CN116082667A - 一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法。现有的多肽水凝胶主要依赖于化学合成目标多肽，从而形成可注射式水凝胶。然而化学合成法价格昂贵，难以大规模应用，并且化学合成只能用于合成序列较少的活性短肽，无法合成较长序列的大分子蛋白。本发明克服了上述困难，可以使得任意重组蛋白自组装成为超分子水凝胶而不依赖于化学合成。具体方法：将淀粉样自组装短肽Ure2(1‑80)融合到任意重组蛋白上，得到的融合蛋白在浓度低于32mg/mL会形成纳米纤维状自组装聚集，而在大于或等于32mg/mL时会形成具有剪切变稀效应和可注射性等特征的超分子水凝胶，此水凝胶的形成无需任何额外的人工干扰，仅仅只需要静置一段时间即可完成成胶。

Description

一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法。
背景技术
驱动单个多肽进入更有序的超分子结构，通常称为自组装，是自然生物系统的标志。自组装过程由非共价物理相互作用控制，诸如氢键、范德华力、离子相互作用，疏水作用等。这些物理相互作用的累计最终生成了稳定、有序的超分子结构，产生复杂和独特的材料功能。因此，基于自组装短肽的纳米材料在众多生物医药和生物技术领域是一种非常有前景的材料，包括组织工程，再生医学、酶催化、生物传感器和药物递送等。
在这些纳米材料中，基于重组蛋白的自组装材料与传统的合成聚合物或天然材料相比有很多优点。例如，化学合成的聚合物在应用上受到本身固有的生物不相容性、生物不降解性以及产生的有毒副产物等局限，而天然来源的蛋白材料如胶原蛋白、层粘连蛋白以及Matrigel尽管已经成为3D细胞培养和组织工程支架的主要成分，然而这些材料不适合医疗应用。首先上述材料从活的动物组织分离，可能具有潜在的不良免疫反应及高感染风险，且Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤，同时动物来源材料的质量通常因批次而异，并且可能由于材料中存在的未知细胞信号因子而产生不良影响。相比之下，微生物合成的自组装重组蛋白材料特别有吸引力，不仅因为它们具有出色的生物降解性、生物相容性以及与细胞外基质的相似性，同时还具有批次稳定的同质性、序列与功能的可编程性、成本低、易于大规模生产。
迄今为止，自组装重组蛋白材料主要依赖于化学法合成具有自组装功能的蛋白短肽来实现，如双亲肽，由交替的亲水性和疏水性氨基酸组成，在溶液中会自组装成为β-折叠式纳米结构水凝胶，然而化学法合成价格昂贵，难以大规模应用；化学法合成难以合成大分子蛋白，导致目前的自组装重组蛋白凝胶材料主要集中在小分子活性肽的自组装成胶体，对于大分子功能蛋白的自组装成胶体尚未见报道。因此，如何降低自组装蛋白的生产成本并且使得大分子功能蛋白同样实现自组装成为水凝胶是亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，包括：1)目前自组装重组蛋白材料主要依赖于化学法合成具有自组装功能的蛋白短肽来实现，价格昂贵，难以大规模应用；2)化学法合成难以合成大分子蛋白，导致目前只能实现小分子活性肽自组装成为水凝胶，对于大分子功能蛋白自组装成为水凝胶难以实现；本项目提供了一种基于淀粉样自组装短肽Ure2(1-80)的自组装成胶机制，可以使得任意大分子蛋白自组装成为纳米纤维和水凝胶等超分子纳米材料，并且无需额外人工化学合成自组装短肽。
一种基于淀粉样自组装短肽Ure2(1-80)的自组装成胶机制，自组装短肽可以使得工程菌表达出的任意重组蛋白自组装成为纳米纤维和水凝胶等超分子纳米材料。
进一步地，自组装短肽为酿酒酵母中的淀粉样纤维Ure2(1-80)，其氨基酸序列为：MMNNNGNQVSNLSNALRQVNIGNRNSNTTTDQSNINFEFSTGVNNNNNNNSSSNNNNVQNNNSGRNGSQNNDNENNIKNT。
进一步地，针对上述氨基酸序列从C端开始截断至第16个氨基酸，生成的每一个短肽突变体同样具备将任意重组蛋白自组装成为纳米纤维和水凝胶等超分子纳米材料特性。
进一步地，针对上述氨基酸序列进行不多于10％的任意氨基酸替换，仍然不会改变上述短肽自组装重组蛋白的特性。
进一步地，将自组装短肽通过基因工程手段融合到任意重组蛋白的N端或C端，即可使得该重组蛋白自组装成为纳米纤维和水凝胶等超分子材料。
进一步地，融合有自组装短肽的重组蛋白，在工作浓度低于32mg/ml(如2-16mg/ml)时会形成纳米纤维状自组装聚集体，工作环境可以为任意的水溶液，包括纯水以及各种缓冲液，环境温度不限，可以在0℃-室温都可以进行；自组装完成的时间随着融合蛋白浓度的提高而缩短，在低浓度(2mg/ml)时，大约需要静置2天时间完成全部自组装，在更高浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时完成全部自组装，此时已形成超分子水凝胶。
进一步地，融合有自组装短肽的重组蛋白，在工作浓度大于或等于32mg/mL时会形成具有剪切变稀效应和可注射性等特征的超分子水凝胶，此水凝胶的形成无需任何额外的人工干扰，如调pH，添加化学交联剂等；工作环境可以为任意的水溶液，包括纯水以及各种缓冲液，环境温度不限，可以在0℃-室温都可以进行；在较低浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时可完成水凝胶的生成，在高浓度时(75mg/ml)，只需要静置30min即可完成成胶。
进一步地，融合有自组装短肽的不同重组蛋白，在工作浓度大于或等于32mg/mL时，可以以任意比例进行混匀，并形成具有剪切变稀效应和可注射性等特征的超分子复合水凝胶，此复合水凝胶的形成无需任何额外的人工干扰，如调pH，添加化学交联剂等；工作环境可以为任意的水溶液，包括纯水以及各种缓冲液，环境温度不限，可以在0℃-室温都可以进行；在较低浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时可完成水凝胶的生成，在高浓度时(75mg/ml)只需要静置30min即可完成成胶。
本发明的有益效果：
本发明通过从酿酒酵母中筛选得到一个淀粉样自组装短肽Ure2(1-80)，将此短肽序列或其突变体通过融合方法连接到任意重组蛋白上，得到的融合蛋白会形成具有剪切变稀效应和可注射性等特征的超分子水凝胶或纳米纤维等超分子纳米材料，此水凝胶的形成无需额外人工化学合成自组装短肽，降低了超分子纳米材料生产成本，且无需任何额外的人工干扰，如调pH，添加化学交联剂等，仅仅只需要静置即可完成成胶。本发明开发的重组蛋白自组装机制将在可注射凝胶、组织工程、药物递送、酶固定化等领域有着广阔的应用。
附图说明
图1为融合自组装短肽Ure2(1-80)的绿色荧光蛋白(Ure2(1-80)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图2为融合有C段截断了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan8)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan8)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图3为融合有C段截断了16个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图4为融合有随机突变了4个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图5为融合有随机突变了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图6为荧光蛋白融合有不同自组装短肽的纳米纤维形成效率；
图7为透射电镜下Ure2(1-80)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图8为透射电镜下Ure2(jieduan)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图9为透射电镜下Ure2(tubian)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图10为Ure2(1-80)-EGFP在不同浓度时形成的有活性自组装聚集体；
图11为使用硫黄素T(Thioflavin T,ThT)检测Ure2(1-80)-EGFP在不同浓度时纳米纤维的形成；
图12为Ure2(1-80)-EGFP和Ure2(1-80)-mCherry在低浓度时(32mg/ml)形成的纳米水凝胶；
图13为Ure2(1-80)-EGFP和Ure2(1-80)-mCherry在高浓度时(75mg/ml)等比形成的超分子复合水凝胶；
图14为Ure2(1-80)-EGFP和Ure2(1-80)-mCherry在低浓度时(32mg/ml)以不同比例形成的超分子复合水凝胶；
图15为Ure2(1-80)-EGFP不同浓度形成的超分子水凝胶的流变特性；
图16为融合有C段截断了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan8)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan8)-EGFP)在低浓度时(32mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图17为融合有C段截断了16个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan)-EGFP)在高浓度时(75mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图18为融合有随机突变了4个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(32mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图19为融合有随机突变了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在高浓度时(75mg/ml)形成的超分子水凝胶。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的方案如下：
本发明提供了一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法，包括以下步骤：
将任意蛋白与淀粉样短肽或其突变体融合，再将一种或多种重组蛋白置于水溶液中进行自组装；
其中，淀粉样短肽的氨基酸序列为：
MMNNNGNQVSNLSNALRQVNIGNRNSNTTTDQSNINFEFSTGVNNN NNNNSSSNNNNVQNNNSGRNGSQNNDNENNIKNT。
进一步地，淀粉样短肽突变体为以下任意一种：
(a)淀粉样短肽从C端开始截断至第1～16个氨基酸中的任一种；
(b)淀粉样短肽进行不多于10％的氨基酸替换。
上述突变体中，不论截断还是氨基酸替换得到的突变体均不会改变上述重组蛋白的特性，生成的每一个短肽突变体同样具备将任意重组蛋白自组装成为水凝胶的特性。
进一步地，淀粉样短肽或其突变体融合至任意蛋白的N端或C端。
进一步地，将一种或多种重组蛋白置于水溶液中，静置得到水凝胶。
进一步地，静置30min～5h。
进一步地，所述重组蛋白在水溶液中的浓度为不低于32mg/ml。
进一步地，所述重组蛋白在水溶液中的浓度为32～75mg/ml。在工作浓度大于或等于32mg/ml时会形成具有剪切变稀效应和可注射性等特征的超分子水凝胶，此水凝胶的形成无需任何额外的人工干扰，如调pH，添加化学交联剂等；工作环境可以为任意的水溶液，包括纯水以及各种缓冲液，环境温度不限，如在0℃-室温都可以进行；在较低浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时可完成水凝胶的生成，在高浓度时(75mg/ml)只需要静置30min即可完成成胶。当然，不同的重组蛋白也可以以任意比例进行混匀实现水凝胶的制备。
本发明的第二个目的是提供一种由上述方法制备得到的水凝胶。
本发明的第三个目的是提供上述水凝胶在生物或医学领域中的应用。
进一步地，所述应用包括但不限于可注射凝胶、组织工程、药物递送、酶固定化等。
下述实施例使用的引物列表如下：
Figure BDA0004060511550000071
下述实施例中涉及的水溶液包括但不限于：
纯水、及各种缓冲溶液如PBS缓冲液，Tris-HCl缓冲液，磷酸缓冲液等。
实施例1淀粉样纤维短肽Ure2(1-80)的获得
Ure2(1-80)既可以从酿酒酵母的基因组克隆获得，也可以直接采用基因合成的方式获得，本案例中采用的基因合成的方式获得，其中的短肽的氨基酸序列为：
MMNNNGNQVSNLSNALRQVNIGNRNSNTTTDQSNINFEFSTGVNNN NNNNSSSNNNNVQNNNSGRNGSQNNDNENNIKNT。
相应的基因序列由于密码子偏好性原因，可以有很多种，但是最终只要编码的氨基酸序列为上述所示，即为本发明中的目标序列。
实施例2将淀粉样纤维短肽Ure2(1-80)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端
使用引物Pf_Ure2(1-80)(N)/Pr_Ure2(1-80)(N)，Pf_Ure2(1-80)-GFP(N)/Pr_Ure2(1-80)-GFP(N)以及Gibson组装试剂盒(New England Biolabs)将淀粉样纤维短肽Ure2(1-80)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端，并插入到表达质粒pET-28a(+)的NdeI/XhoI处，如此构建出表达质粒pET28a-Ure2(1-80)-EGFP。
实施例3将C段截断了16个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端
使用引物Pf_Ure2(jieduan)(N)/Pr_Ure2(jieduan)(N)，Pf_Ure2(jieduan)-GFP(N)/Pr_Ure2(jieduan)-GFP(N)以及Gibson组装试剂盒(New England Biolabs)将截断的淀粉样纤维短肽Ure2(jieduan)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端，并插入到表达质粒pET-28a(+)的NdeI/XhoI处，如此构建出表达质粒pET28a-Ure2(jieduan)-EGFP。
实施例4将随机突变了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端
采用基因合成的方式将淀粉样纤维短肽Ure2(1-80)随机突变了8个氨基酸，占总短肽序列的10％，突变的8个氨基酸位点均是随机选择的，以证明本自组装短肽可以任意改变自身序列的10％，但是仍然不会改变其自组装活性。使用引物Pf_Ure2(tubian)(N)/Pr_Ure2(tubian)(N)，Pf_Ure2(tubian)-GFP(N)/Pr_Ure2(jieduan)-GFP(N)以及Gibson组装试剂盒(New England Biolabs)将突变的淀粉样纤维短肽Ure2(突变)融合到绿色荧光蛋白(EGFP)的N端，并插入到表达质粒pET-28a(+)的NdeI/XhoI处，如此构建出表达质粒pET28a-Ure2(tubian)-EGFP。
实施例5目标蛋白的表达以及纯化
培养基的配制：LB(Luria broth)液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，PH 7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min。
LB固体培养基：在LB(Luria broth)液体培养基基础上添加2％琼脂粉；121℃高压蒸汽灭菌20min。
大肠杆菌感受态制备：
本实施例所选用的表达菌株为大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3)),挑单菌落于5mL LB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)过夜(约12H)。取500μL过夜培养物转接于50mL新鲜LB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)至吸光度在600nm处达到0.35-0.6。将0.1mol/L CaCl2溶液置于冰上预冷。吸取25mL菌液至50mL EP管中，置于冰上冷却10min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1.666mL预冷0.1mol/L CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，冰上放置20min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1mL预冷混合溶液(0.1mol/LCaCl2混合10％甘油)，吸打混匀使细胞重新悬浮。每管100μL细胞悬浮液分装于1.5mL EP管中，于-70℃冷冻贮存备用。
质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli BL21)：
待感受态细胞融化后，向100μL感受态细胞中转入1ul质粒，缓慢轻弹混匀。冰上放置30min后42℃水浴锅中热激90s，冰上放置10min。向感受态细胞EP管中加入1mL新鲜LB培养基，放入摇床培养(37℃,200rpm,1H)。将大肠杆菌全部加入到卡纳霉素的抗性平板中，充分涂布均匀。转化平板放入37℃培养箱倒置培养12-24H。
菌株发酵：
配制菌种活化培养基(LB液体培养基)，将工程菌按照1％的比例加入菌种活化LB培养基中摇床(37℃,200rpm)培养10-12H，将活化的菌种，以OD600为0.1的起始接种量接种入200mL发酵培养基中(LB液体培养基)，摇床(37℃，200rpm)培养至吸光度在600nm处达到0.5-0.6后加入10mM IPTG，摇床(30℃，200rpm)诱导发酵10-12H，测量吸光度在600nm处为2.0-2.5。
收集菌体：
经高速冷冻离心机6000rpm、10min、4℃去除上清后，200mL发酵液分批次转移至50mL EP管中，得到的菌体置于涡旋仪上使菌体重悬均匀，在冰浴中进行超声破碎。
超声破碎仪器参数设置：功率900W、探头大小12mm、振幅60％、超声2s停止2s、总时间2min，一共超声6min。
蛋白纯化：
将细胞破碎液转移至50mL EP管中，高速冷冻离心机8000rpm、10min、4℃，小心的将上清转移到干净的管中而不触碰下面的沉淀，上清与5mL Ni-NTA琼脂糖纯化树脂混匀，置于混匀仪上孵育1h。所用水和Buffer在使用之前均用0.22um或0.45um滤膜过滤已减少杂质对填料的影响。
用10倍柱体积的Stripping Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，100mM EDTA，pH8.0)进行清洗，再用10～20倍柱体积去离子水清洗树脂，然后用5倍柱体积的100mM NiSO4(溶解于去离子水中)洗涤树脂，最后用10倍柱体积的1X PBS重新平衡，平衡好的树脂可进行纯化实验。
将孵育好的Ni-NTA琼脂糖纯化树脂上柱进行梯度洗脱，用20ml浓度为40mM咪唑洗脱掉绝大部分杂蛋白，再用150mM咪唑洗脱目的蛋白。使用改良型BCA法蛋白浓度测定试剂盒(C503051)确定洗脱液中蛋白浓度，洗脱的蛋白可用于SDS-PAGE分析。用5倍体积ElutionBuffer洗脱柱料，再用5倍体积Binding/Wash Buffer平衡柱料，最后用5倍体积ddH2O清洗柱料，加入20％乙醇保护液，置于2～8℃保存，不可冻存。将收集好的蛋白洗脱液透析后进行冻干处理，最终得到目标蛋白，4℃进行保存。
实施例6纳米纤维状自组装聚集的制备
融合有上述自组装短肽的重组蛋白，将其溶解在包括纯水或者各种缓冲液中，浓度区间为2mg/ml-32mg/ml，环境温度不限，0℃-室温都可以进行，将上述蛋白溶液静置即可得到纳米纤维状自组装聚集体，该自组装聚集体的重组蛋白活性仍然保持不变；自组装完成的时间随着融合蛋白浓度的提高而缩短，在低浓度(2mg/ml)时，大约需要静置2天时间完成全部自组装，在高浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时完成全部自组装。
实施例7超分子水凝胶的制备
所述纳米纤维状自组装水凝胶制备方法如下：融合有上述自组装短肽的重组蛋白，将其溶解在包括纯水或者各种缓冲液中，浓度区间为大于32mg/ml，环境温度不限，0℃-室温都可以进行，将上述蛋白溶液静置即可得到纳米纤维状自组装水凝胶，该水凝胶中的重组蛋白活性仍然保持不变；自组装完成的时间随着融合蛋白浓度的提高而缩短，在较低浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时可完成水凝胶的生成，在高浓度时(75mg/ml),只需要静置30min即可完成成胶。
实施例8复合水凝胶的制备
融合有上述自组装短肽的不同重组蛋白，分别将其溶解在包括纯水或者各种缓冲液中，浓度区间为大于10mg/ml，环境温度不限，0℃-室温都可以进行，将上述蛋白溶液按任意比例混合后静置即可得到纳米纤维状自组装复合水凝胶，该复合水凝胶中不同重组蛋白组分混合均匀，并且均保持活性；自组装完成的时间随着融合蛋白浓度的提高而缩短，在较低浓度时(32mg/ml)，大约需要静置5个小时可完成水凝胶的生成，在高浓度时(75mg/ml),只需要静置30min即可完成成胶。
实施例9使用硫黄素T(Thioflavin T,ThT)检测纳米纤维的形成
硫黄素T(Thioflavin T,ThT)会与形成的纳米纤维相结合从而发出荧光，因此将目标蛋白水溶液与20mM硫黄素T(Thioflavin T,ThT)进行混合，在固定波长/激发波长440/530nm下测量荧光值。通过将测量的荧光值除以该孔的OD600，对所有荧光测量进行归一化。细胞荧光和细胞密度(OD600)通过Cystation 3成像读取器系统(BioTek，Winooski，USA)进行测量。进行了三次生物次重复，并对每个样品取平均值。
实施例10TEM观察纳米纤维的形成
进行负染色TEM，吸取10μL目标蛋白悬浮液滴(30μM)加载到辉光放电碳涂层网格，并保持1分钟。通过用滤纸吸去额外的样品并保持1分钟。2％乙酸铀酰用于染色样品持续20秒。在100千伏下操作的CM120-FEG(FEI)显微镜用于记录了显微照片。
实施例11超分子水凝胶的流变测定
使用应变控制流变仪(TA Instruments，AR-G2)进行研究超分子水凝胶的流变性质。通过进行三个所有测量独立制备的水凝胶样品。不同浓度制备的水凝胶样品置于板上。流变学实验为将不同的浓度放在平板上。然后采用与应变相关的应变扫描模式为振幅范围为0.01％至1000％，固定频率为1rad/s或固定频率扫描模式应变1％，0.01弧度/秒至10弧度/秒的频率扫描模式，同时不断测量储能模量(G')和损耗模量(G“)中。
以上实施例的结果如下：
图1融合自组装短肽Ure2(1-80)的绿色荧光蛋白(Ure2(1-80)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体，其中A表示对照，为没有融合短肽的绿色荧光蛋白(EGFP)，B为Ure2(1-80)-EGFP；
图2融合有C段截断了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan8)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan8)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图3融合有C段截断了16个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图4融合有随机突变了4个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图5融合有随机突变了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(2mg/ml)形成的聚集体；
图6荧光蛋白融合有不同自组装短肽的纳米纤维形成效率。Control为没有融合有自组装短肽的荧光蛋白(EGFP)
图7透射电镜下Ure2(1-80)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图8透射电镜下Ure2(jieduan)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图9透射电镜下Ure2(tubian)-EGFP融合蛋白形成纳米纤维结构；
图10Ure2(1-80)-EGFP在不同浓度时形成的有活性自组装聚集体；A：聚集体在白光下，B:聚集体在紫外光下。由于紫外光下聚集体发出荧光，表明该聚集体中的荧光蛋白是有活性的组装。从图中可看出，在浓度低于32mg/ml时可见明显沉淀，未形成凝胶，而当浓度达到32mg/ml时即可形成水凝胶。
图11使用硫黄素T(Thioflavin T,ThT)检测Ure2(1-80)-EGFP在不同浓度时纳米纤维的形成。
图12Ure2(1-80)-EGFP(A)和Ure2(1-80)-mCherry(B)在低浓度时(32mg/ml)形成的纳米水凝胶。A：融合有自组装短肽Ure2(1-80)的绿色荧光蛋白，B:融合有自组装短肽Ure2(1-80)的红色荧光蛋白
图13Ure2(1-80)-EGFP和Ure2(1-80)-mCherry在高浓度时(75mg/ml)等比形成的超分子复合水凝胶。
图14Ure2(1-80)-EGFP和Ure2(1-80)-mCherry在低浓度时(32mg/ml)以不同比例形成的超分子复合水凝胶。
图15Ure2(1-80)-EGFP不同浓度形成的超分子水凝胶的流变特性。使用应变控制流变仪(TA Instruments，AR-G2)分别在振幅(A)和频率(B)扫描模式下测得超分子水凝胶的流变性质。
图16融合有C段截断了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan8)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan8)-EGFP)在低浓度时(32mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图17融合有C段截断了16个氨基酸的短肽突变体Ure2(jieduan)的绿色荧光蛋白(Ure2(jieduan)-EGFP)在高浓度时(75mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图18融合有随机突变了4个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在低浓度时(32mg/ml)形成的超分子水凝胶；
图19融合有随机突变了8个氨基酸的短肽突变体Ure2(tubian)的绿色荧光蛋白(Ure2(tubian)-EGFP)在高浓度时(75mg/ml)形成的超分子水凝胶。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种可以使任意重组蛋白自组装成超分子胶体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将任意蛋白与淀粉样短肽或其突变体融合，再将一种或多种重组蛋白置于水溶液中进行自组装；
其中，淀粉样短肽的氨基酸序列为：
MMNNNGNQVSNLSNALRQVNIGNRNSNTTTDQSNINFEFSTGVNNN NNNNSSSNNNNVQNNNSGRNGSQNNDNENNIKNT。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，淀粉样短肽突变体为以下任意一种：
(a)淀粉样短肽从C端开始截断至第1～16个氨基酸中的任一种；
(b)淀粉样短肽进行不多于10％的氨基酸替换。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：淀粉样短肽或其突变体融合至任意蛋白的N端或C端。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将重组蛋白置于水溶液中静置得到水凝胶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：静置30min～5h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组蛋白在水溶液中的浓度为不低于32mg/ml。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组蛋白在水溶液中的浓度为32～75mg/ml。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备得到的水凝胶。
9.权利要求8所述的水凝胶在生物或医学领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用为可注射凝胶、组织工程、药物递送或酶固定化。
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