KR102642856B1 - 자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로젤의 생접착제 응용 - Google Patents

자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로젤의 생접착제 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP); 및 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, sEBP)를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드(sticky multiblock copolypeptide)에 관한 것으로서, 상기 sEBP는 티로신(Y)과 리신(K)을 포함하고, 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 개질되어 리신 양이온과 DOPA간 π-양이온 상호작용을 바탕으로 표면 접착성을 나타내며, 특히 습윤 조건 하에서도 표면 부착성이 매우 우수하다. 상기 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드는 온도 자극에 따라 가역적인 변화가 가능한, 자가조립된 코어-쉘 구조 및 하이드로젤을 형성하므로, 생체코팅제, 생접착제 등 바이오메디칼 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로젤의 생접착제 응용{Sticky elastin-based multiblock copolypeptides with stimuli-responsiveness and surface adhesion properties, their self-assembled nanostructures and injectable hydrogels as bio-adhesives for biomedical applications}
본 발명은 자극 반응성 및 표면 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 기반 다중 블록 코폴리펩타이드, 그의 자가조립 구조체 및 주사형 하이드로젤의 생접착제 응용 등에 관한 것이다.
천연 및 합성 아미노산을 포함하는 단백질-기반 생체재료는 이들의 아미노산 서열과 분자량이 분자 수준에서 정확하게 조절되고, 다양한 공유결합 및 비공유결합에 따른 독특한 물리화학적 특성을 가지기 때문에 큰 관심을 받고 있다. 특히, 자극 반응성 및 이의 정교한 조절은 단백질-기반 생체재료의 독특한 특성 중 하나이다. 자극 반응성 단백질은 pH, 온도, 이온, 및 리간드와 같은 자극제에 의해 상당한 형태학적 변화를 겪는다. 또한, 자극 반응성을 가진 단백질은 다양한 자극에 의해 형성된 마이셀, 베시클, 및 하이드로젤과 같은 자가조립 구조의 빌딩 블록으로 사용된다. 따라서, 자극 반응성 생체재료는 바이오메디칼 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
포유류의 엘라스틴에서 유래한 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(Elastin-based polypeptides, EBPs)는 자극 반응성 생체재료로, 이의 물리화학적 특성은 온도에 따라 변화한다. 다중 펜타펩타이드 반복 유닛 Val/Ile-Pro-Gly/Ala-Xaa-Gly은 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST), 즉 전이 온도(transition temperature, Tt)에서 가역적인 역상전이를 겪으며, 이 때 상기 Xaa는 프롤린(P)를 제외한 모든 아미노산이 될 수 있다. 상기 EBP는 친수성이기 때문에 LCST보다 낮은 온도에서는 가용성이며, 온도가 LCST 이상으로 상승하면, EBP가 응집되어 불용성으로 변화한다. 일반적으로 EBP의 물리화학적 성질은 펜타펩타이드 반복 유닛의 4번째에 위치한 게스트 잔기(guest residue)로서 아미노산의 비율과 조성, 펜타펩타이드의 반복 횟수에 따라 정확하게 조절된다. 보다 구체적으로, 게스트 잔기와 펜타펩타이드의 반복 유닛은 Tt에 영향을 미치고, 펜타펩타이드 유닛의 세번째 아미노산은 EBP의 유연성을 결정한다. 예를 들어, 펜타펩타이드 유닛의 세번째 아미노산이 글리신(G)인 경우 EBP는 유연성을 나타내나, 동일한 위치에서 알라닌(A)의 경우 EBP가 좀 더 단단한 성질을 가진다. 펜타펩타이드 반복의 독특한 조합에 따라, 본래의 물리화학적 성질 및 Tt를 가진 EBP는 온도 자극에 따라 마이셀, 하이드로젤과 같은 자가조립 구조체를 형성하거나, 부착성 또는 금속 이온과의 배위와 같이 게스트 잔기에 기능적인 아미노산을 도입함으로써 새로운 기능을 나타낸다.
최근, 홍합 족사 단백질, 빨판과 같은 생체 접착 단백질이 생체 재료로서 특히, 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 관심을 받고 있다. 가혹하고 습한 조건에서 홍합의 접착에서 영감을 받은 본 발명의 접착 단백질은 티로신(Y)의 수산화 형태로서 모두 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 가지고 있어, DOPA 분자와 접착 표면 분자 간 다양한 상호작용을 통해 표면 부착하고 리신(K)과 π-양이온 상호작용을 통해 접착력을 증가시킨다.
본 발명자들은, 생접착제로 활용될 수 있는 자극반응성과 부착성을 가진 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky EBPs, sEBPs)에 대한 연구를 계속하였다. 그 결과, 자극반응성을 가진 EBP와 자극반응성과 부착성을 가진 점착성 sEBP를 포함하고, DOPA로 개질된 다중 블록 코폴리펩타이드, 이의 자가조립 나노구조체, 및 하이드로젤의 표면 부착성이 매우 우수하다는 점을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
Figure 112021097264915-pat00001
Stuart, M. A. C.; Huck, W. T.; Genzer, J.; Mller, M.; Ober, C.; Stamm, M.; Sukhorukov, G. B.; Szleifer, I.; Tsukruk, V. V.; Urban, M., Emerging applications of stimuli-responsive polymer materials. Nature materials 2010, 9 (2), 101-113.
본 발명의 목적은 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP)와 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, sEBP)를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드(sticky multiblock copolypeptide)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제조하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드로 형성된 자가조립 나노구조체 및 하이드로젤, 이를 포함하는 접착용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP); 및 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, sEBP)를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드(sticky multiblock copolypeptide)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 sEBP는 티로신(Y)과 리신(K)을 포함하고, 상기 티로신(Y)은 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 (sEBP)n(EBP)n; (EBP)n(sEBP)n; (sEBP)n(EBP)n(sEBP)n; 및 (EBP)n(sEBP)n(EBP)n으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배열로 구성되며,
상기 n은 1 이상의 정수이고, EBP 또는 sEBP의 반복 횟수이며,
상기 sEBP가 친수성인 경우 EBP는 소수성이고, 상기 sEBP가 소수성인 경우 EBP는 친수성인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 소수성 EBP는,
하기 식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[식 1]
[VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]n
상기 식 1에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 1의 반복 횟수이고;
상기 X는 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 리신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
리신(K), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
아스파르트산(D), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
글루탐산(E), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
글리신(G), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
리신(K), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
아스파르트산(D), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
리신(K), 페닐알라닌(F)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
아스파르트산(D), 페닐알라닌(F)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
히스티딘(H), 알라닌(A), 이소루신(I)이 3:3:1의 비율로 이루어지거나,
히스티딘(H), 글리신(G)이 5:1의 비율로 이루어지거나,
글리신(G), 시스테인(C), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 친수성 EBP는, 하기 식 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[식 2]
[VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]n
상기 식 2에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 2의 반복 횟수이고;
상기 X는 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 리신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 및 페닐알라닌(F)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 식 2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
리신(K), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
아스파르트산(D), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
글루탐산(E), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
글리신(G), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 sEBP는, 하기 식 3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
[식 3]
[IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]n
상기 식 3에서,
상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 3의 반복 횟수이고;
상기 X는 티로신(Y), 리신(K), 및 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 식 3에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
티로신(Y), 리신(K)이 2:4의 비율로 이루어지거나,
티로신(Y), 리신(K)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
티로신(Y), 리신(K), 이소루신(I)이 2:2:2의 비율로 이루어지거나,
티로신(Y), 리신(K)이 4:2의 비율로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 또는 인공 아미노산을 의미하며, 바람직하게는 천연 아미노산을 의미한다. 예컨대 상기 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 글루타민, 아스파라진, 시스테인, 히스티딘, 페닐알라닌, 아르기닌, 타이로신 또는 트립토판 등을 의미한다. 상기 아미노산의 성질은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다. 구체적으로 친수성(음전하성 또는 양전하성)을 나타내거나 소수성을 나타내고, 지방족 또는 방향족의 성질도 나타낸다.
본 명세서에서 사용하는 Gly(G), Ala(A) 등의 약어는 아미노산 약어이다. Gly는 글라이신의, Ala는 알라닌의 약어이다. 또한 글라이신은 G, 알라닌은 A라고도 표현한다. 상기 약어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 표현이다.
본 발명에서 용어 "폴리펩타이드"란 아미노산의 임의의 중합체 체인을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 체인을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "코폴리펩타이드(copolypeptide)란 공중합체(copolymer)인 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어 “상 전이(phase transition)”이란, 물이 수증기로 변하거나 얼음이 물로 변하는 것과 같이, 물질의 상태가 변하는 것을 의미한다.
본 발명의 융합 폴리펩타이드는 기본적으로 자극 반응성을 가지는 엘라스틴계 폴리펩타이드(elastin-based polypeptides: EBPs)를 포함하며, 상기 “엘라스틴계 폴리펩타이드”는 “엘라스틴-유사 폴리펩타이드(ealstin-like polypeptieds: ELP)”라고도 불린다. 본 발명의 기술분야에서 널리 사용되는 용어이다.
본 발명에서, 상기 Xaa(또는 X)는 “게스트 잔기”라고 칭한다. 상기 Xaa를 다양하게 도입하여 본 발명에 따른 다양한 종류의 EBP를 제조할 수 있다.
상기 EBP는, 전이 온도(transition temperature: Tt)라고도 칭하는 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature: LCST)에서 가역 상 전이를 거친다. 이들은, Tt 미만에서 수용성이 크지만, 온도가 Tt를 초과하면 불용성으로 된다.
본 발명에서, EBP의 물리화학적 특성들은 펜타펩타이드 반복 단위인 Val-Pro-(Gly 또는 Ala)-Xaa-Gly의 조합에 의해 주로 제어된다. 구체적으로, 그 반복 단위의 3번째 아미노산은 상대적 기계적 특성을 결정한다. 예를 들어, 본 발명에서, 3번째 아미노산인 Gly는 탄력성(elasticity)을, 또는 Ala는 가소성(plasticity) 결정한다. 상기 탄성 또는 가소성은 전이 이후에 나타나는 성질이다.
한편, 4번째 아미노산인 게스트 잔기 Xaa의 소수성과 펜타펩타이드 반복 단위의 중합화(multimerization)는, 모두 Tt에 영향을 끼친다. 상기 Tt에 따라 EBP는 친수성 또는 소수성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 EBP는 펜타펩타이드가 반복된 폴리펩타이드일 수 있고, 이 반복된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 블럭(EBP 블럭)을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 미생물은 버섯 유래 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입되어 공동 발현되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λλλλλλλCharon4A, 및 Charon21A을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λ과 λNM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
본 발명의 숙주 세포는 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 도입된 재조합 미생물이거나, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 미생물에 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 염색체에 통합되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 재조합 미생물을 의미한다. 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
본 발명에서, "co-expression"은 두 개 이상의 유전자가 동시에 발현되는 것을 의미하며, 본 발명에서는 “공동발현”이라고 표현한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:
(1) 제11항의 재조합 미생물을 배양하여 다중 블록 코폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
(2) 상기 생성된 다중 블록 코폴리펩타이드를 수득하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (1) 단계의 재조합 미생물은, 버섯 유래 티로시나제를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입되어 상기 다중 블록 코폴리펩타이드와 티로시나제가 공동 발현되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 소수성 EBP가 코어 구조를 형성하고, sEBP가 쉘 구조를 형성함으로써 자가조립으로 제조되는, 나노구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 블록 폴리펩타이드간 가교 결합을 형성하여 제조되는, 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 블록 코폴리펩타이드, 이의 나노구조체, 또는 하이드로젤을 포함하는 접착용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 코어-쉘 구조는 마이셀 구조를 의미하며, 마이셀은 일반적으로 양친성, 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형의 구조를 지칭하는 것이다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성 약물을 녹여 투입하는 경우 약물은 마이셀 내부에 존재하게 되며, 이러한 마이셀은 체내에서 온도나 pH 변화에 반응하여 표적 지향적 약물방출을 할 수 있으므로, 약물전달용 캐리어로서의 응용 가능성이 대단히 높다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 다중 블록 코폴리펩타이드가 자가조립된 나노구조체도 약물전달체로 활용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다중 블럭 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 블럭 폴리펩타이드 간 가교 결합을 형성하여 제조되는 하이드로젤은 실제 조직과 비슷한 기계적 유연함을 가지고 있고, 물을 많이 함유하되, 물에 의해 젤의 결합이 끊어지지 않기 때문에, 수분을 포함하는 젖은 생체 표면과의 접착을 필요로 하고 외부 수분에도 저항성을 가지고 있어야 하는 의료용 접착제 등으로의 응용이 활발하게 이루어지고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 우수한 조직 접착성을 갖는 하이드로젤은 조직 접착제 또는 지혈제, 조직공학용 지지체, 약물 전달 담체, 조직충진제, 상처 치료, 또는 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
본 발명의 생체접착제 조성물은 현재 시중에서 주로 이용되고 있는 시아노아크릴계 접착제 또는 피브린계 접착제 등을 대체하여, 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 생체적합성 생체조직접착제는 외과 수술용 봉합사를 대체할 수 있고, 불필요한 혈관을 폐색하는 데 사용될 수 있으며, 안면조직, 연골 등의 연조직과 뼈, 치아 등의 경조직 지혈 및 봉합에 이용될 수 있고, 가정 상비약으로 적용하는 것이 가능하다. 본 발명의 생체적합성 생체접착제 조성물의 다양한 응용 분야를 정리하면 다음과 같다.
일 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 인체의 내부 및 외부 표면에 적용될 수 있으며, 즉 본 발명의 생체접착제는 피부와 같은 인체의 외부 표면 또는 외과수술 과정에서 노출되는 내부기관의 표면 등에 국소적으로 적용될수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 조직의 손상된 부분을 접착시키거나 조직에서 공기/유체가 누출되는 것을 봉합하거나, 의료기구를 조직에 접착시키거나 또는 조직의 결함부분을 채우는데 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "생체 조직"은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 피부, 뼈, 신경, 액손, 연골, 혈관, 각막, 근육, 근막, 뇌, 전립선, 유방, 자궁내막, 폐, 비장, 소장, 간, 정소, 난소, 경부, 직장, 위, 림프절, 골수 및 신장 등을 포함한다.
다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 상처치유(wound healing)에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 생체적합성 생체접착제는 상처에 적용되는 드레싱으로 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 피부 봉합에 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 생체접착제는 국소적으로 적용되어 상처를 봉합하는 데 이용되어, 봉합사를 대체할 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 탈장 복원에도 적용될 수 있으며, 예를 들어 탈장복원에 이용되는 메쉬의 표면 코팅에 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 혈관과 같은 관 구조의 봉합 및 누출을 방지하는 데에도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 생체접착제는 지혈에도 이용될 수 있다.
또 다른 구현예로, 본 발명의 생체접착제는 수술 후의 유착방지제로 이용될 수 있다. 유착이란 모든 수술 부위에서 발생하는 것으로 수술 부위의 주변에서 다른 조직들이 상처 주위에 달라붙는 현상이다. 유착은 수술 후 97% 정도 발생을 하며, 특히 그 중에서 5-7%가 심각한 문제를 야기한다. 이러한 유착을 방지하기 위해서 수술시 상처를 최소화 한다거나 소염제를 사용하기도 한다. 또한 섬유소의 형성을 방지하기 위하여 TPA(tissue plasminogen activator)를 활성화하거나 결정성 용액, 고분자 용액, 고체 막 등의 물리적 장벽을 사용하고 있지만 이러한 방법들은 생체 내에서 독성을 나타낼 수 있으며 다른 부작용을 나타낼 수 있다. 본 발명의 생체접착제는 수술 후에 노출된 조직에 적용되어 그 조직과 주위의 조직 사이에 발생되는 유착을 방지하는 데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 하이드로젤을 포함하는 수술용 봉합사, 조직공학용 지지체 등을 제공한다.
조직공학 기술이란 환자의 조직으로부터 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것을 말하며, 조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 본 발명의 생체접착성 하이드로젤은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위하여 생체조직과 유사한 지지체(scaffold)를 제공할 수 있다. 또한 본 발명의 지지체를 이용하여 간편하게 인공 세포외 기질을 구현할 수 있으며, 화장품, 상처피복재, 치과용 매트릭스 등의 의료용 소재로도 활용될 수 있다.
본 발명의 하이드로젤에는 인체의 세포나 조직과 상호작용을 통하여 세포의 성장과 분화를 촉진시키고 아울러 조직의 재생과 회복을 도와주는 작용에 관여하는 각종 생리활성물질들이 쉽게 부착될 수 있다. 또한, 상기 생리활성물질은 천연 세포외 기질과 유사하게 유사한 구조의 인공 세포외 기질을 구현하기 위하여 포함될 수 있는 각종 생체분자들을 총칭하기도 한다. 생리활성물질은 세포, 단백질, 핵산, 당, 효소 등을 포함하며, 일 예로 세포, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 단당류, 올리고당류, 지방산, 핵산 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 세포를 들 수 있다. 상기 세포는 원핵세포 및 진핵세포를 포함한 모든 세포일 수 있고, 일 예로 조골세포(osteoblast), 섬유세포(fibroblast), 간세포(hepatocyte), 신경세포(neurons), 암세포(cancer cell), B cell, 백혈구세포(white blood cell) 등을 포함한 면역세포 및 배아세포 등일 수 있다. 이 외에도, 생리활성물질은 핵산 물질로서 플라스미드 핵산, 당 물질로서 히아루론산, 헤파린 황산염, 콘드로이틴 황산염, 알진염, 단백질 물질로서 호르몬 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP); 및 점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, sEBP)를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드(sticky multiblock copolypeptide)에 관한 것으로서, 상기 sEBP는 티로신(Y)과 리신(K)을 포함하고, 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 개질되어 DOPA의 표면 분자와 다양한 상호작용 및 리신 양이온과 DOPA간 π-양이온 상호작용을 바탕으로 강한 표면 접착성을 나타내며, 특히 습윤 조건 하에서도 표면 부착성이 매우 우수하다. 상기 다중 블록 코폴리펩타이드는 온도 자극에 따라 가역적인 변화가 가능한, 자가조립된 코어-쉘 구조 및 하이드로젤을 형성하므로, 생체코팅제, 생접착제 등 바이오메디칼 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 (A) 상이한 특성을 가진 EBP 단일 블록 라이브러리, (B) 점착성 EBP(sticky EBP, sEBP) 이중 블록 코폴리펩타이드 및 이들의 자가조립 나노구조체, 및 (C, D) ABA 및 BAB형 sEBP 삼중 블록 코폴리펩타이드 및 이들의 자가조립 하이드로젤의 분자 모식도이다. 대문자 'A'는 친수성 EBP를, 'B'는 소수성 EBP를 가리킨다. 대문자 'A'는 친수성 블록을, 'B'는 소수성 블록을 가리킨다. 본 발명은 자극반응성을 가진 일반적인 EBP(normal EBP, E)를 포함하는 친수성 EBP(hydrophilic EBP, phiE), 자극반응성 및 부착성을 가진 친수성 점착성 EBP(hydrophilic sticky EBP, phisE), 자극반응성을 가진 일반적인 EBP(normal EBP, E)를 포함하는 소수성 EBP(hydrophobic EBP, phoE), 자극반응성 및 부착성을 가진 소수성 점착성 EBP(hydrophobic sticky EBP, phosE)를 제공한다.
도 2는 점착성 EBP 이중 블록 및 삼중 블록의 유전자 합성과 정제를 나타낸 것이다. 대문자 'A'는 친수성 블록 유전자를, 'B'는 소수성 블록 유전자를 가리킨다. (A) 소수성 EBP(phoE) 유전자를 친수성 점착성 EBP(phisE) 플라스미드에 삽입하거나 소수성 점착성 EBP(phosE) 유전자를 친수성 EBP(phiE) 플라스미드에 삽입한 후, phiE 또는 phisE 유전자를 상기 phosE-phiE 또는 phoE-phisE 플라스미드에 삽입하여 ABA형 점착성 EBP 삼중 블록 유전자를 합성하였다. (B) phiE 유전자를 phoE 플라스미드에 삽입한 후, phoE 유전자를 phiE-phoE 플라스미드에 삽입함으로써 BAB형 점착성 EBP 삼중 블록을 합성하였다. (C) XbaI 및 BamHI 절단 후, 단일, 이중, 및 삼중 블록 코폴리펩타이드 유전자의 DNA 아가로스 겔 전기영동 이미지를 나타낸 것이다. 예상되는 유전자의 크기는 겔의 왼쪽에, 사이즈 마커는 겔의 오른쪽에 표시했다. (D) 이중 및 삼중 블록의 copper 염색된 SDS-PAGE 이미지를 나타낸 것이다. 예상되는 단백질의 크기는 겔의 오른쪽에, 사이즈 마커는 겔의 왼쪽에 표시했다. (E) (1) sEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 및 (2) 개질된(modified) sEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 (msEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6)의 copper 염색된 SDS-PAGE 이미지를 나타낸 것이다. 예상되는 단백질의 크기는 겔의 왼쪽에, 사이즈 마커는 겔의 오른쪽에 표시했다. 레인(M)이 사이즈 마커를 가리킨다. (F) 티로신이 DOPA로 개질했는지 확인하기 위해, (1) sEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 및 (2) msEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 NBT/glycinate 염색을 나타낸 것이다.
도 3은 PBS (10 mM, pH 7.4), 가열률 1 ℃에서 온도의 함수로서 점착성 EBP (sEBP) 단일 블록의 농도 의존 탁도 프로파일을 나타낸 것이다; (A) EBP[Y2K4]6, (B) EBP[Y3K3]6, (C) EBP[Y2K2I2]6 및 (D) EBP[Y4K2]6.
도 4는 (A) PBS (10 mM, pH 7.4), 가열률 1 ℃에서 온도의 함수로서 sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 열적 프로파일을 나타낸 것이다. (B) 다양한 온도, 4 ℃(LCST 이하) 및 37 ℃ (LCST이상)에서 12.5 μM의 sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 크기를 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 (A) 37 ℃에서 12.5 μM의 sEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 및 msEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 크기를 측정한 것을 나타낸 것이다. (B) 부착성 시험을 위해 4 ℃(1, 3) 및 37 ℃(2, 4)에서 (1, 2) sEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 및 (3, 4) msEBP[G1A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 포토그래픽 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 12.5 μM의 NaIO4 가 첨가된 PBS (10 mM, pH 7.4)에서 특정 온도, 37 ℃ (LCST이상)에서 FITC가 결합된 12.5 μM msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 (A) 부착표면 세척 전, (B) 부착 표면 세척 후의 형광 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바는 (A), (B)에서 20 μm이다.
도 7은 (A) PBS (10 mM, pH 7.4)에서 다양한 온도, 4 ℃ (LCST 이하) 및 37 ℃ (LCST이상)에서 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 하이드로젤의 포토그래픽 이미지를 나타낸 것이다. (B) msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6 및 NaIO4의 농도에 따른 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 대량 부착 시험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 (1) 자극 반응성을 가진 EBP와 (2) 자극 반응성과 부착성을 가진 점착성 EBP(sEBP)를 포함하는 새로운 EBP 기반의 다중 블록 코폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명자들은 강력한 계면 수중 부착성을 EBP에 도입하기 위해, 펜타펩타이드 반복의 4번째 위치에 독특한 게스트 잔기로서 상이한 비율의 티로신(Y)과 리신(K)을 도입하였다.
또한, 본 발명은 EBP의 티로신을 표면 부착성 분자인 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로 전환하여, DOPA와 표면 분자간의 분자 상호작용을 통해 표면 부착성을 나타낸다. 아울러, 상술한 바와 같이, EBP 펜타펩타이드 반복의 게스트 잔기로서 리신(K)을 도입하면, DOPA와 리신의 양이온 간의 수많은 π-양이온 상호작용을 통해 더욱 강한 부착성을 나타낼 수 있다.
따라서, 이러한 관점에서 본 발명은 sEBP 블록을 펜타펩타이드 반복의 게스트 잔기의 아미노산 조성에 따라 (1) 체온보다 낮은 LCST를 가진 소수성, 점착성 EBP(phosE)와 (2) 체온보다 높은 LCST를 가진 친수성, 점착성 EBP(phisE)로 개발하였다. 상기 두 종류의 점착성 EBP는 (1) 체온보다 높은 LCST를 가진 친수성 EBP(phiE) 또는 (2) 체온보다 낮은 LCST를 가진 소수성 EBP(phoE)와 융합하여 ABA형 또는 BAB형의 삼중 블록 코폴리펩타이드를 제공한다.
특히, 펜타펩타이드 반복이 상이한 세 종류의 EBP는 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 가지며, 첫번째 및 세번째 아미노산 잔기를 다르게 하여 제조하였다: (1) Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진 가소성 EBP(EBP with plasticity, EBPP), (2) Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진 탄력성 EBP(EBP with elasticity, EBPE), 및 (3) Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진, 첫번째 아미노산이 이소루신(I)인 이소루신을 포함하는 EBPP(EBPP with isoleucine, EBPPI).
본 발명자들은 점착성 EBP 다중 블록 코폴리펩타이드 시리즈의 제조를 위해 티로신 잔기를 DOPA로 개질하기 위해, 하기 두 가지의 하이드록실화 반응을 수행하였다: (1) 버섯 티로시나제 촉매화 반응 및 (2) 다중 블록 코폴리펩타이드와 orf438를 포함하는 티로시나제를 E.coli에서 동시에 발현하기 위한 세균 공동 발현 시스템. 티로신 잔기가 DOPA로 개질되었는지는 NBT/Glycinate 염색으로 확인하였다. 개질된, 점착성 EBP 이중 및 삼중 블록 코폴리펩타이드(Modified, sticky EBP di- and tri-block copolypeptides, msEBP di-blocks and tri-blocks)는 체온보다 낮은 LCST를 가지는 소수성 EBP(phoE)의 온도 유발 상전이의 물리적 가교결합을 통해 자가조립 나노구조체와 하이드로젤을 형성했으며, 산화를 위해 NaIO4를 이용하여 체온보다 높은 LCST를 가진 친수성 점착성 EBP(phisE)와 화학적 가교결합을 통해 기계적 특성을 강화하였다.
그 결과, 본 발명은 표면 부착성이 강화된 개질된 점착성 EBP 이중 및 삼중 블록 코폴리펩타이드(msEBP di-blocks and tri-blocks)로 형성된 자가조립 나노구조체와 하이드로젤을 제공한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
실시예 1 : 재료
pET-21a 벡터와 BL21 (DE3) E. coli 세포는 Novagen Inc. (Madison, WI, U.S.)에서 수득하였다. Top10 컴피던트 (competent) 세포는 Invitrogen (Carlsbad, CA, U.S.)에서 수득하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Cosmo Gene Tech (Seoul, South Korea)에서 화학적으로 합성하였다. 열민감성 알칼리 포스파타제로서 Fast AP, BamHI와 XbaI를 포함한 제한 엔도뉴클레아제는 Fermentas (Ontario, Canada)에서 구입하였다. BseRI, AcuI를 비롯한 다른 제한효소를 포함한 제한 엔도뉴클레아제는 New England Biolabs (Ipswich, MA, U.S.)에서 수득하였다. T4 DNA ligase는 Elpis Bio-tech (Taejeon, South Korea)에서 수득하였다. DNA 미니 프렙, 겔 추출, 및 PCR 정제를 위한 모든 키트는 Geneall Biotechnology (Seoul, South Korea)에서 수득하였다. Dyne Agarose High는 DYNE BIO (Seongnam, South Korea)에서 수득하였다. 모든 Top10 세포는 TB DRY media (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, U.S.)에서 배양하고, super optimal broth with catabolite repression (SOC) medium (Formedium, UK)에는 20 mM glucose를 첨가하였다. 모든 BL21 (DE3) 세포는 MP Biomedicals (Solon, OH, U.S.)에서 수득한 circle grow media에서 배양하였다. Precast gel로서 The Ready Gel (Tris-HCl, 2-20%)은 Bio-Rad (Hercules, CA, U.S.)에서 수득하였다. Phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), ampicillin, polyethyleneimine (PEI)은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)에서 수득하였다.
실시예 2 : 점착성 EBP(sEBP) 다중 블록 코폴리펩타이드의 유전자 제작
소수성 EBP 블록 유전자를 친수성 점착성 EBP 블록 유전자와 융합하여 ABA 및 BAB형 삼중블록 코폴리펩타이드 유전자를 제조하였다. 대문자 'A'는 친수성 점착성 EBP 블록을, 'B'는 소수성 EBP 블록을 나타낸다. Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복 유닛을 가진 친수성 점착성 EBP 블록, EBP[Y2K4]n은 “En”으로 명명했으며, 이 때, n은 반복된 여섯 펜타펩타이드의 수를, 괄호의 대문자는 각 펜타펩타이드 유닛의 4번째에 위치한 게스트 잔기(Xaa)를, 이들의 첨자는 펜타펩타이드 반복에서 게스트 잔기의 비율을 나타낸다. 또한, 펜타펩타이드 반복이 상이한 세 종류의 EBP는 동일한 게스트 잔기 조성과 비율을 가지며, 첫번째 및 세번째 아미노산 잔기를 다르게 하여 제조하였다: (1) Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진 가소성 EBP(EBP with plasticity, EBPP), (2) Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진 탄력성 EBP(EBP with elasticity, EBPE), 및 (3) Ile-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가진, 첫번째 아미노산이 이소루신(I)인 이소루신을 포함하는 EBPP(EBPP with isoleucine, EBPPI). 다중 블록 코폴리펩타이드를 형성하기 위해 본 발명은 상이한 네 종류의 EBP 라이브러리를 제공한다: 친수성 EBP(phiE), 소수성 EBP(phoE), 친수성 점착성 EBP(phisE), 소수성 점착성 EBP(phosE). 하기 표 1 및 표 2는 각각 EBPP, EBPE, 및 EBPPI의 유전자 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
1. EBPE[A 1 G 4 I 1 ] GTC CCA GGT GGA GGT GTA CCC GGC GCG GGT GTC CCA GGT GGA GGT
GTA CCT GGG GGT GGG GTC CCT GGT ATT GGC GTA CCT GGA GGC GGC		 서열번호 1
2. EBPP[A 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCA GCT GGC GGT GTA CCT GCT GCT GCT GTT CCG GCC GGT GGT
GTT CCG GCG GGC GGC GTG CCT GCA ATA GGA GTT CCC GCT GGT GGC		 서열번호 2
3. EBPE[K 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GGT GGT GGT GTT CCG GGT AAA GGT GTT CCG GGT GGT GGT
GTT CCG GGT GGT GGT GGT GTT CCG GGT ATC GGT GTT CCG GGT GGC		 서열번호 3
4. EBPP[K 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG AAA GGT GTT CCG GCG GGT GGT
GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG ATC GGT GTT CCG GCG GGT GGC		 서열번호4
5. EBPE[D 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GGT GGT GGT GTT CCG GGT GAT GGT GTT CCG GGT GGT GGT
GTT CCG GGT GGT GGT GGT GTT CCG GGT ATC GGT GTT CCG GGT GGC		 서열번호5
6. EBPP[D 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG GAT GGT GTT CCG GCG GGT GGT
GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG ATC GGT GTT CCG GCG GGT GGC		 서열번호6
7. EBPE[E 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GGT GGT GGT GTT CCG GGT GAA GGT GTT CCG GGT GGT GGT
GTT CCG GGT GGT GGT GGT GTT CCG GGT ATC GGT GTT CCG GGT GGC		 서열번호7
8. EBPP[E 1 G 4 I 1 ]
　 		GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG GAA GGT GTT CCG GCG GGT GGT
GTT CCG GCG GGT GGT GTT CCG GCG ATC GGT GTT CCG GCG GGT GGC		 서열번호8
9. EBPE[G 1 A 3 F 2 ]
　 		GTC CCG GGT GCG GGC GTG CCG GGA TTT GGA GTT CCG GGT GCG GGT
GTT CCA GGC GGT GGT GTT CCG GGC GCG GGC GTG CCG GGC TTT GGC		 서열번호9
10. EBPP[G 1 A 3 F 2 ]
　 		GTG CCG GCG GCG GGC GTT CCA GCC TTT GGT GTG CCA GCG GCG GGA
GTT CCG GCC GGT GGC GTG CCG GCA GCG GGC GTG CCG GCT TTT GGC		 서열번호10
11. EBPP[K 1 A 3 F 2 ]
　 		GTG CCG GCG GCG GGC GTT CCA GCC TTT GGT GTG CCA GCG GCG GGA
GTT CCG GCC AAA GGC GTG CCG GCA GCG GGC GTG CCG GCT TTT GGC		 서열번호11
12. EBPP[D 1 A 3 F 2 ]
　 		GTG CCG GCG GCG GGC GTT CCA GCC TTT GGT GTG CCA GCG GCG GGA
GTT CCG GCC GAT GGC GTG CCG GCA GCG GGC GTG CCG GCT TTT GGC		 서열번호12
13. EBPP[K 3 F 3 ]
　 		GTT CCA GCG TTT GGC GTG CCA GCG AAA GGT GTT CCG GCG TTT GGG
GTT CCC GCG AAA GGT GTG CCG GCC TTT GGT GTG CCG GCC AAA GGC		 서열번호13
14. EBPP[D 3 F 3 ]
　 		GTT CCA GCG TTT GGC GTG CCA GCG GAT GGT GTT CCG GCG TTT GGG
GTT CCC GCG GAT GGT GTG CCG GCC TTT GGT GTG CCG GCC GAT GGC		 서열번호14
15. EBPP[H 3 A 3 I 1 ]
　 		GTG CCG GCG CAT GGA GTT CCT GCC GCC GGT GTT CCT GCG CAT GGT
GTA CCG GCA ATT GGC GTT CCG GCA CAT GGT GTG CCG GCC GCC GGC		 서열번호15
16. EBPP[H 5 G 1 ]
　 		GTT CCG GCC GGA GGT GTA CCG GCG CAT GGT GTT CCG GCA CAT GGT
GTG CCG GCT CAC GGT GTG CCT GCG CAT GGC GTT CCT GCG CAT GGC		 서열번호16
17. EBPP[G 1 C 3 F 2 ] GTG CCG GCG TGC GGC GTT CCA GCC TTT GGT GTG CCA GCG TGC GGA
GTT CCG GCC GGT GGC GTG CCG GCA TGC GGC GTG CCG GCT TTT GGC		 서열번호17
18. EBPPI[G 1 A 4 F 1 ] ATT CCT GCA GCC GGT ATC CCG GCC GGT GGC ATT CCG GCA GCC GGC
ATT CCG GCC GCC GGC ATC CCG GCA TTT GGC ATT CCT GCA GCA GGC		 서열번호18
19. EBPPI[G 1 A 3 F 2 ] ATT CCG GCC GCA GGC ATT CCT GCA TTT GGT ATT CCG GCG GCA GGC
ATT CCT GCC GGT GGC ATC CCG GCA GCG GGC ATT CCG GCC TTT GGC		 서열번호19
20. EBPPI [Y 2 K 4 ] ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC
ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC		 서열번호20
21. EBPPI [Y 3 K 3 ] ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT
ATC CCG GCC AAA GGC ATT CCT GCA TAC GGT ATC CCG GCC AAA GGC		 서열번호21
22. EBPPI [Y 2 K 2 I 2 ] ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC
ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCT GCA ATT GGC		 서열번호22
23. EBPPI [Y 4 K 2 ] ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCG GCC TAC GGC
ATT CCG GCC TAC GGC ATC CCG GCA AAA GGC ATT CCG GCC TAC GGC		 서열번호 23
1. EBPE[A 1 G 4 I 1 ] VPGGG VPGAG VPGGG VPGGG VPGIG VPGGG 서열번호24
2. EBPP[A 1 G 4 I 1 ] VPAGG VPAAG VPAGG VPAGG VPAIG VPAGG 서열번호25
3. EBPE[K 1 G 4 I 1 ] VPGGG VPGKG VPGGG VPGGG VPGIG VPGGG 서열번호26
4. EBPP[K 1 G 4 I 1 ] VPAGG VPAKG VPAGG VPAGG VPAIG VPAGG 서열번호27
5. EBPE[D 1 G 4 I 1 ] VPGGG VPGDG VPGGG VPGGG VPGIG VPGGG 서열번호28
6. EBPP[D 1 G 4 I 1 ] VPAGG VPADG VPAGG VPAGG VPAIG VPAGG 서열번호29
7. EBPE[E 1 G 4 I 1 ] VPGGG VPGEG VPGGG VPGGG VPGIG VPGGG 서열번호30
8. EBPP[E 1 G 4 I 1 ] VPAGG VPAEG VPAGG VPAGG VPAIG VPAGG 서열번호31
9. EBPE[G 1 A 3 F 2 ] VPGAG VPGFG VPGAG VPGGG VPGAG VPGFG 서열번호32
10. EBPP[G 1 A 3 F 2 ] VPAAG VPAFG VPAAG VPAGG VPAAG VPAFG 서열번호33
11. EBPP[K 1 A 3 F 2 ] VPAAG VPAFG VPAAG VPAGG VPAAG VPAFG 서열번호34
12. EBPP[D 1 A 3 F 2 ] VPAAG VPAFG VPAAG VPAGG VPAAG VPAFG 서열번호35
13. EBPP[K 3 F 3 ] VPAFG VPAKG VPAFG VPAKG VPAFG VPAKG 서열번호36
14. EBPP[D 3 F 3 ] VPAFG VPADG VPAFG VPADG VPAFG VPADG 서열번호37
15. EBPP[H 3 A 3 I 1 ] VPAHG VPAAG VPAHG VPAIG VPAHG VPAAG 서열번호38
16. EBPP[H 5 G 1 ] VPAGG VPAHG VPAHG VPAHG VPAHG VPAHG 서열번호39
17. EBPP[G 1 C 3 F 2 ] VPACG VPAFG VPACG VPAGG VPACG VPAFG 서열번호40
18. EBPPI[G 1 A 4 F 1 ] IPAAG IPAGG IPAAG IPAAG IPAFG IPAAG 서열번호41
19. EBPPI[G 1 A 3 F 2 ] IPAAG IPAFG IPAAG IPAGG IPAAG IPAFG 서열번호42
20. EBPPI[Y 2 K 4 ] IPAKG IPAYG IPAKG IPAKG IPAYG IPAKG 서열번호43
21. EBPPI[Y 3 K 3 ] IPAYG IPAKG IPAYG IPAKG IPAYG IPAKG 서열번호44
22. EBPPI[Y 2 K 2 I 2 ] IPAYG IPAKG IPAIG IPAYG IPAKG IPAIG 서열번호45
23. EBPPI[Y 4 K 2 ] IPAYG IPAKG IPAYG IPAYG IPAKG IPAYG 서열번호 46
티로신과 리신 잔기를 가진 점착성 EBP 블록은 점착성 En(sticky En, sEn)이라 부르며, 이 때, n은 반복되는 여섯 펜타펩타이드의 수를 나타낸다. 예를 들어, 친수성 점착성 EBP-소수성 EBP 이중 블록은 phisEn-phoEn으로 표시하였다. 두 종류의 EBP 삼중 블록 코폴리펩타이드 유전자는 RDL을 통해 합성하였다. 각 경우에 삼중 블록 유전자는 두 단계의 공정으로 제조하였다. sEBP 이중 블록 유전자를 합성한 후, sEBP 삼중 블록 유전자를 제조하였다. ABA형 삼중 블록 유전자 합성을 위해, 'B' 유전자를 삽입 유전자로서 XbaI 및 AcuI로 두 번 절단한 후, 'B' 삽입 유전자를 XbaI 및 BseRI으로 선형화한 'A'를 암호화하는 플라스미드에 도입함으로써 BA 이중 블록 암호화된 플라스미드를 제조하였다. 이후, XbaI 및 AcuI로 두 번 절단한 'A' 유전자를 선형화된 'BA' 이중 블록 벡터에 삽입하여 'ABA' 삼중 블록이 암호화된 플라스미드를 제조하였다. 마찬가지로, BAB 삼중 블록 유전자를 합성하였다. 이들의 유전자 크기는 XbaI 및 BamHI으로 절단한 후 DNA 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.
실시예 3 : sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 발현과 정제
상기 플라스미드를 암호화하는 EBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 E.Coli BL21(DE3) 세포에 형질전환하였다. 하나의 세균 콜로니를 50 μg/mL ampicillin을 함유하는 10mL의 CG media (1차 사전 배양)에 접종하고, 180 rpm으로 37 ℃에서 밤새도록 배양하였다. 2 L 플라스크에서 50 μg/mL ampicillin을 첨가한 400 mL의 CG media에 1차 사전 배양물을 접종하고, 200 rpm으로 37 ℃에서 4 시간동안 배양하였다. 2 L 플라스크에서 15 mL의 2차 사전 배양물을 500 mL의 CG (50 μg/mL ampicillin)에 접종하고, 3 시간의 배양 후 최종 농도가 1 mM가 될 때까지 IPTG를 첨가함으로써 발현을 유도하였다. 세균 세포를 원심분리를 통해 12 시간동안 배양하고, 세포 펠렛은 8 M 요소를 함유한 5 % 아세트산에 재용해하여 sEBP 블록의 비공유결합 상호작용을 방지하였다. 얼음 욕조에서 5 분동안 60% 전력(10 초 on, 30 초 off)으로 시료를 초음파 처리(VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT)함으로써 세포를 용해하였다. sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 역상전이순환(inverse transition cycling, ITC)으로 정제하였다. ITC 동안, 세포를 4 ℃에서 원심분리 16,000 rpm으로 분리하고, 용해물은 새로운 튜브로 옮겼다. 상 전이를 유발하기 위해 최종 농도가 2M일 때 NaCl을 첨가하였다. 응집된 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 40 ℃에서 20 분동안 원심분리 16,000 rpm으로 분리하였다. 정제된 시료를 탈이온수에 투석하여 요소와 염분을 제거하고, 추후 특성화를 위해 동결건조하였다.
실시예 4 : (1) 버섯 티로시나제 및 (2) 세균 공동 발현 시스템에 의한 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 수산화 반응
버섯에서 유래한 티로시나제(Sigma Aldrich, T3824)에 의한 개질을 통해 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기를 DOPA로 전환하였다. sEBP 블록 코폴리펩타이드를 10 mM sodium borate가 첨가된 10 mM phosphate 버퍼에 재용해했다. 이 때, 아스코브산을 이용하여 pH 7.0으로 조정하였다. 티로시나제는 최종 농도가 ~ 0.01 mg/ml일 때 첨가하였다. 용액을 부드럽게 섞으며 상온에서 3 시간동안 배양하였다. 3M NaCl을 첨가하여 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 응집함으로써 반응을 종결하고, 티로시나제를 제거하기 위해 ITC를 3~4 회 수행했다. 상기 개질된 sEBP(msEBP)를 8 M 요소를 함유한 5 % 아세트산으로 재용해하였다. 마지막으로, DOPA의 어떤 산화반응도 방지하기 위해, msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 낮은 pH에서 1 % 아세트산 용액에 투석하고, 동결건조하였다. 한편, 세균 공중 발현 시스템을 통해 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 티로신 잔기의 수산화반응을 수행하였다. 하기 두 종류의 플라스미드를 포함한 E. coli strain BL21 (DE3) 세포를 msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 위한 배지에 배양하였다: (1) EBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 암호화하는 개질된 pET21a(+) 및 (2) orf438를 포함한 티로시나제를 위한 pACYC 듀엣 벡터. 응집된 msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 8 M 요소를 함유하는 5 % 아세트산에 재용해하고, 남아있는 불용성 오염물을 제거하기 위해 시료를 4 ℃에서 15 분동안 16,000 rpm으로 원심분리하였다. 마지막으로, DOPA의 어떤 산화반응도 방지하기 위해, msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 1 % 아세트산 용액에 투석하고, 동결건조하였다.
실시예 5 : sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 특성화
sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 순도 및 분자량을 0.3M copper 염색과 함께 SDS-PAGE를 통해 특성화하였다. sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 상 전이와 자가조립 양상은 UV-visible 분광계와 동적광산란(dynamic light scattering, DLS)을 통해 고정된 각도 90°에서 특성화하였다. PBS (10mM, pH 7.4)에서 25 μM의 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 350 nm에서 광학 밀도(optical density at 350 nm, OD350)를 가열률 1 ℃/min로 10 - 70 ℃ 온도 범위에서 측정하였다. Tt는 온도의 함수로서 탁도(turbidity)의 1차 도함수가 최댓값일 때의 온도로 정의하였다. PBS (10 mM, 7.4 pH)에서 25 μM 농도의 sEBP 다중 블록 코폴리펩타이드의 유체역학적 반경(Hydrodynamic radius, Rh)은 동적광산란(DLS)에 의해 37 °C에서 측정하였다. 광산란 측정 전에 10 분동안 평형(equilibrium)을 맞추고, 각 온도에서 11번 측정하였다.
실시예 6 : msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드-기반 나노구조체의 표면 부착성 시험
msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드-기반 나노구조체의 부착성을 시각화하기 위해, sEBP 블록의 리신 잔기를 FTIC로 표지하였다. msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드를 8 M 요소를 첨가한 탄산 수소 나트륨에 용해하고, 디메틸 설폭사이드에 용해된 FITC를 용액과 1:1 몰농도로 적하 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 3 시간동안 교반하고, 3 M NaCl을 첨가함으로써 퀀칭하여 msEBP 블록 코폴리펩타이드의 응집을 유도했다. 응집된 msEBP 블록 코폴리펩타이드를 8 M 요소가 첨가된 5% 아세트산에 용해하고, 유리된 FITC를 제거하기 위해 ITC로 정제하였다. FITC가 표지된 msEBP 블록 코폴리펩타이드를 동결건조를 위해 탈이온수에 하루동안 투석하였다. msEBP-기반 나노구조체의 자가조립 나노구조체는 명시야 및 형광 모드 모두에서 팽윤된 상태로 공초점 레이저 스캐닝 현미경(confocal laser scanning microscopy, CLSM)으로 확인하였다. msEBP-기반 나노구조체의 표면 부착성을 확인하기 위해, PBS (10 mM, 7.4 pH)에서 12.5 μM의 msEBP-기반 나노구조체를 슬라이드 그라스에 떨어뜨리고 12.5 μM의 NaIO4 와 혼합하여 37 ℃에서 1 시간동안 배양하고, 시료 용액을 포함한 유리 표면을 PBS (10 mM, pH 7.4)을 이용하여 세 번 세척하였다.
실시예 7 : msEBP 다중 블록 코폴리펩타이드-기반 하이드로젤의 대량 부착 강도 시험
대량 부착 강도를 측정하기 위해 Lap-shear 테스트를 수행하였다. msEBP-기반 하이드로젤의 표면 부착성 시험을 수행하기 위해, 알루미늄 고정물을 피착체(adherends)로 사용했다. 접착 표면을 아세톤, 에탄올, 및 탈이온수에 각각 15분동안 담가 헹구었다. 피착체는 추후 사용을 위해 건조시켰다. msEBP-기반 하이드로젤을 10 mM PBS에 20 및 30 wt.%.로 용해하였다. 각 용액을 바로 알루미늄 고정물에 놓고 다양한 농도의 NaIO4와 혼합하였다. 피착제의 덮인 영역이 10 mm × 10 mm가 되도록 다른 피착제로 덮고, PBS에서 37 ℃로 담그기 전에 60 g 무게로 30 분동안 상온에서 보존 처리를 하였다. 시료를 평범한 조건에서 cross-head speed가 5 mm/min인 일반적인 시험 기기(INSTON 3365; Norwood, MA)을 이용하여 lap shear 시험을 수행하였다. msEBP-기반 하이드로젤의 습윤 부착 강도는 최대 거리 실패 직전의 힘 플롯으로 계산하였다.
실험결과
Val/Ile-Pro-Gly/Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복 유닛을 포함한 상이한 EBP를 DNA 수준에서 고안하여 온도와 pH를 비롯한 자극-반응성을 가지도록 하였다. 이 때, 상기 Xaa는 프롤린(P)을 제외한 모든 아미노산이 될 수 있다. Val-Pro-Ala-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가지는 소수성 EBP(phoE)와 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly의 펜타펩타이드 반복을 가지는 친수성 EBP(phiE)를 점착성 EBP 블록과 융합하였다. 홍합 족사 단백질에서 영감을 받은 점착성 EBP 블록을 습윤 조건 하에서도 부착성을 가지도록 디자인하였다. 상기 EBP 라이브러리는 (1) DOPA의 전구체로서 티로신과 (2) 정전기적 및 π-양이온 상호작용을 통한 부착성을 위한 잠재적 공헌자로서 펜타펩타이드 반복의 게스트 잔기인 리신의 상이한 조성을 바탕으로 합리적으로 디자인하였다. 또한, 펜타펩타이드 반복의 첫번째 아미노산으로 발린(V) 대신 이소루신(I)을 도입하여 소수성을 조절하였다(도 1(A)). (1) 친수성 점착성 EBPs(hydrophilic sticky EBPs, phisE)로서 EBP[Y2K4] 또는 [Y3K3] (2) 소수성 점착성 EBPs(hydrophobic sticky EBPs, phosE)로서 EBP[Y4K2] 또는 [Y2K2I2]를 포함하는 점착성 EBP(sEBP)는 부착성을 가진 자가조립된 나노구조체 및 하이드로젤을 위해 phoE 및 phiE와 함께 다중 블록 코폴리펩타이드로 구성되었다. 점착성 EBP 이중 블록 디자인을 도 1(B)에 도시하였다. 이는 EBP 블록의 열적 유발 상전이를 통한 자가조립 나노구조체를 형성하기 위해 고안되었다. 예를 들어, msEBP[Y-2K4]6-EBP[G1A3F2]6 이중 블록은 온도에 반응하여 자가조립 나노구조체를 형성할 수 있으며, 나노구조체의 쉘에 있는 phisE 블록을 통해 부착성을 나타냈다. 도 1(C, D)는 상이한 표면 부착성을 가지기 위해 다양한 블록 순서와 길이를 가진 ABA 및 BAB형 점착성 EBP 삼중 블록을 도시하였다. 여기서, 상기 'A' 블록은 친수성 블록을, 상기 'B' 블록은 소수성 블록을 나타내며, 소수성 EBP 블록으로서 'B' 블록이 열감응성이고 친수성 EBP 블록으로서 'A' 블록이 수용성이라는 점을 시사한다. 하한 임계 용액 온도((LCST) 이상으로 용액 온도가 증가하면, 탈수된 B 블록이 코어 안으로로 무너지고, 용해성 A 블록이 친수성 다리를 형성함으로써 3D 네트워크 하이드로젤을 형성을 유도했다. 더욱이, 티로신의 수산화 형태로서 DOPA를 포함하는 다중 블록 코폴리펩타이드를 NaIO4로 산화하고, 소수성 EBP 블록의 열민감성을 통한 물리적 가교결합과 함께 화학적으로 가교결합한 msEBP 삼중 블록 코폴리펩타이드 하이드로젤을 형성하였다.
점착성 이중 블록과 ABA, BAB형 EBP 삼중 블록 유전자의 합성을 도 2(A)에 나타내었다. 각 경우에, 삼중 블록은 두 단계의 공정으로 제조하였다. 점착성 EBP 이중 블록유전자를 먼저 합성한 후, 점착성 EBP 삼중 블록 유전자를 제조하였다. ABA형 삼중 블록 유전자 합성에서, B를 암호화하는 플라스미드는 XbaI 및 AcuI로 두 번 절단한 후, B 유전자를 XbaI 및 BseRI으로 선형화된 A를 암호화하는 플라스미드에 삽입함으로써, BA 이중 블록 유전자를 암호화하는 플라스미드를 형성하였다. 다음, XbaI 및 AcuI로 두 번 절단된 A를 암호화하는 플라스미드를 XbaI 및 BseRI에 의해 선형화된 BA 이중 블록 유전자에 삽입함으로써, ABA 삼중 블록 유전자를 제조하였다(도 2(A)). 마찬가지로, BAB 삼중 블록 유전자 합성에서, A를 암호화하는 유전자를 B를 암호화하는 플라스미드에 삽입한 후, B를 암호화하는 유전자를 AB를 암호화하는 플라스미드에 삽입함으로써 BAB 삼중 블록 유전자를 제조하였다(도 2(B)). 이들의 유전자 크기는 XbaI 및 BamHI 절단 후에 DNA 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석하고(도 2(C)), DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 단일, 이중, 및 삼중 블록의 유전자 크기는 어댑터 서열 66bp를 포함하여 각각 606, 1146, 및 1686 bp였다. DNA 사이즈 마커는 겔의 오른쪽, 예상되는 블록의 크기는 겔의 왼쪽이다. 점착성 EBP 이중 블록 및 삼중 블록은 이들의 열적으로 유도된 응집을 이용하여 ITC로 정제하고, 8 M 요소를 첨가한 10 mM PBS에서 재용해하여, 이들의 LCST 이하에서 점착성 EBP 블록을 완벽히 용해하였다. 모든 라이브러리를 ITC 5-6 회를 수행하여 성공적으로 정제하였다. 정제된 삼중 블록의 수율은 배양물의 리터 당 ~40 mg였다. sEBP[Y2K4]6-EBP[G-A3F2]6 및 sEBP[G-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6의 Copper 염색된 SDS-PAGE 겔 이미지를 도 2(D)에 나타내었다. 점착성 EBP 블록 코폴리펩타이드는 모두 그들의 예상되는 분자량(molecular weights, MWs)에 따라 이동했다. 단백질 마커의 분자량은 겔의 왼쪽, 삼중 블록의 이론적인 분자량은 겔의 오른쪽에 나타내었다. 하기 표 3 및 표 4는 각각 본 발명의 이중 및 삼중 블록 코폴리펩타이드의 유전자 크기와 분자량을 나타낸 것이다.
Di-block copolypeptides Nucleotide chain length (bp) M.W (kDa)
EBPPI[Y4K2]6-EBPE[A1G4I1]6 1146 32.08
EBPPI[Y2K2I2]6-EBPE[A1G4I1]6 1146 31.59
EBPPI[Y3K3]6-EBPPI[G1A3F2]6 1146 32.26
EBPPI[Y2K4]6-EBPPI[G1A3F2]6 1146 30.98
Tri-block copolypeptides Chain length (bp) M.W (kDa)
EBPPI[G1A3F2]6- EBPPI[Y2K4]6 - EBPPI[G1A3F2]6 1686 46.87
EBPPI[Y2K4]6 - EBPPI[G1A3F2]6 - EBPPI[Y2K4]6 1686 48.92
EBPPI[Y4K2]6 - EBPE[A1G4I1]6 - EBPPI[Y4K2]6 1686 47.56
EBPE[A1G4I1]6 - EBPPI[Y4K2]6 - EBPE[A1G4I1]6 1686 48.12
이중 및 삼중 블록의 EBP[Y2K4]6의 티로신 잔기를 버섯 티로시나제를 이용하여 DOPA로 개질하고 ITC를 통해 정제하였다(도 2(E)). 개질된 EBP는 DOPA 모이어티 때문에 개질되지 않은 EBP에 비해 더 많이 이동하는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1A3F2]6와 개질된 sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 (msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6)은 개질 전 후 비슷하게 이동하였다. DOPA 개질은 이들의 산화 환원 순환에 의한 NBT/Glycinate 염색을 통해 입증되었다. msEBP[G1-A3F2]6--EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6는 보라색으로 염색되었으며, 대조군으로서 sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6는 노랑색이었다(도 2(F)).
점착성 EBP 단일 블록의 열적 특성화는 PBS (10 mM, pH 7.4)에서 가열율 1 ℃/min으로 10 ℃에서 70 ℃로 온도를 증가함에 따른 350 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 수행하였다. 하한 임계 용액 온도(lower critical solution temperature, LCST)는 온도의 함수로서 탁도의 1차 도함수(d(OD)/dT)가 최댓값일 때의 온도로 결정하였다. 25 μM의 농도에서 [Y2K4] 및 [Y3K3]을 포함한 친수성 점착성 EBP의 LCST는 70 ℃보다 높은 반면, [Y4K2] 및 [Y2K2I2]을 포함한 소수성 점착성 EBP의 LCST는 45 ℃보다 낮았다(도 3). 농도의 함수로서 점착성 EBP 삼중 블록, sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 LCST를 보여주기 위해 상기 삼중 블록을 탁도 프로파일로 측정하였다(도 4(A)). 소수성 EBP 끝부분 블록의 응집에 의해 유도된 LCST는 삼중 블록 코폴리펩타이드의 농도가 증가함에 따라 감소했다. 온도 의존 상 전이에 의해 유발된 sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 자가조립을 4 ℃와 37 ℃에서 동적 광산란(DLS) 측정으로 특성화하였다(도 4(B)). sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 희석된 상태에서 나노구조체의 유체역학적 반경(Hydrodynamic radii, Rh) 은 PBS (10 mM, pH 7.4)에서 4 ℃및 37 ℃에서 각각 18.15 ± 3.31 nm 및 59.54 ± 10.26 nm였다. 나노구조체는 LCST 이상 및 이하에서 모두 형성되었는데, 이는 점착성 EBP가 LCST 이상 및 이하에서 점착성 EBP가 티로신과 리신 잔기간의 π-양이온 및 수소결합을 통해 서로 상호작용하는 반면, 소수성 EBP 코어와 점착성 EBP 쉘은 소수성 EBP의 응집을 통해 자가조립되기 때문이다.
희석된 조건 하에서 rhodamine 6G를 염색 분자로 하여 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 나노구조체 크기 특성화 및 이의 부착성 시험을 수행하였다. sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 및 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 나노구조체의 크기는 37 ℃에서 각각 59.54 ± 10.26 및 42.45 ± 8.45이다(도 5(A)). 나노구조체의 크기는 삼중 블록의 개질 이후 감소했는데, 이는 DOPA와 리신간의 분자 상호작용이 티로신과의 상호작용보다 더 강하기 때문이다. sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 및 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 표면 부착성 시험 결과를 도 5(B)에 나타내었다. PBS (10 mM, pH 7.4)에서 (1, 2) sEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 및 (3, 4) msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 시료를 염료로서 rhodamine 6G와 함께 3 시간동안 (1, 3) 4 ℃ 및 (2, 4) 37 ℃에서 배양하였다. 온도가 LCST보다 높아지면, 나노구조체의 쉘에서 점착성 EBP 블록이 상당한 부착성을 나타내었다.
msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 나노구조체의 표면 부착성을 특성화하기 위해서 특정 온도 (37 ℃, LCST 이상)에서 공초점 레이저 주사현미경 (Confocal laser scanning microsocope, CLSM)이 사용되었다. 소수성의 EBP가 LCST 이상에서 응집으로 인한 코어를 형성하고, 친수성의 부착성 EBP가 표면에 노출되어 자가 조립된 나노구조체가 형성된다. 10mM PBS에 용해된 FITC가 결합된 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 용액을 슬라이드 글라스 위에 50 μl 떨어뜨리고 12.5 μM NaIO4와 섞어준다. 이 혼합용액을 37 ℃에서 1시간 동안 부착시킨 다음, NaIO4- 산화제에 의한 DOPA 가교 결합을 통해 di-DOPA를 형성하고, 이를 바탕으로 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 분자의 내부적, 외부적인 상호작용을 유도했다. 나노 구조체의 부착성 결과는 부착 표면 세척 전, 후의 비교를 통해서 나타내었다(도 6). 표면 세척 전 형광 이미지에서, NaIO4-에 의해서 가교 결합된 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 는 형광 신호를 나타내는 나노구조체를 보여준다(도 6(A)). 또한 나노 구조체가 부착된 유리 표면을 PBS로 세번 세척한 후에도 형광 신호를 나타내는 나노구조체들이 표면에 부착되어 있는 것을 보여준다(도 6(B)). 이러한 세척 전, 후의 형광신호는, 자가조립된 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6- 나노구조체의 표면 부착성을 보였다.
msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 하이드로젤의 대량 부착 강도를 측정하기 위해, 10 mM PBS에 용해된 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6을 접착제로서 알루미늄 표면에 로딩하였다. 부착 시험 전에, 자가조립된 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6 하이드로젤 이미지를 4 ℃ 및 37 ℃에서 촬영하였으며, 이는 자극 반응성 상 전이를 명확하게 나타낸다. msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6는 LCST 이하(10 ℃)에서 점탄성 액체특성(viscoelastic liquid properties)을 나타낸 반면, LCST 이상(37 ℃)에서 점탄성 겔 특성(viscoelastic gel properties)을 나타내었다(도 7(A)). DOPA의 산화를 위해 NaIO4를 처리한 msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6를 대량 표면 부착성을 측정하기 위해 시험하였다. 그 결과, msEBP[G1-A3F2]6-EBP[Y2K4]6-EBP[G1-A3F2]6의 농도가 증가할수록 DOPA 분자의 농도도 증가하여 이들의 부착성이 상당히 향상되었다. 또한, NaIO4 산화를 통한 DOPA의 화학적 가교 결합은 도 7(B)에 도시된 바와 같이 5 mM NaIO4까지 대량 부착성을 증가시켰다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Sticky elastin-based multiblock copolypeptides with stimuli-responsiveness and surface adhesion properties, their self-assembled nanostructures and injectable hydrogels as bio-adhesives for biomedical applications <130> P20200585OP, APC-2021-0599 <150> KR 10-2020-0105908 <151> 2020-08-24 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[A1G4I1] <400> 1 gtcccaggtg gaggtgtacc cggcgcgggt gtcccaggtg gaggtgtacc tgggggtggg 60 gtccctggta ttggcgtacc tggaggcggc 90 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[A1G4I1] <400> 2 gttccagctg gcggtgtacc tgctgctgct gttccggccg gtggtgttcc ggcgggcggc 60 gtgcctgcaa taggagttcc cgctggtggc 90 <210> 3 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[K1G4I1] <400> 3 gttccgggtg gtggtgttcc gggtaaaggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60 ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90 <210> 4 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K1G4I1] <400> 4 gttccggcgg gtggtgttcc ggcgaaaggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60 gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90 <210> 5 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[D1G4I1] <400> 5 gttccgggtg gtggtgttcc gggtgatggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60 ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D1G4I1] <400> 6 gttccggcgg gtggtgttcc ggcggatggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60 gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[E1G4I1] <400> 7 gttccgggtg gtggtgttcc gggtgaaggt gttccgggtg gtggtgttcc gggtggtggt 60 ggtgttccgg gtatcggtgt tccgggtggc 90 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[E1G4I1] <400> 8 gttccggcgg gtggtgttcc ggcggaaggt gttccggcgg gtggtgttcc ggcgggtggt 60 gttccggcga tcggtgttcc ggcgggtggc 90 <210> 9 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[G1A3F2] <400> 9 gtcccgggtg cgggcgtgcc gggatttgga gttccgggtg cgggtgttcc aggcggtggt 60 gttccgggcg cgggcgtgcc gggctttggc 90 <210> 10 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[G1A3F2] <400> 10 gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccggtggc 60 gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90 <210> 11 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K1A3F2] <400> 11 gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccaaaggc 60 gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90 <210> 12 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D1A3F2] <400> 12 gtgccggcgg cgggcgttcc agcctttggt gtgccagcgg cgggagttcc ggccgatggc 60 gtgccggcag cgggcgtgcc ggcttttggc 90 <210> 13 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K3F3] <400> 13 gttccagcgt ttggcgtgcc agcgaaaggt gttccggcgt ttggggttcc cgcgaaaggt 60 gtgccggcct ttggtgtgcc ggccaaaggc 90 <210> 14 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D3F3] <400> 14 gttccagcgt ttggcgtgcc agcggatggt gttccggcgt ttggggttcc cgcggatggt 60 gtgccggcct ttggtgtgcc ggccgatggc 90 <210> 15 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H3A3I1] <400> 15 gtgccggcgc atggagttcc tgccgccggt gttcctgcgc atggtgtacc ggcaattggc 60 gttccggcac atggtgtgcc ggccgccggc 90 <210> 16 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H5G1] <400> 16 gttccggccg gaggtgtacc ggcgcatggt gttccggcac atggtgtgcc ggctcacggt 60 gtgcctgcgc atggcgttcc tgcgcatggc 90 <210> 17 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[G1C3F2] <400> 17 gtgccggcgt gcggcgttcc agcctttggt gtgccagcgt gcggagttcc ggccggtggc 60 gtgccggcat gcggcgtgcc ggcttttggc 90 <210> 18 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[G1A4F1] <400> 18 attcctgcag ccggtatccc ggccggtggc attccggcag ccggcattcc ggccgccggc 60 atcccggcat ttggcattcc tgcagcaggc 90 <210> 19 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[G1A3F2] <400> 19 attccggccg caggcattcc tgcatttggt attccggcgg caggcattcc tgccggtggc 60 atcccggcag cgggcattcc ggcctttggc 90 <210> 20 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI [Y2K4] <400> 20 atcccggcca aaggcattcc tgcatacggt atcccggcca aaggcatccc ggccaaaggc 60 attcctgcat acggtatccc ggccaaaggc 90 <210> 21 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI [Y3K3] <400> 21 attcctgcat acggtatccc ggccaaaggc attcctgcat acggtatccc ggccaaaggc 60 attcctgcat acggtatccc ggccaaaggc 90 <210> 22 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI [Y2K2I2] <400> 22 attccggcct acggcatccc ggcaaaaggc attcctgcaa ttggcattcc ggcctacggc 60 atcccggcaa aaggcattcc tgcaattggc 90 <210> 23 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI [Y4K2] <400> 23 attccggcct acggcatccc ggcaaaaggc attccggcct acggcattcc ggcctacggc 60 atcccggcaa aaggcattcc ggcctacggc 90 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[A1G4I1] <400> 24 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[A1G4I1] <400> 25 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[K1G4I1] <400> 26 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 27 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K1G4I1] <400> 27 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[D1G4I1] <400> 28 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 29 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D1G4I1] <400> 29 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 30 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[E1G4I1] <400> 30 Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Glu Gly Val Pro Gly Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[E1G4I1] <400> 31 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Glu Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPE[G1A3F2] <400> 32 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly Val Pro Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Phe Gly 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[G1A3F2] <400> 33 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K1A3F2] <400> 34 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D1A3F2] <400> 35 Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Ala Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[K3F3] <400> 36 Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Lys Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[D3F3] <400> 37 Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Asp Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Asp Gly 20 25 30 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H3A3I1] <400> 38 Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Ile Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[H5G1] <400> 39 Val Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly Val Pro Ala His Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPP[G1C3F2] <400> 40 Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly Val Pro Ala Cys Gly Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Val Pro Ala Cys Gly Val Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[G1A4F1] <400> 41 Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly 20 25 30 <210> 42 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[G1A3F2] <400> 42 Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Gly Gly Ile Pro Ala Ala Gly Ile Pro Ala Phe Gly 20 25 30 <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[Y2K4] <400> 43 Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly 20 25 30 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[Y3K3] <400> 44 Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly 20 25 30 <210> 45 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[Y2K2I2] <400> 45 Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Ile Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Ile Gly 20 25 30 <210> 46 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBPPI[Y4K2] <400> 46 Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Pro Ala Tyr Gly Ile Pro Ala Lys Gly Ile Pro Ala Tyr Gly 20 25 30

Claims (18)

  1. 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(elastin-based polypeptide, EBP); 및
    점착성 엘라스틴 기반 폴리펩타이드(sticky elastin-based polypeptide, sEBP)를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드(sticky multiblock copolypeptide)로서,
    상기 sEBP는 티로신(Y)과 리신(K)을 포함하고,
    상기 티로신(Y)은 3,4-디하이드록시페닐아민(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)으로 변형된 것을 특징으로 하는, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드로서,
    상기 sEBP가 친수성인 경우 EBP는 소수성이고, 상기 sEBP가 소수성인 경우 EBP는 친수성이며,
    상기 sEBP는 하기 식 3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
    [식 3]
    [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]n
    상기 식 3에서,
    상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 3의 반복 횟수이고;
    상기 X는 티로신(Y), 리신(K), 및 이소루신(I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드는 (sEBP)n(EBP)n; (EBP)n(sEBP)n; (sEBP)n(EBP)n(sEBP)n; 및 (EBP)n(sEBP)n(EBP)n으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배열로 구성되며,
    상기 n은 1 이상의 정수이고, EBP 또는 sEBP의 반복 횟수이며,
    상기 sEBP가 친수성인 경우 EBP는 소수성이고, 상기 sEBP가 소수성인 경우 EBP는 친수성인 것을 특징으로 하는, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 소수성 EBP는,
    하기 식 1내지 식 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 식으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
    [식 1]
    [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]n
    [식 2]
    [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]n
    [식 3]
    [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]n
    상기 식 1내지 식 3에서,
    상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 1의 반복 횟수이고;
    상기 X는 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 리신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 및 시스테인(C)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식 1에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
    알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    리신(K), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    아스파르트산(D), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    글루탐산(E), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    글리신(G), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
    리신(K), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
    아스파르트산(D), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어지거나,
    리신(K), 페닐알라닌(F)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
    아스파르트산(D), 페닐알라닌(F)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
    히스티딘(H), 알라닌(A), 이소루신(I)이 3:3:1의 비율로 이루어지거나,
    히스티딘(H), 글리신(G)이 5:1의 비율로 이루어지거나,
    글리신(G), 시스테인(C), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 친수성 EBP는,
    하기 식 1내지 식 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 식으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
    [식 1]
    [VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG VPAXG]n
    [식 2]
    [VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG VPGXG]n
    [식 3]
    [IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG IPAXG]n
    상기 식 1 내지 식 32에서,
    상기 n은 1 이상의 정수이고, 상기 식 2의 반복 횟수이고;
    상기 X는 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 리신(K), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 및 페닐알라닌(F)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상임.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식 2에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
    알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    리신(K), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    아스파르트산(D), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    글루탐산(E), 글리신(G), 이소루신(I)이 1:4:1의 비율로 이루어지거나,
    글리신(G), 알라닌(A), 페닐알라닌(F)이 1:3:2의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 식 3에서 n은 1이고, 상기 반복되는 펜타펩타이드 각각의 X는,
    티로신(Y), 리신(K)이 2:4의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K)이 3:3의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K), 이소루신(I)이 2:2:2의 비율로 이루어지거나,
    티로신(Y), 리신(K)이 4:2의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는, 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드.
  9. 제1항의 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드를 코딩하는 유전자.
  10. 제9항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  11. 제9항의 유전자 또는 제10항의 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 버섯 유래 티로시나제(tyrosinase)를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입되어 공동 발현되는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  13. 하기 단계를 포함하는 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드의 제조방법:
    (1) 제11항의 재조합 미생물을 배양하여 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
    (2) 상기 생성된 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드를 수득하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 재조합 미생물은, 버섯 유래 티로시나제를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 발현벡터가 추가로 도입되어 상기 다중 블록 코폴리펩타이드와 티로시나제가 공동 발현되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  15. 제1항의 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드를 포함하는 접착용 조성물.
  16. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 소수성 EBP가 코어 구조를 형성하고, sEBP가 쉘 구조를 형성함으로써 자가조립으로 제조되는, 나노구조체.
  17. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항의 점착성 다중 블록 코폴리펩타이드가 온도 자극에 의해 블록 폴리펩타이드간 가교 결합을 형성하여 제조되는, 하이드로젤.
  18. 제17항의 하이드로젤을 포함하는 접착용 조성물.
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