CN108048477A - 基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法。所述方法先将多肽的目的基因重组到载体质粒中，将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α，扩增重组质粒，通过抗性基因进行筛选，并测序验证，获得重组质粒转化成功的大肠杆菌DH5α，并通过碱裂解法提取重组质粒，再将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS菌株中，诱导目的多肽的表达，培养并收集菌体，最后将菌体用PBS缓冲液重悬、破碎、离心取沉淀，利用含有Triton X‑100的缓冲溶液重复重悬和离心步骤，反复清洗沉淀，然后溶解沉淀得到目的多肽。本发明利用大肠杆菌菌株BL21(DE3)Star和高表达量形成的包涵体，极大地提高多肽产量的同时简化了多肽纯化的步骤，提高了多肽的纯度，在基因重组制备多肽领域具有应用前景。

Description

基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法

技术领域

本发明涉及一种基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法，具体涉及应用大肠杆菌BL21(DE3)Star菌株和利用包涵体的特点表达并纯化以制备多肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

多肽具有极高的营养价值和丰富的多样性，是生物学界、医学界、药学界研究开发的热点。生物活性多肽不仅是人体生长发育所必需的营养物质，还担负着调节人体生理功能的作用(励建荣，封平，功能肽的研究进展，食品科学，2004，25(11)：415-419)。目前比较常见的多肽制备方法有蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法和提取分离法。近年来，比较优选的方法是化学合成法和基因重组法。化学合成法在寡肽制备方面有一定的优势，但是当多肽所含氨基酸个数达到30及以上时，基因重组法则更具优势。

基因重组法的作用对象广泛，可以基于转基因动植物，也可以通过基因工程微生物来生产多肽。比较常见的乳腺生物反应器就是一种典型的利用基因重组的动物来生产基因工程多肽的实例，其主要用途是生产多肽类药物。但是动物转基因技术相比于微生物还不够成熟且成功率较低，使用基因工程菌株生产多肽的技术较为成熟。李云亮等人使用大肠杆菌BL21菌株表达乳源性降血压肽，产量达到0.012g/L，且制备的活性乳源降血压肽对原发性高血压大鼠具有良好的降血压效果(李云亮，马海乐，基因工程法制备乳源性降血压肽及其活性研究，2011)。陈晨辉等人使用基因重组法完成了人心房利钠肽(ANP)的原核表达、纯化，产量也可达到0.016ml/L，且纯化后的ANP经UPLC及Tris-Tricine-SDS-PAGE鉴定，纯度大于90％(陈晨辉等.重组人心房利钠肽(ANP)的原核表达、纯化及鉴定.生物工程学报,2016,32(9):1273-1285)。但是使用基因工程菌株表达制备多肽仍然存在着一些问题，如何进一步提高多肽的产量和最大限度地简化纯化多肽的步骤一直是该技术领域的焦点问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法。

本发明的技术方案如下：

基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法，具体步骤如下：

步骤1，将多肽的目的基因通过分子克隆技术重组到载体质粒中，将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α，扩增重组质粒，通过抗性基因进行筛选，并测序验证，获得重组质粒转化成功的大肠杆菌DH5α，再通过碱裂解法提取重组质粒；

步骤2，将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS菌株中，诱导目的多肽的表达，培养并收集菌体；

步骤3，将菌体用PBS缓冲液重悬、破碎、离心取沉淀，利用含有Triton X-100的缓冲溶液重复重悬和离心步骤，反复清洗沉淀，加入6～8M尿素或者胍酸盐，溶解沉淀，得到目的多肽。

优选地，步骤3中，将目的多肽在体外用甲硫氨酸氨酰氨肽酶进行酶切，得到去除N端甲酰甲硫氨酸的多肽。

优选地，步骤1中，同时将多肽的目的基因和甲硫氨酸氨酰氨肽酶的目的基因重组到载体质粒中，共表达以得到去除N端甲酰甲硫氨酸的多肽。

优选地，步骤3中，对目的多肽进一步纯化，纯化方法为离子交换色谱、分子筛或超滤。

优选地，步骤3中，离子交换色谱使用反相色谱除去原先含量较低的杂蛋白，使目的多肽流穿。

本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS菌株的特性，实现了多肽的大量制备。大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS菌株是使用T7噬菌体RNA聚合酶为表达系统的高效表达外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的基因组上。同时该菌株又含有rne131基因突变，rne131突变基因能够增强菌株细胞内mRNA的稳定性，从而有效提高多肽的mRNA的稳定性，进而提高菌株表达多肽的能力，促进包涵体的形成。

另一方面，本发明在制备多肽时巧妙利用高表达量形成的包涵体的特点，在利用包涵体所带来的高表达量、高纯度的同时避免了其经常带给外源蛋白质的错误折叠、难以复性等问题。

在进一步的纯化手段方面，本发明还提出了一些优选方案，利用溶解包涵体后杂蛋白含量相对较低的特点，采用反相的离子交换色谱除去杂蛋白，让多肽以流穿的形式保留下来，以近乎零损失的方案完成了进一步纯化多肽的目的。

本发明与现有技术相比，其优点是：

(1)不仅适用于短肽的制备而且在长多肽的制备方面有其独特的优势；

(2)利用包涵体表达量高的特点极大限度地提高了多肽的产量，但却没有引入包涵体本身带来的引起蛋白错误折叠的问题；

(3)利用包涵体易于清洗、利于纯化的特点，极大地简化了后续的多肽纯化步骤。

附图说明

图1为用于表达Aβ40和Aβ42多肽的菌株破碎后上清和沉淀的蛋白分布的Tris-Tricine-SDS-PAGE胶图。

图2为用于表达Aβ40多肽的菌株破碎后获得的沉淀通过反复重悬洗涤、阳离子交换柱和超滤手段纯化之后的Tris-Tricine-SDS-PAGE胶图。

图3为用于表达Aβ42多肽的菌株破碎后获得的沉淀通过反复重悬洗涤、阳离子交换柱和超滤手段纯化之后的Tris-Tricine-SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明的适用范围，以下结合实施例和附图对本发明加以说明，但该发明的应用不局限本实施例所定范围。

本实例所述的质粒pET-Sac，pLysS，以及大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)Star均由商业购买。

实施例1：多肽Aβ42在大肠杆菌BL21(DE3)Star中的表达

(1)载体pET-Sac-Aβ(M1-42)的构建和扩增：

本实验中所使用的大肠杆菌DH5α和表达菌株BL21(DE3)均为本实验室原有菌种，BL21Star(DE3)pLysS购买自上海唯地生物有限公司，pET-Sac-Aβ(M1-42)购买自Addgene。

(a)扩增目的基因。使用划线法将含有目的基因质粒pET-Sac-Aβ(M1-42)的大肠杆菌DH5α接种到含有氨苄青霉素和氯霉素混合抗性的平板上，37℃，12h。挑取单克隆接种到5ml LB培养基中37℃，12h。

(b)提取含有目的基因的pET-Sac-Aβ(M1-42)质粒。使用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒进行抽提质粒。成功收集到含有目的ΔNA片段的质粒并测浓度，测试结果如表1。

表1质粒pET-Sac提取结果

(c)转化重组质粒至大肠杆菌BL21Star(DE3)pLysS感受态细胞。用移液枪吸取2μl的pET-Sac-Aβ(M1-42)质粒分别加入到两管BL21Star(DE3)pLysS感受态细胞，混匀，冰敷30min，42℃水浴热击90s，再冰敷2-3min，加入700μl LB培养基，37℃摇床培育45min，取100μl用涂布平板法涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素混合抗性的平板上，恒温37℃培养12h，同时涂五种培养基平板，观察培养基菌落生长状况。如表2所示，+表示生长状况良好，-表示没有生长。

表2培养基平板涂样情况

(2)Aβ42多肽在大肠杆菌BL21Star(DE3)pLysS中的表达纯化：

(a)诱导目的蛋白的表达。从5号平板上挑取单克隆子至5ml含有氨苄青霉素和氯霉素混合抗性的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。第二天1:200二次接种至1L培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.8左右，加入终浓度1.0mM IPTG继续诱导培养3h。

(b)将发酵后菌液4℃，6,000g离心15min，收集菌体，加入80ml 10mM Tris/Hcl1mM EDTA pH8.0缓冲液重悬沉淀，再4℃6,000g离心15min。再加入80ml 10mMTris/Hcl 1mMEDTA pH8.0的缓冲液重悬细胞。

(c)加入蛋白酶抑制剂PMSF，用均质机破碎菌体，将破碎之后的乳浊液4℃，12,000g离心10min，分离上清和沉淀，用16％的Tris-Tricine-SDS-PAGE分析上清和沉淀中的蛋白分布。图1为Aβ40和Aβ42上清和沉淀的分布的胶图。大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS和pET-Sac(AβM1-40)和pET-Sac(AβM1-42)质粒将多肽以不可溶的形式表达在包涵体当中。C为副对照组S40和C40分别表示用于表达Aβ40多肽的菌株中上清和沉淀的蛋白分布的Tris-Tricine-SDS-PAGE分析结果。S42和C42分别表示用于表达Aβ42多肽的菌株中的上清和沉淀的蛋白分布的Tris-Tricine-SDS-PAGE分析结果。

(d)将沉淀(包涵体)用50ml 10mM Tris/Hcl 1mM EDTA 0.5％Triton X-100pH8.00重悬，4℃，12,000g离心，反复洗涤三次。

(e)再加入50ml 10mM Tris/Hcl 1mM EDTA8M Urea pH 8.00的缓冲液4℃上下颠倒1h溶解沉淀(包涵体)。

(f)将50ml溶解液流过柱体积为1ml的阳离子交换柱。由于多肽Aβ42等电点为5左右，在pH 8.00的情况下，目的多肽Aβ42带负电，而大多数杂蛋白带正电，且杂蛋白的摩尔量较目的蛋白至少小一个数量级，所以利用小载量的阳离子交换柱就可以简单地在目的蛋白基本没有损失的情况下达到纯化的目的。

(g)通过Tris-Tricine-SDS-PAGE胶对纯化蛋白结果进行分析，用银染的手段进行染色，银染检测限达到ng级别。胶图可见流穿样品纯度已经较高，若预拿到更高纯度的多肽，可进一步采用超滤的手段，基本可以达到99％纯度。图3为用于表达Aβ42多肽的菌株破碎后获得的沉淀通过反复重悬洗涤、阳离子交换柱和超滤手段纯化之后的Tris-Tricine-SDS-PAGE胶图结果图。流穿为阳离子交换色谱的流穿液，超滤管上层清液为进过超滤处理后的上层未过超滤膜的液体，超滤管“废液”是指透过超滤膜之后的液体。

(h)通过Nanodrop(超微量紫外分光光度计)大致定量，多肽产量能达到至少20mg/L。

实施例2：多肽Aβ40在大肠杆菌BL21Star(DE3)pLysS中的表达

实验手段与实施例1，多肽Aβ42在大肠杆菌中的表达实验方案一致，Aβ40序列参考SEQ No.2，实验结果如图1、图2所示。图2为用于表达Aβ40多肽的菌株破碎后获得的沉淀通过反复重悬洗涤、阳离子交换柱和超滤手段纯化之后的Tris-Tricine-SDS-PAGE胶图结果。流穿为阳离子交换色谱的流穿液，超滤管上层清液为进过超滤处理后的上层未过超滤膜的液体，超滤管“废液”是指透过超滤膜之后的液体。

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 人类(Human species)

<400> 2

gacgctgaat tccgtcacga ctctggttac gaagttcacc accagaagct ggtgttcttc 60

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人类(Human species)

<400> 1

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Claims (5)

1.基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，将多肽的目的基因通过分子克隆技术重组到载体质粒中，将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α，扩增重组质粒，通过抗性基因进行筛选，并测序验证，获得重组质粒转化成功的大肠杆菌DH5α，再通过碱裂解法提取重组质粒；

步骤2，将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)Star pLysS菌株中，诱导目的多肽的表达，培养并收集菌体；

步骤3，将菌体用PBS缓冲液重悬、破碎、离心取沉淀，利用含有Triton X-100的缓冲溶液重复重悬和离心步骤，反复清洗沉淀，加入6～8M尿素或者胍酸盐，溶解沉淀，得到目的多肽。

2.根据权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于，步骤3中，将目的多肽在体外用甲硫氨酸氨酰氨肽酶进行酶切，得到去除N端甲酰甲硫氨酸的多肽。

3.根据权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于，步骤1中，同时将多肽的目的基因和甲硫氨酸氨酰氨肽酶的目的基因重组到载体质粒中，共表达以得到去除N端甲酰甲硫氨酸的多肽。

4.根据权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于，步骤3中，对目的多肽进一步纯化，纯化方法为离子交换色谱、分子筛或超滤。

5.根据权利要求1所述的制备多肽的方法，其特征在于，步骤3中，离子交换色谱使用反相色谱除去原先含量较低的杂蛋白，使目的多肽流穿。