ES2344097B1 - Biopolimero, implante que lo comprende y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Biopolímero, implante que lo comprende y sus
usos.
La presente invención se refiere a un
biopolímero, bioactivo y totalmente biocompatible, muy fluido a
temperatura ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a
37ºC; formando un implante sólido estructuralmente íntegro, continuo
y con altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al
menos un dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa la
formación de un implante sólido o semi-sólido.
Asimismo la invención se refiere a cualquiera de los ácidos
nucleicos que codifican para la secuencia aminoacídica del
biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente aceptables, a
sus usos y a un método de síntesis del mismo.
Description
Biopolímero, implante que lo comprende y sus
usos.
La presente invención se refiere a un
biopolímero, bioactivo y totalmente biocompatible, muy fluido a
temperatura ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a
37ºC; formando un implante sólido estructuralmente íntegro, continuo
y con altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al
menos un dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa la
formación de un implante sólido o semi-sólido.
Asimismo la invención se refiere a cualquiera de los ácidos
nucleicos que codifican para la secuencia aminoacídica del
biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente aceptables, a
sus usos y a un método de síntesis del mismo.
Los implantes de materiales biomédicos
macroscópicos sólidos pueden clasificarse en 2 categorías: (1)
implantes carentes de integridad estructural o no continuos y (2)
materiales que forman un implante estructuralmente íntegro o
continuo. La primera estrategia se basa en implantes de micro o
nanopartículas suspendidas en un vehículo biocompatible (Gamisans
et al., 1999. Int J Pharm, 79: 37-48;
Igartua et al., 1998. J Control Rel; 56:
63-73; Brannon-Peppas L, 1995.
Controlled release of ®-estradiol from biodegradable
microparticles within silicone matrix; In: Polymer Biomaterials in
Solution, as Interfaces and as Solids. 1st ed. Utrech (The
Netherlands): VSP-Utrecht; Kawaguchi H, 2000.
Prog Polym Sci, 25: 1171-1210). Debido a que
no poseen propiedades mecánicas, estos implantes pueden migrar del
sitio de inserción. Para superar esta desventaja, se han diseñado
sistemas que combinan baja viscosidad y alta fluidez al momento de
la inyección con un aumento pronunciado en las propiedades mecánicas
a posteriori, que resulta en la formación de un implante
sólido y con límites bien definidos.
Las familias de biomateriales inyectables
existentes se pueden resumir en a) Pastas Termoplásticas, b)
Precipitación In Situ, c) Sistemas Polimerizables o
Entrecruzables In Situ, d) Materiales Inteligentes y e)
Sistemas de Estrategia Combinada.
Las pastas termoplásticas que despliegan un
aumento de viscosidad son materiales de bajo peso molecular
caracterizados por una baja temperatura de transición vítrea (Tg) y
una temperatura de fusión (Tm) entre 37ºC y 65ºC. Así, las pastas
son inyectadas en estado fundido (en general a una temperatura por
encima de la temperatura corporal) y la cristalización gradual en el
cuerpo resulta en la solidificación y formación de un implante
continuo (Hatefi et al.,2002. J Control Rel, 80:
9-28). Los polímeros más importantes para el
desarrollo de estos implantes son policaprolactona (PCL), ácidos
poliláctico (PLA), poliglicólico (PGA) y polidioxanona (PDO),
poliortoésteres (POEs), entre otros.
Sosnik y Cohn diseñaron una modificación de esta
estrategia mediante la síntesis de oligómeros segmentados de
polietilenglicol y PCL que combinaron inyectabilidad mejorada y
endurecimiento gradual a 37ºC a lo largo del tiempo (Sosnik et
al., 2003. Polymer, 44: 7033-7042).
Los materiales inteligentes son aquellos que
despliegan un cambio abrupto en una de sus propiedades (por ejemplo
viscosidad) ante un pequeño cambio en las condiciones del entorno.
El estímulo puede ser físico (p.e. temperatura, fuerza iónica, campo
magnético o eléctrico, estrés mecánico), químico (p.e. pH) o
bioquímico (p.e. substrato de enzimas o ligandos específicos)
(Hoffman et al., 2000. J Biomed Mater Res Part A, 52:
577-586).
Las soluciones acuosas de los materiales
inteligentes tienen baja viscosidad a temperatura ambiente y exhiben
un aumento con el calentamiento formando un gel
semi-sólido o sólido cuando alcanzan la temperatura
fisiológica. Esta transición se observa generalmente en un estrecho
intervalo de temperatura. Existen varios polímeros que presentan
este comportamiento. Entre ellos, cabe destacar la
poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAAm)
(Peppas et al., 2000. Eur J Pharm Biopharm, 50:
27-46), copolímeros segmentados de poli(óxido de
etileno)-poli(óxido de propileno)
(PEO-PPO) (Bromberg et al., 1998. Adv Drug
Del Rev, 31: 197-221), copolímeros segmentados
de poli(óxido de etileno)-poliésteres
(PEO-PLA, PEO-PCL) (Jeong et
al., 1999. J Control Rel, 62: 109-114) y
otras moléculas anfifílicas diseñadas alternando segmentos
hidrofílicos e hidrofóbicos (Lee et al., 2002.
Macromolecules, 35: 3876-3879). Una de las
desventajas presentada por los polímeros comerciales de PEO y PPO es
la no degradabilidad de la cadena polietérica en el medio
biológico.
La combinación de las técnicas anteriores ha
dado lugar a implantes que presentan propiedades de dos grupos de
materiales anteriormente descritos: (1) aumento de la viscosidad con
el incremento de la temperatura y (2) entrecruzamiento covalente
para obtener propiedades mecánicas robustas y mayor estabilidad
estructural. Así, el implante puede ser insertado en forma líquida,
gelificar a 37ºC para formar un gel semi-sólido y
finalmente ser estabilizado por entrecruzamiento covalente. En
muchos casos estos polímeros van acompañados de disolventes y
reactivos orgánicos. Las limitaciones más importantes de los
Poli-N-isopropilacrilamida
(PoliNIPAAm) que son algunos de los polímeros termosensibles
inversos más populares son la no degradabilidad de las matrices
puras y la pérdida de volumen o contracción durante el
calentamiento.
Es conocido que las proteínas recombinantes tipo
elastina (ELR) que se usan como polímeros biocompatibles, son
altamente versátiles, puesto que estas características se pueden
modificar y ampliar insertando los aminoácidos de dominios
funcionales extraídos de otras proteínas o diseños naturales de
novo (Rodríguez-Cabello JC, Prieto S, Reguera J,
Arias FJ y Ribeiro A. (2007). J. Biomater. Sci. Polymer Edn,
18(3): 269-286). En dicha revisión también se
comenta que recientemente, el potencial demostrado de los polímeros
ELR ha sido amplificado por el uso de las tecnologías de ADN
recombinantes. Esta revisión explora el actual desarrollo de los
polímeros ELR, con un énfasis particular en las aplicaciones
biomédicas.
También es conocido que en la cadena del
biopolímero se pueden insertar péptidos que contengan dominios
bioactivos como por ejemplo RGD (R = L-arginina, G =
glicina y D = ácido L-aspártico) o REDV (E = ácido
L-glutámico y V = L-valina) que
dotan a los biopolímeros de una alta capacidad de unión a diversos
tipos celulares.
Otra familia de materiales de suma importancia
son los polímeros segmentados de PEO y PPO, comercialmente conocidos
como Pluronic (lineales y bifuncionales) y Tetronic
(ramificados y tetrafuncionales) que no presentan contracción de
volumen como los PoliNIPAAm, pero que, como contrapartida, aun en
casos donde los materiales comerciales presentan la transición
sol-gel, los niveles de viscosidad alcanzados no son
lo suficientemente elevados para la mayoría de las aplicaciones
clínicas. Es decir, las propiedades mecánicas de los polímeros PEO y
PPO son insatisfactorias y los geles muestran excesiva permeabilidad
al agua y consecuentemente tiempos de residencia sumamente cortos en
el sitio del implante. Por este motivo y para situaciones semejantes
se recurre a estrategias combinadas con el objeto de prevenir la
reabsorción del implante inmediatamente después de la inserción,
mediante el aumento pronunciado de la viscosidad, y un posterior
entrecruzamiento covalente para alcanzar propiedades mecánicas
robustas y de mayor estabilidad. De esta manera se obtienen
hidrogeles con módulos de 415 kPa pero con el consecuente aumento
del tiempo necesario para alcanzar la consistencia deseada ya que en
este caso se debe producir una reacción de entrecruzamiento en
condiciones fisiológicas que serán superiores a la hora.
A pesar de que se han venido ensayando mediante
diferentes estructuras basadas en proteínas ELR, no se ha conseguido
sintetizar un bipolímero que no presente una dilución apreciable del
implante. Este hecho es debido a que la gelificación de este tipo de
polímeros todavía es demasiado lenta. Esta dilución del implante
disminuye la eficacia del mismo.
Por tanto se hace necesario resolver la
dificultad de conseguir una gelificación lo suficientemente rápida y
selectiva para producir un implante sólido eficaz.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un
biopolímero, bioactivo y biocompatible, muy fluido a temperatura
ambiente y con capacidad de gelificar de forma brusca a 37ºC
formando un implante sólido estructuralmente íntegro, continuo y con
altas prestaciones mecánicas. El biopolímero comprende al menos un
dominio bioactivo capaz de dirigir de forma precisa la formación de
un implante sólido o semi-sólido de manera que
además de formar el implante presenta biofuncionalidades como
interactuar con células en el organismo, o introducirlas actuando
como sistema de terapia celular (medicina regenerativa); también
puede actuar como sistema de liberación controlada de fármacos,
inducir nucleación inorgánica, etc. Asimismo la invención se refiere
a cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para la secuencia
aminoacídica del biopolímero, implantes, vehículos farmacéuticamente
aceptables, a sus usos y a un método de síntesis del mismo.
El biopolímero de la presente invención es un
copolímero ya que está formado por varios monómeros. El término
copolímero es un sinónimo de heteropolímero. Los monómeros son
péptidos de 5 aminoácidos (pentapéptidos) que se pueden unir de
diferentes formas por medio de enlaces químicos.
En la presente invención se han obtenido
sistemas autogelificables a partir de polímeros proteicos tipo
elastina con un alto grado de eficiencia, complejidad, control y
robustez. Los biopolímeros de la presente invención se han
conseguido empleando las siguientes herramientas:
- -
- Conocimiento sobre las fuerzas hidrofóbicas y elásticas de los aminoácidos. De este modo se puede disponer de un control preciso y cuantitativo de cuánto de hidrofóbico o hidrofílico ha de ser cada pentapéptido en el biopolímero. Partiendo de este conocimiento y del fenómeno de transición inversa (T_{t}) que se da en estos materiales, se construyeron biopolímeros tipo elastina autogelificables mediante estructuras que alternan pentapéptidos hidrofílicos y pentapéptidos hidrofóbicos de manera que las interacciones entre los pentapéptidos hidrófobos, en disoluciones acuosas, son vitales para producir el fenómeno de autogelificación deseado por encima de una temperatura determinada.
- -
- Uso de la tecnología de ADN recombinante mediante la clonación de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la secuencia aminoacídica del biopolímero de la presente invención en un vector capaz de expresar dicha secuencia. Mediante esta tecnología se aprovecha la maquinaria de replicación, transcripción y traducción de los organismos para producir los biopolímeros.
- -
- Biocompatibilidad de los biopolímeros basados en secuencias de polipéptidos ELP (Elastin-Like Polypeptide). Ésta es una característica útil en el desarrollo de sistemas que funcionen en contacto con tejidos vivos o fluidos específicos. Los ELPs no pueden ser distinguidos de la elastina natural por el sistema inmune por lo que su biocompatibilidad puede considerarse extrema.
Por tanto, aprovechando estas herramientas, los
biopolímeros recombinantes (producidos por medio de la tecnología de
ADN recombinante), adquieren la capacidad de autoensamblado y
permiten el desarrollo de sistemas nanométricos. Con esta nueva
estrategia se consiguen sistemas y propiedades de autoensamblado con
características claramente superiores a los descritos en la
actualidad.
Los biopolímeros de la presente invención
presentan varias ventajas respecto de otros copolímeros conocidos
del estado de la técnica:
- -
- Tiene al menos una secuencia con un dominio bioactivo de modo que de esta manera el biopolímero se adhiere a las células específicas para el que se ha diseñado y se produce la gelificación, obteniendo un material con un módulo elástico de compresión orden de 10^{5} Pa.
- -
- El tiempo de gelificación desde que se administra el biopolímero (normalmente por inyección) es de entre 1 y 3 minutos a 37ºC para un biopolímero con una concentración de entre 150 y 200 mg/ml.
La gelificación rápida es muy importante para
evitar una dilución apreciable del implante en el entorno biológico,
lo que puede disminuir la eficacia del implante. Puesto que la
gelificación se produce en un intervalo de tiempo tan corto, es muy
importante dirigir el biopolímero al tejido específico de interés,
consiguiendo de este modo un implante sólido selectivo.
Los biopolímeros pueden formar un implante
sólido, estructuralmente íntegro y con altas prestaciones mecánicas
en unos minutos sin necesidad de entrecruzamiento. Los polímeros se
pueden aplicar en terapias para el daño en tejido nervioso y médula
espinal, en terapias para el daño en cartílagos y hueso (incluyendo
secuencias capaces de inducir nucleación inorgánica), en la
prevención de cicatrices (incluyendo secuencias antiadherentes como
por ejemplo SEQ ID NO: 1), en el tratamiento de necrosación de
varices, en aumento de tejidos, en tratamiento de enfermedades
mediante la liberación controlada de fármacos (incluidos en dicho
biopolímero). En definitiva, los biopolímeros de la invención pueden
ser capaces de incluir múltiples funcionalidades simultáneamente en
un único biopolímero que puede tener ventajas obvias debido a la
biocompatibilidad del mismo.
En este sentido, el primer aspecto de la
presente invención es un biopolímero que comprende las secuencias
aminoacídicas A, B y C con la estructura:
(A_{n}-B_{m})_{s}-C_{p},
donde,
A tiene la estructura
(D_{t1}-E_{v1}-D_{t2}) o la
estructura (D_{t1}-E_{v2}), donde D es SEQ ID
NO: 1; E es SEQ ID NO: 2; t1 y t2 tienen valores de entre 2 y 4; y
v1 y v2 tienen valores de entre 1 y 5,
B se selecciona de la lista que comprende SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 26. B también puede ser la
secuencia SEQ ID NO: 27.
C tiene la estructura
(G_{w1}-H_{x1}-G_{w2}) O
H_{x2}, donde G es SEQ ID NO: 5; H es una secuencia aminoacídica
que comprende un péptido que se selecciona de la lista que comprende
RGD, LDT, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID
NO: 15 o SEQ ID NO: 16; w1 y w2 tienen valores de entre 5 y 15; y x1
y x2 tienen valores de entre 1 y 5,
n tiene un valor de entre 5 y 15,
m tiene un valor de entre 10 y 70,
s tiene un valor de entre 2 y 4, y
p tiene un valor de entre 1 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia aminoacídica A es el bloque
hidrofóbico, la secuencia aminoacídica B es el bloque hidrofílico y
la secuencia aminoacídica C es el bloque bioactivo. Este último
bloque comprende dominios que son capaces de reconocer secuencias
específicas e interaccionar con ellas de modo que permiten la
proximidad del biopolímero de la invención a la diana celular
deseada.
t1 y t2 pueden tener valores iguales o
diferentes. v1 y v2 pueden tener valores iguales o diferentes. w1 y
w2 pueden tener valores iguales o diferentes. x1 y x2 pueden tener
valores iguales o diferentes.
La secuencia RGD es reconocida por diversos
tipos celulares, la secuencia SEQ ID NO: 7 es reconocida por células
endoteliales, LDT, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 está presente en
laminina y es reconocida por diversos tipos celulares, SEQ ID NO: 10
es reconocida por neuritas, es decir, cualquier expansión del soma
de una neurona, ya sea una dendrita o un axón. Estas secuencias, que
forman parte del biopolímero de la invención, son reconocidas por
sus respectivos tipos celulares y propician su unión. Los
biopolímeros que contengan SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEO ID NO:
10 se pueden emplear en terapias de daños vasculares, tejidos
nerviosos o de médula espinal respectivamente.
La secuencia SEQ ID NO: 11 tiene afinidad por
fosfato de calcio, SEQ ID NO: 12 tiene afinidad por el oro, SEQ ID
NO: 13 tiene afinidad por la plata, SEQ ID NO: 14 tiene afinidad por
el platino, SEQ ID NO: 15 tiene afinidad por el silicio (SiO_{2}),
SEQ ID NO: 16 tiene afinidad por el carbonato cálcico (CaCO_{3}).
Estas secuencias permiten la integración en el biopolímero de
capacidades como, unión a la parte mineral del hueso, introducción
de elementos de detección, capacidad bactericida y otras.
La secuencia aminoacídica H puede comprender un
péptido que pertenezca a una secuencia de un factor de crecimiento,
una secuencia inductora de nucleación inorgánica, una secuencia
antiadherente como por ejemplo, pero sin limitarse, SEQ ID NO: 1. La
secuencia H puede codificar para un agente activo o agente
terapéutico o agente quimioterapéutico o un anticuerpo terapéutico o
un fragmento de anticuerpo terapéutico.
Un factor de crecimiento es una sustancia,
normalmente de naturaleza proteica, pero sin limitarse. La función
principal de un factor de crecimiento es estimular la proliferación
celular, entre otras funciones. La secuencia del factor de
crecimiento se selecciona de la lista que comprende los factores;
factor de crecimiento transformante beta TGF-beta
(para la regeneración de hueso), factor de crecimiento de los
fibroblastos FGF o KGF, factor de crecimiento epidérmico EGF o
TGF-alfa, factor de crecimiento endotelial vascular
VEGF, factor de tipo insulina ILGF, factor como BMPs para hueso o
factor TGF-\beta de la familia Sonic hedgehog
gene.
La secuencia inductora de la nucleación
inorgánica es un péptido que tiene la función, pero sin limitarse,
de promover de forma activa y eficaz la nucleación y crecimiento de
cristales inorgánicos en condiciones en las que éstos no aparecerían
o aparecerían con otra estructura en ausencia de esta secuencia.
La secuencia antiadherente es una secuencia
peptídica que inhibe la interacción específica entre el biopolímero
que la contiene y al menos un tipo celular.
En este sentido, los biopolímeros de la presente
invención presentan una gelificación que en algunos casos es
instantánea y en todos muy corta; de entre 1 y 12 minutos para el
biopolímero A y 21 minutos para el biopolímero B. Este tiempo es
mucho menor al de los biopolímeros descritos en el estado de la
técnica que suele ser de varias horas, en los que se aumenta la
viscosidad y se lleva a cabo un entrecruzamiento covalente in
situ para que alcancen propiedades mecánicas robustas y de mayor
estabilidad. De esta manera no existe dilución apreciable del
implante en el entorno biológico como ocurre con los sistemas
exclusivamente entrecruzables. Y además se alcanzan propiedades
mecánicas con valores de módulos en compresión del orden de 10^{5}
Pa (tanto para el biopolímero A como para el biopolímero B) y por
tanto no es necesario recurrir a estrategias combinadas que tienen
el inconveniente de presentar un aumento de los tiempos necesarios
para alcanzar las propiedades óptimas así como la introducción de
otros agentes que pueden afectar a la biocompatibilidad del
implante.
Una realización preferida de la invención se
refiere al biopolímero donde A tiene la estructura
(D_{t1}-E_{v1}-D_{t2})- En
otra realización preferida del biopolímero, C tiene la estructura
(G_{w1}-H_{x1}-G_{w2}). Según
otra realización preferida del biopolímero, la secuencia
aminoacídica de H contiene el péptido RGD. En otra realización
preferida del biopolímero, la secuencia aminoacídica de H que
contiene el péptido RGD es SEQ ID NO: 6.
En otra realización preferida, la secuencia
aminoacídica B es SEQ ID NO: 3.
Según una realización aún más preferida del
biopolímero, m tiene un valor de entre 55 y 65. Una realización más
preferida es el biopolímero que comprende los péptidos B, E, G, D y
H con la estructura
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{60}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
Otra realización preferida se refiere al
biopolímero donde la secuencia aminoacídica B es SEQ ID NO: 4. Según
una realización más preferida del biopolímero, m tiene un valor de
entre 15 y 25. Otra realización aún más preferida se refiere al
biopolímero que comprende los péptidos B, E, G, D y H con la
estructura
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{20}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
El péptido resultante de intercalar un aminoácido Valina (V) entre los aminoácidos Glicina (G) y Alanina (A) de la secuencia SEQ ID NO: 4 actúa como diana de proteasas y modula la biodegradabilidad del biopolímero y es muy adecuado por ejemplo para la liberación de fármacos o medicina regenerativa.
El péptido resultante de intercalar un aminoácido Valina (V) entre los aminoácidos Glicina (G) y Alanina (A) de la secuencia SEQ ID NO: 4 actúa como diana de proteasas y modula la biodegradabilidad del biopolímero y es muy adecuado por ejemplo para la liberación de fármacos o medicina regenerativa.
Con el fin de introducir las funcionalidades que
se necesita para cada aplicación, los biopolímeros proteicos
recombinantes tipo elastina se diseñan y construyen a medida
mediante la conjunción de diferentes péptidos que contengan dominios
que se introducen para incluir cada una de las características
requeridas. Así pues, los dominios son:
- -
- Dominios con funciones biomiméticas. Se incluyen aquellos dominios capaces de introducir funciones de autoensamblado y autoorganización en la nano y microescala, necesarios para inducir un cambio en sus propiedades físicas muy acusado al aumentar la temperatura. Esta característica del biopolímero se denomina Gelación Térmica Inversa (Reverse Thermal Gelation, RTG). Las soluciones acuosas de estos biopolímeros tienen baja viscosidad a temperatura ambiente y exhiben una mayor viscosidad con el aumento de la temperatura, llegando a formar un gel semisólido o sólido cuando alcanzan la temperatura fisiológica (entorno a los 37ºC). Dicha característica además de ser la responsable de la autogelificación permite la utilización de estos biopolímeros como sistemas de dosificación de fármacos ya que el mismo proceso de gelificación va a servir para encapsular fármacos y principios activos presentes en la disolución que posteriormente se pueden liberar de forma controlada. Otro tipo de aplicación sería el de aumento de volumen de tejido.
- -
- Dominio no bioactivo tipo elastina. Su función es dotar al material de la adecuada biocompatibilidad y propiedades mecánicas. Un biopolímero que sólo incluyera este tipo de secuencias sin incluir secuencias bioactivas podría diseñarse además como sistema antiadherente para aplicaciones como la prevención de adherencias.
- -
- Dominios bioactivos. Estos dominios dotan al biopolímero de propiedades específicas de adhesión celular a través de péptidos conocidos de las proteínas de la matriz extracelular. Como se ha indicado anteriormente, entre secuencias con dominios de este tipo están SEQ ID NO: 7 que es reconocida por las células endoteliales, LDT, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 procede de la laminina o SEQ ID NO: 10 que es reconocida por neuritas.
- -
- Otros dominios para inducir la biodegradabilidad del biopolímero, muy adecuado para que se produzca una liberación controlada de fármacos.
En adelante, se hará referencia a cualquiera de
los biopolímeros anteriores como "biopolímeros de la invención"
o "biopolímeros de la presente invención".
Las secuencias aminoacídicas (se puede usar el
término "péptidos" indistintamente para referirse a las
secuencias aminoacídicas) B, D, E, G y H de acuerdo con las
estructuras descritas que dan lugar a los biopolímeros de la
invención, pueden estar unidos por enlace covalente o cualquier otro
tipo de enlace que de lugar a una estructura que mantenga las
propiedades de los biopolímeros de la presente invención. El enlace
se selecciona, aunque sin limitarse, de la lista que comprende
puentes de hidrógeno, apareamiento iónico, asociación hidrofóbica o
formación de complejos de inclusión.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica para la secuencia aminoacídica de cualquier biopolímero de
la invención.
El ácido nucleico (en adelante, ácido nucleico
de la invención o ácido nucleico de la presente invención) incluye
secuencias de ácido nucleico cuyo producto de la transcripción, el
ARN mensajero (ARNm) codifica para la misma secuencia de aminoácidos
(en adelante, secuencia de aminoácidos de la presente invención o
secuencia de aminoácidos de la invención). También se incluyen
secuencias variantes degeneradas de las secuencias nucleotídicas de
la invención, cuyo producto es un biopolímero con las mismas
características que el biopolímero de la invención. También se
incluyen secuencias de nucleótidos que codifiquen para secuencias
aminoacídicas que tengan modificaciones en su extremo
N-terminal, C-terminal y/o en alguna
posición aminoacídica interna de modo que la función del biopolímero
resultante sea la misma que la que resulta de la traducción de la
secuencia de ARNm transcrita a partir de la secuencia de nucleótidos
de la invención. La secuencia de aminoácidos puede estar codificada
por cualquier secuencia nucleotídica que de lugar a cualquiera de
las secuencias de aminoácidos de la invención. Debido a que el
código genético es degenerado, un mismo aminoácido puede ser
codificado por diferentes codones (tripletes), por ello, la misma
secuencia de aminoácidos puede ser codificada por distintas
secuencias de nucleótidos.
El ácido nucleico de la presente invención puede
tener unido a su extremo 5' una secuencia nucleotídica que sirva de
secuencia iniciadora de la transcripción. La secuencia puede ser,
pero sin limitarse, la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20.
Asimismo, el ácido nucleico de la presente invención puede tener
unido a su extremo 3' una secuencia de terminación de la
transcripción como por ejemplo, pero sin limitarse, la secuencia
GTATGA.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere a un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de
la invención.
El término "vector de expresión" (en
adelante, vector de la invención o vector de la presente invención)
se refiere a un fragmento de ADN que tiene la capacidad de
replicarse en un determinado huésped y, como el término indica,
puede servir de vehículo para multiplicar otro fragmento de ADN que
haya sido fusionado al mismo (inserto). Inserto se refiere a un
fragmento de ADN que se fusiona al vector; en el caso de la presente
invención, el vector puede comprender cualquiera de las secuencias
nucleotídicas que codifican para cualquiera de los biopolímeros de
la invención, fusionadas al mismo, que puede replicarse en el
huésped adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, cósmidos,
bacterió-
fagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector.
fagos o vectores virales, sin excluir otro tipo de vectores que se correspondan con la definición realizada de vector.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una célula aislada transfectada con el vector de la invención. En
adelante, se hará referencia a las células anteriores como las
células de la invención o las células de la presente invención.
El término "célula" tal como se entiende en
la presente invención hace referencia a una célula procariótica o
eucariótica. La célula puede ser una bacteria capaz de replicar un
ADN ajeno transformado como por ejemplo cualquiera de las cepas de
la especie Escherichia coli o una bacteria capaz de
transferir el ADN de interés al interior de una planta como por
ejemplo Agrobacterium tumefaciens. Preferiblemente, la célula
hace referencia a una célula eucariótica vegetal y dentro de este
grupo, más preferiblemente, a aquellas células pertenecientes al
reino Plantae. Así pues, en el caso de que la célula sea
vegetal, el término célula comprende, al menos, una célula del
parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o
indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un
protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).
El término "transfección" hace referencia a
la introducción de material genético externo en células mediante
plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de
transducción) u otras herramientas para la transferencia. El término
transfección para métodos no-virales es usado en
referencia a células eucarióticas de mamífero, mientras que el
término transformación se prefiere para describir las transferencias
no-virales de material genético en bacterias y
células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del biopolímero de la invención para preparar la preparación
de un implante. El término "implante" tal como se entiende en
la presente invención es una sustancia en estado sólido o
semi-sólido que puede colocarse en el cuerpo para
mejorar alguna de sus funciones, o con fines estéticos.
Otro aspecto de la presente invención es un
implante que comprende cualquiera de los biopolímeros de la
invención. Una realización preferida de la presente invención es un
implante donde el biopolímero tiene una concentración de entre 30 y
300 mg/ml. Preferiblemente el implante tiene una concentración de
biopolímero de entre 50 y 200 mg/ml. Otra realización preferida de
la invención es un implante que se presenta en una forma adaptada a
la administración parenteral. La forma adaptada a la administración
parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su
administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado
líquido, y para ello se requiere que el biopolímero esté a una
temperatura inferior a su temperatura de gelificación. La
administración parenteral puede ser por vía de administración
intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin
limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración
parenteral. Otra posibilidad es que el implante se presente en una
forma adaptada a la administración seleccionada del grupo que
comprende, pero sin limitarse, oral, rectal, bucal, tópica, nasal,
oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica,
intratecal, intra-articular,
intra-arterial, sub-aracnoideo,
bronquial, linfática, vaginal o intra-uterina.
Según otra realización preferida, el implante
incluye además una sustancia activa. Preferiblemente la citada
sustancia activa es una sustancia farmacéuticamente aceptable usada
para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de
enfermedades en animales. Preferiblemente el animal es un mamífero.
Preferiblemente el mamífero es un humano. El implante puede
mezclarse con células de uno o varios tipos, previamente a la
implantación del mismo.
En adelante se hará referencia al implante como
el implante de la invención o el implante de la presente
invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del implante de la invención para el tratamiento de cartílago
o hueso. Mediante el uso del implante pueden tratarse defectos que
no sean dañinos. El tratamiento puede ser preventivo de daños o
simplemente como mejora de un estado que no implique un daño. El
implante es capaz de reparar un daño en el cartílago o hueso o de
mantener unidas estructuras cartilaginosas u óseas fragmentadas a
cualquier nivel, macroscópico o microscópico así como permitir la
liberación de sustancias activas farmacéuticamente aceptables que
ayuden al tratamiento del dolor o a la recuperación de los
daños.
Un aspecto más de la presente invención es el
uso del implante de la invención para el tratamiento del tejido
nervioso o médula espinal. Mediante el uso del implante pueden
tratarse defectos que no sean dañinos. El tratamiento puede ser
preventivo de daños o simplemente como mejora de un estado que no
implique un daño. El implante es capaz de permitir la liberación de
sustancias activas farmacéuticamente aceptables que ayuden al
tratamiento del dolor o a la recuperación de un daño en el tejido
nervioso o médula espinal. Para llevar a cabo este tipo de
tratamiento, el biopolímero puede contener la secuencia SEQ ID NO:
10 con células incorporadas. Las células incorporadas pueden ser
células madre, mesenquimales, o cualquier célula diferenciada.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
del implante para el tratamiento de necrosaciones de varices. El
biopolímero de la invención actúa taponando varices y causando su
necrosación. El implante puede contener agentes farmacológicos.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere a un vehículo farmacéuticamente aceptable que comprende
cualquiera de los biopolímeros de la invención.
Tal como se entiende en la presente invención,
un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas
sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector
farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas
de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes,
tensioactivos, etc. El vehículo farmacéuticamente aceptable de la
presente invención permite una dosificación o administración
específica y dirigida además de dar consistencia y forma a la
preparación farmacéutica. Además, el vehículo debe ser
farmacéuticamente adecuado, es decir, que permita la actividad del
biopolímero de la invención.
Una realización preferida es el vehículo
farmacéuticamente aceptable donde el biopolímero de la invención
tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml. Preferiblemente el
vehículo tiene una concentración de biopolímero de entre 50 y 200
mg/ml. Según otra realización preferida el vehículo
farmacéuticamente aceptable se presenta en una forma adaptada a la
administración parenteral. Además, el tipo de administración se
puede seleccionar de entre los que se han citado en un apartado
anterior.
En adelante se hará referencia al vehículo
farmacéuticamente aceptable como el vehículo de la invención o
vehículo de la presente invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del vehículo de la invención para la liberación controlada de
fármacos. El vehículo es capaz de dosificar un fármaco de una manera
sostenida y/o localizada en un tejido o entorno de células
específico. El vehículo de la presente invención puede comprender
una sustancia activa. Tal como se ha descrito en la presente
invención el biopolímero comprendido en el vehículo de la invención
puede tener secuencias de reconocimiento celular que proporcionan
una localización específica. El vehículo de la invención puede ser,
pero sin limitarse, del tipo nanopartícula, micropartícula,
microesfera o microcápsula. El uso del vehículo de la invención para
la liberación controlada de fármacos se puede llevar a cabo en
animales. Preferiblemente los animales son mamíferos.
Preferiblemente los mamíferos son humanos.
El vehículo de la presente invención capaz de
liberar fármacos de forma controlada, puede emplearse, pero sin
limitarse, para el tratamiento de varices.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un método para la síntesis del biopolímero de la invención que
comprende:
- a.
- insertar el ácido nucleico de la invención en un vector de expresión,
- b.
- transfectar una célula con el vector de expresión obtenido según el apartado (a),
- c.
- seleccionar la célula transfectada según el apartado (b) que comprende el ácido nucleico de la invención,
- d.
- expresar el ácido nucleico en la célula según el apartado (c) y
- e.
- purificar el biopolímero producido según el apartado (d).
\vskip1.000000\baselineskip
El grado de complejidad composicional impuesto
por las necesidades del diseño multifuncional no puede ser alcanzado
por técnicas estándar de síntesis macromolecular. El biopolímero se
obtiene como proteína recombinante, mediante técnicas adaptadas de
biología molecular y biotecnológica, en microorganismos o plantas
modificados genéticamente.
La secuencia nucleotídica que codifica para la
secuencia aminoacídica del biopolímero de la presente invención, se
inserta en un vector de expresión definido anteriormente.
La transfección de una célula, definida en un
párrafo anterior, se lleva a cabo con técnicas conocidas en el
estado de la técnica, por ejemplo pero sin limitarse, con
electroporación, con biolística, Agrobacterium tumefaciens o
cualquier otra técnica que permita la integración de cualquiera de
los ácidos nucleicos de la invención en el ADN de la célula huésped,
ya sea genómico, cloroplástico o mitocondrial.
La expresión del ácido nucleico en la célula de
la invención da lugar a un biopolímero que puede ser purificado
mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Muestra la electroforesis
SDS-PAGE del biopolímero A.
Fig. 2. Muestra la dependencia de las
propiedades reológicas del polímero con la temperatura para una
muestra del biopolímero A en PBS y para una concentración de 200
mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los
valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho
los valores correspondientes a G'' (círculos negros), los valores
están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de
desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra la temperatura
(T) en ºC.
Fig. 3. Muestra la variación de las
propiedades reológicas a 37ºC para una muestra del biopolímero A en
PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los
valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho
los valores correspondientes a G'' (círculos negros), los valores
están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de
desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra el tiempo (t) en
minutos.
Fig. 4. Muestra la electroforesis
SDS-PAGE del biopolímero B.
Fig. 5. Muestra la dependencia de las
propiedades reológicas del polímero con la temperatura para una
muestra del biopolímero B en PBS y para una concentración de 200
mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los
valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho
los valores correspondientes a G'' (círculos negros), los valores
están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de
desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra la temperatura
(T) en ºC.
Fig. 6. Muestra la variación de las
propiedades reológicas a 37ºC para una muestra del biopolímero B en
PBS y para una concentración de 200 mg/ml.
En el eje de ordenadas izquierdo se muestran los
valores correspondientes a G' (círculos blancos) y en el eje derecho
los valores correspondientes a G'' (círculos negros), los valores
están en Pascales (Pa).
La escala Delta hace referencia al ángulo de
desfase, medido en grados.
En el eje de abcisas se muestra el tiempo (t) en
minutos.
Fig. 7. Muestra los biopolímeros de la
invención disueltos en PBS por debajo (4ºC) y por encima (37ºC) de
su temperatura de transición.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la
síntesis del biopolímero de la presente invención así como sus
características reológicas. Los ejemplos se proporcionan para poder
comprender la descripción, y no se pretende que sean limitativos de
la presente invención.
Desde el diseño del gen se tuvo que intentar
obviar la contradicción existente entre el uso de los codones más
frecuentes y oportunos que identifiquen aminoácidos muy repetidos y
la necesidad de no sobrecargar o incluso, empobrecer hasta el
colapso el sistema de traducción celular. Si se usan sistemas
heterólogos procariontes, se debe considerar el problema derivado
del limitado uso que hacen del código genético y que varía con la
especie. También se consideró el problema que reside en la creación
de un gen que está formado por una larga secuencia codificante por
múltiples y/o pequeños fragmentos artificiales. Por último se debe
soslayar la alta frecuencia de recombinación que suele ocurrir
cuando el ADN exógeno contiene repeticiones de dominios con alta
semejanza.
Esta etapa incluye la utilización de
sintetizadores automáticos de ADN junto con técnicas de ADN
recombinante. La obtención de polímeros con múltiples repeticiones
pasa por la obtención del gen que lo codifica, que según sea la
longitud de la secuencia puede hacer necesaria la síntesis previa de
un monómero polinucleotídico que se pueda interconectar linealmente
y en la dirección correcta.
La obtención de la cantidad suficiente del gen
monomérico con la secuencia correcta para producir las secuencias
nucleotídicas repetitivas que codifiquen los distintos polipéptidos
ha requerido el cultivo de los clones adecuados y de la digestión de
sus plásmidos. De esta forma se generó fácilmente la gran cantidad
de monómero necesaria para la reacción de ligación controlada,
concatenación o concatenamerización.
Aunque este tipo de estrategia parezca ser más
dispendiosa en términos de tiempo, la síntesis in vivo
garantiza la producción de la secuencia correcta en gran cantidad y
además ofrece ulteriores ventajas: permite controlar el gen
monomérico antes de la oligomerización, posibilita ulteriores
modificaciones de la secuencia sea por mutagénesis dirigida sea por
la creación de co-polímeros antes de la
oligomerización.
La polimerización de las secuencias
nucleotídicas monoméricas se puede llevar a cabo, pero sin
limitarse, por medio de la concatenación, es decir, la ligación
aleatoria de las piezas monoméricas; por medio del método iterativo
y recursivo, una técnica de preparación paso a paso de olígomeros
desde monómeros; o por medio del método de clonaje Seamless
que se trata de un método de clonaje sin costuras, definición que se
refiere a la posibilidad de elegir una secuencia específica que se
traduzca en el deseado aminoácido en el punto de corte.
La concatenación permite sintetizar polímeros de
oligómeros mediante la unión lineal unidireccional,
cabeza-cola, de los segmentos de ADN que forman el
monómero, esta unión solo es posible si los extremos de los
segmentos son de hebra única, protuberantes y cohesivos entre ellos
pero no consigo mismos. De esta forma el extremo a una hebra de la
cabeza del monómero será complementario y se hibridará
exclusivamente con el extremo de cola de otro monómero idéntico.
Estos extremos, por tanto, no pueden ser palindrómicos, como
corrientemente ocurre cuando son generados por las endonucleasas de
restricción empleadas rutinariamente en ingeniería genética, donde
el sitio de reconocimiento y corte coinciden secuencialmente, sino
que deben ser diferentes.
Se han ido desarrollando distintas
modificaciones a la técnica de la concatenación adaptándose a las
exigencias específicas. Los monómeros con extremos cohesivos de
única hebra se han obtenido por hibridación de oligómeros, por unión
de oligonucleótidos cortos (linkers) o también por digestión con
endonucleasas específicas.
El método iterativo y recursivo es una técnica
de preparación paso a paso de olígomeros desde monómeros, que
permite controlar tanto el orden de adición como el número de
bloques que se unirán en cada etapa de su crecimiento, permitiendo
confeccionar polímeros ad hoc. Para realizar tal método es
necesario crear unas secuencias en las extremidades del segmento que
codifiquen el monómero proteico que sean reconocidas por dos
diferentes endonucleasas y cuyos cortes produzcan extremidades
complementarias pero no palindrómicas. Esta secuencia monomérica es
clonada en un plásmido que sirve de vector de amplificación génica y
que proporciona tanto el siguiente vector de clonaje cuando se
digiere con un único enzima; como el inserto de la clonación
cortando con ambos enzimas.
El método de clonaje Seamless independiza
el diseño de la secuencia del inserto que codifica el monómero de
las secuencias reconocidas por las endonucleasas que lo generan.
Esta estrategia es posible por la existencia de un restringido
número de enzimas de restricción de tipo IIs que reconocen una
secuencia específica no palindrómica que no coincide con el sitio de
corte. Esta característica peculiar elimina los inconvenientes de la
necesidad de incluir secuencias extrañas al polímero para permitir
la generación de extremos cohesivos que permitan la concatenación y
además con una única digestión se logran fragmentos que se unen de
forma uni-direccional.
Una vez creada la secuencia nucleotídica que
codificaba el biopolímero completo se pasó a la expresión del mismo.
Para ello se transfirió la secuencia nucleotídica desde el
correspondiente vector de clonación al vector especializado en su
expresión mediante el uso de enzimas de restricción convencionales.
Una vez comprobada que la transferencia se ha producido
correctamente se transformó una cepa bacteriana específica para la
expresión de dicha secuencia mediante cualquiera de las técnicas
válidas que forman parte del conocimiento general común.
La expresión de las polipéptidos recombinantes
se inició inoculando una colonia aislada que contenía el vector
recombinante correspondiente en medio líquido LB con el eventual
antibiótico de resistencia de la cepa y el antibiótico de
resistencia adquirida con el vector de expresión.
Se incubó el cultivo bacteriano a 37ºC, con
agitación orbital a 250 rpm, durante 11 horas aproximadamente, se
utilizó este caldo de cultivo como inoculo de un medio fresco en una
relación de 1/30. El volumen de medio en los Erlenmeyers no superó
el 20-25% de su capacidad para favorecer una buena
oxigenación del cultivo y se continuó el crecimiento de las
bacterias en las mismas condiciones hasta que la densidad óptica a
600 nm estaba en torno a 0,6. En ese momento se indujo la expresión
del biopolímero recombinante añadiendo IPTG a una concentración
final de 1 mM, y se volvió a incubar el cultivo a la temperatura
adecuada y durante el tiempo requerido en cada ensayo.
Una vez terminada la inducción, se inhibió el
crecimiento y el metabolismo de las bacterias enfriándolas a 4ºC.
Posteriormente, se sedimentaron las células centrifugando a 5000xg
durante 10 minutos a 4ºC, se decantó el sobrenadante y se secaron
las paredes de los tubos de centrífuga para retirar los restos de
medio de cultivo.
Se lavó el cultivo sedimentado con 100 mL/L de
cultivo en tampón salino TBS (Tris-base 20 mM, NaCl
150 mM pH=8) resuspendiendo las bacterias mediante agitación fuerte
y/o pipeteo, y se volvió a centrifugar a 5000xg durante 10 minutos a
4ºC. A continuación se decantó el sobrenadante, y se resuspendió el
sedimento con 25 mL/L de cultivo con la solución TE
(Tris-base 20 mM, EDTA 1 mM pH=8) mediante agitación
fuerte y/o pipeteo. Se mantuvo a 4ºC y se le añadió 10 \mug/mL del
inhibidor de proteasa PMSF.
Las bacterias se lisaron sonicando con un
aparato Sonicator 3000 de Misonix (New York) se realizaron 6
ciclos de 3,5 minutos con pulsos de 2 segundos cada 5 segundos a
unos 100 W de potencia. Durante este proceso, la muestra se mantuvo
en hielo para evitar la desnaturalización y precipitación por calor
de las proteínas. Por último, se centrifugó a 15000xg durante 60
minutos a 4ºC: el sobrenadante constituye la fracción soluble total,
y el sedimento, la fracción insoluble total. La fracción soluble
total de las bacterias se acidificó hasta un pH=3,5 con ácido
clorhídrico diluido en agua manteniendo la muestra en hielo y en
agitación. A continuación, el material precipitado (fundamentalmente
proteínas ácidas y ADN) se retiró por centrifugación a 15000xg
durante 20 minutos a 4ºC. Según el polímero en cuestión se modificó
o no la concentración salina y el valor de pH del sobrenadante.
La purificación de los polímeros se realizó
aprovechando la naturaleza inteligente de los polímeros tipo
elastina, y su transición inversa. La purificación de los polímeros
recombinantes a partir de la fracción soluble de E. coli
consta de etapas sucesivas de
calentamiento-precipitación y
enfriamiento-resuspensión. La precipitación
selectiva se realizó mediante el calentamiento de la muestra a 70ºC
durante dos horas. A continuación se separó el precipitado
centrifugando a 15000xg durante 20 minutos a 40ºC y se solubilizó el
precipitado a 2 mL/L de agua tipo I a 4ºC en agitación durante 12
horas. Se repitió la operación dos veces más. Tras la última
solubilización, el polímero disuelto se dializó frente a agua de
tipo I a 4ºC, posteriormente se liofilizó y se conservó a -20ºC.
Como primer ejemplo se describe un copolímero
tipo elastina A con capacidad de autoensamblarse por contener
bloques alternantes con carácter hidrofóbicos e hidrofílicos de
forma que al superar su temperatura de transición inversa cambian
drásticamente sus propiedades mecánicas. En este caso los bloques
hidrofóbicos corresponden con péptidos tipo B donde la secuencia
aminoacídica es SEQ ID NO: 3 y los hidrofílicos a péptidos tipo
[(D)_{2}(E)(D)_{2}]. Además, la secuencia
aminoacídica C incluye una secuencia bioactiva RGD no específica. Es
decir, el biopolímero de este ejemplo tiene la estructura:
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{60}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis del polímero se realizó tal como se
ha descrito en el ejemplo 1. Para sintetizar el bloque hidrofílico
de 25 aminoácidos
(D_{2}-E-D_{2}) se generó una
secuencia nucleotídica artificial por hibridación de dos
oligonucleóticos complementarios con la secuencia SEQ ID NO: 17.
Con el objeto de que la secuencia monomérica
anterior pudiera concatenarse para formar la secuencia completa, se
situaron convenientemente en los extremos del mismo sendas
secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción que, al ser
utilizadas, dejarán como extremos cohesivos únicamente el codón GTA
codificante para el aminoácido Valina. De esta forma se pueden
formar cadenas del monómero sin saltos en su marco de lectura y sin
la incorporación de codones ajenos a la secuencia deseada.
Siguiendo la técnica de concatenación se obtuvo
una secuencia nucleotídica formada por 10 repeticiones de la
secuencia inicial, con una longitud de zona codificante de 750 pares
de bases y flanqueado también por las secuencias de restricción y
sendos codones GTA de enlace.
En la síntesis del bloque hidrofóbico se partió
de un fragmento de mayor tamaño pero que también fue sintetizado a
partir de oligonucleótidos de síntesis química. En este caso el
monómero peptídico tenía la estructura (B)_{20} donde B es
SEQ ID NO: 3, codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:
18.
También esta vez se usaron las mismas enzimas de
restricción y por tanto las mismas secuencias flanqueantes del gen
codificante, si bien en este caso se utilizó la técnica recursiva
iterativa para repetir tres veces el gen descrito y formar un gen de
900 pares de bases que codifica 60 repeticiones del pentabloque tipo
B.
La secuencia nucleotídica del bloque hidrofílico
descrito
(D_{2}-E-D_{2})_{10} y
el correspondiente al bloque hidrofóbico (B)_{60} donde B
es SEQ ID NO: 3, se fusionaron utilizando las secuencias de
restricción citadas situando en el extremo 5' el gen que codifica
para el bloque hidrofílico. Posteriormente la secuencia resultante,
con una longitud de 1650 pares de bases, se duplicó por la técnica
recursiva dando lugar a la secuencia de 3300 pares de bases que
codifica el polipéptido
(D_{2}-E-D_{2})_{10}-(B)_{60}
La incorporación de la secuencia bioactiva se
realizó por la misma técnica descrita.
En este caso, la secuencia que codifica la
estructura (G_{10}-H-G_{10}) es
SEQ ID NO: 19.
En este caso, también se duplicó el fragmento
por las mismas técnicas descritas antes de unirlo al tetrabloque de
1650 pares de bases. El producto de la duplicación tenía una
longitud de 672 pares de bases codificando un polipéptido de 224
aminoácidos. La incorporación del fragmento con las dos secuencias
bioactivas RGD al extremo 3' del fragmento de 3330 pares de bases se
realizó por la técnica iterativa recursiva usando las enzimas de
restricción ya mencionadas.
Como resultado de la incorporación de los
fragmentos se obtuvo una secuencia de 3972 pares de bases que
codifica el polipéptido abreviado:
[D_{2}-E-D_{2}]_{10}-[B]_{60}-[D_{2}-E-D_{2}]_{10}-[B]_{60}-[(G)_{10}-H-(G)_{10}]-[(G)_{10}-H-(G)_{10}]
Esta secuencia se incorporó a un vector de
expresión previamente modificado para aceptar fragmentos procedentes
de la digestión con las enzimas de restricción adecuadas descritas
incorporando la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20 en el extremo
5' del fragmento de 3972 pares de bases y la secuencia GTATGA en el
extremo 3' del mismo. El plásmido resultante comprende una secuencia
nucleotídica con un marco abierto de lectura de 3996 pares de bases,
SEQ ID NO: 21, que codifica para 1331 aminoácidos, SEQ ID NO:
22.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión se usó para transformar
una cepa de Escherichia coli adecuada a la expresión de genes
exógenos seleccionando las colonias transformantes mediante el
apropiado antibiótico.
Se usó una de las colonias resultantes de la
transformación para inocular un volumen de medio LB con el mismo
antibiótico y un 1% de glucosa. Tras la incubación a 37ºC con
agitación orbital a 250 rpm durante toda la noche, el cultivo
bacteriano se utilizó para inocular un volumen 100 veces superior de
medio TB con el mismo antibiótico utilizado y una concentración de
0,8% (v/v) de glicerol, un 0,2% (p/v) de
alfa-lactosa y un 0,05% (p/v) de glucosa.
Tras incubación en las mismas condiciones
anteriores se aislaron por centrifugación las células resultantes y
se sometieron a dos lavados con tampón salino. Posteriormente se
resuspendieron en tampón con EDTA y se añadió PMSF en una
concentración final de 1 mM. La suspensión celular se rompieron por
sonicación manteniendo su temperatura a 4ºC y el extracto se
centrifugó para retirar los restos bacterianos.
El sobrenadante del extracto bacteriano se
sometió a varios ciclos de calentamiento a 60ºC, centrifugación,
recolección del sedimento y solubilización a 4ºC en tampón con EDTA.
Cada paso de la purificación se verificó por electroforesis en
poli-acrilamida en presencia de SDS. Cuando se
consideró que el polímero estaba suficientemente puro se dializó la
solución frente a agua tipo I y se liofilizó, manteniendo el
polímero liofilizado en lugar seco y frío hasta su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar el biopolímero A se realizó
una electroforesis en gel de acrilamida (PAGE) en presencia de SDS
que permitió estimar de forma aproximada el Peso Molecular del
polímero además de verificar su pureza. En la Fig. 1, la calle de la
izquierda corresponde a la muestra y la de la derecha a los
marcadores (Fermentas SM0431). En dicha figura se observa una buena
producción del polímero además de poderlo identificar como
electroforéticamente puro. La posición de la banda del polímero
coincidió con el marcador de 116 kDa por lo que el biopolímero A
tiene este peso molecular aparente.
También se realizó una espectrometría de masas
MALDI-TOF en un espectrómetro modelo
Q-Star para calcular exactamente el peso molecular
del polímero. De dicho análisis se dedujo que el peso molecular es
de 112292 Da.
La caracterización física del material se llevó
a cabo mediante un estudio reológico. Los ensayos se realizaron en
reómetro de esfuerzo controlado AR2000ex (TA Instruments) utilizando
platos paralelos con un gap de 250 \mum. Para la gelificación las
soluciones fueron colocadas sobre un plato Peltier termostatizado.
El rango de viscoelasticidad lineal se determinó a 1 Hz de
frecuencia seleccionándose dentro de este rango una deformación del
0.5% para los barridos de tiempo y temperatura.
Se prepararon muestras en PBS de 50,100,150 y
200 mg/ml de concentración del biopolímero A y se sometieron a un
calentamiento entre 4 y 60ºC y a una velocidad de 1ºC/min, con el
fin de obtener sus propiedades reológicas. Se identificó la
temperatura de gelificación con el "punto gel"
(T^{a}_{gel}), que se define como el punto en que G' es igual a
G'' (Pilosof 2000).
A modo de ejemplo, en la Fig. 2 se muestran el
módulo elástico o de almacenamiento (G'), módulo viscoso o de
pérdida (G'') y el ángulo de desfase (delta) para la muestra de 200
mg/ml de concentración. El ángulo de desfase delta indica la
relación entre la elasticidad y la viscosidad De dicha figura se
obtiene una temperatura de gelificación de 16ºC, visualizándose que
el inicio de la reestructuración comienza a 10ºC y alcanzándose las
mejores propiedades mecánicas a los 26ºC. Para el resto de las
concentraciones la temperatura de gelificación es la misma. De esta
manera se puede concluir que una vez introducido el producto en el
organismo alcanza sus mejores cualidades mecánicas. Además en la
Tabla 1 pueden observarse los valores alcanzados del módulo
elástico, módulo viscoso y ángulo de desfase para las distintas
concentraciones. De dichos valores se deduce que las propiedades
mecánicas del material disminuyen de la muestra de mayor
concentración a la de menor concentración. Para la muestra de 200
mg/ml el valor de G' es de 3.0x10^{5} Pa y para la de 50 mg/ml de
5.7x10^{4}.
Otra característica de vital importancia como ya
se ha mencionado es el tiempo que el sistema una vez inyectado tarda
en gelificar a la temperatura corporal, es decir a producirse su
autoensamblado y el cambio de sus propiedades mecánicas y en
especial de su viscosidad para que no se produzca su dispersión en
el interior del organismo. En este sentido y para conocer la
cinética de gelificación se realizaron ensayos reológicos en modo
isotermo y a 37ºC, de manera que se estudiaron las variaciones de
las propiedades reológicas, respecto al tiempo, de las disoluciones
del copolímero A en solución PBS. La Fig. 3 muestra los resultados
obtenidos para la muestra de concentración de 200 mg/ml. Como se
observa en dicha figura, tiempos de calentamiento superiores a 4
minutos no afectan significativamente a los valores de los módulos
de pérdida y almacenamiento, observándose la formación del gel
transcurridos 2 minutos de someter la muestra a 37ºC.
En la Tabla 1 también se reflejan datos acerca
de la inyectabilidad de las muestras con agujas de diferentes
diámetros. Se ensayó con agujas G20 y G26, observándose que hasta
una concentración de 150 mg/ml las muestras son fácilmente
inyectables con agujas de diámetros de hasta G26 mientras que las de
200 mg/ml se inyectaban con cierta dificultad con agujas de dicho
diámetro y con agujas tipo G20 se inyectaban con facilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como primer ejemplo se describe un copolímero
tipo elastina B con capacidad de autoensamblarse por contener
bloques alternantes con carácter hidrofóbicos e hidrofílicos de
forma que al superar su temperatura de transición inversa cambian
drásticamente sus propiedades mecánicas. En este caso los bloques
hidrofóbicos corresponden péptidos tipo B donde la secuencia
aminoacídica es SEQ ID NO: 4 y los hidrofílicos a péptidos tipo
[(D)_{2}(E)(D)_{2}]. Además, la secuencia
aminoacídica C incluye una secuencia bioactiva RGD no específica. Es
decir, el biopolímero de este ejemplo tiene la estructura:
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{20}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis del polímero se realizó tal como se
ha descrito en el ejemplo 1. Para sintetizar el bloque hidrofílico
de 25 aminoácidos
(D_{2}-E-D_{2}) se generó una
secuencia nucleotídica artificial por hibridación de dos
oligonucleóticos complementarios con la secuencia SEQ ID NO: 17.
Con el objeto de que la secuencia monomérica
anterior pudiera concatenarse para formar la secuencia completa, se
situaron convenientemente en los extremos del mismo sendas
secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción que, al ser
utilizadas, dejarán como extremos cohesivos únicamente el codón GTA
codificante para el aminoácido Valina. De esta forma se pueden
formar cadenas del monómero sin saltos en su marco de lectura y sin
la incorporación de codones ajenos a la secuencia deseada.
Siguiendo la técnica de concatenación se obtuvo
una secuencia nucleotídica formada por 10 repeticiones de la
secuencia inicial, con una longitud de zona codificante de 750 pares
de bases y flanqueado también por las secuencias de restricción y
sendos codones GTA de enlace.
En la síntesis del bloque hidrofóbico se partió
de un fragmento de mayor tamaño pero que también fue sintetizado a
partir de oligonucleótidos de síntesis química. En este caso el
monómero peptídico tenía la estructura (B)_{20} donde B es
SEQ ID NO: 4, codificado por la secuencia nucleotídica SEQ ID NO:
23.
También esta vez se usaron las mismas enzimas de
restricción y por tanto las mismas secuencias flanqueantes del gen
codificante. La secuencia nucleotídica del bloque hidrofílico
descrito
(D_{2}-E-D_{2})_{10} y
el correspondiente al bloque hidrofóbico (B)_{20}, donde C
es SEQ ID NO: 4, se fusionaron utilizando las secuencias de
restricción citadas situando en el extremo 5' el gen que codifica
para el bloque hidrofílico. Posteriormente la secuencia resultante,
con una longitud de 1050 pares de bases, se duplicó por la técnica
recursiva dando lugar a la secuencia de 2100 pares de bases que
codifica el polipéptido
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-(B)_{20}]_{2}.
La incorporación de la secuencia bioactiva se
realizó por la misma técnica descrita.
La secuencia que codifica la estructura
(G_{10}-H-G_{10}) es SEQ ID NO:
19.
En este caso, también se duplicó el fragmento
por las mismas técnicas descritas antes de unirlo al tetrabloque de
2100 pares de bases. El producto de la duplicación tenía una
longitud de 672 pares de bases codificando un polipéptido de 224
aminoácidos. La incorporación del fragmento con las dos secuencias
bioactivas RGD al extremo 3' del fragmento de 2100 pares de bases se
realizó por la técnica iterativa recursiva usando las enzimas de
restricción ya mencionadas.
Como resultado de la incorporación de los
fragmentos se obtuvo una secuencia de 2772 pares de bases que
codifica el polipéptido abreviado:
[D_{2}-E-D_{2}]_{10}-[B]_{20}-[D_{2}-E-D_{2}]_{10}-[B]_{20}-[(G)_{10}-H-(G)_{10}]-[(G)_{10}-H-(G)_{10}]
donde B es SEQ ID NO: 4.
Esta secuencia se incorporó a un vector de
expresión previamente modificado para aceptar fragmentos procedentes
de la digestión con las enzimas de restricción adecuadas descritas
incorporando la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 20 en el extremo
5' del fragmento de 2772 pares de bases y la secuencia GTATGA en el
extremo 3' del mismo. El plásmido resultante comprende una secuencia
nucleotídica con un marco abierto de lectura de 2796 pares de bases,
SEQ ID NO: 24, que codifica para 931 aminoácidos, SEQ ID NO: 25.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión del biopolímero recombinante B se
llevó a cabo del mismo modo que se ha descrito en el ejemplo
2.2.
De la misma forma que en el ejemplo 2 se realizó
una electroforesis en gel de acrilamida (PAGE) en presencia de SDS.
En la Fig. 4, la calle de la derecha corresponde a la muestra y la
de la izquierda a los marcadores (Fermentas SM0431). En dicha figura
se observa una buena producción del biopolímero además de poderlo
identificar como electroforéticamente puro. La posición de la banda
del biopolímero nos permite estimar que el peso molecular aparente
del polímero está entre 75 y 85 kDa.
También se realizó una espectrometría de masas
MALDI-TOF en un espectrómetro modelo
Q-Star para calcular exactamente el peso molecular
del polímero. De dicho análisis se dedujo un valor de 78379 Da.
La caracterización física del material se llevó
a cabo mediante un estudio reológico como en el caso anterior. Los
ensayos se realizaron en reómetro de esfuerzo controlado AR2000ex
(TA Instruments, España) usando platos paralelos con un gap de 250
\mum. Para la gelificación las soluciones fueron colocadas sobre
un plato Peltier termostatizado. El rango de viscoelasticidad lineal
se determino a 1 Hz de frecuencia seleccionándose dentro de este
rango una deformación del 0.5% para los barridos de tiempo y
temperatura.
Se prepararon muestras en PBS de 200 mg/ml de
concentración y se sometieron a un calentamiento entre 4 y 60ºC y a
una velocidad de 1ºC/min, con el fin de obtener sus propiedades
reológicas. Se identificó la temperatura de gelificación con el
"punto gel" (T^{a}_{gel}), que se define como el punto en
que G' es igual a G'' (Pilosof
2000).
2000).
En la Fig. 5 se representa el módulo elástico o
de almacenamiento (G'), módulo viscoso o de pérdida (G'') y el
ángulo de desfase (delta) para la disolución del copolímero B
respecto de la temperatura. De dicha figura se obtiene una
temperatura de gelificación de 29ºC, visualizándose que el inicio de
la reestructuración comienza a 25ºC y alcanzándose las mejores
propiedades mecánicas a los 33ºC. Aunque dicha temperatura es
inferior a la corporal es una temperatura muy próxima a ella y por
lo tanto podrían surgir problemas en zonas corporales en que por
algún motivo se produzcan descensos de la temperatura. Además, en la
Tabla 2 pueden observarse los valores alcanzados del módulo
elástico, módulo viscoso y ángulo de desfase. El valor de G' es de
2.5x10^{5} Pa muy parecido a los 3.0x10^{5} Pa del copolímero
A.
\newpage
En la Fig. 6 se observa la formación del gel
pasados 21 minutos (t_{gel}) de someter la muestra a 37ºC y que
tarda unos 37 minutos en alcanzar las propiedades óptimas es decir,
presenta una cinética sensiblemente más lenta que la del biopolímero
A.
En la Tabla 2 también se reflejan datos acerca
de la inyectabilidad de las muestras con agujas de diferentes
diámetros. Se ensayó con agujas G20 y G26, observándose que las
muestras son fácilmente inyectables con ambos tipos de agujas. Dicho
resultado es razonable ya que la viscosidad de la disolución del
copolímero B para una concentración de 200 mg/ml es comparable a la
del copolímero A para concentraciones de 50 mg/ml y a su vez es
justificable ya que el peso molecular del copolímero B es inferior
al del copolímero A.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto de los resultados de los dos ejemplos
se concluye que las propiedades del copolímero B son ligeramente
inferiores a las del copolímero A presentado en el ejemplo 2. Aunque
los módulos elásticos que se alcanzan para los dos copolímeros son
muy parecidos, el tiempo y la temperatura de gelificación son
sensiblemente mayores para el copolímero B del ejemplo 3.
En la Fig. 8 pueden verse unas imágenes de
biopolímeros tipo elastina autogelificables disueltos en una
solución PBS por debajo de su temperatura de transición, a 4ºC,
donde se encuentra en estado líquido y por encima de su temperatura
de transición, a 37ºC, donde se encuentran gelificados.
Claims (27)
1. Biopolímero que comprende las secuencias
aminoacídicas A, B y C con la estructura
(A_{n}-B_{m})_{s}-C_{p},
donde,
A tiene la estructura
(D_{t1}-E_{v1}-D_{t2}) o la
estructura (D_{t1}-E_{v2}), donde D es SEQ ID
NO: 1; E es SEQ ID NO: 2; t1 y t2 tienen valores de entre 2 y 4; y
v1 y v2 tienen valores de entre 1 y 5,
B se selecciona de la lista que comprende SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 26 (VPAIG),
C tiene la estructura
(G_{w1}-H_{x1}-G_{w2}) o
H_{x2}, donde G es SEQ ID NO: 5; H es una secuencia aminoacídica
que comprende un péptido que se selecciona de la lista que comprende
RGD, LDT, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID
NO: 15 o SEQ ID NO: 16; w1 y w2 tienen valores de entre 5 y 15; y x1
y x2 tienen valores de entre 1 y 5,
n tiene un valor de entre 5 y 15,
m tiene un valor de entre 10 y 70,
s tiene un valor de entre 2 y 4, y
p tiene un valor de entre 1 y 5.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Biopolímero según la reivindicación 1 donde A
tiene la estructura
(D_{t1}-E_{v1}-D_{t2}).
3. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 donde C tiene la estructura
(G_{w1}-H_{x1}-G_{w2}).
4. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde la secuencia aminoacídica de H contiene
el péptido RGD.
5. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 donde la secuencia aminoacídica de H que
contiene el péptido RGD es SEQ ID NO: 6.
6. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde la secuencia aminoacídica B es SEQ ID
NO: 3.
7. Biopolímero según la reivindicación 6, donde
m tiene un valor de entre 55 y 65.
8. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7 que comprende los péptidos B, D, E, G, D y H
con la estructura
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{60}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
9. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido B es SEQ ID NO: 4.
10. Biopolímero según la reivindicación 9, donde
m tiene un valor de entre 15 y 25.
11. Biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10 que comprende los péptidos B, D, E, G y H
con la estructura
[(D_{2}-E-D_{2})_{10}-B_{20}]_{2}-(G_{10}-H-G_{10})_{2}.
12. Ácido nucleico que comprende una
secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia aminoacídica
del biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Vector de expresión que comprende el ácido
nucleico según la reivindicación 12.
14. Célula aislada transfectada con el vector
según la reivindicación 13.
15. Uso del biopolímero según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de un implante.
16. Implante que comprende el biopolímero según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
17. Implante según la reivindicación 16, donde
el biopolímero tiene una concentración de entre 30 y 300 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Implante según cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 17, donde se presenta en una forma adaptada a
la administración parenteral.
19. Implante según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18 donde incluye además una sustancia
activa.
20. Uso del implante según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, para el tratamiento de cartílago o
hueso.
21. Uso del implante según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, para el tratamiento del tejido nervioso o
médula espinal.
22. Uso del implante según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, para el tratamiento de necrosaciones de
varices.
23.Vehículo farmacéuticamente aceptable que
comprende el biopolímero según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 11.
24. Vehículo farmacéuticamente aceptable según
la reivindicación 23, donde el biopolímero tiene una concentración
de entre 30 y 300 mg/ml.
25. Vehículo farmacéuticamente aceptable según
cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, donde se presenta en una
forma adaptada a la administración parenteral.
26. Uso del vehículo farmacéuticamente aceptable
según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, para la liberación
controlada de fármacos.
27. Método para la obtención del biopolímero
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende:
- a.
- insertar el ácido nucleico de la reivindicación 12 en un vector de expresión,
- b.
- transfectar una célula con el vector de expresión obtenido según el apartado (a),
- c.
- seleccionar la célula transfectada según el apartado (b) que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 12,
- d.
- expresar el ácido nucleico en la célula según el apartado (c) y
- e.
- purificar el biopolímero producido según el apartado (d).
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