径の針の使用ができるようにする。

－ 発明の組成物は、２Ｄ及び／又は３Ｄプリンティングでの使用を、非常に良好な形状精度で可能にする（実施例４及び６参照）。さらに、プリンティングサポートに使用でき、広範囲の活性成分と細胞をカプセル化でき、従って生医学において有用である。例えば、限定するものではないが、再生医療、例えば、組織再生のためにインビトロ又はインビボでの細胞増殖に使用される。

このため、細胞及び／又は活性成分を、好ましくは本発明の組成物に均質に分散させ、プリントした後に、所定の方法でマトリックスに分布させ、活性成分をコントロールされて放出ができ、又は細胞が良好に接着して増殖して、損傷組織を再生できるようにして、効果的な移植と自然な細胞外マトリックスとして作用するようにする。

－ バイオインクとしてこれら組成物のプリント表面へのデポジットは、過去に本発明者による特定ソフトウェアで規定したデザインで制御された方法で行われる。このプリントプロセスは、押出ヘッドを組成物のＴｔ以下の低温に保ち、加熱ベッドの温度を組成物のＴｔより高く保っている必要がある。そこで、組成物は、シリンジ中では溶液であるが、デポジットすると転移する、すなわち、針の中にあるときの無秩序な液体状態から、ベッド上に分配されると秩序ある疎水性水和状態に移行する。従って、ベッド上にフィラメントを形成して、構造を保持したまま層状にデポジットさせることができる。

－ さらに、本発明の組成物は、さらに少なくとも別のモノマーＤを含んでもよい。ここで、モノマーＤは、例えばＲＧＤ及びＲＥＤＶ細胞接着モチーフ、ＶＥＧＦなどの成長因子、又は形成された構造を制御して崩壊するメタロプロテイナーゼなどのバイオ活性ドメインのシークエンスである。この種のバイオ活性ドメインを本発明の組成物を含むバイオポリマーに導入すると、種々の機能性及びバイオ活性を有する構造をデザインすることができるようになり、例えば、特定の細胞結合シークエンスを導入することを目的として、そのシークエンス中に組換えで導入する。この可能性は、今日あるバイオインクには存在しない。種々のシークエンスの導入は、例えば、構造上の細胞挙動を予め決定し、十分に分化した細胞領域もつマトリックスを生成することができ、これは、移植できる組織又はマイクロ器官の模倣デザインするために必要な特性である。

したがって、第１の態様で、本発明は、モノマーＢ、モノマーＣ、及び少なくともモノマーＸ、モノマーＹ又は両方を含むバイオポリマーを含む組成物に関するものである。
ここで、
Ｂは、既に述べたように、ＥＬＲドメインの繰り返し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を作るアミノ酸シークエンスであり、より好ましくは、モノマーＢは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む。
Ｃは、ＥＬＲドメインの繰り返しでなるアミノ酸シークエンスであり、より好ましくは、モノマーＣは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含む。
Ｘは、“ジッパー”構造モチーフを含むアミノ酸シークエンスであり、より好ましくは、モノマーＸは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含む。
Ｙは、エラスチンドメインシークエンスとカイコボンビモリに由来する“シルク”と呼ばれるシークエンスの組み合わせを含むアミノ酸シークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；ＧＡＧＡＧＳ）であり、より好ましくは、モノマーＹは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む。

別の好ましい実施形態で、本発明の組成物は、さらにモノマーＤを含む。より好ましくは、モノマーＤは、αｖβ３、α５β１及びαＩＩｂβ３のインテグリン受容体の細胞接着ドメインとしてＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＬＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、又はレクチン、アググルチニン、成長因子、メタロプロテイナーゼ由来のヘパリン結合ドメイン又は糖結合ドメイン、さらに、酵素、ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）及びタンパク質分解に良いその他類似シークエンスに属するＧＴＡＲシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）及びＤＲＩＲシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）から選ばれる少なくとも１つのペプチドを含む細胞結合シークエンスである。好ましくは、モノマーＤは、ＲＧＤドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を含み、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である。

ＲＧＤドメインはよく知られており、その名前が示すように、アミノ酸アルギニン、グリシン及びアスパラギン酸からなっている。このドメインは、種々の細胞タイプの細胞表面タンパク質によって認識され、細胞接着ドメインとして機能する。ＲＥＤＶドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）も良く知られており、その名前が示すように、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸及びバリンのアミノ酸でなり、細胞接着ドメインとして機能し、内皮細胞によって認識される。ヘパリン結合ドメインは、細胞表面グリコサミノグリカン結合ドメインであるので、細胞結合ドメインとして機能する。同様にして、糖結合ドメインは、膜糖タンパク質を有する糖類により細胞に結合することができる。レクチン及びアグルチニンは、よく知られた糖結合ドメインを有している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８は、ラミニン中に存在し、種々の細胞タイプによって認識され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９は、神経突起、言い換えれば、樹状突起又は軸索のいずれかの神経細胞の細胞体の膨張によって認識される。本発明のバイオポリマーの一部であるこれらのシークエンスは、それぞれの細胞タイプによって認識され、その結合を促進する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含むバイオポリマーは、組織発生に使用することができる。

さらに、本発明のバイオポリマーは、必要に応じて、追加のモノマー、その５’末端に結合することができ、かつ開始ヌクレオチドシークエンスの転写の結果であるモノマーＡを含んでいてよい。このように、モノマーＡは、ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤＮＯ：１の転写の結果であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含むことができる。

本発明のバイオポリマーを生じさせる記載された構造に従ってモノマーを形成するアミノ酸シークエンス（アミノ酸シークエンスに関し、“ペプチド”という用語が交換可能に使用できる）は、本発明のバイオポリマーの性質をもつ構造を生じさせる共有結合又は任意の他のタイプの結合によって結合することができる。この結合は、限定するものではないが、水素結合、イオン対合、疎水性結合又は包接複合体の形成を含む群から選ばれる。

好ましい実施形態で、本発明のバイオポリマーの一部であるモノマーは、互いに直接、又はポリペプチドスペーサー又はリンカーと呼ばれる結合を容易にするシークエンスの手段で結合することができる。

したがって、本発明の目的に対して、“リンカー”又は“ポリペプチドスペーサー”という用語は、短いアミノ酸シークエンスを指し、好ましくは長さが２０までのアミノ酸、より好ましくは、長さが１５までのアミノ酸、より好ましくは長さが１０までのアミノ酸、さらには好ましくは、長さが５のアミノ酸であり、一般的に記載されている本発明のバイオポリマーを形成するモノマーＢ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、及び／又はＤのアミノ酸シークエンスの間、あるいは下記に示す式（Ｉ）又は（ＩＩ）に位置して、異なるモノマーの間に結合できる。

好ましくは、このポリペプチドスペーサーは、非構造化ドメインを生じさせるペプチドのような構造的にフレキシブルなペプチドである。事実上、構造的にフレキシブルなペプチドは、ペプチドスペーサーとして使用することができるが、このペプチドスペーサーの例は、限定するものではないが、例えば、Ｖａｌ、ＧＩｙ及び／又はＳｅｒのアミノ酸残基の繰り返し、又は他の任意の適切なアミノ酸残基の繰り返しを含むペプチドがある。

別の好ましい実施形態で、本発明の組成物は、バイオポリマーが構造（Ｉ）：［（Ｂ_ｂ－Ｃ_ｃ）－Ｚ_ｚ］_ｎ－Ｄ_ｄを有していることに特徴がある。
ここで、Ｂ、Ｃ、Ｄは上述のモノマーであり、
Ｚは、上で定義したモノマーＸとＹから選択され、
ｂは、５と１５の間の値であり、
ｃは、５０と７０の間の値であり、
ｚは、１と５の間の値であり、
ｎは、１と５の間の値であり、
ｄは、０か３の間の値である。

本発明の組成物の別の好ましい実施形態で、より詳しくは、組成物は、構造（Ｉ）のバイオポリマーを含み、モノマーＺがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。

本発明の組成物の別の好ましい実施形態で、より詳しくは、組成物は、構造（Ｉ）を有するバイオポリマーを含み、モノマーＺがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。

より好ましい実施形態で、本発明の組成物は、構造（Ｉ）のバイオポリマーを組み合わせて含むことを特徴としている。この組み合わせは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のモノマーＺを組成物中に少なくとも２０重量％、好ましくは２０重量％と４０重量％の間、より好ましくは少なくとも４０重量％の濃度で含む第１のバイオポリマーと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４モノマーＺを、組成物中に少なくとも６０重量％、好ましくは６０重量％と８０重量％の間の濃度で含む第２のバイオポリマーである。

本発明の組成物の別の好ましい実施形態で、組成物は、バイオポリマーが構造（ＩＩ）：Ｚ１_ｚ－［（Ｂ_ｂ－Ｃ_ｃ）－Ｚ２_ｚ］_ｎ－Ｄ_ｄを有していることに特徴がある。ここで、
Ｂ、Ｃ、Ｄが前に定義しており、
Ｚ１は、“ジッパー”構造モチーフを含むアミノ酸シークエンス、より好ましくは、モノマーＸ、さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含んでおり、
Ｚ２は、“シルク”構造モチーフを含むアミノ酸シークエンス、より好ましくは、モノマーＹ、さらに好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含んでおり、
ｂ、ｃ、ｚ、ｎ、及びｄは、既に定義している。

本発明の組成物の別の好ましい実施形態で、この組成物は、ｂが１０の値であり、ｃが６０の値であり、ｚが１の値であり、ｎが２の値であり、ｄが０又は１の値であることを特徴としている。

別の好ましい実施形態で、本発明の組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、又はそれらの組み合わせからなる群から選ばれる構造（Ｉ）をもったバイオポリマーを少なくとも１つ含む。

別の好ましい実施形態で、本発明の組成物は、（Ｉ）構造のバイオポリマーを組み合わせて含む。この組み合わせは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５の群から選ばれるシークエンス、より好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のシークエンスを含む第１のバイオポリマーと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の群から選ばれるシークエンス、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のシークエンスを含む第２のバイオポリマーである。

別のより好ましい実施形態で、本発明の組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のバイオポリマーを含む。

別の好ましい実施形態で、本発明の組成物は、さらに細胞、バイオ活性分子、活性成分又はその組み合わせを更に含むことができる。

表１は、本発明に記載した種々のバイオポリマーを、それぞれを含むモノマー及びそれぞれの構造と共に示している。

本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のバイオポリマーのアミノ酸シークエンスをコードしているヌクレオチドシークエンスを含む核酸に関するものである。

この核酸（以下、本発明の核酸）は、核酸シークエンス、その転写産物、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、同一アミノ酸シークエンスのコード（以下、本発明のアミノ酸シークエンス又は発明のアミノ酸シークエンス）を包含する。本発明のヌクレオチドシークエンスの縮退変異シークエンス、本発明のバイオポリマーと同じ特性を有するバイオポリマーである生成物も包含する。それらのＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部アミノ酸位置で、バイオポリマーの機能が本発明のヌクレオチドシークエンスから転写されたｍＲＮＡシークエンスの翻訳に起因する機能と同じになるように変形したアミノ酸シークエンスをコードしているヌクレオチドシークエンスもまた包含する。アミノ酸シークエンスは、本発明のアミノ酸シークエンスのいずれかを生じさせる任意のヌクレオチドシークエンスによってコードされる。遺伝コードが退化していれば、同じアミノ酸を異なるコドン（トリプレット）でコードすることができる。その目的で、同じアミノ酸シークエンスが、異なるヌクレオチドシークエンスによってコードされ得る。

既に述べたように、本発明のバイオポリマーに含まれるモノマーＢ、Ｃ、Ｘ、Ｙ及び／又はＤをコードするヌクレオチドシークエンスは、直接、又はポリペプチドスペーサー又はリンカーによって互いに結合されてよい。本発明の目的のために、本発明のバイオポリマーそれぞれに対するポリヌクレオチドシークエンスコードは、従ってリンカーを含んでいてよい。

好ましい実施形態で、本発明のバイオポリマーそれぞれをコードするヌクレオチドシークエンスは、以下から選択される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を含むバイオポリマー１をコードしている、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を含むバイオポリマー２をコードしている、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３を含むバイオポリマー３をコードしている、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４を含むバイオポリマー４をコードしている、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５を含むバイオポリマー５をコードしている、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を含むバイオポリマー６をコードしている。

本発明の核酸は、転写開始シークエンスとして役立つ５′末端に結合したヌクレオチドシークエンスを有することができる。このシークエンスは、限定するものではないが、ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であってもよい。これは、本発明の各バイオポリマーにおいてアミノ酸シークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０をコードしたものであり、バイオポリマーそれぞれの最終構造においてモノマーＡとも呼ばれる。同様に、本発明の核酸は、限定するものではないが、ＧＴＡＴＧＡシークエンスのような３′末端に結合した転写終結シークエンスを有することができる。

本発明の組成物の一部であるバイオポリマーのアミノ酸シークエンスをコードしているヌクレオチドシークエンスは、発現ベクターに挿入される。従って、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含む発現ベクターに関するものである。

本発明の目的のために、“発現ベクター”という用語は、あるホストに複製する能力を有するＤＮＡ断片であり、この用語が示すように、融合（挿入）された別のＤＮＡ断片を掛け合わせる手段として作用してもよい。挿入は、ベクターに融合されたＤＮＡ断片を指す。すなわち、本発明の場合には、このベクターは、本発明の任意のバイオポリマーをコードするヌクレオチドシークエンスのいずれかを含み、融合されて適切なホスト中で複製することができる。ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスベクターであり、与えられたベクターの定義に対応する別タイプのベクターを排除するものではない。

先の項で定義した細胞のトランスフェクションは、公知の技術で行われ、例えば、限定するものではないが、エレクトロポレーション、バイオリスティクス、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス、又はゲノム、クロロプラスチック又はミトコンドリアのいずれかのホスト細胞のＤＮＡにおける本発明の核酸の統合を可能にする他の任意の技術で行われる。

本発明の細胞中の核酸の発現は、上で議論したように、公知の技術によって精製することができるバイオポリマーを生じさせる。

本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様の核酸にトランスフェクトされた単離細胞に関するものである。

本発明において理解される“細胞”という用語は、原核細胞又は真核細胞を指している。この細胞は、例えばエシェリキア・コリの任意の変異種などトランスフォームされた外来ＤＮＡを複製することができる細菌、あるいは例えばアグロバクテリウム・トゥメファシアンのような目的とするＤＮＡを植物に移すことができる細菌であることができる。好ましくは、細胞は植物真核細胞、この群の中で、より好ましくは、植物界に属する細胞である。従って、細胞が植物細胞であるならば、この用語は、少なくとも柔組織の細胞、分裂組織的細胞又は任意のタイプの細胞で、分化又は未分化のものである。同様に、プロトプラスト（細胞壁を欠いた植物細胞）もこの定義に包含される。

用語“トランスフェクション”は、プラスミド、ウイルスベクター（この場合、“トランスダクション”も挙げることができる）、又はその他のトランスファー手段によって細胞に外部遺伝物質を導入することである。非ウイルス性方法のトランスフェクションという用語は、哺乳類の真核細胞を参照して使用されが、細菌及び真菌、藻類又は植物などの非動物の真核細胞への遺伝物質の非ウイルス転移を記述するためには、トランスフォーメーションという用語が好ましい。

シークエンスが確立されると、本発明の組成物を含むバイオポリマーは、均質化と精製プロセスなど追加の処理が対象となる。これらは、広く公知であり、所望の細胞適合性レベルにして、細胞又はその他のバイオ活性分子及び／又は種々の診断活性を有する成分と組み合わせての使用、さらに、例えば、藻類、ゼラチン、アガロースヒアルロン酸、キトサン、細胞外マトリックス、ＤＮＡペプチド、及びコラーゲン、シルクフィブロイン、及びフィブリンなどの構造タンパク質などの天然バイオインクと、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、プルロン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及びポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）などの合成バイオインクなどがバイオインクとして使用される組成物と組み合わせての使用もできるようになる。

同様に、これらは、種々の機械的、酵素的及び／又は化学的ステップで処理して、形態学的及び物理的特性の両方で所望のポリマー特性を得ることができる。本発明に記載した組成物によって形成されたバイオインクを、アミノ酸組成分析、物理的特性評価、又はレオロジー分析などいくつかの特性評価プロセスを行い、完全な条件で使用できるようにする。

本発明の第４の態様は、本発明の組成物をバイオインク、好ましくは３Ｄプリンティング用のバイオインクとしての使用に関するものである。

本発明の第５の態様は、本発明に記載した組成物を含むバイオインクに関するものである。

本発明の目的のために 、バイオインクは、無菌の成分を用いて調製され、常に無菌条件下で使用できるようにする。記載したバイオインクを形成するためにデザインされた種々のバイオポリマーは、細胞と一緒に、又は細胞なしでプリントすることができ、また、脱細胞化組織及び器官から調製された材料のような他のバイオインクのサポートとしても使用することができる。

本発明の第６の態様は、本発明の組成物を含む３Ｄバイオマテリアルに関するものである。

ここに記載した実施形態で、本発明に記載した組成物、バイオインク及びバイオマテリアルは、さらに、治療剤（例えば、生物学的活性剤）及び生物学的試料を含む所望の目的に適した１つ以上の薬剤（例えば、賦形剤、添加剤、活性成分、生物学的活性剤など）を含むことができる。典型的には、このような薬剤を加えることは、組成物、バイオインク又はバイオマテリアルを“機能化”すると言い、付加的な機能性を提供する。

本発明の組成物、バイオインク及びバイオマテリアルの機能化のために加えるに適した上記薬剤の限定しない例は、これらに限定するものではないが、導電性又は金属粒子、無機粒子、染料／顔料；薬物又は有効成分（例えば、抗生物質、低分子又は低分子有機化合物）、タンパク質及びその断片又は複合体（例えば、酵素、抗原、抗体及び抗原結合断片）、細胞及びその分画（ウイルス及びウイルス粒子、細菌等の原核生物細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞、菌類）がある。

ここに使用したように、“生物学的活性剤”という用語は、少なくとも１つのインビトロ又はインビボ生物学的効果のある任意の分子を指している。例えば、生物学的活性剤は、被験体の疾患状態又は状態を治療又は予防するための治療薬である。生物学的活性剤は、限定するものではないが、有機分子、無機物質、タンパク質、ペプチド、核酸（例えば、遺伝子、遺伝子断片、遺伝子調節シークエンス及びアンチセンス分子）、ヌクレオタンパク質、多糖類、糖タンパク質及びリポタンパク質がある。ここに記載した組成物に配合できる生物学的に活性な化合物は、限定するものではないが、抗癌剤、抗生物質、鎮痛薬、抗炎症剤、免疫抑制剤、酵素阻害剤、抗ヒスタミン薬、抗けいれん薬、ホルモン、筋弛緩剤、鎮痙剤、眼科薬、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病薬、栄養因子、骨誘導性タンパク質、増殖因子及びワクチンがある。

本発明の１実施形態で、添加剤は治療剤である。ここに使用する用語“治療剤”は、分子、分子群、診断・治療・予防の医薬目的又は獣医学的目的のために生体に投与される複合体又は物質を意味する。ここに使用しているように、“治療薬”という用語は、“薬物”又は“ワクチン”を含む。この用語はまた、詳しくは、治療効果を生み出す核酸及び核酸を含む化合物であることができる。

“治療剤”という用語は、それが適用される生物学的システムにおいて局所的又は全身的な生物学的、生理学的又は治療的効果を提供することができる薬剤も包含する。例えば、治療剤は、他の機能の中にあって、感染又は炎症を抑え、細胞の成長と組織再生を増強し、腫瘍の成長を抑え、鎮痛薬として作用し、抗細胞結合及び骨成長を促進するために作用することができる。その他適した治療剤としては、抗ウイルス剤、ホルモン剤、抗体、又は治療用タンパク質が挙げられる。その他の治療薬は、投与された時に生物学的に活性ではないが、被験体に投与された後、代謝又はその他の機構を通じて生物学的に活性な薬剤に変換される薬剤であるプロドラッグが挙げられる。さらに、シルクベースの薬物送達組成物は、１つの治療薬又は２つ以上の治療薬の組み合わせを含有していてもよい。

本発明の１実施形態で、この薬剤は、組織形成、及び／又は自然組織治癒及び再増殖、及びそれらの任意の組み合わせを刺激する。注入部位で新しい組織形成を増加させる、及び／又は天然組織治癒又は再増殖を刺激する薬剤は、成長因子（線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、骨形成タンパク質を含む骨形成因子、ヘパリン、アンジオテンシンＩＩ（Ａ－ＩＩ）及びそれらの断片は、インスリン様成長因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、神経成長因子、インターフェロン、増殖因子などの生物学的活性類似体、断片及び誘導体因子、及びそれらの任意の組み合わせ、が挙げられる。

本発明の１実施形態で、この薬剤は創傷治癒剤である。ここで使用しているように、“創傷治癒剤”は、創傷治癒プロセスを積極的に促進する化合物又は組成物である。

本発明の１実施形態で、ここに記載した活性剤は免疫原である。１つの実施形態で、免疫原はワクチンである。

本発明の１実施形態で、この薬剤は細胞、例えば、生物学的細胞であることができる。組成物中に配合するために有用な細胞は、例えば、哺乳類、昆虫、植物等の任意の供給源から得ることができる。別の実施形態で、細胞は、ヒト細胞、霊長類細胞、哺乳類細胞、げっ歯類細胞などであり、好ましくはヒト細胞であることができる。別の実施形態で、細胞は、遺伝子組み換え細胞であることができる。細胞は、遺伝子的に改変して、例えば、バイオ活性剤、増殖因子、分化因子、サイトカインなど所望の化合物を発現及び分泌するようにしてよい。目的の化合物を発現及び分泌するように細胞を遺伝的に改変する方法は、当該分野において知られており、当業者によって容易に適応することができる。

本発明の１実施形態で、本発明の組成物、バイオインク及びバイオマテリアルは、色素又は染料又はそれらの組み合わせたような着色剤であることができる。色素と着色剤は、有機及び／又は無機であり、蛍光物質などであってもよい。

従って、上述の観点から、本発明の別の態様は、ここに薬物として使用するように記載した組成物、バイオインク、及びバイオマテリアルに関するものである。

本発明の別の態様は、組織再生に使用する、ならびに疾患モデルとして用い、又は新しい治療及び／又は予防する化合物の検査するために欠陥がある組織模倣症状を発生するに使用して動物モデルを避ける組成物、バイオインク、及びバイオマテリアルに関するものである。

本発明の別の態様は、以下のステップを含む本発明の組成物を得る方法に関するものである。
（ａ）本発明の第３の態様の細胞を、本発明の第２の態様の核酸の発現に適した条件下で培養する。
（ｂ）この核酸によりコードされたバイオポリマーを精製する。

多機能デザインニーズによって導入される組成の複雑さの度合は、標準的な高分子合成技術では達成できない。このバイオポリマーは、適応された分子及びバイオ技術生物学技術の手段で、遺伝子的に改変した微生物又は植物における組換えタンパク質として得られる。

本発明のバイオポリマーのアミノ酸シークエンスをコードするヌクレオチドシークエンスは、上記で定義した発現ベクターに挿入される。

先の項で定義した細胞のトランスフェクションは、公知の技術で行われ、例えば、限定するものではないが、エレクトロポレーション、バイオリスティクス、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス、又は本発明の核酸のいずれかを、ゲノム、葉緑体又はミトコンドリアのホスト細胞のＤＮＡに統合を可能にする任意のその他技術で行われる。

本発明の細胞での核酸の発現は、公知の手段で精製できるバイオポリマーを生じさせる。

明細書及び請求の範囲を通して、“含む”及びその変形は、他の技術的動態、添加剤、成分又はステップを除外する意図はない。当業者にとっては、他の目的、本発明の利点及び特徴は、本発明の説明及び実施形態の両方から部分的に推測され得る。以下の実施例及び図面は、例として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。

本発明を、以下に、発明者によって行った評価によって、本発明の組成物の合成、ならびにその特徴を説明する。実施例は、説明を理解する目的で提供されるものであり、本発明を限定するものではない。

〔実施例１〕 本発明の組成物を形成する組換えタンパク質バイオポリマーの取得及び特性評価：
本発明組成物のバイオポリマーを含み、用いた種々のバイオポリマーのアミノ酸シークエンスをコードする合成ヌクレオチドシークエンスのデザイン及び取得は、ＷＯ／２０１０／０９２２２４に記載に従って行った。同様に、バイオポリマーの発現、精製及び特性評価は、ＷＯ／２０１０／０９２２２４に記載に従って行った。

簡単に言えば、ＥＬＲは、組換えＤＮＡ技術によってデザインされ、生産される。所望のタンパク質のヌクレオチドシークエンスコードを大腸菌に導入すると、この菌株は発酵槽内で培養し、生産条件の絶対的なコントロールが可能となる。細菌培養成長曲線が停止期に達すると、所望のＥＬＲを、細菌壁の超音波溶解によって抽出する。バイオポリマーの精製は、その逆温度転移性を用いて行い、純粋なポリマーを得るまで細菌の破片を加熱及び冷却サイクルを行う。

透析による塩除去プロセスの後、使用する全てのバイオポリマーを凍結乾燥する。白色綿状の外観を示し、使用するまで－２０℃の状態に置く。
得られたバイオポリマーの特性評価は、以下の技術を用いる。
－ ＳＤＳ存在下のアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）：バイオポリマーの分子量を概略推測でき、さらに純度も評価できる。
－ Ｑ－Ｓｔａｒ分光計でのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析：ポリマーの分子量を正確に得る。
－ Ｂｒｕｋｅｒ・ＡＲＸ３００分光計でのプロトン核磁気共鳴（^１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル。
－ Ｃａｒｙ５０分光光度計を使用するフーリエ変換赤外分光（ＦＴ－ＩＲ）スペクトル。
－ ＷＡＴＥＲＳ２４８７検出器を備えたＷＡＴＥＲＳ６００ＨＰＬＣ勾配システムを用いたＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣクロマトグラフィー：アミノ酸組成を決定できる。
－ Ｍｅｔｔｌｅｒ・Ｔｏｌｅｄｏ８２２ｅＤＳＣ装置での５０ｍｇ／ｍｌ濃度の材料水溶液の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：ポリマーの逆転移温度が得られる。

本発明の組成物の有効性を示すために、詳しくはバイオインクとして使用するために、以下のバイオポリマーをデザインし（表２）、バイオインクとして使用するためにどれが最適組成物を決定する。

・バイオポリマー１（１１０７アミノ酸）；
構造：（Ａ）－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）｝_２－Ｄ．
アミノ酸シークエンス：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：ＭＥＳＬＬＰ－｛［ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０｝_２－（［ＶＰＧＩＧ］_５ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ）_６－Ｖ
ヌクレオチドシークエンス ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１によってコードした。
理論的アミノ酸組成と、ＵＶ（紫外線）検出を備えたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成とを表３に示す。

生成収量は２２７．６５ｍｇ／ｌであった。
バイオポリマー１の理論分子量は９３１７５Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図１）及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により実験的に推定した分子量は９２８９７Ｄａであった。
バイオポリマー１について得られたＨＰＬＣ、赤外吸収（ＩＲ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルをそれぞれ図２、３、４に示す。
ｐＨ７．８のＭＱ中でＤＳＣ測定により得られた転移温度は１９．１０℃であり、一方、ｐＨ７．６５の１ｘＰＢＳ中では１４．６６℃であった。

・バイオポリマー２（１２３３アミノ酸）：
構造：（Ａ）－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）－Ｙ｝_２
アミノ酸のシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：ＭＥＳＬＬＰ－｛（［（ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０）－［Ｖ（ＧＡＧＡＧＳ）_５Ｇ］_２｝_２
ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２によってコードした。

理論的アミノ酸組成とＵＶ（紫外線）検出を備えたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成物とを表４に示す。

生成収量は１７８．９ｍｇ／ｌであった。
ポリマー２の理論分子量は１０１６９６Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図５）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（図６）により実験的に推定した分子量は１０１６６４Ｄａであった。
バイオポリマー２に対して得られたＩＲとＮＭＲスペクトルをそれぞれ図７及び８に示す。
ｐＨ６．１４のＭＱ中でのＤＳＣ測定により得られた転移温度は２０．０８℃であり、一方、ｐＨ６．４０の１ｘＰＢＳ中では１６．９２℃であった。

・バイオポリマー３（１２１３アミノ酸）：
構造：（Ａ）－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）－Ｘ｝_２
アミノ酸シークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：ＭＥＳＬＬＰ－｛［ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０－［ＶＧＧＧＧＧＫＥＮＱＩＡＩＲＡＳＦＬＥＫＥＮＳＡＬＲＱＥＶＡＤＬＲＫＥＬＧＫＣＫＮＩＬＡＫＹＥＡＧＧＧＧＧ］｝_２
ヌクルエオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３によってコードした。

理論的アミノ酸組成物と、ＵＶ（紫外線）検出器を備えたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成とを表５に示す。

生成収率は５１７．２２ｍｇ／ｌであった。
ポリマーＦの理論分子量は１０４１１９Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図９）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（図１０）により実験的に推定した分子量は１０３７９３Ｄａであった。
バイオポリマー３のＩＲ及びＮＭＲスペクトルを図１１と１２に示す。
ｐＨ７．５のＭＱ中でのＤＳＣ測定により得られた転移温度は１５．３０℃であり、一方、ｐＨ７．５の１ｘＰＢＳ中では１４．１８℃であった。

・バイオポリマー４（１４３５アミノ酸）：
構造：（Ａ）－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）－Ｘ｝_２－Ｄ
アミノ酸シークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：ＭＥＳＬＬＰ－｛［ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０－［ＶＧＧＧＧＧＫＥＮＱＩＡＩＲＡＳＦＬＥＫＥＮＳＡＬＲＱＥＶＡＤＬＲＫＥＬＧＫＣＫＮＩＬＡＫＹＥＡＧＧＧＧＧ］｝_２－（［ＶＰＧＩＧ］_５ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ）_６－Ｖ
ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４でコードした。

理論アミノ酸組成と、ＵＶ（紫外線）検出を用いたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成とを表６に示す。

生成収率は２３９．８１ｍｇ／ｌであった。
バイオポリマー４の理論分子量は１２３３４５Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図１３）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（図１４）により実験的に推定した分子量は１２２８８２Ｄａであった。
バイオポリマー４に対して得られたＩＲとＮＭＲスペクトルのそれぞれを図１５及び１６に示す。
ｐＨ６．４８のＭＱ中でのＤＳＣ測定により得られた転移温度は１７．５８℃であり、ｐＨ６．０２の１ｘＰＢＳでは１４．９２℃であった。

・バイオポリマー５（１４５５アミノ酸）：
構造：（Ａ）－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）－Ｙ｝_２－Ｄ
アミノ酸シークエンスＩＤ ＮＯ：１５：ＭＥＳＬＬＰ－｛（［（ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０）－［Ｖ（ＧＡＧＡＧＳ）_５Ｇ］_２｝_２－（［ＶＰＧＩＧ］_５ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ）_６－Ｖ
ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５でコードした。

理論アミノ酸組成と、ＵＶ（紫外線）検出を用いたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成とを表７に示す。

生成収率は２０３．０７ｍｇ／ｌであった。
バイオポリマー３の理論分子量は１２０９２１Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図１７）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法（図１８）により実験的に推定した分子量は１２０６１１Ｄａであった。
バイオポリマー２に対しのＩＲ及びＮＭＲスペクトルをそれぞれ図１９及び２０に示す。
ｐＨ６．５９でＭＱ中でのＤＳＣ測定により得られた転移温度は２０．８４℃であり、ｐＨ７．２４で１ｘＰＢＳでは１７．２６℃であった

・バイオポリマー６（１５０８アミノ酸）：
構造：（Ａ）－Ｘ－｛（Ｂ_１０－Ｃ_６０）－Ｙ｝_２－Ｄ
アミノ酸シークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：ＭＥＳＬＬＰ－［ＶＧＧＧＧＧＫＥＮＱＩＡＩＲＡＳＦＬＥＫＥＮＳＡＬＲＱＥＶＡＤＬＲＫＥＬＧＫＣＫＮＩＬＡＫＹＥＡＧＧＧＧＧ］－｛（［（ＶＰＧＶＧ）_２－（ＶＰＧＥＧ）－（ＶＰＧＶＧ）_２］_１０［ＶＧＩＰＧ］_６０）－［Ｖ（ＧＡＧＡＧＳ）_５Ｇ］_２｝_２－（［ＶＰＧＩＧ］_５ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳ）_６－Ｖ
ヌクレオチドシークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６でコードした。

理論アミノ酸組成と、ＵＶ（紫外線）検出を用いたＨＰＬＣで得られたアミノ酸組成とを表８に示す。

生成収率は１１６ｍｇ／ｌであった。
バイオポリマー６の理論分子量は１２６３９３Ｄａであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（図２１）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法（図２２）により実験的に推定した分子量は１２５８５７Ｄａであった。
バイオポリマー６に対してのＩＲ及びＮＭＲスペクトルをそれぞれ図２３及び２４に示す。
ｐＨ７．５０でＭＱ中でのＤＳＣ測定により得られた転移温度２０．４２℃であり、ｐＨ７．５０で１ｘＰＢＳでは１７．４１℃であった。

〔実施例２〕 最適なプリントを可能にする本発明バイオインク組成の決定：
表２に記した種々のバイオポリマー、又はこれらの混合物を用いた３Ｄプリンティングは、それらの各々の逆転移温度を考慮して行われる。この転移温度は、本発明のバイオポリマー組成物の特定の性状と共に、単純な温度変化によって潜在的にバイオインクをゲル化させる。

用いた実験システムは、ＲＥＧＥＭＡＴ・３Ｄプリンタを含み、その頭部を冷却浴に接続して噴射温度を４℃に保った。さらに、このプリンタは、プリントプロセスを行っている間加熱ベッドを３０℃に保った。

バイオポリマー１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の場合には、ゲル化は、そのブロックＣ（疎水性）とＢ（親水性）の間に存在する疎水性分子間力によるものである。ブロックＤは、詳しくはそのシークエンスに追加で導入したペプチドＲＧＤを含み、ゲル形成に影響を与えないが、導入したことでバイオポリマーにバイオ機能を与えている。このバイオポリマー１は、モノマーＸ、モノマーＹ、又はその両方のいずれも含んでいないことを考え、バイオプリンティングのネガティブコントロールとして使用される。

ベースモノマーＣ（疎水性）及びＢ（親水性）を、他のモノマーＸ及び／又はＹと一緒に含むその他のバイオポリマー２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、４（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１４）、５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）及び６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）も、これらの疎水性相互作用も示している。これらは全て、さらに、実施例に示すように、詳しくは、細胞接着ができるバイオ機能をもつバイオポリマーを与えるペプチドＲＧＤを含むブロックＤを含む。

バイオポリマー４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）及び３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）は、ジッパーシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含み、荷電アミノ酸間の静電的相互作用でαヘリックスを形成にしてポリマーの安定性に寄与している。バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）及び２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）は、同じ疎水性相互作用を示すが、この場合、そのアミノ酸中のアミドとカルボキシル基の間に水素結合を形成することによりシルクシークエンス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）に由来するβシートを形成し、その結果として安定化している。

バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）の特定の場合、このバイオポリマーに前硬化処理を施したとき（以下、前硬化型バイオポリマー５とする）又は前記処理を施していないとき（これは、そのままバイオポリマー５とする）のゲル化を比較した。前硬化処理を行うことで、バイオポリマー５の分子レベルでの構造変化により、機械的特性に影響を与えるβシートの形成度合が異なっているかもしれない。バイオポリマー５を製造及び精製している間に、水素結合でβシートを形成している。この架橋は、バイオポリマーの異なるバッチ間で同じでなく、初期架橋が異なるバッチを生成する。前硬化処理で水素結合を破壊すると、全てのバッチでβシートの初期形成状態が同じになる。

前硬化処理を行うために、先ず、バイオポリマーをギ酸を用いて分子間力を断って均質化して、βシートのない状態から始める。この状態にした後、このバイオポリマーを３７℃で２４時間硬化させ、βシートを形成していく。このプロセスを、このポリマーの全てのバッチで同じ初期状態にして、プリントに適すると期待できる前ゲル化状態から始める。

バイオポリマー４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）と混合したバイオポリマー１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）と、前硬化バイオポリマー５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と混合したバイオポリマー１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を、プリンティングのネガティブコントロールとする。これらのプリンティングは、両方の強化シークエンスを含む混合物のみ最適なプリンティングが得られることを示している（図２６）。

さらに、ポリマー４と前硬化ポリマー５の混合物が、モノマーＸとＹが同じバイオポリマー中に存在するとき、同じ様に動作するかどうかを確認する目的で、バイオポリマー６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を合成した。このバイオポリマー６は、ジッパーシークエンスとシルクシークエンスに由来した初期の疎水性相互作用と、静電的及び水素結合の相互作用の両方を有している。

バイオポリマー１、４、５、前硬化バイオポリマー５及びバイオポリマー６含む組成物を単独で、又は組み合わせて、種々のプリント操作を行った。この目的のために、ＲＥＧＥＭＡＴ・３Ｄプリンタソフトウェアによって、高さが１．３０ｍｍ（６層の高さに相当）、そして９０°の角度で並んだ空隙１．５ｍｍの１０×１０ｍｍ格子をデザインした。本発明のバイオポリマーの種々の組成物を、０．２５ｍｍノズルから０．０６ｍｍ／秒で流動させて注入する。この流動は、必要ならば、それぞれのケースで構造が互いに良く比較できるように同じ幅のラインを作るに適用している。

１ｘＰＢＳで異なる濃度（１２０、１５０、１８０、２００、２５０、３００ｍｇ／ｍｌ）に溶解した前硬化バイオポリマー５のプリントから、最適プリント濃度は、図２５に見られるように、２５０ｍｇ／ｍｌと推定され、この濃度は、溶液の粘度が３Ｄプリンタによる“注入”プロセスに適した濃度であると考えられる。それ故、種々のプリント操作を比較するために、２５０ｍｇ／ｍｌの濃度を選んでいる。バイオポリマー４の場合、図２５でも観察されるように、３Ｄプリンタでの注入プロセスに適した濃度は、２５０ｍｇ／ｍｌである。

デザインした格子のプリントは、プリンタ適性を測定することによって本発明の種々のバイオポリマーのプリンタ適性を半定量化できる。これは、デザインされた構造に対してプリントされた構造が有する類似性に関する知見を与える。この場合、正方形空隙がデザインされ、プリントされ、したがって、これらの正方形に対してプリント操作の類似度を測定するパラメータ（Ｐｒ）が確立される。

良好なプリンタ適性を有するバイオインクは、一定の形態を有するフィラメントを押し出してデポジットさせ、互いに融合することなく高くデポジットすることができなければならない。バイオインクのプリンタ適性が低い場合には、これが起きず、フィラメントが崩壊して互いに融合し易く、空隙が円形になりがちである。

円形度は、次のように定義される。

ここで、Ｌは周囲を、Ａは面積である。得られた値が１に近いほど、円形度が大きく、１で完全な円になる。正方形の場合、円形度はπ／４となるが、正方形形状に基づくパラメータＰｒは次のように定義できる。

理想的なプリンタ適性は、互いに接続した空隙が正方形になり、Ｐｒ値は１になる。

パラメータＰｒの決定は、ＬＥＩＣＡ・ＤＭＳ１０００デジタル顕微鏡で写真を撮り、撮影した光学画像をイメージＪソフトウェア（ｎ＝５）で分析して行った（図２６）。

評価サンプルに対するこのパラメータの結果を表９にまとめる。

バイオインクのプリンタ適性を決める別のパラメータは、この場合、定性的ではあるが、フィブリルの観察である。言い換えると、もしポリマーのデポジットが一層ずつデポジットし、そのデポジットしたファイバを観察するのであれば、これらのファイバが互いに融合して形状の精度が下るまえに、構造が崩壊してしまうことになるだろう。

図２６は、プリントした写真である。Ｐｒパラメータを測定した後、Ｐｒ値０．９０とした後、ファイバがデポジットする時互いに混り合わず、フィブリル構造を高く保持することができるコントロールされた方法でプリント操作を行う。

図２６で観察されるように、バイオポリマー１は、プリント後にゲル化せず、したがってその構造を保持しない。この挙動は、このポリマーが形成されたゲルを安定化するモノマーＸ及び／又はＹを含んでいないことを考えると、想定通りである。

バイオポリマー１と異なり、バイオポリマーがモノマーＸ及び／又はＹを有するとき、この場合にはバイオポリマー４、５及び前硬化バイオポリマー５は、同様にしてプリントが行えた。バイオポリマー５は、そのプリントはできるが、プリントされた構造は、そのプリンタ適性を測定できない程に急速に崩壊する。

これに対し、前硬化ポリマー５は、プリント精度が高いにもかかわらず、ファイバの非線状デポジットに過剰ゲル化が観察される。従って、温度変化によってサンプルがゲル化したことは、このシステムに対して良好なバイオインクとなり、デザインされた構造に真に似た構造のプリント面を得ると期待した程に充分な条件でない。ゲル化に伴う現象と、ゲル化前後の材料の機械的特性の変化は、決定ファクターであり、バイオインクとしてどの材料が適しているかを予測できず、不十分である可能性がある。

最後に、バイオポリマー４は、Ｐｒ値０．９４で信頼できる構造を示す（図２６）。

前硬化ポリマー５がポリマー５よりも高いプリンタ適性パラメータであることを踏まえて、モノマーＸとＹの相乗効果を実証するために、前硬化ポリマー５をモノマーＹのキャリヤーとして選び、以下の混合物をプリントする：
バイオポリマー４（重量％８０％）＋前硬化バイオポリマー５（２０重量％）；バイオポリマー４（重量％６０％）＋前硬化バイオポリマー５（重量４０％）及びバイオポリマー４（重量％２０％）＋前硬化バイオポリマー５（８０重量％）；バイオポリマー４（重量６０％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の割合のプリントは、プリントされた混合物で最高のＰｒ値を示し、故にこの混合物は３Ｄプリンティングに最適と考えることができる。前硬化バイオポリマー５の割合が高いときに最も低い値が得られる。

さらに、バイオポリマー４（重量６０％）＋バイオポリマー５（４０重量％）の混合物のプリントは、このタイプのポリマーのプリント混合物が最適である場合、バイオポリマー５が前硬化していないならばプリンタ適性が下がり、より良好な構造精度を得るならば、前硬化バイオポリマー５を使用する必要がある、ということが観察できる。

モノマーＸとＹの相乗効果を確認するために、バイオポリマー５（４０重量％）＋バイオポリマー１（６０重量％）及びバイオポリマー４（６０重量％）＋バイオポリマー１（４０重量％）を含む混合物でなる混合物もプリントする。この混合物は、プリンタ適性が悪く、良好なプリンタ適性を得るには、モノマーＸ及びＹを含むバイオポリマーの混合物が必要であることが確認できる。

最後に、バイオポリマー６のプリントは、非常に良好な形状精度を示し、ファイバの析出が完全に重なり合っていないことが観察される。このポリマーに対して、０．９７に対応する最高のプリンタ適性値が得られている。このポリマーについて得られたＰｒ値は、バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）を含む混合物のＰｒ値とあまり変わらないが、デポジットファイバをより良好にコントロールしてデポジットし易いプリントであることが観察される。

〔実施例３〕 本発明組成物の機械的特性：
バイオインクとして使用すべく本発明の組成物をレオロジー分析し、機械的特性を分析した。プリンタ適性がより大きいことを示したこれら組成物は、バイオポリマー４、バイオポリマー６、前硬化バイオポリマー５及びバイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）を含む組成物に対応して選んでいる。

レオロジー研究は、ペルチェプレートを備えたＴＡ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ・ＡＲ２００ＥＸレオメーターを用い、直径４０ｍｍの形状で行う。分析した組成物は全て評価している間は４℃に保つ。

第１の特性評価は、剪断速度を増加させたとき、バイオインクとして使用する本発明の組成物が受ける粘度変動の研究に基づいている（図２７）。バイオポリマー４と、バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）を含む混合物の両方とも、剪断速度が上昇したとき粘度の低下を示さない。それ故、比較的低い粘度（約１Ｐａ．ｓ）を示すニュートン流体のように挙動している。低粘度ニュートン流体のような挙動をしているという事は、制御されたデポジットが低剪断応力となり、従って、この組成物に存在する細胞を保護している。また、前硬化バイオポリマー５により形成された組成物は、剪断応力が増加すると粘度が低下し、１０Ｐａｓの粘度から始まり、バイオインクが高い剪断速度を受けると１Ｐａｓの粘度で安定化する。バイオインクのこの挙動は、擬塑性流体と記される動作と類似している。

さらに、バイオポリマー６を含む組成物は、粘塑性（又はビンガム塑性）の挙動を有し、２４８．６１／ｓに相当する臨界変形応力に達するまで２．３５Ｐａ．ｓの粘度を示し、その後粘度が１．４１Ｐａ．ｓに達する迄僅かに低下し始める。

モノマーＹ含む組成物は、バイオインクで擬塑性挙動を示していると結論することができる。バイオポリマー６の場合、この挙動は、遅延があり、臨界変形応力を超えると観察できるようになる。この挙動は、粘塑性又はビンガム塑性の挙動を示す塑性に対応する。

本発明の組成物がプリンタでバイオインクとして使用される際に受ける注入プロセスをシミュレートするため、チキソトロピー分析を行った。この分析は、バイオポリマーに短時間の高剪断速度を与え、バイオインクがプリントプロセスで非常に小さい径の針を通過する際に受ける力を映し出そうとすることから成っている。

上記の組成物のチキソトロピー分析で得られた結果は、注入プロセスをシミュレートするとき粘度にばらつきがないことを明確に示しており、言い換えれば、分析した組成物のいずれも、短期間に高剪断応力を受けた場合には粘度は変化していない（図２８）。

次に、温度上昇が生じたときの粘度変動を分析した。この分析は、プリントベッドを予め加熱してバイオインクの粘度を高くする、したがってプリント解像度を上げる理想的な温度を決定する。

この結果は、温度を上げていくと、分析した組成物のポリマー粘度が増加していき、１８～２２℃の範囲で組成物それぞれに依る最大値に達し、その後、温度が上昇し続けるにつれて粘度が徐々に低下している（図２９）。バイオインク組成物毎に最大粘度は異なり、その最大値は異なる温度で達する。すなわち、図２９で観察されるように、バイオポリマー４を含む組成物は１５．０℃の温度で２１２．５Ｐａ．ｓの粘度を有し、前硬化したバイオポリマー５を含む組成物は１８．４℃の温度で９０．９Ｐａ．ｓの粘度を有し、バイオポリマー６を含む組成物は２１．７℃の温度で３７１Ｐａ．ｓの粘度を有し、そして、バイオポリマー（６０重量％）＋前硬化したバイオポリマー５（４０重量％）の混合物を含む組成物は１９．５℃の温度で２４２．６Ｐａ．ｓの粘度を有する。

この結果を考慮すると、試験したバイオインクによって達成される最大粘度とそれらのプリンタ適性との間に相関関係がある。そこで、低いプリンタ適性を示すバイオインク（バイオポリマー４及び前硬化バイオポリマー５それぞれを含むバイオインク）は、より高いプリンタ適性を有するバイオインク（バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（重量４０％）の混合物を含むバイオインク、及びバイオポリマー６を含むバイオインク）よりも低い最大粘度に達する。これは、バイオインクの粘度が高いほど、プリント精度が高くなることより説明される。

同様に、全てのバイオインクには、粘度が徐々に増加し始める臨界温度があること、そしてその臨界温度は、バイオポリマー４を含むバイオインクとバイオポリマー４（６０％重量）＋前硬化バイオポリマー５（４０％重量）の混合物を含むバイオインクでは８．５℃、バイオポリマー５又はバイオポリマー６では１１℃であると観察された。この臨界点は、低粘度でプリントするために、バイオインクを貯槽内でこの温度以下に保たなければならないことを示している。

〔実施例４〕 バイオインクの流体安定性；
次に、本発明に記載した組成物の選ばれた流体中での安定性を、本実施例の場合に１ｘＰＢＳ中で分析した。本発明に記載した組成物でプリントされた構造がインビトロ培養、又は組織モデルに使用されるであろうことから、その構造は、長期間水性媒体中で安定した状態に保たれねばならない。この例では、シリンダーは、直径６ｍｍ、高さ１．５ｃｍであり、プリント操作は、直径０．２５ｍｍのノズルを通して行った。評価した組成物は、バイオポリマー４、前硬化バイオポリマー５、バイオポリマー６、又はバイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（重量４０％）の混合物を含む組成物であった。

１ｘＰＢＳ中２５０ｍｇ／ｍｌ濃度でのバイオポリマー４を含む組成物のプリントは、良好な構造保持を示すが、経時的に保持できない（図３０）。逆に、上と同じ条件で、前硬化バイオポリマー５を含む組成物を用いたプリントは、短時間間隔で、形状の精度が低く、崩壊し、経時安定性を示しているにも拘わらず、形状の高さを適切に保持するプリント構造とはならない（図３１）。

反対に、バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の混合物を含む組成物を用いてのプリントは、これらの組成物がバイオインクとして別々に有していた欠点を解決している。この混合物は、プリントしたとき、良好な形状精度と経時的な構造保持ができ、複雑な構造を作ることができるようになる（図３２）。同様に、バイオポリマー６組成物を含むバイオインクも、そのシークエンスにモノマーＸとＹを含むので、経時的な構造保持を示している（図３３）。

〔実施例５〕 組成物の細胞生存率及び細胞毒性の評価：
本発明の組成物のバイオインクとしてのプリンタ適性、及び経時安定性を評価した後、ヒト線維芽細胞株ＨＦＦ－１を用いてそれらの細胞毒性と細胞生存率を評価した。この目的に、直径５ｍｍ、高さ１ｍｍで横向きに正方形空隙１ｍｍがある多孔質円形格子をプリントしている。

評価を行うために選んだ組成物は、前の実施例で示したように、モノマーＸ及びＹを含むために最良のプリンタ適性と経時安定性を示したバイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）の混合物を含む。組成物中に、組成物がシークエンス中にモノマーＤ、詳しくは、ＲＧＤシークエンスを含むモノマーＤ、より詳しくは、シークエンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含むモノマーＤ、を含むバイオポリマーを含むとき、その組成物がもつバイオ活性を決定するために、バイオポリマー３（６０重量％）＋バイオポリマー２（重量４０％）の混合物を含む組成物をネガティブコントロールとして使用する。この組成物は、他の評価組成物と同じ構造を含むが、組成物のバイオ活性を可能にする機能のモノマーＤを欠いている。

上記した組成物をそれぞれでプリントした表面に、１０，０００個の細胞を播種する。アラマーブルー評価は、早期の細胞生存率と増殖を研究するために用いる。アラマーブルーは、細胞の代謝活性の結果として色を変化させて減少する蛍光指標を含む試薬であり、細胞生存率及び細胞毒性の定量的決定を可能にする。アラマーブルー評価により、評価する組成物それぞれに播種した後３０分、２時間及び４時間で初期細胞生存率を観察する。表面に付着した細胞数は、キャリブレーションラインの手段で計算する。

モノマーＤを含むバイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（４０重量％）を含む組成物では、モノマーＤを含まないバイオポリマー３（重量６０％）＋バイオポリマー２（重量４０％）の混合物を含む組成物に対して、付着している細胞数が有意に多いことが明らかに示されている（図３４）。そのため、バイオインク中のＲＧＤインテグリン付着シークエンスの存在が、早期細胞接着を可能にし、かつ改善することが推測できる。

さらに、前述の組成物でプリントした格子上の線維芽細胞の増殖を、長期間、すなわち２１日間分析した。結果は、時間の経過とともに両方の組成物でアラマーブルーの減少率が徐々に増加しており、バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（重量４０％）の混合物を含む組成物の場合、最初の４．４％から始まり６４．１％となり、バイオポリマー３（６０重量％）＋バイオポリマー２（４０重量％）の混合物を含む組成物の場合では、最初の２．２％から始まり５３．２％となっている。このパーセントは、そのシークエンス中にモノマーＤを有する混合物を含む組成物でプリントされた格子の場合では有意に高い。

細胞が、前述の組成物でプリントされた格子に付着していることを示すために、ＤＡＰＩ／ファロイジン染色を行った。ＤＡＰＩ染色は、細胞核に存在するＤＮＡのアデニン－チミン結合を染色するために使用され、一方、ファロイジンは、アクチンフィラメントを染色するために使用され、残存する細胞質を観察することができる。この両方の染色技術の組み合わせにより、細胞形態が観察される。

ＤＡＰＩ／ファロイジン染色は、バイオポリマー４（６０重量％）＋前硬化バイオポリマー５（重量４０％）を含む組成物でプリントした格子で線維芽細胞の培養後１４日に行う。図３６では、細胞がどのようにプリントされた格子、好ましくは縦方向に位置して三次元マトリックスを形成している格子に付着しているかを観察することができる。また、細胞は、異なるファイバのデポジットに対応して異なる高さで並んでいるのが観察され（図３７）、格子状の細胞の並びと成長の形態又は構造を示している。

〔実施例６〕 バイオプリンティング前にバイオインク（バイオポリマー６）に導入された細胞の細胞生存率及び細胞毒性の評価：
次に、バイオポリマー６と共にプリントしたときにヒト線維芽細胞ＨＦＦ－１によって示される細胞生存率及び形態を評価する。

この目的で、ＨＦＦ－１細胞（６×１０^６細胞／ｍｌ）をバイオポリマー６と混合してＤＭＥＭに溶解し、直径５ｍｍ、高さ１ｍｍで横向きに正方形空隙１ｍｍがある多孔質円形格子にプリントする。表面を無菌下でプリントし、それらを細胞媒体に浸漬し、２１日間培養する。

まず、プリントした表面にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標名）染色を行う。このタイプの染色は、生細胞及び死細胞を染色することによって細胞生存率を決定することができる。プリントされた格子の異なる場面の写真を得ることによって、細胞を数え、生存率割合（生細胞の割合）がわかる。プリントプロセスにより細胞生存率が変わるかどうかを確かめるために、コントロールを行う。このコントロールは、同じバイオポリマーを同じ細胞濃度で混合し、３Ｄバイオプリントプロセスに供することなく格子にデポジットさせる。

生細胞と死細胞の存在の分析は、プリントした後４時間と、異なる日：１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目に行う。図３８には、バイオポリマー６でプリントした後４時間での細胞生存率が７６％であることが観察される。しかしながら、細胞生存率は、培養７日後に有意に増加し、細胞生存率が９０％に達した。細胞培養の最初の数日間、プリントされた格子で得られた細胞生存率とそれに対応するコントロールとの間に顕著な違いが見られる。これらの結果は、培養の最初の数日間、バイオポリマー６の押出しが細胞生存率に悪影響を及ぼしていることを示唆しているが、長期的な細胞生存率は影響を受けないことを示唆している。

ＨＦＦ－１の細胞形態、再構築及び増殖は、ＤＡＰＩ／ファロイジン染色による光顕微鏡法によって研究し、上に説明した。染色は、バイオポリマー６を細胞（６×１０^６細胞／ｍｌ）と混合してプリントした後、１、３、７、７、１４、及び２１日後に行った。図３９に示されるように、最初の日から、細胞はプリントされた表面に均質に分布しており、これは、その内側と外側の両方の部分に細胞を保持している格子で栄養が良好に分布していることを示している。さらに、培養の最初のステップ／日で、細胞は丸いままであるが、培養の最初の３日後に、この細胞タイプ（線維芽細胞）の特徴である細長く線維状の形状ができ始め、培養後７日で完全に拡がっている。このステップでは、細胞は構造に沿って凝集を形成し始め、培養の残りの日では、実験を終了した２１日まで成長及び増殖を続けた。

従って、ここに挙げた実施例のように、バイオポリマー４＋前硬化バイオポリマー５の混合物を含む組成物、ならびにバイオポリマー６を含む組成物を、バイオインクとして使用することができる。この組成物は、詳しくはシークエンス中にモノマーＸ及び／又はＹが在る結果、良好なプリンタ適性を示し、高さが変わらず、経時間的に安定した構造でプリントすることができる（表９、図３０及び３１）。加えて、低温でのプリントを容易にする低粘度（図２７）、温度が上昇した時の急速な粘度上昇（図２９）を示し、これは、プリントプロセスにおいてプリントされた構造が安定した状態を保持することを容易にする。さらに、これらは、モノマーＤが存在する結果、細胞接着及び増殖を可能にする。

Claims (27)

1. モノマーＢ、Ｃ、Ｘ及びＹを含むバイオポリマーを含む、又は、
   モノマーＢ、Ｃ及びＸ、並びにモノマーＢ、Ｃ及びＹをそれぞれ含む少なくとも２つのバイオポリマーを含むことを特徴とする組成物。
   ここで、
   Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むアミノ酸シークエンス、
   Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含むアミノ酸シークエンス、
   Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンス、
   Ｙは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスである。
2. 前記バイオポリマーは、さらに、モノマーＤを含み、
   前記モノマーＤは、細胞結合性アミノ酸シークエンスであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記モノマーＤは、
   ＲＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＬＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９からなる群から１つ選ばれるシークエンスを含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. 前記モノマーＤは、さらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含むことを特徴とする請求項２又は３に記載の組成物。
5. 前記バイオポリマーは構造（Ｉ）：［（Ｂ_ｂ－Ｃ_ｃ）－Ｚ_ｚ］_ｎ－Ｄ_ｄ、
   の構造を有する請求項１乃至請求項４のいずれかの組成物であって、
   前記組成物は、
   ＺがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である構造（Ｉ）の第１のバイオポリマーと、
   ＺがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である構造（Ｉ）の第２のバイオポリマーとを含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
   ここで、
   Ｂ、Ｃ、Ｄは、請求項１乃至請求項４で定義しており、
   Ｚは、請求項１で定義したモノマーＸ及び／又はＹから選択され、
   ｂは、５～１５の値であり、
   ｃは、５０～７０の値であり、
   ｚは、１～５の値であり、
   ｎは、１～５の値であり、
   ｄは、０～３の値である。
6. 前記第１のバイオポリマーは、前記組成物中に４０～６０重量％の濃度であり、
   前記第２のバイオポリマーは、前記組成物中に６０～４０重量％の濃度であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
7. 前記バイオポリマーは、構造（ＩＩ）：Ｚ１_ｚ－［（Ｂ_ｂ－Ｃ_ｃ）－Ｚ２_ｚ］_ｎ－Ｄ_ｄ、
   の構造を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
   ここで、
   Ｂ、Ｃ、Ｄは、請求項１乃至請求項４で定義しており、
   Ｚ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスであり、
   Ｚ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ 又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンスであり、
   好ましくは、Ｚ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンス、Ｚ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスであり、
   ｂ、ｃ、ｚ、ｎ及びｄは、請求項５で定義している。
8. ｂが１０の値、ｃが６０の値、ｚが１の値、ｎが２の値、ｄが０又は１の値を有することを特徴とする請求項５乃至７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記バイオポリマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６から選ばれる、
   又は、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１４とＳＥＱ ＩＤＮＯ：１５のバイオポリマーの組み合わせから選ばれることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
10. 前記組成物は、さらに、細胞、生理活性分子、活性成分、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記組成物は、ヒドロゲルの形態であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物のバイオポリマーのアミノ酸シークエンスをコードするヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸をトランスフェクトしたことを特徴とする単離細胞。
14. バイオインク、好ましくはバイオマテリアルの２Ｄ又は３Ｄプリンティング用のバイオインクとして使用することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
15. 臓器及び／又は組織を得るサポートの調製のため、又は活性成分若しくは細胞をカプセル化するための使用であって、
    請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物、
    請求項１２に記載の核酸、
    又は請求項１３に記載の細胞を使用することを特徴とする使用。
16. 請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物を含むことを特徴とするバイオインク。
17. 請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物を含むことを特徴とする３Ｄまたは２Ｄバイオマテリアル。
18. 薬物としての使用することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物。
19. 組織再生に使用することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物。
20. モノマーＢ、Ｃ、及び少なくともモノマーＸ又はＹを含むバイオポリマーを含む組成物を、バイオインクとして、好ましくはバイオマテリアルの２Ｄ又は３Ｄプリンティングのバイオインクとして使用することを特徴とする組成物の使用。
    ここで、
    Ｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含むアミノ酸シークエンスであり、
    Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を含むアミノ酸シークエンスであり、
    Ｘは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を含むアミノ酸シークエンスであり、
    Ｙは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸シークエンスである。
21. 前記バイオポリマーは、さらにモノマーＤを含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
22. 前記モノマーＤは、ＲＧＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、ＬＤＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、
    及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６からなる群から１つ選ばれる細胞結合性アミノ酸シークエンスであることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
23. 前記バイオポリマーは、構造（Ｉ）：［（Ｂ_ｂ－Ｃ_ｃ）－Ｚ_ｚ］_ｎ－Ｄ_ｄ
    を有することを特徴とする請求２０乃至２２のいずれか１項に記載の使用。
    ここで、
    Ｂ、Ｃ、Ｄは、請求項１から４で定義しており、
    Ｚは、請求項１で定義したモノマーＸ及びＹから選ばれ、
    ｂは、５～１５の値、好ましくは１０であり、
    ｃは、５０～７０の値、好ましくは６０であり、
    ｚは、１～５の値、好ましくは１であり、
    ｎは、１～５の値、好ましくは２であり、
    ｄは、０～３の値、好ましくは０又は１である。
24. 前記バイオポリマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３から選ばれることを特徴とする請求項２０乃至２３のいずれか１項に記載の使用。
25. 細胞、バイオ活性分子、活性成分、又はそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項２０乃至２４のいずれか１項に記載の使用。
26. 薬物として使用することを特徴とする請求項２０乃至２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 組織再生に使用することを特徴とする請求項２０乃至２５のいずれか１項に記載の組成物。
    
    

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