CN115724944B - 一种类弹性蛋白多肽(vptig)30及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类弹性蛋白多肽(VPTIG)30及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明首先合成类弹性蛋白多肽(VPTIG)30基因序列，插入质粒中构建重组质粒，导入到DH5a大肠杆菌中，培养后提取重组质粒；然后将得到的重组质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达重组蛋白后，向重组大肠杆菌中加入裂解缓冲液并重悬菌体，进行破碎处理，收集含有目的蛋白的沉淀，得到的沉淀通过变性和复性的方法纯化获得类弹性蛋白多肽(VPTIG)30。本发明的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30制备方法比较简单，易于大规模制备，本发明的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30为设计满足不同需求的新ELPs奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽(VPTIG)30及其制备方法和应用。
背景技术
具有生物相容性和自组装特性的新型纳米材料的发现和应用拓宽了纳米材料在生物医学领域研究中的发展。该领域的进展有望推进生物医学研究，并为设计具有自组装能力的智能纳米生物相容性材料提供新的灵感。这些新设计的材料具有生物相容性高、稳定性好、药代动力学优异等特性。在这些新型纳米材料中，类弹性蛋白多肽(elastin-likepolypeptides，ELPs)及其衍生物等生物相容性材料显示出巨大的潜力。弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，主要存在于动脉、皮肤、肺和韧带的结缔组织中，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维，与胶原纤维一起赋予组织以弹性和抗张能力。ELPs是由原弹性蛋白疏水结构域中的重复氨基酸序列衍生而来的重复人工多肽，其结构主要由五肽(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly,VPGXG)重复单元串联而成，其中Xaa代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸。ELPs最典型的特性是温度敏感性和自组装性，随着环境温度的改变，ELPs会发生可逆相变过程。在一定环境条件下，若环境温度低于相变温度(transition temperature,Tt)则ELPs高度可溶，反之高于该温度时则组装形成凝聚相，随着温度降低，又恢复溶液态。这种相变或自组装过程主要是温度感应的聚集，通常具有不同程度的热滞。凭借这些特殊性质，纳米工程ELPs被认为是一种新的有前景的药物递送和控释材料，具有延长药物半衰期、较低的药物毒性、较高的药物溶解性、良好的生物相容性、优异的药代动力学行为等特点。然而，它们可能的应用领域主要取决于它们的内在特性，由于其单一的高Tt值、不受控制的自组装行为和不可调节的滞后特性，它们在生物医学领域的进一步应用仍然受到很大限制。
ELPs具有重要的理论研究和实际应用价值，但也存在一些问题，主要有：(1)蛋白纯化复杂，需要经过离子交换、分子排阻等一系列层析方法纯化，成本高昂；(2)ELPs相变蛋白序列较为有限，生物医学应用相对受限。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种类弹性蛋白多肽(VPTIG)30及其制备方法和应用。
本发明的技术方案如下：
一种类弹性蛋白多肽，所述的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTIG)n，n＝5-50。
基于上述技术方案，进一步地，所述的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTIG)30，在0.5mg/ml浓度下发生相态转变的温度(Tt值)为22℃，且在降温时，不发生可逆相变，显示其热行为是大热滞类型，保持稳定的沉淀状态。
本发明另一方面提供上述的类弹性蛋白多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)人工合成编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列，插入质粒中构建重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中，培养后提取重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达；
(3)向步骤(2)得到的大肠杆菌中加入裂解缓冲液并重悬菌体，进行破碎处理，收集含有目的蛋白的沉淀；
(4)步骤(3)得到的沉淀通过变性和复性的方法纯化获得类弹性蛋白多肽。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述质粒为pET28a，基因片段插入到pET28a载体的NcoI和XhoI之间。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中培养温度为30～37℃，培养基为LB培养基。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中诱导表达的具体过程为：当菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入0.5～5mmol/L的IPTG，30～37℃条件下培养3～8h。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中破碎处理的具体方式为超声破碎、均质破碎、球磨破碎和反复冻融破碎的一种或二种以上的组合。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中裂解缓冲液的组分为：10～30mmol/LTris-HCl、0.5～10mmol/L EDTA。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中变性和复性的方法包括以下步骤：
1)向含有目的蛋白的沉淀中加入洗涤缓冲液I，依次洗涤离心3次以上去除细胞碎片，然后加入洗涤缓冲液II，依次洗涤离心2次以上去除杂蛋白；
2)向步骤1)得到的沉淀中加入8mol/L尿素溶液，剧烈搅动1～5h，随后将上清液装入透析袋中于复性缓冲液透析，每12个小时更换一次复性缓冲液，复性缓冲液中的尿素浓度从8mol/L梯度递减至0mol/L，最终获得复性的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30。
基于上述技术方案，进一步地，洗涤缓冲液I的组分为：0.5～5％TritonX-100，20～100mmol/L氯化钠；洗涤缓冲液II的组分为：0.5～2mol/L尿素，20～100mmol/L氯化钠，20～100mmol/L Tris-HCl。
本发明还提供上述的类弹性蛋白多肽在制备药物递送系统方面的应用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30制备方法比较简单，同时降低了纯化降低，易于大规模制备；
2.本发明的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30丰富了ELPs的种类，为药物载体的开发提供新类型；
3.本发明探究了1,6己二醇对类弹性蛋白多肽ELP30自组装机制的影响，有助于进一步了解之前报道的其他缺乏分子深度理解的ELPs的行为，为设计满足不同需求的新ELPs奠定基础，有助于设计满足不同需求的新ELPs，并扩大其在多个领域的实际应用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为类弹性蛋白多肽(VPTIG)30的酶切验证图。
图2为类弹性蛋白多肽(VPTIG)30的纯化结果图。
图3为类弹性蛋白多肽(VPTIG)30的质谱分析图。
图4为类弹性蛋白多肽(VPTIG)30热行为分析图。
图5为类弹性蛋白多肽(VPTIG)30圆二色谱分析图。
图6为不同浓度的1,6己二醇对类弹性蛋白多肽(VPTIG)30的浊度影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
类弹性蛋白多肽主要由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n五肽重复单元串联组成，其中Xaa(X)指除了脯氨酸(Pro)外的氨基酸，通常为缬氨酸(Val，V)，丙氨酸(Ala,A)，甘氨酸(Gly,G)，亮氨酸(Leu,L)，异亮氨酸(Ile,I)，赖氨酸(Lys,K)，苯丙氨酸(Phe,F)，组氨酸(His,H)等几种氨基酸类型，通常VPGXG中前3个和最后1个氨基酸在五肽重复单元串联组成n为20-120的重复序列中一直保持不变，我们改变策略，设计一种新型的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30。
本发明提供一种类弹性蛋白多肽ELP30[(VPTIG)30]的制备方法，包括以下步骤：
(1)人工合成类弹性蛋白多肽ELP30的基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，并进行扩增，具体条件为：95℃预变性5min，95℃变性25s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。
(2)将获得的ELP30基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到pET28a载体的NcoI和XhoI之间，形成pET28a-ELP30载体；具体过程为：将获得的ELP30基因片段通过NcoI和XhoI双酶切和试剂盒纯化，按照Takara公司的TIANgel Midi purification说明书连接获得pET28a-ELP30载体，酶切鉴定阳性后，将pET28a-ELP30载体导入DH5α感受态，37℃条件下卡那霉素抗性平板培养，挑取单克隆菌落，在10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液中，37℃摇菌过夜；
(3)NcoI和XhoI双酶切鉴定阳性后，提取质粒，将含外源目的基因ELP30的pET28a表达载体质粒pET28a-ELP30，转导到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)感受态，挑取单克隆菌，在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液，37℃摇菌过夜，然后在300mL三角瓶中加入100mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液，然后加入1mL菌液，37℃条件下摇菌3h左右，当OD600值达到0.6-0.8时，加入1mmol/L的IPTG，37℃摇菌表达5h。10000rpm离心10min收集表达菌体。然后，加入0.02mol/LPBS缓冲液30mL，超声破碎，17000rmp离心40min取沉淀，将沉淀加入缓冲液重悬后，与带巯基乙醇的LoadingBuffer混合后100℃煮5分钟，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达菌沉淀中(VPTIG)30的重组蛋白表达分子量和表达量。
实施例2
(VPTIG)30的进一步纯化与复性：
通过包涵体洗涤与复性即可获得相应纯化蛋白，具体步骤如下：
(VPTIG)30重组蛋白的表达形式为包涵体，故采用包涵体洗涤的方法对重组蛋白进行分离纯化。使用裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)重悬菌体后，超声破碎仪将其破碎，离心收集沉淀。首先用包涵体洗涤缓冲液I(1％TritonX-100，50mmol/L氯化钠)依次洗涤离心4-5次去除细胞碎片，然后用包涵体洗涤缓冲液II(1mol/L尿素，50mmol/L氯化钠，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)依次洗涤离心2-3次去除杂蛋白，最后加入8mol/L尿素将包涵体变性，剧烈搅动2-3h，随后将上清液装入透析袋中于复性缓冲液透析，每12个小时更换一次复性缓冲液，复性缓冲液中的尿素浓度从8mol/L梯度递减至0mol/L，最终获得复性的(VPTIG)30重组蛋白，-20℃保存蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白含量和纯度，结果如图2所示，(VPTIG)30重组蛋白的质谱结果如图3所示。
实施例3
将装有类弹性蛋白多肽ELP30水溶液(0.5mg/ml)的比色皿放入仪器中，按先后顺序打开仪器电源开关→电脑→window7操作界面下打开纳米粒度及zeta电位操作软件Zetasizer software。
(1)在菜单栏中功能选项中选择size，之后点Manual measurement右侧的开始按钮(仪器正常联机后该按钮显示绿色)，出现方法设定界面。
(2)在方法设定界面中Measure type项下选择size；Sample项下输入样品名，分散溶剂Dispersant项下选择水；Temperature项下输入设定温度：15℃；Equilibration time项下输入样品测定前稳定时间；Measurement项下输入对应的测定运行次数(Number ofruns)、运行时间(Run duration)和循环次数(Number of measurements)。
(3)参数设定之后点start开始测定，结束后返回到主菜单窗口在records view项下找到对应的样品文件名，在intensity PSD等项下查看结果Z-average平均直径。
(4)最后，在配备多单元热电温度控制器的ZS90型纳米粒度及Zeta电位分析仪上以1℃/分钟的速率加热和冷却，结果如图4所示，类弹性蛋白多肽ELP30在0.5mg/ml浓度下Tt值为22℃，且在降温时，不能恢复溶液状态，显示其热行为是大热滞类型。
实施例4
实施例2制备的可溶性类弹性蛋白多肽ELP30的圆二色谱分析检测，包括以下步骤：
(1)开机
(2)光谱条件设定
①设置狭缝宽度，这里设置为0.5nm。
②点击窗口上部“Acquisition Setup”，
弹出Scanning Setup对话框，在Acquisition mode中选择“Absorbance”。
与CD光谱扫描类似设置相应的测试条件，而后单击“OK”确认。
(3)参考谱测试(高压调节)
点击“Reference spectrum”的“record”记录光源能谱。
在这个过程中“HV on”为打开，“Auto”为关闭。在一次参考谱扫描完成后，查看谱图纵轴电压值范围。手动输入HV的值，再次扫描参考谱，建议使谱图纵轴电压最大值在8V-9V左右。参考谱测试完成后，“Reference spectrum”变为红色。
(4)空白测试
将装有去离子水的比色池放入样品室中，单击Blank spectrum的“Record”按钮测试空白。
空白测试完成后，“Blank spectrum”变为红色。勾选“Subtract”，下一步样品测试时会直接扣除空白。
(5)样品测试
取出空白样品比色池，换成类弹性蛋白多肽ELP30溶液(0.01mg/ml)。点击Acquisition control下的开始按钮，进行样品测试，检测结果如图5所示。
(6)关机
实施例5
将分离纯化得到的类弹性蛋白多肽ELP30分装到6个1.5mL离心管中，分别加入0M、1M、2M、3M、4M、5M的1,6-己二醇水溶液至类弹性蛋白多肽ELP30终浓度为0.1mg/ml。然后将其放入42℃(高于其Tt值)水浴锅中水浴5分钟，拿出观察其状态。将不同浓度1,6己二醇的类弹性蛋白多肽ELP30溶液分别取200ul加至96孔板中，用带有温度控制的紫外分光光度计在42℃下测定其浊度。结果如图6所示，可以看出1,6-己二醇的添加可以改变其不可逆的相变情况，说明维持持ELPs结构的主要作用力为疏水作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种类弹性蛋白多肽，其特征在于，所述的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTIG)30。
2.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人工合成编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列，插入质粒中构建重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中，培养后提取重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达；
(3)向步骤(2)得到的大肠杆菌中加入裂解缓冲液并重悬菌体，进行破碎处理，收集含有目的蛋白的沉淀；
(4)步骤(3)得到的沉淀通过变性和复性的方法纯化获得类弹性蛋白多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述质粒为pET28a，基因片段插入到pET28a载体的NcoI和XhoI之间；培养温度为30～37℃，培养基为LB培养基。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中诱导表达的具体过程为：当菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入0.5～5mmol/L的IPTG，30～37℃条件下培养3～8h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中破碎处理的具体方式为超声破碎、均质破碎、球磨破碎和反复冻融破碎的一种或二种以上的组合。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中裂解缓冲液的组分为：10～30mmol/L Tris-HCl、0.5～10mmol/L EDTA。
7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中变性和复性的方法包括以下步骤：
1)向含有目的蛋白的沉淀中加入洗涤缓冲液I，依次洗涤离心3次以上去除细胞碎片，然后加入洗涤缓冲液II，依次洗涤离心2次以上去除杂蛋白；
2)向步骤1)得到的沉淀中加入8mol/L尿素溶液，搅动1～5h，随后将上清液装入透析袋中于复性缓冲液透析，每12个小时更换一次复性缓冲液，复性缓冲液中的尿素浓度从8mol/L梯度递减至0mol/L，最终获得复性的类弹性蛋白多肽(VPTIG)30；
步骤1)中洗涤缓冲液I的组分为：0.5～5％TritonX-100，20～100mmol/L氯化钠；洗涤缓冲液II的组分为：0.5～2mol/L尿素，20～100mmol/L氯化钠，20～100mmol/L Tris-HCl。
8.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽在制备药物递送系统方面的应用。
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