CN101434958A

CN101434958A - 一种制备猪α-干扰素的方法

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Publication number: CN101434958A
Application number: CNA2008101636165A
Authority: CN
Inventors: 余东游; 姜礼辉; 刘韶娜; 陈伟东
Original assignee: HANGZHOU WONDERFUL BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: HANGZHOU WONDERFUL BIOTECHNOLOGY CO Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2009-05-20

Abstract

本发明提供一种制备猪α－干扰素的方法，通过目的基因克隆、构建芽孢杆菌表达载体、克隆启动子和信号肽序列并研究其对外源基因表达和分泌的影响，从而构建高效分泌型芽孢杆菌表达系统。通过改进猪α－干扰素基因工程菌发酵条件，提高其表达量；在复性液中添加与盐酸胍有相似结构的精氨酸，促进蛋白质溶解，不影响蛋白质活性，来提高猪α－干扰素的比活性，从而生产出具有高效、价廉、安全、无潜在病毒污染、稳定性高、单位体积活性效价高等优点的猪α－干扰素，本发明设计合理，适于工业化生产。

Description

一种制备猪α-干扰素的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及用高分泌型枯草芽孢杆菌表达系统制备猪α-干扰素的方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力，替代部分抗生素的使用。

1966—1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，而后，干扰素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认识。猪α-干扰素基因有2个亚型，至少有17个亚种，定位于猪的1号染色体上，目前只有部分被测序和表达。

猪α-干扰素是由10多个相关功能基因编码的蛋白质家族，与猪-ω干扰素亚型之间有高度的同源性。猪α-干扰素的全基因为570bp，编码189个氨基酸，其中诱导分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成，猪α-干扰素无内含子。早在1986年，Lefevre等得到了一个含α-干扰素基因的片段，序列分析表明其中有一连续的含190个密码子的开放阅读框，起始密码子上游有约100个核苷酸的5’区域，具TATTTAA序列，被认为是经修饰的HognessGoldberg盒。此基因编码的成熟猪α-干扰素的70-80位氨基酸有一个潜在的N-糖基化位点。此基因与人IFN-α1核苷酸的编码序列有78.5％同源，编码的氨基酸与人IFN-α1有64％同源，是所有已知动物IFN-α基因中与人类IFN-α基因同源性最高的。随着猪干扰素基因的克隆成功，对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre等人在大肠杆菌中表达了IFN-α基因，得到了一个含189个氨基酸的前体蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然IFN-α生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。重组猪α-干扰素的抗病毒能力是后续研究的一个热点，如对伪狂犬病毒(Jan et al，1991)、水泡性口膜炎病毒、流感病毒(Horisberger，1992)、传染性胃肠炎病毒(Jordan et al，1994)、猪呼吸与繁殖综合症病毒(Albina et al，1998)和口蹄疫病毒(Chinsangaramet al，2001)等。国内对猪α-干扰素的研究也比较早，刘万钧等(1998)用Vero传代细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行干扰试验，证明猪白细胞干扰素能有效地抑制PEDV的繁殖活性，在IFN剂量为100U/ml时可明显抑制，1000U/ml可显著抑制，2500U/ml几乎可完全抑制。其它研究人员对猪-α干扰素基因进行了克隆和表达，并获得了具有抗病毒活性重组蛋白，陈涛(2002)将克隆的猪α-干扰素基因进行了定点突变，第86位的CyS突变为Tyr，同时将N端首位氨基酸(CyS)的密码子TGT同义突变为大肠杆菌偏爱的密码子TGC，并将在大肠杆菌BL21中表达，获得的重组蛋白比未突变的重组蛋白抗病毒能力有所提高。谢海燕等(2004)在大肠杆菌BL21(DE3)中对猪α-干扰素进行了融合表达，经western-blotting检测，重组融合蛋白具有良好的反应源性；猪干扰素是一类具有抗病毒和免疫调节活性的细胞因子，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统之一。应用基因工程的方法通过大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统等表达的重组猪干扰素可以具有与天然干扰素高度相似甚至更高的抗病毒等生物学活性。因此，作为一类具有高效的抗病毒和免疫调节作用的生物制剂，重组猪α-干扰素在养猪业有广泛的应用前景。

1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫升干扰素。从1987年开始，使用基因工程方法生产干扰素。但目前的猪α-干扰素存在着稳定性差、产品活性低等难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备猪α-干扰素的方法，通过以下技术方案实现：

(1)设计一对在大肠杆菌中表达猪α-干扰素成熟肽基因的表达引物，克隆猪α-干扰素成熟肽基因，得到重组质粒；

SEQ NO 1：5Fifn 5’-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3，FcoRI

SEQ NO 2：3Eifn 5’-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3’NotI

猪α-干扰素基因序列见SEQ NO 3。

(2)载体构建：将重组质粒和表达载体用EcoI和Xba I进行双酶切，回收酶切片段，与表达载体连接，转化，筛选阳性质粒，然后进行PCR和酶切鉴定；

(3)猪α-干扰素在枯草芽孢杆菌中的表达：制备芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒经过点击转化导入其中，作进一步培养，并抽提质粒后进行SalI和XbaI双酶切检验；

(4)重组工程菌的蛋白电泳：菌液上清进行浓缩，用银染对SDS-PAGE进行染色；

(5)猪α-干扰素标的产物产量和活性的研究；

(6)菌种制备：将猪α-干扰素基因工程菌菌株接种到含氨苄青霉素钠的LB液体培养基中培养，将菌液接种于发酵罐中，温度30℃，pH为7.0，搅拌速度200-220rpm，培养6小时后增温至45℃诱导，猪α-干扰素开始表达，至28小时表达量达到最大值，在此期间质粒稳定性良好；

(7)获得产品：离心收集菌体，用缓冲液冲洗菌体，冰浴超声破碎，取上清液，收集包涵体沉淀，用洗涤液洗涤，取上清液，加入复性液，调节pH用复性液透析，取上清液浓缩；

(8)产品纯化：利用DEAE阴离子交换纤维柱梯度洗脱，收集含猪α-干扰素的洗脱液，超滤浓缩，得到产品。

本发明提供的方法，不仅提高猪α-干扰素的稳定性，降低其生产成本，提高其生产效率，而且能提高猪α-干扰素的单位体积的活性。具体体现在：

(1)构建的载体整合到芽孢杆菌中，十分稳定，不易丢失。

(2)发酵初期采用不含甲醇的LB培养基，培养后期采用1.0％甲醇诱导培养基培养，使芽孢杆菌的生长和蛋白表达有效分开，从而使得干扰素表达量可维持在较高的水平，不易分解。

(3)本发明是一种用高分泌型枯草芽孢杆菌表达系统生产猪α-干扰素的新工艺，这种新工艺通过目的基因克隆、构建芽孢杆菌表达载体、克隆启动子和信号肽序列并研究其对外源基因表达和分泌的影响，从而构建构建高效分泌型芽孢杆菌表达系统。通过改进猪α-干扰素基因工程菌发酵条件，提高其表达量；在复性液中添加与盐酸胍有相似结构的精氨酸，促进蛋白质溶解，不影响蛋白质活性，来提高猪α-干扰素的比活性。从而生产出具有高效、价廉、安全、无潜在病毒污染、稳定性高、单位体积活性效价高等优点的猪α-干扰素，这为工业化生产猪α-干扰素，并应用于我国的养猪事业奠定了基础。

附图说明

图1 为基因克隆示意图。

图2 为猪α干扰素基因PCR扩增电泳。

图3 为猪α-干扰素基因在枯草芽孢杆菌中的表达。

图4 为含有限制性酶切位点SalI和XbaI的PoIFN基因扩增。

图5 为枯草杆菌阳性表达子的双酶切产物电泳。

图6 为猪α-干扰素基因在枯草杆菌中表达产物的蛋白质电泳。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。

实施例1：猪α-干扰素生产用芽孢杆菌种的构建

一材料与方法

(一)实验材料

(1)目的基因扩增：

设计一对在大肠杆菌中表达猪α-干扰素成熟肽基因的表达引物，在上、下游引物的5’端分别引入EcoRI和NotI酶切位点序列，引物序列如下：

SEQ NO 1：5Eifn 5’-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3’EcoRI

SEQ NO 2：3Eifn 5’-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3’NotI

猪α-干扰素基因序列见SEQ NO 3。

(2)载体构建：将按照上述方法得到的重组质粒和表达载体用EcoI和XbaI进行双酶切，回收酶切片段，将经双酶切的基因片段与表达载体连接，转化，筛选阳性质粒，然后提取重组表达质粒，进行PCR和酶切鉴定，以稀释10倍的重组表达质粒为模板，5’Pifn和3’Pifn为引物扩增猪α-干扰素基因，反应体系如下，

稍离心，置于PCR仪中

PCR条件：

PCR产物经割胶回收与pEGM-T载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌Top10并涂LB平板(涂有IPTG和X-gal，含Amp)过夜培养。挑取白斑于LB培养基中，37℃培养12-14h，提取质粒进行PCR鉴定，结果参见图1，图2。图2中1为基因组DNA作模板PCR扩增产物，2为猪α干扰素基因组，M为DNA Marker。

(3)猪α-干扰素在枯草芽孢杆菌中的表达：表达策略参见图3，制备芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒经过点击转化导入其中，在含Amp和Kan双抗的平板上挑取表达子，进行PCR鉴定，参见图4，图4中M为DNA marker，1为阴性对照，2-3为含Sal I和Xba I酶切位点的PoIFN基因的扩增。将筛选到的疑似重组子作进一步培养，并抽提质粒后进行SalI和XbaI双酶切检验，参见图5，图5中1为重组质粒(Sal I/Xba I)双酶切产物，2为质粒pBES1未酶切，3为pBES1(Sal I/Xba I)双酶切产物，M为500bp(marker)。

(4)重组工程菌的蛋白电泳：菌液上清进行浓缩，需要用灵敏度更高的银染对SDS-PAGE进行染色，B.subtilis菌液在约19KD处有一条特异性条带，说明重组α-干扰素基因已在枯草杆菌中成功表达，参见图6，图6中M为蛋白marker，1-2为浓缩的重组蛋白，3为含有pEBS1空质粒的枯草杆菌。

(5)猪α-干扰素标的产物产量和活性的研究：活性检测结果表明，利用本工艺生产的猪α-干扰素，具有较高的抗病毒能力，纯化后活性约为1.8×10⁶U/ml。

实施例2：猪α-干扰素工业化发酵

一、实验材料

(1)菌种：芽孢杆菌

(2)发酵罐：

(3)分光光度计

(4)培养基及其他试剂：LB培养基；人肝癌细胞(BEL-7402)细胞由浙江大学饲料科学研究所提供，猪肾细胞，水疱性口炎病毒(VSV)由浙江省农科院畜牧科学研究所提供。

二、发酵方法

(1)菌种制备：将猪α-干扰素基因工程菌(Bacillus subtilis菌株由中科院微生物研究所提供，编号为1.1629，分离号为BR151-CM1)菌株接种到含氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，于37℃，220r/min恒温震荡培养12h，至OD600约为1.2。

(2)生产条件：将菌液接种于发酵罐中，温度30℃，pH为7.0，搅拌速度200-220rpm，培养6小时后增温至45℃诱导，猪α-干扰素开始表达，至28小时表达量达到最大值，在此期间质粒稳定性良好。

(3)获得产品：离心收集菌体，用pH7.0的0.1mol/L的Tris-HCl，冲洗菌体，悬浮于裂解液中(4倍体积)，冰浴超声破碎，1000rpm离心10分钟取上清液，10000rpm离心10分钟，收集包涵体沉淀，用洗涤液(50mmol/L Tris-HCl、5mmol/LEDTA、8mmol/L尿素、20mmol/L β-巯基乙醇、0.015mol/L NaCl、pH8.5)4℃条件下洗涤3次，每次1小时，12000rpm离心15min，取上清液，加入复性液中(0.5mmol/L L-精氨酸、50mmol/L Tris-HCl、5mmol/L EDTA、6mol/L盐酸胍、10％蔗糖、20mmol/Lβ-巯基乙醇、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽、1mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.0)，4℃搅拌，调节pH8.4，用不含谷胱甘肽和β-巯基乙醇的复性液透析，每2h换一次，共换4次，所得透析液12000rpm离心15min，取上清液浓缩。

(4)产品纯化：利用DEAE阴离子交换纤维柱用0.1-0.3mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，收集含猪α-干扰素的洗脱液，超滤浓缩，用S-200凝胶层析柱，pH为7.6Tris-HCl洗脱，收集成分，得到产品。实施例3：利用微量细胞病变抑制法检测猪α-干扰素抗病毒活性。

a复性重组蛋白对人肝癌细胞(BEL-7402)的影响

1)重组蛋白来源于透析剩余物；

2)指数生长期的人肝癌细胞(BEL-7402)，以0.25％胰酶(含0.02％ EDTA)消化后用RPMI-1640培养基(含15％新生小牛血清)制成单细胞悬液，以5×10⁴/mL细胞浓度100μl/孔接种于96孔培养板中培养；

3)细胞悬液培养24h后，弃原培养液，加入新鲜培养液90μl；

4)设对照组，不同浓度重组测试组，每组设四个重复；

5)测定孔加10μl不同浓度复性的浓缩蛋白，对照孔加入等量的RPMI-1640培养液；

6)将培养板置于370C，5％CO₂饱和湿度条件下培养箱中培养，培养24h后取出一块培养板，在倒置显微镜下观察细胞形态。

经过不同浓度复性蛋白处理的人肝癌细胞(BEL-7402)培养过夜后，在Olympus倒置显微镜下观察细胞形态变化，与对照组相比，经复性的浓缩蛋白处理的人肝癌细胞的细胞质发生了浓缩，表现出细胞凋亡的特征

b重组猪α-干扰素对病毒的抑制

待猪肾细胞在96孔培养板中长成单层后，倾去营养液，分别将倍比稀释的大肠杆菌表达重组干扰素和枯草芽孢杆菌表达重组干扰素10μl和90μl细胞维持液加到孔中，每一稀释度做4个重复。将细胞培养板置于5％CO₂、37℃培养箱中继续培养过夜，倾去孔内液体，用维持液洗两遍，加入100个TCID₅₀/ml的病毒稀释液，同时设空白和阴性对照，37℃继续在CO₂培养箱中培养过夜，在倒置显微镜下观察结果。

在病毒抑制实验中体现出相应的抗病毒活性。

实施例4：

实验动物：21日龄断奶仔猪240只。

实验方法：本工艺产得干扰素产品，按照600U/Kg剂量，通过饮水饲喂，对断奶仔猪进行7天连续饲喂，饮用含本工艺生产出的干扰素饮用水，观察断奶仔猪的生长情况，没有发现异常现象和病例变化。

实施例5：

实验动物：选自80Kg育肥猪240只

实验方法：本工艺产得干扰素产品，按照600U/Kg剂量，通过饮水饲喂，对育肥猪进行7天连续饲喂，饮用含本工艺生产出的干扰素饮用水，观察育肥猪的生长情况，没有发现异常现象和病例变化。

本发明涉及的序列

<110>杭州万得富生物技术有限公司

<120>一种制备猪α-干扰素的方法

<160>3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TAGAATTCTG CAACCTGCCT CAGAC CCA 28

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

GCGGCCGCTC ACTCCTTCTT CCTGAGTCTG TCT 33

<210>3

<211>680

<212>DNA

<213>猪α-干扰素全长基因片段(the nucleotide sequences of porcine alpha interferon gene)

<400>3

TCACAGAGTC ACCCACCTTA GCCAGGACAG AAGATTCTGC AAGGTCCCCA ATGGCCCCAT CCTCAACTTT 70

CCTCACGGTC CTGGTGCTGC TCAGCTGCAA TGCCATCTGC CTTCTGGGCT GCAACCTGCC TCAGACCCAC 140

AGCCTGACTC ATACCAGGGC CCTGAGGCTC CTGGCACAAA TGAGGAGAAT CTCTCCCTTC TCCTGCCTGG 210

ACCACAGAAG GGACTTTGAT CCCCTCATGA GGCTTTTGGG GGCAACCAGG TCCAGAAGGC TCAAGCCATG 280

GCTGCTGGTG CATGAGATGC TCCAGCAGAC CCTCCAGCTC TTCAGCACAG AGGGCTCGGC TGCTGCCTGG 350

GATGAGAGCC CCCTGCACCA GTTCTGCACT GGACTGGATC AGCAGCTCAG GGACCTGGAA GCCTGTGTCA 420

TGCAGGAGGC GGGGCTGGAA GGGACCCCCC TGCTGGAGGA GGACTCCATC CTGGCTGTGA GGAAATACTT 490

CCACAGACTC ACCCTCTATC TGCAGGAGAA GAACTACAGC CTCTGTGCCT GGGAGATCAT CAGGGCAGAA 560

GTCATGAGAG TCTTCTCTTC CTCCACAAAC CTGCAAGACA GACTCAGGAA GAAGGAGTGA CAGACACCTG 630

GTTCATCTCG GAAATGCTTC TCACAGACTA ACAAGCCCAT TCTTCCTCCT 680

Claims

1.一种制备猪α-干扰素的方法，通过以下技术方案实现：

(1)设计一对在大肠杆菌中表达猪α-干扰素成熟肽基因的表达引物，在上、下游引物的5’端分别引入EcoRI和NotI酶切位点序列；

(5)猪α-干扰素标的产物产量和活性的研究；

2.根据权利要求1所述的一种制备猪α-干扰素的方法，其特征在于：引物序列为：

SEQ NO 1：5Eifn 5’-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3’EcoRI

SEQ NO 2：3Eifn 5’-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3’NotI

3.根据权利要求1所述的一种制备猪α-干扰素的方法，其特征在于：所述猪α-干扰素基因序列为SEQ NO 3。