CN110343183A - 一种重组表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高表达的重组蛋白载体pRELPN，是由9聚精氨酸(R9)‑类弹性蛋白多肽(ELP)n‑10聚天冬酰胺(N10)组成的人工合成的ELP融合蛋白(RELPN)，当克隆在原核或真核表达载体(p)的多克隆位点不是作为外源基因直接表达，而是作为起第二启动子的作用。pRELPN载体促进克隆在ELP融合蛋白后起始密码ATG后的外源目的基因独立高表达，该融合蛋白本身极少表达，并且轻微抑制大肠杆菌或真核细胞等宿主自身蛋白的表达，促进外源目的基因的重组蛋白积聚和高表达，这类含双启动子的高表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的独立高表达，从而有助于解决普通表达载体对外源基因或外源基因与ELP组成的融合基因的低表达或不表达导致不能产业化的问题。
Description
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，涉及一种高表达的重组表达载体pRELPN及其构建方法和应用。
背景技术
自从1909年丹麦遗传学家约翰逊(W.Johansen 1859～1927)在《精密遗传学原理》一书中正式提出“基因”概念后，20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出DNA双螺旋结构以后，人们用各种办法采用各种表达载体在细菌(大肠杆菌)、酵母、植物、昆虫及细胞系中表达各种生物或人的基因，以研究基因的功能和促进基因产业重组蛋白的产业化应用。目前人类相关蛋白有75％可以在大肠杆菌中表达，许多蛋白已经在药物治疗中发挥了巨大作用，例如1982年用于糖尿病治疗的人胰岛素得到批准生产。但是，目前仍有许多基因在上述各类表达系统中低表达或不表达导致无法产业化应用或无法研究其功能。
类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)是一种人工合成的基因工程化多肽聚合物，有多种不同的形式，主要是(VPGXG)n五肽重复序列，也有一些变异形式，例如，(KGGVG)n,(VGGVG)n,(GVGVP)n,(LGAGGAG)n,(LGAGGAGVL)n等,人的ELP为(VAPGVG)n。目前ELP研究最多的最主要的形式由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n五肽重复单元串联组成，其中Xaa(X)指除了脯氨酸(Pro)外的氨基酸，通常为缬氨酸(Val，V),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G)亮氨酸(Leu,L)异亮氨酸(Ile,I)，赖氨酸(Lys,K),苯丙氨酸(Phe,F),组氨酸(His,H)等几种氨基酸类型，重复单元n通常为20-120不等。Xaa(X)可以是在重复单元n为20-120中由除了Pro外的单一氨基酸组成，也可以例如上述Val,Ala,Gly,Ile,Leu，Lys,Phe,His等氨基酸以不同比例组成，但是VPGXG中前3个和最后1个氨基酸在五肽重复单元中一直保持不变,只变化第4个氨基酸的类型或比例,重复单元n通常为20-120不等。ELP蛋白单独或与外源基因在N端或C端形成融合蛋白表达时具有相转变特性，即达到一定温度时ELP蛋白或ELP融合蛋白能发生从溶液到凝聚态的可逆转变，随着温度降低到一定温度，则又能恢复溶液态，当Xaa为疏水性基团时，相变温度可降低，反之则升高，因此可以根据Xaa极性不同设计出不同的相变温度的ELP或ELP融合蛋白，从而通过ELP凝聚态的可逆转变，利用离心就能分离重组蛋白，达到重组蛋白的简单的ITC(inverse transition cycling)非色谱纯化(Rodriguez-Cabelo JC,Arias FJ,Rodrigo MA.et al.Elastin-likepolypeptides in drug delivery.Advanced Drug Delivery Reviews.2016,97:85-100)。此外，ELP已被证明能增强植物中不同的重组蛋白的积累，ELP在植物内质网中增加重组蛋白积累，从而解决了植物源表达系统产量低的主要局限性(Conley AJ,Joensuu JJ,Menassa R.et al.Induction of protein body formation in plant leaves byelastin-like polypeptide fusions.BMC Biology.2009,7(48):1-18)。
但是到目前为止，只有ELP蛋白或ELP与目的基因作为ELP融合蛋白一起表达的许多文献报道，还没有用ELP融合蛋白作为第二启动子促进外源基因独立高表达的报道。由于这种ELP是连续的重复序列，与目的基因连接在一起作为融合蛋白表达时经常导致许多外源基因ELP融合蛋白的表达量较低甚至有的不表达，因此这种重组ELP融合蛋白非色谱纯化在应用中对于部分外源基因来说仍遇到表达量低的技术瓶颈，部分外源基因由于结构特征和毒性等各种原因也经常遇到低表达或不表达的表达外源基因技术障碍。
发明内容
针对目前外源基因或与外源基因连接的ELP融合蛋白有的表达量低，宿主蛋白含量高，有的重组蛋白表达低和纯化困难，导致无法产业化或无法研究其功能的问题，提供以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种ELP融合蛋白RELPN。
本发明的第二个目的是提供一种重组载体pRELPN。
本发明的第三个目的是提供一种重组载体pRELPN的构建方法。
本发明的第四个目的是提供一种含目的基因的重组表达载体pRELPN。
本发明的第五个目的是提供重组载体或重组表达载体pRELPN在促进外源目的基因的独立高表达中的应用。
一种ELP融合蛋白RELPN，所述ELP融合蛋白RELPN由9聚精氨酸(R9)-类弹性蛋白多肽(ELP)m-10聚天冬酰胺(N10)组成，所述9聚精氨酸(R9)在ELP融合蛋白RELPN的N端，10聚天冬酰胺(N10)在ELP融合蛋白RELPN的C端。
进一步的，所述类弹性蛋白多肽(ELP)m由串联的五肽重复单元(VPGXG)n通过酶切位点间隔连接或克隆形成。
进一步的，所述串联的五肽重复单元(VPGXG)n中，(VPGXG)为Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，所述Xaa(X)为除脯氨酸外的任何氨基酸；每个(VPGXG)五肽重复单元的串联个数n为20-120。
一种重组载体pRELPN，所述重组载体pRELPN为将上述ELP融合蛋白RELPN克隆入原核或真核载体(p)的多克隆位点得到。
进一步的，ELP融合蛋白RELPN插入在前后两个起始密码ATG之间，。
进一步的，所述原核载体包括大肠杆菌载体、酵母载体，优选的，为pET28a,pET26b,pET30a或pPICZαA中的一种；所述真核载体包括细胞系的真核载体，优选的，为pIRES2-EGFP中的一种。
进一步的，所述ELP融合蛋白RELPN插入在pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间，或pET26b、pET30a的多克隆位点NdeI和NcoI之间，或pPICZαA的多克隆位点EcoRI和KpnI之间，或真核表达载体的多克隆位点NheI和XhoI之间，上述酶切位点上缺少起始密码ATG的需要通过PCR方式或合成方式补充ATG,形成RELPN插入在前后两个起始密码ATG之间。
上述重组载体pRELPN的构建方法，包括以下步骤：
S1：人工合成串联的五肽重复单元(VPGXG)n；
S2：将S1合成的串联的五肽重复单元(VPGXG)n通过连接结构间隔连接，或通过两端加上酶切位点克隆，得到类弹性蛋白多肽(ELP)m；所述连接结构为多克隆位点内的酶切位点；
S3：在S2得到的类弹性蛋白多肽(ELP)m的N端前加上9聚精氨酸(R9)，C端后加上10聚天冬酰胺(N10)，得到ELP融合蛋白RELPN；
S4：将S3得到的ELP融合蛋白RELPN克隆到表达载体(p)的多克隆位点之间，得到重组载体pRELPN。
进一步的，S1所述串联的五肽重复单元(VPGXG)n为ELP[V10G6A4]20(SEQ IDNO.1)、ELP[V20]20(SEQ ID NO.2)、ELP[K2V16F2]20(SEQ ID NO.3)、ELP[I20]20(SEQ IDNO.4)、ELP[A20]20(SEQ ID NO.5)中的一种；
S2得到的类弹性蛋白多肽(ELP)m为ELP[V30G18A12]60、ELP[V60]60、ELP[K6V48F6]60、ELP[I60]60、ELP[A120]120中的一种。
进一步的，S2所述连接结构为酶切位点BamHI，EcoRI，HindIII中的一种或几种，克隆所用的酶切位点为pflMI(SEQ ID NO.10)和BglI(SEQ ID NO.11)。
一种重组表达载体pRELPN，在上述重组载体pRELPN的ELP融合蛋白RELPN后的2个以上的酶切位点之间插入外源目的基因。
进一步的，所述外源目的基因插入在pET28a的NdeI和XhoI之间的酶切位点内，或pET26b、pET30a的NcoI和XhoI之间的酶切位点内，或pPICZαA的KpnI和NotI之间的酶切位点内，或pIRES2-EGFP的EGFP的酶切位点之间，也可以将外源目的基因取代EGFP基因。
上述重组载体pRELPN或重组表达载体pRELPN在促进外源目的基因的独立高表达中的应用，所述外源目的基因包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽或ELP融合蛋白。ELP融合蛋白RELPN是一种人工合成蛋白，克隆在现有的市场销售的多种原核细胞或真核细胞合适的表达载体的多克隆位点，在大肠杆菌或真核细胞载体的原有启动子后面进一步起第二启动子的作用，与原大肠杆菌或真核细胞载体的启动子一起，组成双启动子促进克隆在ELP融合蛋白后起始密码ATG后的外源基因或外源基因与另外类型的ELP组成的融合蛋白的独立高表达。
本发明的有益效果在于：
不同于传统的外源基因克隆在多克隆位点就起融合基因表达重组融合蛋白的原理，本发明克隆在不同表达载体上的多克隆位点的ELP融合蛋白(RELPN)不作为常规的融合蛋白进行重组融合蛋白的表达，该融合蛋白本身极少表达，并且轻微抑制大肠杆菌或真核细胞等宿主细胞自身蛋白的表达，该融合蛋白主要起第二启动子的作用，促进外源目的基因的高表达，它直接促进多克隆位点的ELP融合蛋白后起始密码ATG后面的外源基因的独立高表达，表达出来的重组蛋白分子量与外源目的基因的预期分子量相同，通过Westernblot证明，极少检测到包括ELP融合蛋白与外源目的基因连接到一起的相应的重组融合蛋白的表达，只有克隆在ELP融合蛋白后的起始密码ATG后的外源目的基因或外源目的基因与另外类型的ELP组成的融合蛋白的独立高表达，并且与不含第二启动子的单启动子的原表达载体外源目的基因的表达量比较增加了2-10倍的目的蛋白表达量。这类含双启动子的高表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的高表达，从而有助于解决目前原有的表达载体外源基因低表达导致不能产业化的问题。
附图说明
图1 不同ELP融合蛋白作为第二启动子促进外源基因改构人内皮抑素(mEndostatin)表达效果，SDS-PAGE电泳图。1,2,3的表达载体分别为pN(ELP)40R3，pN(ELP)40R2，pN(ELP)40R1；4,5,6,7,8的表达载体分别为pRELPN5,pRELPN4,pRELPN3,pRELPN2,pRELPN1；M为预染蛋白分子量，150,100,70,50,35,25,20,10kDa。
图2 不同ELP融合蛋白作为第二启动子促进外源基因改构人内皮抑素(mEndostatin)的表达效果，SDS-PAGE电泳图。1,2的表达载体为克隆在pET26b载体上的pRELPR1；3,4的表达载体为克隆在pET30a载体上的pRELPR2；M为预染蛋白分子量，150,100,70,50,35,25,20,10kDa
图3 pRELPR2载体的ELP融合蛋白RELPR2克隆入表达载体pPICZαA载体，SDS-PAGE电泳图的表达结果显示表达出分子量大约100kDa的Endostatin-HAS融合蛋白(1)，通过对表达产物的山羊抗人内皮抑素抗体的Western Blot鉴定，分别是阳性对照品内皮抑素阳性(2)，内皮抑素-HSA融合蛋白阳性(3)，并且在酵母菌表达上清中可溶性表达。M为预染蛋白分子量，在Western Blot的阳性位置分别代表100和20kDa分子量。
图4 pRELPN1载体通过NheI-XhoI酶切切下ELP融合蛋白RELPN1，接到同样用NheI-XhoI酶切的pIRES2-EGFP真核表达载体上，转染入乳腺癌细胞MCF7细胞中通过IRES使EGFP高表达。
图5 ELP融合蛋白RELPN2克隆在pET28a载体上为pRELPR2表达载体表达CPB的SDS-PAGE电泳图,1-4为CPB的菌体全菌，5-7为CPB的菌体上清，M为预染蛋白分子量，150,100,70,50,35,25,20,10kDa
图6 ELP融合蛋白RELPN1克隆在pET28a载体上为pRELPR1表达载体表达Endostatin、铜,锌超氧化物歧化酶(SOD)的SDS-PAGE电泳图。1,2,3分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg,4μg,4,5分别为SOD和Endostatin的表达，上样量5μl。M为预染蛋白分子量，120,80,60,40,30,20,10kDa
图7 ELP融合蛋白RELPN1克隆在pET28a载体上为pRELPR1表达载体表达15个重复序列的Exendin-4和7个重复序列的甲状旁腺激素、Her2纳米抗体二聚体的SDS-PAGE电泳图。1,2,3分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg,4μg,4,5分别为Exendin-4的表达，6,7和分别为甲状旁腺激素的表达，8,9分别为Her2纳米抗体二聚体的表达，4,6,8上样量5μl,5,7,9上样量10μl。M为预染蛋白分子量，120,80,60,40,30,20,10kDa
图8 ELP融合蛋白RELPN1克隆在pET28a载体上为pRELPR1表达载体表达肝素酶I的SDS-PAGE电泳图。1为未加IPTG诱导表达，2为加入IPTG诱导表达的肝素酶I,M为预染蛋白分子量，150,100,70,50,35,25,20,10kDa
图9 ELP融合蛋白RELPN1克隆在pET28a载体上为pRELPR1表达载体表达GCSF-ELP[H33V7]40(GCSF-ELP40)、GCSF、SOD-ELP[V10G6A4]20(SOD-ELP20)的SDS-PAGE电泳图。1,2,3分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg,4μg,4,5分别为GCSF-ELP40的表达，6,7和分别为GCSF的表达，8,9分别为SOD-ELP20的表达，4,6,8上样量5μl,5,7,9上样量10μl。其中上样量5μl的SOD-ELP20的表达量测定为60mg/L,M为预染蛋白分子量，120,80,60,40,30,20,10kDa
图10 用普通pET28a载体表达同图9同序列的SOD-ELP20的SDS-PAGE电泳图，1,2分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg，3为未加IPTG诱导样品，4,8,9为用15℃16h表达和5,6,7,10,11为37℃表达4h的全菌、上清或沉淀的SDS-PAGE电泳图，SOD-ELP20的最高表达量(箭头指示)测定为6mg/L。
图11 用普通pET28a载体表达SOD-ELP40的SDS-PAGE电泳图，1,2分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg，3为未加IPTG诱导样品，4,8,9为用15℃16h表达和5,6,7,10,11为37℃表达4h的全菌、上清或沉淀的SDS-PAGE电泳图，SOD-ELP40的最高表达量(箭头指示)测定为10mg/L。
图12 ELP融合蛋白RELPN1克隆在pET28a载体上为pRELPR1表达载体表达同图11相同序列的SOD-ELP[H33V7]40(SOD-ELP40)的SDS-PAGE电泳图(1,2),3为未加IPTG诱导样品。M为预染蛋白分子量，150,100,70,50,35,20kDa
图13 pRELPN1表达载体表达的含有6His标签的单片段的甲状旁腺激素-ELP40的ELP融合蛋白(4,5),含有6His标签的ELP40对照(6,7),含有6His标签的单片段的Exendin-4-ELP40融合蛋白(8,9)高表达，1,2,3分别为牛血清白蛋白(BSA)标准品1μg,2μg,4μg,4,6,8上样量5μl,5,7,9上样量10μl。M为预染蛋白分子量，120,80,60,40,30,20,10kDa
图14 11个外源基因利用pRELPN的载体进行表达的SDS-PAGE电泳凝胶，用GS-900成像仪(SH1WBA10698)进行凝胶透射图像扫描，1-11分别代表SOD、Endostatin、甲状旁腺激素-ELP40、ELP40、Exendin-4-ELP40、Exendin-4重复序列、甲状旁腺激素重复序列、Her2纳米抗体二聚体、GCSF-ELP40、GCSF、SOD-ELP20的凝胶扫描图。从目的蛋白的测量峰值可以观察到高表达。
图15 C末端携带6His外源目的蛋白的进行的Western blot图。图中1-11分别代表用6his-tag的单克隆抗体检测用pRELPN载体表达的C末端带有6his-tag的SOD、Endostatin、甲状旁腺激素-ELP40、ELP40、Exendin-4-ELP40、Exendin-4重复序列、甲状旁腺激素重复序列、Her2纳米抗体二聚体、GCSF-ELP40、GCSF、SOD-ELP20等11种重组蛋白Western blot全部是阳性。C为无目的基因的空白载体对照组，M为蛋白分子量，120,80,60,50,42,32,18kDa。
图16 将普通pET28a表达的SOD-ELP20的表达量设定为100％，分别将pET28a表达的SOD-ELP40及用高表达载体pRELPN载体表达的SOD-ELP20、SOD-ELP40、GCSF-ELP40、甲状旁腺激素-ELP40(PTH-ELP40)、Exendin-4-ELP40、SOD、GCSF、Endostatin、Her2纳米抗体二聚体等9个外源基因的表达量与pET28a表达的SOD-ELP20的表达量进行比较得到的相对表达量图，pRELPN载体表达的8种抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的表达量是用pET28a载体表达的SOD-ELP20表达量的2-10倍。
具体实施方式
本发明中所使用的术语，除非有另外的说明外，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义和操作方法。
下面结合实施例的具体实施方法和应用实施例，并参照实施数据进一步详细描述本发明。应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物和基因序列，均在首次出现时候标明，其后所用相同引物和所指基因，均以首次标明的内容相同。所用的基因载体，均在首次出现时候标明，没有标明的均是本领域中公知的常规载体。载体或基因的名称或序列号，在公开的刊物或相应数据库中均可以方便检索到。
实施例1
人工合成类弹性蛋白多肽(ELP)m的五肽重复单元(VPGXG)n。按照Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n五肽重复单元串联组成，其中Xaa(X)指除了脯氨酸(Pro)外的氨基酸，通常为缬氨酸(Val，V),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G)亮氨酸(Leu,L)异亮氨酸(Ile,I)，赖氨酸(Lys,K),苯丙氨酸(Phe,F),组氨酸(His,H)等几种氨基酸类型，但是VPGXG中前3个和最后1个氨基酸在五肽重复单元串联组成n为20-120的重复序列中一直保持不变,只变化第4个氨基酸的类型或比例,(VPGXG)重复单元n通常为20-120不等。
为了筛选出能达到本申请所需要的在表达载体的多克隆位点只起第二启动子作用，促进连接在其后的起始密码ATG后的外源重组蛋白的积聚和促进目的蛋白的独立高表达，克隆在不同表达载体上的多克隆位点的这一ELP融合蛋白(RELPN)本身不是作为与目的基因组合为融合蛋白表达。这一特征的筛选通过蛋白电泳测定外源目的蛋白表达的分子量大小就可以确定。
为了便于描述，本申请给出ELP特殊定名原则，(VPGXG)n中的X用ELP[AiBjCk]n代表在(VPGXG)n中的X的不同氨基酸类型(A,B,C)和A,B,C在n为20-120中的总和数量(i,j,k)及(VPGXG)五肽的重复次数(n)，i,j,k的总和与n值相等。我们委托人工合成了如下类型，n都为20：
1、(VPGXG)n五肽重复单元串联的X为10个缬氨酸，5个甘氨酸，5个丙氨酸，n为20的ELP[V10G6A4]20，(SEQ ID NO.1)；
2、(VPGXG)n五肽重复单元串联的X为20个缬氨酸，n为20的ELP[V20]20，(SEQ IDNO.2)；
3、(VPGXG)n五肽重复单元串联的X为2个赖氨酸，16个缬氨酸，2个苯丙氨酸，n为20的ELP[K2V16F2]20，(SEQ ID NO.3)；
4、(VPGXG)n五肽重复单元串联的X为20个异亮氨酸，n为20的ELP[I20]20，(SEQ IDNO.4)；
5、(VPGXG)n五肽重复单元串联的X为20个丙氨酸，n为20的ELP[A20]20，(SEQ IDNO.5)。
实施例2
上述描述的5种不同的串联的五肽重复单元，通过不同酶切位点选择，连接在合适的中间载体上，人工合成类弹性蛋白多肽(ELP)m。实施例1中的ELP[V10G6A4]20、ELP[V20]20、ELP[K2V16F2]20、ELP[I20]20(SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4)，以每20个五肽重复单元通过酶切位点连接，形成4种ELP60类弹性蛋白多肽，分别为1、ELP[V30G18A12]60；2、ELP[V60]60；3、ELP[K6V48F6]60；4、ELP[I60]60。
第5种ELP[A120]120(SEQ ID NO.5)是在ELP[A20]20两端加上pflMI(SEQ IDNO.10：核苷酸序列为ggccacggcgtgggt)和BglI(SEQ ID NO.11：核苷酸序列为gtgccgggcgggctg)的酶切位点分步克隆合成。
然后在上述5种ELP类弹性蛋白多肽的N端前加上R9和C末端后加上N10形成本申请特指的5种ELP融合蛋白RELPN，将ELP融合蛋白RELPN克隆到pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间，或pET26b、pET30a的多克隆位点的NdeI和NcoI之间，选择这两类内切酶是因为该类载体启动子后的NdeI和NcoI这2种内切酶在多克隆位点分别各有1个起始密码ATG，第1个起始密码ATG促使ELP融合蛋白RELPN在原载体启动子作用下起第二启动子的作用，第2个起始密码ATG是在双启动子作用下外源基因开始独立高表达的起始密码。也可以通过酶切或PCR方法转到其它pET系列的克隆载体上，ELP融合蛋白后的酶切位点如果没有ATG需要用PCR引物加上ATG，或通过酶切转到酵母表达载体，例如pPICZαA载体，也可以是细胞系的真核表达载体，通过NheI和XhoI酶切克隆到例如pIRES2-EGFP等真核表达载体上。
以pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间的克隆位点为例，将5种ELP融合蛋白RELPN序列分别克隆到pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间,形成以下5种pRELPN重组载体，这里的p就代表pET28a载体，其中R代表9聚精氨酸，N代表10聚天冬酰胺，ELP60分为两种类型，一种是(VPGXG)n中的X由不同数量的V,G,A,K,F,H等氨基酸按照不同比例组成，另一种是只有1种V、A或I组成。具体分别为：
重组载体pRELPN1：NcoI-R9-ELP[V10G6A4]20-BamHI-ELP[V10G6A4]20-EcoRI-ELP[V10G6A4]20-HindIII-N10-NdeI-XhoI-6His-tag-stop。
重组载体pRELPN2：
NcoI-R9-ELP[V20]20-BamHI-ELP[V20]20-EcoRI-ELP[V20]20-HindIII-N10-NdeI-XhoI-6His-tag-stop。
重组载体pRELPN3：
NcoI-R9-ELP[K2V16F2]20-BamHI-ELP[K2V16F2]20-EcoRI-ELP[K2V16F2]20-HindIII-N10-NdeI-XhoI-6His-tag-stop。
重组载体pRELPN4：
NcoI-R9-ELP[I20]20-BamHI-ELP[I20]20-EcoRI-ELP[I20]20-HindIII-N10-NdeI-XhoI-6His-tag-stop。
重组载体pRELPN5：NcoI-R9-ELP[A120]120-N10-NdeI-XhoI-6His-tag-stop。
实施例3
我们先用pET28a载体构建完成上述pRELPN1,pRELPN2,pRELPN3,pRELPN4，pRELPN5载体后，通过导入DH5α感受态，37℃摇菌过夜，用购买的生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，分别在这5种载体的ELP融合基因后的NdeI和XhoI酶切位点之间插入外源目的基因改构人的内皮抑素基因(mEndostatin,序列见专利申请号：201610189012.2)，用质粒提取试剂盒提取含有ELP融合基因和外源基因mEndostatin基因的质粒，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成改构内皮抑素(mEndostatin)基因的PCR引物(SEQ ID NO.12:cgccatatgcacagccaccgcgacttccag和SEQ ID NO.13:ccgctcgagcttggaggcagtcatgaagctg),PCR引物中下划线分别指NdeI或XhoI酶切位点，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。
将mEndostatin的PCR产物和上述5种表达载体分别用NdeI和XhoI酶切，琼脂糖电泳，用NEB胶回收试剂盒回收酶切产物，按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit说明书分别进行基因连接，连接产物通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用购买的生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，酶切鉴定阳性后，将在NdeI和XhoI之间含有外源目的基因mEndostatin的5种pRELPN表达质粒，分别转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，37℃抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，收集1mL表达菌8000rpm离心5min,加入1X电泳缓冲液100μl，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白表达分子量和表达量。
用同样的方法将pRELPN1,pRELPN2,pRELPN3的载体中的R9和N10在N末端和C末端交换，并且将上述前3种ELP只连接到ELP40,不连接形成ELP60,构建成另外3种含ELP40的五肽重复串联的载体pNELPR1,pNELPR2,pNELPR3,同时在NdeI和XhoI之间插入外源目的基因mEndostatin形成3种不同的含ELP40的表达质粒pNELPR1,pNELPR2,pNELPR3，同样条件下进行表达。
结果表明，SDS-PAGE电泳图1显示，含ELP40的五肽重复串联的载体pNELPR1,pNELPR2,pNELPR3表达外源目的基因mEndostatin比较弱，含ELP120的五肽重复串联的载体pRELPN5表达外源目的基因mEndostatin也比较弱，含不同ELP60的五肽重复串联的载体pRELPN4和pRELPN3表达外源目的基因mEndostatin比较强，但是分子量偏大一点。含不同ELP60的五肽重复串联的ELP[V30G18A12]60载体pRELPN1和含ELP[V60]60载体的pRELPN2表达外源目的基因mEndostatin较强(图1)，按照表达的重组蛋白分子量大小符合含有6His的mEndostatin重组蛋白的分子量。
实施例4
采用pRELPN1载体进一步进行ELP融合蛋白的表达。采用本实验室保存的pET28a载体,在NdeI和BamHI之间插入粒细胞集落刺激因子(GCSF)或铜,锌超氧化物歧化酶(SOD)外源基因，并且在外源基因后的BamHI和XhoI之间进一步插入：ELP[V10G6A4]20(ELP20,SEQID NO.1)或N端和C端分别含有N10和R9的ELP40(SEQ ID NO.9)，含有N10和R9的ELP40与外源基因GCSF或SOD基因形成ELP融合蛋白。这里的ELP40是ELP[H33V7]40形式，与前述的ELP40和5种本申请特指的ELP融合蛋白序列都不同，N10和R9的在N端和C端的位置也是与RELPN融合蛋白相反的。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司测序正确后，通过NdeI-XhoI酶切，将GCSF-ELP40或SOD-ELP20、SOD-ELP40基因的酶切片段分别克隆入pRELPN1载体的NdeI-XhoI酶切位点，从而形成NdeI酶切位点前的RELPN基因为第二启动子，在NdeI酶切位点含的ATG后接有外源目的基因GCSF-ELP40、SOD-ELP20及SOD-ELP40，通过酶切鉴定阳性克隆后，再次用质粒提取试剂盒分别提取含有上述3种含外源基因的质粒，并且将没有转导外源基因的含ELP[H33V7]40的ELP40也作为对照克隆入pRELPN1载体的NdeI-XhoI酶切位点，这4种质粒分别转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG37℃摇菌表达4h，收集1mL表达菌8000rpm离心5min,加入1X电泳缓冲液，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达分子量和表达量(图9,12)。
进一步通过外源基因GCSF-ELP40、SOD-ELP20、SOD-ELP40融合基因和对照ELP40基因C末端携带的6His-tag，用Western blot证明该载体NdeI前的本申请特指的ELP融合基因(RELPN)没有检测到表达，表达的是带有6His-tag的外源基因GCSF-ELP40、SOD-ELP20、SOD-ELP40融合基因的重组融合蛋白和对照ELP40重组蛋白(图15)。并且用pRELPN载体比单独用pET28a载体表达的含外源基因的ELP融合蛋白表达量高2-10倍(图16)。因此，采用本专利的双启动子高表达载体，从而解决了ELP重复序列导致外源基因ELP融合蛋白表达量低的技术问题。从而进一步证明了pET载体上的第一启动子后的多克隆位点第一个ATG后面的ELP融合基因可以起第二启动子的作用，促进克隆在该ELP融合基因后第2个ATG后的外源目的基因或外源目的基因与ELP组成的融合基因的重组蛋白高表达。
实施例5
将上述ELP融合蛋白载体pRELPN1和pRELPN2，在合成时候考虑到更换不同的pET载体，因此选择多克隆位点分别具有NdeI和NcoI酶切位点的pET26b和pET30a载体，将pRELPN1的ELP融合基因分别在N端和C端携带NdeI和NcoI酶切位点，酶切连接到pET26b载体上，这时候的p就代表pET26b。同样方法将pRELPN2的ELP融合基因分别在N端和C端携带NdeI和NcoI酶切位点，酶切连接到pET30a载体上，这时候的p就代表pET30a。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成改构内皮抑素(mEndostatin)的PCR引物(SEQ ID NO.14：tataccatgggccacagccaccgcgacttccag和SEQ ID NO.13),PCR引物划线部分为NcoI酶切位点，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。分别将mEndostatin的PCR产物和上述2种NdeI和NcoI酶切位点含有不同ELP60的ELP融合蛋白的pRELPN1(p为pET26b)和pRELPN2(p为pET30a)载体用NcoI和XhoI酶切，琼脂糖电泳，NEB胶回收试剂盒回收酶切片段，按照NEB公司的M2200SQuick ligation kit说明书连接mEndostatin的PCR酶切产物和酶切载体，通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后，将在NcoI和XhoI之间插入外源目的基因mEndostatin的pRELPN1和pRELPN2表达载体质粒，转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，收集1mL表达菌8000rpm离心5min,加入1X电泳缓冲液100μl，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白表达分子量和表达量。
结果表明，SDS-PAGE电泳图2显示，含有ELP60的五肽重复串联的ELP[V30G18A12]60载体构建在pET26b上的pRELPN1和有含ELP[V60]60结构的构建在pET30a载体上的pRELPN2表达外源目的基因mEndostatin都比较强(图2)。按照表达分子量大小符合含有6His的mEndostatin重组蛋白的分子量。
实施例6
上述含ELP融合蛋白结构的载体pRELPN2，直接合成ELP60,中间不携带任何酶切位点，N端和C端分别仍有R9和N10，接到本实验室原有的毕赤酵母表达载体上，该载体已经含有内皮抑素基因Endostatin(ES,序列见专利号ZL97107112.8)和已经连接到委托Invitrogen公司合成的质粒pPICZαA-HSA上，其中HSA为人血清白蛋白(Human SerumAlbumin，GenBank:A06977.1),在酶切位点EcoRI、KpnI和NotI之间先后克隆入RELPN2融合基因(EcoRI和KpnI之间，在kpnI后加上ATG)，在KpnI和NotI之间有原来的endostatin-HAS融合基因不变。按照该载体的操作手册制备毕赤酵母GS115感受态细胞，取1份GS115感受态细胞加入含有pRELPN2-ES-HSA片段的100ng(小于5μL)线性化的表达载体pPICZαA，混匀。将酵母感受态细胞和转化DNA混合物转移到冰冷的0.2cm间隙的电击池中。按一般真菌转化的设置(1.5kV、25μF、200Ω、时间常数5ms)，进行电击转化。电击后，立即向电击池中加入600μL冰冷的1mol/L山梨醇，用移液枪吹吸混匀，回收酵母菌液到1.5mL离心管中。将回收的酵母菌液平均涂布于含100μg/mL博来霉素的YPDS平板上，于30℃培养3-6d，直到平板上长出菌落。菌落PCR法鉴定后，阳性转化子进行表达，接种筛选的阳性转化子(pPICZαA-RELPN2-ES-HSA/GS115)于含有5mL BMGY液体培养基的50mL的三角瓶中，28～30℃，250r/m振荡培养至OD600≈2，换到含有15mL BMMY的100mL三角瓶中，28～30℃，275r/m振荡培养24h，每24h加入75μL的100％甲醇，28～30℃，275r/m振荡培养，连续培养两天后，收集样品中第3d的表达上清，进行SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白表达分子量和表达量。
结果表明，SDS-PAGE电泳图3显示，pRELPN2的ELP融合蛋白没有观察到相应重组蛋白的表达，而是在其后的ATG后的ES-HAS融合蛋白表达，上清可溶性表达量不高(图3)。通过表达产物的山羊抗人内皮抑素抗体的Western Blot鉴定，是内皮抑素-HSA融合蛋白在酵母菌表达上清中可溶性表达(图3)。
实施例7
载体pRELPN1，通过NheI-XhoI酶切切下RELPN1融合蛋白，接到同样含有NheI-XhoI酶切位点的pIRES2-EGFP真核表达载体上，按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit说明书连接RELPN1融合基因双酶切产物和双酶切的pIRES2-EGFP真核表达载体，通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取含有RELPN1融合基因的pRELPN1-IRES2-EGFP质粒，这里的p代表pIRES2-EGFP真核表达载体。通过同上双酶切鉴定后，将乳腺癌细胞MCF7细胞接种在小培瓶中，加入含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的新鲜DMEM培养基，并放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中进行培养。当细胞长满小培瓶(80％左右)时，吸去原有细胞培养基，用PBS清洗一次，加入1×胰酶-EDTA消化液1mL，吸去大部分消化液，37℃下消化1-2min，加入新鲜培养基培养，当细胞达到50％左右时，用50μL Opti-MEM稀释0.8μg pRELPN1-IRES2-EGFP质粒DNA，用50μLOpti-MEM稀释2μL Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温下静置5min，混合转染试剂和上述质粒DNA，室温下静置20min转染复合物，然后加入到24孔细胞板中，100μL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。将细胞板置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。倒置荧光显微镜观察细胞，并且照相。
结果表明，pRELPN1-IRES2-EGFP质粒通过IRES在乳腺癌细胞中直接表达EGFP(图4)，不受该载体克隆入的pRELPN1载体上的ELP融合蛋白的影响，并且表达强度较高，因此可以将EGFP替换成目的基因采用pRELPN1载体进行直接表达外源基因。
实施例8
将直接合成的ELP60,中间不携带任何酶切位点，N端和C端分别仍有R9和N10，克隆在pET28a的NcoI和NdeI之间，形成载体pRELPN2，然后在该ELP融合蛋白后的NdeI和XhoI酶切位点之间，克隆入羧肽酶B(Carboxypeptidase B,CPB,EC 3.4.17.2,GenBank:CH471052)。委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成CPB的PCR引物(SEQ ID NO.15:cgccatatgggtggtgagcactttg和SEQ ID NO.16：ccgctcgaggtacaggtgttccaggacgtag),PCR引物划线部分分别为NdeI或XhoI酶切位点，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性25s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。将CPB的PCR产物和ELP融合蛋白载体pRELPN2分别用NdeI和XhoI酶切，琼脂糖电泳，NEB胶回收试剂盒回收酶切产物，按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit说明书连接CPB的PCR酶切产物和pRELPN2载体双酶切产物，通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用购买的生工生物工程(上海)股份有限公司的质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后，将在NdeI和XhoI之间插入外源目的基因CPB的pRELPN2表达载体质粒，转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，分别收集1mL和2mL表达菌8000rpm离心5min,前者加入1X电泳缓冲液100μl，超声破碎，后者加入80μl裂解缓冲液后超声破碎，13000rpm离心10min，取上清加入5X电泳缓冲液20μl，两种样品都100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达菌全菌和表达菌上清中重组蛋白表达分子量和表达量。
结果表明，SDS-PAGE电泳图5显示，含有ELP60的五肽重复串联的ELP[V60]60载体构建在pET28a上的pRELPN2表达外源目的基因CPB都比较强(图5)。按照表达分子量大小符合有6His的CPB重组蛋白的分子量，上清中也含有许多CPB重组蛋白，表达可溶性比较好(图5)。
实施例9
将上述载体pRELPN1，N端和C端有R9和N10，ELP融合蛋白的RELPN1克隆在pET28a的NcoI和NdeI，然后在该ELP融合蛋白后的NdeI和XhoI酶切位点之间，克隆入Her2纳米抗体二聚体(SEQ ID NO.6)、野生型内皮抑素(Endostatin，序列见专利号ZL97107112.8)、铜,锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn Superoxide Dismutase,Cu,Zn-SOD,EC 1.15.1.1,GenBank:AY049787)、肝素黄杆菌的肝素酶I(pedobacter Heparinase I，HepI,GenBank:EU541216.1)、Exendin-4(SEQ ID NO.7，15X重复序列)，甲状旁腺激素(parathyroidhormone，PTH，SEQ ID NO.8，7X重复序列)等6种外源基因。委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成Endostatin的PCR引物(SEQ ID NO.17:cgccatatgcacagccaccgcgacttccag和SEQ IDNO.18：ccgctcgagcttggaggcagtcatgaagctg)；委托合成Her2纳米抗体二聚体的PCR引物(SEQ ID NO.19:cgccatatgcaagtcaaactggtggaatcggg和SEQ ID NO.20：ccgctcgagggaactcacggtgacttg)；委托合成HepI的PCR引物(SEQ ID NO.21:cgccatatgcagcaaaaaaaatccggtaac和SEQ ID NO.22：ccgctcgagtctggcagtttcgctgtac)；委托合成SOD的PCR引物(SEQ ID NO.23:cgccatatggcgacgaaggccgtgtgcg和SEQ ID NO.24：ccgctcgagctgcgcaataccgataacgccg)；上述PCR引物划线部分分别为NdeI或XhoI酶切位点，PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性25s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。分别将Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I等4个基因的PCR产物和ELP融合蛋白载体pRELPN1用NdeI和XhoI双酶切。委托按照SEQ IDNO.7的氨基酸序列重复串联15次的重复序列Exendin-4，进行密码子优化后直接克隆入pET28a的NdeI和XhoI之间；按照SEQ ID NO.8的氨基酸序列重复串联7次重复序列的甲状旁腺激素，密码子优化后克隆入pET28a的NdeI和XhoI之间。15个重复序列的Exendin-4和7个重复序列甲状旁腺激素则直接从pET28a载体上用NdeI和XhoI双酶切。上述酶切产物进行琼脂糖电泳，NEB胶回收试剂盒回收酶切片段，按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit说明书分别连接Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I等4个基因的PCR酶切产物和pRELPN1载体的双酶切产物，分别连接Exendin-4和甲状旁腺激素重复序列的双酶切片段和pRELPN1载体的双酶切产物，通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后，将在NdeI和XhoI之间已经插入外源目的基因Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I、含重复序列的Exendin-4和甲状旁腺激素等6个基因的pRELPN1表达载体质粒，分别转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L IPTG 37℃摇菌表达4h，分别收集1mL表达菌，8000rpm离心5min,加入1X电泳缓冲液100μl，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达菌中Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I、Exendin-4和甲状旁腺激素等6个基因的重组蛋白表达分子量和表达量。
结果表明，SDS-PAGE电泳显示，含有ELP[V30G18A12]60载体pRELPN1表达外源目的基因Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、GCSF、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I、15个重复序列的Exendin-4和7个重复序列的甲状旁腺激素表达都比较强(图6,7,8)。按照表达分子量大小分别符合C末端含有6His的Endostatin、Her2纳米抗体二聚体、GCSF、铜,锌超氧化物歧化酶、肝素酶I、15个重复序列的Exendin-4和7个重复序列的甲状旁腺激素等重组蛋白的各自分子量(图6,7,8)。特别是对多肽重复序列表达量高是本申请的一个特点。
实施例10
将上述载体pRELPN1，N端和C端有R9和N10，ELP融合蛋白的RELPN1克隆在pET28a的NcoI和NdeI，然后在该ELP融合蛋白后的NdeI和XhoI酶切位点之间，克隆入粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,GCSF,GenBank:M17706.1)。在普通的pET28a载体的NdeI和BamHI之间克隆入GCSF和Cu,Zn-SOD等2种外源基因，在插入的GCSF和SOD基因后的BamHI和XhoI之间插入ELP40融合基因,并且在SOD基因后插入ELP20基因。具体操作为委托南京金斯瑞生物科技有限公司提前分别合成ELP[H33V7]40和ELP[V10G6A4]20的2种ELP40和ELP20基因预先插在pET28a载体的BamHI和XhoI之间，其中，ELP[H33V7]40的N端含有N10，C端含有R9,形成pET28a-N10-ELP40-R9(pET28a-ELP40)或pET28a-ELP20载体。委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成GCSF的PCR引物(SEQ ID NO.25:cgccatatgacaccattaggccctgccagctccctg和SEQ ID NO.26：cgcggatccgggctgggcaaggtggcgtag)；委托合成SOD的PCR引物(SEQ ID NO.23:和SEQ IDNO.27：cgcggatccctgcgcaataccgataacgccg),划线处分别为NdeI或BamHI酶切位点。PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性25s，56℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次，72℃延伸10min，10℃保温。分别将GCSF和SOD基因的PCR产物与委托合成的含有ELP[H33V7]40的pET28a-ELP40载体通过NdeI和BamHI双酶切和试剂盒纯化，按照NEB公司的M2200S Quickligation kit说明书分别连接GCSF和SOD的PCR酶切产物和含有ELP[H33V7]40的pET28a-ELP40载体的双酶切产物，同时将SOD的PCR酶切产物与委托合成的已经NdeI和BamHI双酶切的含有ELP[V10G6A4]20的pET28a-ELP20载体也按照试剂盒说明书连接,通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后，用NdeI和XhoI双酶切，将含有GCSF-ELP[H33V7]40的融合基因片段插入已经用NdeI和XhoI双酶切的pRELPN1载体，将含有SOD-ELP[H33V7]40和SOD-ELP[V10G6A4]20融合基因的酶切片段插入已经用NdeI和XhoI双酶切的pRELPN1载体，通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后NdeI和XhoI双酶切鉴定阳性后，分别提取质粒，将含外源目的基因GCSF、GCSF-ELP[H33V7]40、SOD-ELP[H33V7]40和SOD-ELP[V10G6A4]20等4个外源基因的pRELPN1表达载体质粒，分别转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，分别收集1mL表达菌，8000rpm离心5min,加入100μL 1X电泳缓冲液，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达菌中GCSF、GCSF-ELP[H33V7]40(ELP40)、SOD-ELP[H33V7]40和SOD-ELP[V10G6A4]20(ELP20)等4个外源基因的重组蛋白表达分子量和表达量。结果表明，SDS-PAGE电泳图9显示，GCSF单基因高表达，GCSF-ELP40的ELP融合蛋白也高表达，图9、图12显示，SOD-ELP20和SOD-ELP40的2种ELP融合蛋白也高表达，其中SOD-ELP40的表达量高于SOD-ELP20。
实施例11
大部分多肽的分子量小，比较难以用大肠杆菌表达，并且表达量比较低，采用重复序列表达是一种方式，实施例3中，Exendin-4(SEQ ID NO.7)就采用了15X的重复序列，甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH，SEQ ID NO.8)采用了7X重复序列后表达比较高。也可以采用ELP融合蛋白载体pRELPN1，N端和C端有R9和N10，在pRELPN1的载体NdeI和XhoI酶切位点克隆入没有重复序列的Exendin-4和甲状旁腺激素单体，并且与ELP40连接进行融合基因表达。委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成含有ELP[H33V7]40的pET28a-ELP40载体，同时委托合成Exendin-4的PCR引物(SEQ ID NO.28：cgccatatgcatggtgaaggcacctttaccag和SEQ ID NO.29：cgcggatccactcggaggcggtgcaccactg)，委托合成甲状旁腺激素的PCR引物(SEQ ID NO.30：cgccatatgagcgttagcgaaattcagctg和SEQ ID NO.31：cgcgaatccctggcttttggctttggtcag),划线部分为NdeI或BamHI酶切位点。PCR条件为95℃预变性5min，95℃变性15s，56℃退火10s，72℃延伸10s，循环30次，72℃延伸5min，10℃保温。通过NdeI和BamHI双酶切和试剂盒纯化，按照NEB公司的M2200S Quick ligation kit说明书分别连接Exendin-4或甲状旁腺激素的PCR酶切产物与含有ELP[H33V7]40的pET28a-ELP40载体的NdeI和BamHI双酶切后胶回收的酶切载体,按照试剂盒说明书分别连接后,通过导入DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后，用NdeI和XhoI双酶切，将ELP[H33V7]40对照片段、含有Exendin-4-ELP[H33V7]40或甲状旁腺激素-ELP[H33V7]40的ELP融合蛋白酶切片段琼脂糖凝胶电泳，NEB胶回收试剂盒回收，分别插入已经用NdeI和XhoI双酶切的pRELPN1载体，按照NEB公司的M2200S Quick ligationkit说明书分别连接，连接产物分别转导到DH5α感受态，37℃卡那霉素抗性平板菌落培养，挑取单克隆菌落在3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，PCR鉴定单克隆菌阳性后，用质粒提取试剂盒提取表达质粒，酶切鉴定阳性后转导到大肠杆菌表达菌BL21·DE3感受态，挑取单克隆菌，在15mL试管中加入3mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液37℃摇菌过夜，然后在50mL试管中加入10mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素的普通LB培养液加入0.5mL菌液37℃摇菌2h-3h,当OD值达到0.4-0.6时候，加入1mmol/L的IPTG 37℃摇菌表达4h，分别收集1mL表达菌，8000rpm离心5min,加入100μl 1X电泳缓冲液，超声破碎，100℃煮10分，离心，SDS-PAGE电泳鉴定表达菌中通过pRELPN1的载体表达的对照ELP40，Exendin-4-ELP40和甲状旁腺激素-ELP40等3个外源基因的重组蛋白表达分子量和表达量。
结果表明，SDS-PAGE电泳图13显示，pRELPN1的载体表达的C末端含有6His标签的对照组ELP40高表达,C末端含有6His标签的单体的Exendin-4-ELP40融合蛋白高表达，C末端含有6His标签的单体的甲状旁腺激素-ELP40的ELP融合蛋白也高表达。用pRELPN1的载体进行多肽-ELP融合蛋白的表达，从而解决了多肽分子量小，ELP融合蛋白重复片段多，表达量低的技术问题，使非色谱纯化的多肽ELP融合蛋白的产业化有了应用基础。
实施例12
为了便于与pET28a载体比较表达量，委托南京金斯瑞生物科技有限公司在pET28a载体上人工合成ELP20和ELP40过程中，同时用普通pET28a表达含上述同样结构的SOD-ELP20(图10)和SOD-ELP40(图11)，用pRELPN1载体表达的SOD-ELP20(图9)和SOD-ELP40(图12)的表达量进行电泳比较，BSA作为测量标准品，GS-900成像仪(SH1WBA10698)进行凝胶透射图像扫描，测算SDS-PAGE电泳图中目的基因的表达水平，测定结果表明，在普通LB培养基采用普通摇床进行37℃表达4h,用pET28a载体表达的SOD-ELP20融合蛋白的表达量(图10)最高是6mg/L,用pRELPN1载体表达的同样结构的SOD-ELP20融合蛋白的表达量是32mg/L，用pRELPN1载体表达GCSF-ELP40融合蛋白的表达量为60mg/L(图9)，用pRELPN1载体表达的SOD-ELP20融合蛋白或GCSF-ELP40融合蛋白的表达水平比用pET28a载体表达提高了5-10倍。同样，pET28a载体表达的ELP40表达量最高是10mg/L(图11),用pRELPN1载体表达的SOD-ELP40表达水平为60-100mg/L(图12)。这说明对于含有许多重复序列的ELP融合蛋白在一般pET载体中很难高表达，但是通过pRELPN1载体就比较容易达到外源目的基因与ELP形成的ELP融合蛋白的高表达。
实施例13
为了进一步证明pRELPN1的载体中含有R9和N10的ELP[V30G18A12]60的ELP融合蛋白没有表达或极少表达，在该载体中主要起第二启动子的作用，我们设计了在ELP融合蛋白后面连接的外源目的基因都没有携带终止密码，利用pET28a载体C末端XhoI后面携带6His标签和其后携带的终止密码，将前述实施例中利用pRELPN的载体进行表达的11个外源目的蛋白，以及将含同样结构的用pET28a载体表达的2个SOD-ELP20和SOD-ELP40蛋白，13个表达样品全部委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行同样条件的SDS-PAGE电泳，CoomassieBrilliant Blue R250染色，用GS-900成像仪(SH1WBA10698)进行凝胶透射图像扫描，用99％纯度的牛血清白蛋白1μg，2μg，4μg为标准品对照，为了进行背景校准，进一步采用BandscanV5.0软件检测，获得各重组蛋白占菌体总蛋白的表达百分比。将SDS-PAGE电泳转导进行Western blot，采用ONE-HOUR WesternTM检测系统，蛋白从凝胶转移到膜上之后，按照试剂盒说明书在ONE-HOUR预处理液中将转印膜孵育5分钟，将洗涤三遍后的转印膜在WB溶液加入所需的抗His-tag的鼠一抗孵育40min，洗涤3次后用含HRP标记的羊抗鼠二抗的WB溶液处理后，转印膜即可用来显色了。结果显示，委托进行凝胶透射图像扫描和通过BandscanV5.0软件检测的11种用pRELPN载体表达的外源基因均为高表达，用5μl上样量进行的SDS-PAGE电泳凝胶透射图像扫描测定和BandscanV5.0软件检测外源目的基因的表达量，其中SOD、Endostatin、甲状旁腺激素-ELP40、ELP40、Exendin-4-ELP40、Exendin-4重复序列、甲状旁腺激素重复序列、Her2纳米抗体二聚体、GCSF-ELP40、GCSF、SOD-ELP20的凝胶扫描和BandscanV5.0软件检测的目的蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为58.67％、64.97％、42.83％、42.63％、44.53％、61.13％、63.23％、55.63％、59.43％、69.13％、52.13％，说明用pRELPN载体表达的11种外源基因高表达已经达到目的蛋白占菌体总蛋白的42.63％-69.13％(图14)，远高于用pET28a载体的表达水平。用6his-tag的单克隆抗体western blot检测SOD、Endostatin、甲状旁腺激素-ELP40、ELP40、Exendin-4-ELP40、Exendin-4重复序列、甲状旁腺激素重复序列、Her2纳米抗体二聚体、GCSF-ELP40、GCSF、SOD-ELP20等11种含有6his-tag的重组蛋白全部是阳性(图15)，按照外源基因表达的目的蛋白分子量大小判断，由于6his-tag是在重组蛋白C末端XhoI酶切位点后面，因此westernblot的阳性和分子量大小可以判断出是NdeI含的ATG起始密码后面的外源目的基因表达，在NdeI前的含有R9和N10的ELP60融合基因极少表达，因为如果表达，在western blot上会观察到在目的蛋白分子量基础上还要增加两端含有R9和N10的ELP[V30G18A12]60的融合蛋白近30kDa的分子量的更大的融合蛋白阳性条带，在图15中仅仅有少数目的基因阳性条带的上方显示出微弱的增加了近30kDa的ELP[V30G18A12]60与目的基因一起形成的融合蛋白阳性条带，说明了在NdeI前的含有R9和N10的ELP60融合基因极少表达，主要起第二启动子的作用。通过与pET28a载体表达的SOD-ELP20和SOD-ELP40低表达(图10,11)比较，这类含双启动子的高表达载体pRELPN表达ELP融合蛋白的表达量比pET28a载体表达高了2-10倍。
进一步进行比较，将上述实施例12中的以普通pET28a表达的SOD-ELP20的表达量设定为100％，将pET28a表达的SOD-ELP40,用高表达载体pRELPN载体表达的SOD-ELP20、SOD-ELP40、GCSF-ELP40、甲状旁腺激素-ELP40(PTH-ELP40)、Exendin-4-ELP40、SOD、GCSF、Endostatin、Her2纳米抗体二聚体等9个基因的表达量与pET28a表达的SOD-ELP20的表达量进行相对表达量比较，按照凝胶透射图像扫描，用99％纯度的牛血清白蛋白标准品相对定量测定，得到2种表达载体相同目的基因或不同目的基因的相对表达量图(图16)，用高表达载体pRELPN载体表达的上述实施例中8种抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的表达量是用pET28a载体表达的SOD-ELP20表达量的2-10倍(图16)。
因此，本申请发明了一种高表达的重组蛋白表达载体pRELPN，是由9聚精氨酸(R9)-类弹性蛋白多肽(ELP)m-10聚天冬酰胺(N10)组成的人工合成ELP融合蛋白，可以克隆在大肠杆菌表达载体(p)或真核表达载体(p)的多克隆位点起第二启动子的作用，促进克隆在ELP融合蛋白后起始密码ATG后的外源基因独立高表达，该融合基因本身极少表达，主要促进外源目的基因的高表达，外源目的基因表达量达到占宿主蛋白的20-60％。用一般pET载体难以高表达的ELP融合蛋白用pRELPN载体表达可以增加2-10倍的ELP融合蛋白的表达产物。这类含双启动子的高表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的高表达，从而有助于解决其它表达载体外源基因或外源基因ELP融合蛋白低表达导致不能产业化的问题。
序列表
<110> 点斗基因科技(南京)有限公司
<120> 一种重组表达载体及其构建方法和应用
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
20 25 30
Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly
35 40 45
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala
50 55 60
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Gly Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Gly Gly Val
85 90 95
Pro Gly Val Gly
100
<210> 2
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
20 25 30
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
35 40 45
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
50 55 60
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
85 90 95
Pro Gly Val Gly
100
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
20 25 30
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
35 40 45
Phe Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Lys Gly Val Pro Gly Val
50 55 60
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
85 90 95
Pro Gly Phe Gly
100
<210> 4
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro
20 25 30
Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly
35 40 45
Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile
50 55 60
Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val Pro Gly Ile Gly Val
85 90 95
Pro Gly Ile Gly
100
<210> 5
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
20 25 30
Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
35 40 45
Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala
50 55 60
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
85 90 95
Pro Gly Ala Gly
100
<210> 6
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser Pro Asn
20 25 30
Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Asn Arg Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Thr Ala Thr Asn Trp Asp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
145 150 155 160
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
165 170 175
Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Leu Tyr
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Ala Pro Trp Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
<210> 8
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His
20 25 30
Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser
35 40 45
Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu
50 55 60
Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys
65 70 75 80
Ala Lys Ser Gln
<210> 9
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Pro Gly His Gly Val
1 5 10 15
Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro
20 25 30
Gly Val Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly
35 40 45
His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly His
50 55 60
Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val
85 90 95
Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
100 105 110
Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly
115 120 125
His Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His
130 135 140
Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly Val Gly
145 150 155 160
Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val
165 170 175
Pro Gly His Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro
180 185 190
Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly His Gly Val Pro Gly
195 200 205
Trp Pro Val Asp Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
210 215 220
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggccacggcg tgggt 15
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgccgggcg ggctg 15
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgccatatgc acagccaccg cgacttccag 30
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgctcgagc ttggaggcag tcatgaagct g 31
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tataccatgg gccacagcca ccgcgacttc cag 33
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgccatatgg gtggtgagca ctttg 25
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgctcgagg tacaggtgtt ccaggacgta g 31
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgccatatgc acagccaccg cgacttccag 30
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgctcgagc ttggaggcag tcatgaagct g 31
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgccatatgc aagtcaaact ggtggaatcg gg 32
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccgctcgagg gaactcacgg tgacttg 27
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgccatatgc agcaaaaaaa atccggtaac 30
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgctcgagt ctggcagttt cgctgtac 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgccatatgg cgacgaaggc cgtgtgcg 28
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccgctcgagc tgcgcaatac cgataacgcc g 31
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgccatatga caccattagg ccctgccagc tccctg 36
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgcggatccg ggctgggcaa ggtggcgtag 30
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgcggatccc tgcgcaatac cgataacgcc g 31
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgccatatgc atggtgaagg cacctttacc ag 32
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcggatcca ctcggaggcg gtgcaccact g 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgccatatga gcgttagcga aattcagctg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgcgaatccc tggcttttgg ctttggtcag 30
Claims (13)
1.一种ELP融合蛋白RELPN，其特征在于，所述ELP融合蛋白RELPN由9聚精氨酸(R9)-类弹性蛋白多肽(ELP)m-10聚天冬酰胺(N10)组成，所述9聚精氨酸(R9)在ELP融合蛋白RELPN的N端，10聚天冬酰胺(N10)在ELP融合蛋白RELPN的C端。
2.根据权利要求1所述的ELP融合蛋白RELPN，其特征在于，所述类弹性蛋白多肽(ELP)m由串联的五肽重复单元(VPGXG)n通过酶切位点间隔连接或克隆形成。
3.根据权利要求2所述的ELP融合蛋白RELPN，其特征在于，所述串联的五肽重复单元(VPGXG)n中，(VPGXG)为Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，所述Xaa(X)为除脯氨酸外的任何氨基酸；每个(VPGXG)五肽重复单元的串联个数n为20-120。
4.一种重组载体pRELPN，其特征在于，所述重组载体pRELPN为将权利要求1至3任一项所述ELP融合蛋白RELPN克隆入原核或真核载体(p)的多克隆位点得到。
5.根据权利要求4所述的重组载体pRELPN，其特征在于，ELP融合蛋白RELPN插入在前后两个起始密码ATG之间。
6.根据权利要求4所述的重组载体pRELPN，其特征在于，所述原核载体包括大肠杆菌载体、酵母载体，优选的，为pET28a,pET26b,pET30a或pPICZαA中的一种；所述真核载体包括细胞系的真核载体，优选的，为pIRES2-EGFP中的一种。
7.根据权利要求6所述的重组载体pRELPN，其特征在于，所述ELP融合蛋白RELPN插入在pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间，或pET26b、pET30a的多克隆位点NdeI和NcoI之间，或pPICZαA的多克隆位点EcoRI和KpnI之间，或真核表达载体的多克隆位点NheI和XhoI之间。
8.权利要求4至7任一项所述的重组载体pRELPN的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人工合成串联的五肽重复单元(VPGXG)n；
S2：将S1合成的串联的五肽重复单元(VPGXG)n通过连接结构间隔连接，或通过两端加上酶切位点克隆，得到类弹性蛋白多肽(ELP)m；所述连接结构为多克隆位点内的酶切位点；
S3：在S2得到的类弹性蛋白多肽(ELP)m的N端前加上9聚精氨酸(R9)，C端后加上10聚天冬酰胺(N10)，得到ELP融合蛋白RELPN；
S4：将S3得到的ELP融合蛋白RELPN克隆到表达载体(p)的多克隆位点之间，得到重组载体pRELPN。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
S1所述串联的五肽重复单元(VPGXG)n为ELP[V10G6A4]20(SEQ ID NO.1)、ELP[V20]20(SEQ ID NO.2)、ELP[K2V16F2]20(SEQ ID NO.3)、ELP[I20]20(SEQ ID NO.4)、ELP[A20]20(SEQ ID NO.5)中的一种；
S2得到的类弹性蛋白多肽(ELP)m为ELP[V30G18A12]60、ELP[V60]60、ELP[K6V48F6]60、ELP[I60]60、ELP[A120]120中的一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S2所述连接结构为酶切位点BamHI，EcoRI，HindIII中的一种或几种，克隆所用的酶切位点为pflMI(SEQ ID NO.10)和BglI(SEQID NO.11)。
11.一种重组表达载体pRELPN，其特征在于，在权利要求4至7任一项所述重组载体pRELPN的ELP融合蛋白RELPN后的酶切位点之间插入外源目的基因。
12.根据权利要求11所述的重组表达载体pRELPN，其特征在于，所述外源目的基因插入在pET28a的NdeI和XhoI酶切位点之间，或pET26b、pET30a的NcoI和XhoI酶切位点之间，或pPICZαA的KpnI和NotI酶切位点之间，或pIRES2-EGFP的EGFP基因的酶切位点之间。
13.权利要求4所述的重组载体或权利要求11所述的重组表达载体pRELPN在促进外源目的基因的独立高表达中的应用，其特征在于，所述外源目的基因包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽或ELP融合蛋白。
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