CN110845625A

CN110845625A - 一种穿膜肽-前b细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110845625A
Application number: CN201911181413.3A
Authority: CN
Inventors: 刘晋宇; 王勃; 刘菲琳
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-02-28

Abstract

本发明提供了一种穿膜肽‑前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，通过将CPP与PBX1融合表达的方式，利用CPP能携带外源蛋白进入细胞的穿膜特性，将PBX1转录因子高效的带入干细胞内，从而维持干细胞的自我更新能力，促进其增殖并延缓其衰老，为体外大规模制备干细胞提供一种新的解决方案。

Description

一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞具有自我更新与多向分化的潜能,是再生医学的核心组成部分,已被应用于造血系统疾病、中枢神经系统疾病及免疫系统疾病等多种疾病的治疗。如同其它体细胞一样，干细胞也会衰老，影响其增殖、分化及组织修复能力。一方面，干细胞的衰老被认为是机体衰老的重要驱动力，可引起机体多种组织器官的功能障碍；另一方面，干细胞的在体外大量扩增时产生的复制性衰老限制了其在临床治疗中的应用范围。干细胞分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。研究发现，前B细胞白血病转录因子1(PBX1)可通过激活Nanog转录以增强胚胎干细胞的自我更新能力(Chan K K,Zhang J,Chia N Y,et al.KLF4and PBX1 directly regulate NANOG expression in human embryonic stem cells[J].Stem Cells,2009,27(9):2114-25.)；我们课题组发现，PBX1可通过激活PI3K/AKT信号通路，促进毛囊间充质干细胞的增殖和自我更新，同时促进毛囊间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞(Jiang Y,Liu F,Zou F,et al.PBX homeobox 1 enhances hair folliclemesenchymal stem cell proliferation and reprogramming through activation ofthe AKT/glycogen synthase kinase signaling pathway and suppression ofapoptosis[J].Stem Cell Res Ther,2019,10(1):268.)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用，通过将CPP与PBX1融合表达的方式，利用CPP能携带外源蛋白进入细胞的穿膜特性，将PBX1转录因子高效的带入干细胞内，从而维持干细胞的自我更新能力，促进增殖并延缓衰老，为体外大规模制备干细胞提供一种新的解决方案。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白(CPP-PBX1)，所述融合蛋白的结构为：N端-纯化标签(Tag)-酶切位点(Site)-细胞穿膜肽(CPP)-连接肽(Linker)-前B细胞白血病转录因子1(PBX1)-C端。

优选的，所述纯化标签包括His6、GST、Myc、MBP、NusA或SUMO。

优选的，所述酶切位点包括：Enterokinase，Thrombin，Factor Xa，TEV protease，PreScission，HRV 3C Protease，Furin或SUMO Protease，所述Enterokinase的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；Thrombin的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；Factor Xa的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；TEV protease的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；PreScission的酶切位点氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示；HRV 3C Protease的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；Furin的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；SUMO Protease的酶切位点为SUMO的三级结构。

优选的，所述细胞穿膜肽位于所述前B细胞白血病转录因子1的N端，所述细胞穿膜肽包括鱼精蛋白、TAT肽或R9肽；所述鱼精蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述TAT肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述R9肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，在所述融合蛋白中的CPP与PBX1之间包含顺次连接的1～3组连接肽，每组所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

优选的，所述前B细胞白血病转录因子1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将编码所述融合蛋白的基因插入到表达载体中，形成重组蛋白表达系统，利用所述重组蛋白表达系统进行体外表达。

优选的，所述重组蛋白表达系统包括：大肠杆菌原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。

本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进间充质干细胞增殖中的应用。

本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述制备方法制备得到的融合蛋白在延缓细胞衰老中的应用。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明通过将CPP与PBX1融合表达的方式，利用CPP能携带外源蛋白进入细胞的穿膜特性，将PBX1转录因子高效的带入干细胞内，从而维持干细胞的自我更新能力，促进增殖并延缓衰老，为体外大规模制备干细胞提供一种新的解决方案。

本发明通过分子克隆方法构建出PBX1与CPP的一系列融合蛋白表达载体，包括原核表达系统、真核表达系统、酵母表达系统及昆虫杆状病毒表达系统中的常规表达载体，通过外源表达后大量获取CPP-PBX1融合蛋白，再通过不同的纯化方法，可大量制备高纯度的CPP-PBX1。

本发明将纯化后的CPP-PBX1融合蛋白用细胞培养基稀释为适当的浓度，使用该培养基在体外长期培养间充质干细胞，可实现维持干细胞自我更新能力，并促进干细胞增殖、延缓其衰老。

附图说明

图1为CPP-PBX1的结构示意图；

图2为阳性表达克隆筛选后的考马斯亮蓝染色结果，箭头处为55kDa的TAT-PBX1融合蛋白的过表达带；

图3为使用Western Blot，分别用His6、HA、PBX1抗体鉴定融合蛋白的结果，TAT-PBX1融合蛋白共有His6、HA、PBX1三个抗原表位，经Western Blot鉴定均为阳性，表明原核表达的融合蛋白结构完整；

图4为镍柱纯化过程中各组分的考马斯亮蓝染色结果，其中Start为变性后的总蛋白，Flowthrough为镍柱流穿液留样，Wash为洗涤液留样，Elution为洗脱液留样，经过镍柱亲和层析后，目的蛋白纯度大大提高；

图5为细胞免疫荧光的结果，为避免干细胞内源蛋白的干扰，使用HA抗体进行鉴定，结果表明，TAT-PBX1能穿透hHF-MSCs，并进入细胞核；

图6为CCK-8细胞增殖实验结果，分别用不同浓度的TAT-PBX1融合蛋白孵育hHF-MSCs结果发现，在孵育24h后，各剂量组细胞增殖率没有明显差异，在孵育96h后，随着剂量增加，各组细胞增值率逐渐升高，与0.0μg/mL剂量组相比，7.5(P<0.05)、10.0(P<0.01)、12.5(P<0.001)均有统计学差异，表明TAT-PBX1融合蛋白能促进hHF-MSCs的增殖；

图7为衰老相关β-Gal染色的结果图，与对照组相比，使用含TAT-PBX1培养基培养的hHF-MSCs中，衰老细胞阳性率明显降低(P<0.0001)，说明TAT-PBX1能延缓hHF-MSCs在体外长期传代中的衰老现象；

图8为衰老相关β-Gal染色的结果统计图；

图9为重组表达载体的质粒图谱。

具体实施方式

本发明所述融合蛋白CPP-PBX1的结构如图1所示，其中所述纯化标签优选包括His6、GST、Myc、MBP、NusA或SUMO；所述酶切位点包括：Enterokinase，Thrombin，Factor Xa，TEV protease，PreScission，HRV 3C Protease，Furin或SUMO Protease，所述酶切位点的氨基酸序列如表1所示：

表1酶切位点信息

酶切位点	序列	SEQ ID NO.
			Enterokinase	DDDDK↓	1
Thrombin	LVPRG↓S	2
			Factor Xa	I-E/D-G↓R	3/4
TEV protease	ENLYFQ↓G	5
			PreScission	LEVLFQ↓GP	6
HRV 3C Protease	LEVLFQ↓GP	7
			Furin	RRKR↓	8
SUMO Protease	SUMO三级结构	-

注：在表1中↓表示酶切的粘性末端。

本发明所述细胞穿膜肽优选位于所述前B细胞白血病转录因子1的N端，所述细胞穿膜肽优选包括鱼精蛋白、TAT肽或R9肽；所述鱼精蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：VSRRRRRRGGRRRR；所述TAT肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：YGRKKRRQRRR；所述R9肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示：RRRRRRRRR。

本发明在所述融合蛋白中，CPP和PBX1之间优选包括顺次连接的1～3组所述连接肽，每组所述连接肽的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.13所示：GGGGS。

本发明所述前B细胞白血病转录因子1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示：MDEQPRLMHSHAGVGMAGHPGLSQHLQDGAGGTEGEGGRKQDIGDILQQIMTITDQSLDEAQARKHALNCHRMKPALFNVLCEIKEKTVLSIRGAQEEEPTDPQLMRLDNMLLAEGVAGPEKGGGSAAAAAAAAASGGAGSDNSVEHSDYRAKLSQIRQIYHTELEKYEQACNEFTTHVMNLLREQSRTRPISPKEIERMVSIIHRKFSSIQMQLKQSTCEAVMILRSRFLDARRKRRNFNKQATEILNEYFYSHLSNPYPSEEAKEELAKKCGITVSQVSNWFGNKRIRYKKNIGKFQEEANIYAAKTAVTATNVSAHGSQANSPSTPNSAGSSSSFNMSNSGDLFMSVQSLNGDSYQGAQVGANVQSQVDTLRHVISQTGGYSDGLAASQMYSPQGISANGGWQDATTPSSVTSPTEGPGSVHSDTSN。

本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将编码所述融合蛋白的基因插入到表达载体中，形成表达系统，利用所述表达系统进行体外表达。其中一种PBX1编码基因如下(SEQ ID NO.9)：ATGGACGAGCAGCCCAGGCTGATGCATTCCCATGCTGGGGTCGGGATGGCCGGACACCCCGGCCTGTCCCAGCACTTGCAGGATGGGGCCGGAGGGACCGAGGGGGAGGGCGGGAGGAAGCAGGACATTGGAGACATTTTACAGCAAATTATGACCATCACAGACCAGAGTTTGGATGAGGCGCAGGCCAGAAAACATGCTTTAAACTGCCACAGAATGAAGCCTGCCTTGTTTAATGTGTTGTGTGAAATCAAAGAAAAAACAGTTTTGAGTATCCGAGGAGCCCAGGAGGAGGAACCCACAGACCCCCAGCTGATGCGGCTGGACAACATGCTGTTAGCGGAAGGCGTGGCGGGGCCTGAGAAGGGCGGAGGGTCGGCGGCAGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCTTCTGGAGGGGCAGGTTCAGACAACTCAGTGGAGCATTCAGATTACAGAGCCAAACTCTCACAGATCAGACAAATCTACCATACGGAGCTGGAGAAATACGAGCAGGCCTGCAACGAGTTCACCACCCACGTGATGAATCTCCTGCGAGAGCAAAGCCGGACCAGGCCCATCTCCCCAAAGGAGATTGAGCGGATGGTCAGCATCATCCACCGCAAGTTCAGCTCCATCCAGATGCAGCTCAAGCAGAGCACGTGCGAGGCGGTGATGATCCTGCGTTCCCGATTTCTGGATGCGCGGCGGAAGAGACGGAATTTCAACAAGCAAGCGACAGAAATCCTGAATGAATATTTCTATTCCCATCTCAGCAACCCTTACCCCAGTGAGGAAGCCAAAGAGGAGTTAGCCAAGAAGTGTGGCATCACAGTCTCCCAGGTATCAAACTGGTTTGGAAATAAGCGAATCCGGTACAAGAAGAACATAGGTAAATTTCAAGAGGAAGCCAATATTTATGCTGCCAAAACAGCTGTCACTGCTACCAATGTGTCAGCCCATGGAAGCCAAGCTAACTCGCCCTCAACTCCCAACTCGGCTGGTTCTTCCAGTTCTTTTAACATGTCAAACTCTGGAGATTTGTTCATGAGCGTGCAGTCACTCAATGGGGATTCTTACCAAGGGGCCCAGGTTGGAGCCAACGTGCAATCACAGGTGGATACCCTTCGCCATGTTATCAGCCAGACAGGAGGATACAGTGATGGACTCGCAGCCAGTCAGATGTACAGTCCGCAGGGCATCAGTGCTAATGGAGGTTGGCAGGATGCTACTACCCCTTCATCAGTGACCTCCCCTACAGAAGGCCCTGGCAGTGTTCACTCTGATACCTCCAACTGATAA。本发明所述表达系统优选包括：大肠杆菌原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。本发明对所述表达系统的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规表达载体构建和转化菌株方法即可。在本发明实施例中，以细胞穿膜肽为TAT肽为例，利用原核表达系统表达TAT穿膜肽与PBX1的融合蛋白TAT-PBX1，但是不能仅将其认为是本发明的保护内容。

本发明在利用所述表达系统进行体外表达，得到所述融合蛋白后，优选还包括纯化，本发明对所述纯化的方法并没有特殊限定，优选的包括：层析纯化方法和透析、超滤和冷冻干燥，从而大量制备高纯度的CPP-PBX1，其产物最终形式可包括冻干粉针剂、溶液剂和片剂等。

本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进干细胞增殖中的应用。本发明将纯化后的CPP-PBX1融合蛋白用细胞培养基稀释为适当的浓度，使用该培养基在体外长期培养干细胞，可实现维持干细胞自我更新能力的目的，并促进干细胞增殖、延缓其衰老。本发明所述干细胞优选的包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞。其中成体干细胞包括但不限于角朊干细胞、黑色素干细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、视网膜色素上皮细胞、神经干细胞等以及多种组织来源的间充质干细胞，如毛囊来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、羊膜来源间充质干细胞、脂肪来源间充质干细胞、血液来源间充质干细胞、尿液来源间充质干细胞等。

本发明还提供了所述融合蛋白或利用所述制备方法制备得到的融合蛋白在延缓细胞衰老中的应用。本发明所述应用与上述应用相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

使用原核表达系统表达TAT穿膜肽与PBX1的融合蛋白TAT-PBX1

1、采用PCR法扩增PBX1的编码基因，并在其两端分别加上EcoR1和Kpn1限制性内切酶酶切位点。以pLVX-PBX1-IRES-mCherry(购自长沙优宝生物)为模板，该模版含有完整的上述PBX1编码序列，引物序列如下：forward primer:5’-GGTACCATGGACGAGCAGCCCAGGCTG(SEQ ID NO.15),reverse primer:5’-GAATTCTTATCAGTTGGAGGTATCAGAGTGAACACTGCC(SEQID NO.16)；通过T-A克隆将PCR产物连到克隆载体pT-EASY上，随后通过蓝白筛选挑取正确连接的白色克隆，经过菌液PCR、酶切鉴定及基因测序等分子生物学常规方法鉴定后，将阳性克隆中的PBX1编码基因片段通过双酶切、T4连接的方式插入原核表达载体pTAT-HA上，再转入原核表达菌株Rosetta(DE3)中，经氨苄抗性筛选，获取正确的转化子用于原核表达；重组表达载体的质粒图谱如图9所示。

2、阳性转化子在表达培养基(氨苄和氯霉素抗性)中37℃过夜活化，1：10～1：100扩大培养，待OD₆₀₀达到0.4～0.6之间，降温至22-30℃继续培养15-24h。5000g 10min离心收集沉淀；

3、将沉淀于8M尿素中超声破碎溶解，12000g×30min离心，上清用0.45μm滤器过滤后，采用镍柱亲和层析法进行纯化，再通过脉冲稀释的方式进行复性，再对复性液进行透析和超滤，结果如图2所示，证明获取高纯度、高浓度的TAT-PBX1融合蛋白；同时使用WesternBlot，分别用His6、HA、PBX1抗体鉴定融合蛋白，结果如图3所示，经Western Blot鉴定均为阳性，表明原核表达的融合蛋白结构完整；镍柱纯化过程中各组分的考马斯亮蓝染色结果如图4所示，其中Start为变性后的总蛋白，Flowthrough为镍柱流穿液留样，Wash为洗涤液留样，Elution为洗脱液留样，可以看出，经过镍柱亲和层析后，目的蛋白纯度大大提高。

实施例2

1、使用TAT-PBX1融合蛋白转导hHF-MSCs

(1)用细胞完全培养基将TAT-PBX1稀释为1μg/mL；

(2)用稀释后的培养基孵育hHF-MSCs，6h后进行免疫荧光染色；

结果如图5所示，TAT-PBX1能高效穿透细胞，并进入细胞核。

2、使用TAT-PBX1融合蛋白促进hHF-MSCs增殖

(1)用细胞完全培养基将TAT-PBX1稀释为0.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg/mL；

(2)用稀释后的培养基分别孵育hHF-MSCs，于孵育后24h和96h分别用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平，结果如图6所示，在孵育24h后，各剂量组细胞增殖率没有明显差异，在孵育96h后，随着剂量增加，各组细胞增值率逐渐升高，与0.0μg/mL剂量组相比，7.5(P<0.05)、10.0(P<0.01)、12.5(P<0.001)均有统计学差异，表明TAT-PBX1融合蛋白能促进hHF-MSCs的增殖。

3、使用TAT-PBX1融合蛋白延缓hHF-MSCs衰老

(1)用细胞完全培养基将TAT-PBX1稀释为10.0μg/mL，并用等体积的PBS与细胞完全培养基混合作为对照组培养基；

(2)分别用含TAT-PBX1的培养基和等体积PBS的培养基培养P5代hHF-MSCs，并在细胞培养条件下持续培养至P10代；

(3)分别使用β-Gal染色试剂盒检测P10代细胞中衰老细胞阳性率。结果如图7和图8所示，与对照组相比，使用含TAT-PBX1培养基培养的hHF-MSCs中，衰老细胞阳性率明显降低(P<0.0001)，说明TAT-PBX1能延缓hHF-MSCs在体外长期传代中的衰老现象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Glu Gly Arg

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Asp Gly Arg

1

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Arg Arg Lys Arg

1

<210> 10

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggacgagc agcccaggct gatgcattcc catgctgggg tcgggatggc cggacacccc 60

ggcctgtccc agcacttgca ggatggggcc ggagggaccg agggggaggg cgggaggaag 120

caggacattg gagacatttt acagcaaatt atgaccatca cagaccagag tttggatgag 180

gcgcaggcca gaaaacatgc tttaaactgc cacagaatga agcctgcctt gtttaatgtg 240

ttgtgtgaaa tcaaagaaaa aacagttttg agtatccgag gagcccagga ggaggaaccc 300

acagaccccc agctgatgcg gctggacaac atgctgttag cggaaggcgt ggcggggcct 360

gagaagggcg gagggtcggc ggcagcggcg gcagcggcgg cggcttctgg aggggcaggt 420

tcagacaact cagtggagca ttcagattac agagccaaac tctcacagat cagacaaatc 480

taccatacgg agctggagaa atacgagcag gcctgcaacg agttcaccac ccacgtgatg 540

aatctcctgc gagagcaaag ccggaccagg cccatctccc caaaggagat tgagcggatg 600

gtcagcatca tccaccgcaa gttcagctcc atccagatgc agctcaagca gagcacgtgc 660

gaggcggtga tgatcctgcg ttcccgattt ctggatgcgc ggcggaagag acggaatttc 720

aacaagcaag cgacagaaat cctgaatgaa tatttctatt cccatctcag caacccttac 780

cccagtgagg aagccaaaga ggagttagcc aagaagtgtg gcatcacagt ctcccaggta 840

tcaaactggt ttggaaataa gcgaatccgg tacaagaaga acataggtaa atttcaagag 900

gaagccaata tttatgctgc caaaacagct gtcactgcta ccaatgtgtc agcccatgga 960

agccaagcta actcgccctc aactcccaac tcggctggtt cttccagttc ttttaacatg 1020

tcaaactctg gagatttgtt catgagcgtg cagtcactca atggggattc ttaccaaggg 1080

gcccaggttg gagccaacgt gcaatcacag gtggataccc ttcgccatgt tatcagccag 1140

acaggaggat acagtgatgg actcgcagcc agtcagatgt acagtccgca gggcatcagt 1200

gctaatggag gttggcagga tgctactacc ccttcatcag tgacctcccc tacagaaggc 1260

cctggcagtg ttcactctga tacctccaac tgataa 1296

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Asp Glu Gln Pro Arg Leu Met His Ser His Ala Gly Val Gly Met

1 5 10 15

Ala Gly His Pro Gly Leu Ser Gln His Leu Gln Asp Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Thr Glu Gly Glu Gly Gly Arg Lys Gln Asp Ile Gly Asp Ile Leu Gln

35 40 45

Gln Ile Met Thr Ile Thr Asp Gln Ser Leu Asp Glu Ala Gln Ala Arg

50 55 60

Lys His Ala Leu Asn Cys His Arg Met Lys Pro Ala Leu Phe Asn Val

65 70 75 80

Leu Cys Glu Ile Lys Glu Lys Thr Val Leu Ser Ile Arg Gly Ala Gln

85 90 95

Glu Glu Glu Pro Thr Asp Pro Gln Leu Met Arg Leu Asp Asn Met Leu

100 105 110

Leu Ala Glu Gly Val Ala Gly Pro Glu Lys Gly Gly Gly Ser Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Gly Ala Gly Ser Asp Asn Ser

130 135 140

Val Glu His Ser Asp Tyr Arg Ala Lys Leu Ser Gln Ile Arg Gln Ile

145 150 155 160

Tyr His Thr Glu Leu Glu Lys Tyr Glu Gln Ala Cys Asn Glu Phe Thr

165 170 175

Thr His Val Met Asn Leu Leu Arg Glu Gln Ser Arg Thr Arg Pro Ile

180 185 190

Ser Pro Lys Glu Ile Glu Arg Met Val Ser Ile Ile His Arg Lys Phe

195 200 205

Ser Ser Ile Gln Met Gln Leu Lys Gln Ser Thr Cys Glu Ala Val Met

210 215 220

Ile Leu Arg Ser Arg Phe Leu Asp Ala Arg Arg Lys Arg Arg Asn Phe

225 230 235 240

Asn Lys Gln Ala Thr Glu Ile Leu Asn Glu Tyr Phe Tyr Ser His Leu

245 250 255

Ser Asn Pro Tyr Pro Ser Glu Glu Ala Lys Glu Glu Leu Ala Lys Lys

260 265 270

Cys Gly Ile Thr Val Ser Gln Val Ser Asn Trp Phe Gly Asn Lys Arg

275 280 285

Ile Arg Tyr Lys Lys Asn Ile Gly Lys Phe Gln Glu Glu Ala Asn Ile

290 295 300

Tyr Ala Ala Lys Thr Ala Val Thr Ala Thr Asn Val Ser Ala His Gly

305 310 315 320

Ser Gln Ala Asn Ser Pro Ser Thr Pro Asn Ser Ala Gly Ser Ser Ser

325 330 335

Ser Phe Asn Met Ser Asn Ser Gly Asp Leu Phe Met Ser Val Gln Ser

340 345 350

Leu Asn Gly Asp Ser Tyr Gln Gly Ala Gln Val Gly Ala Asn Val Gln

355 360 365

Ser Gln Val Asp Thr Leu Arg His Val Ile Ser Gln Thr Gly Gly Tyr

370 375 380

Ser Asp Gly Leu Ala Ala Ser Gln Met Tyr Ser Pro Gln Gly Ile Ser

385 390 395 400

Ala Asn Gly Gly Trp Gln Asp Ala Thr Thr Pro Ser Ser Val Thr Ser

405 410 415

Pro Thr Glu Gly Pro Gly Ser Val His Ser Asp Thr Ser Asn

420 425 430

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtaccatgg acgagcagcc caggctg 27

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaattcttat cagttggagg tatcagagtg aacactgcc 39

Claims

1.一种穿膜肽-前B细胞白血病转录因子1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构为：N端-纯化标签-酶切位点-细胞穿膜肽-连接肽-前B细胞白血病转录因子1-C端。

2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述纯化标签包括His6、GST、Myc、MBP、NusA或SUMO。

3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述酶切位点包括：Enterokinase，Thrombin，Factor Xa，TEV protease，PreScission，HRV 3C Protease，Furin或SUMOProtease，所述Enterokinase的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；Thrombin的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；Factor Xa的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；TEVprotease的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；PreScission的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；HRV 3C Protease的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；Furin的酶切位点氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；SUMO Protease的酶切位点为SUMO的三级结构。

4.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述细胞穿膜肽位于所述前B细胞白血病转录因子1的N端，所述细胞穿膜肽包括鱼精蛋白、TAT肽或R9肽；所述鱼精蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述TAT肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述R9肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，在所述融合蛋白中的细胞穿膜肽和前B细胞白血病转录因子1之间顺次连接1～3组连接肽，每组所述连接肽的氨基酸序列如SEQID NO.13所示。

6.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述前B细胞白血病转录因子1的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.权利要求1～6任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码所述融合蛋白的基因插入到表达载体中，形成重组蛋白表达系统，利用所述重组蛋白表达系统进行体外表达。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述重组蛋白表达系统包括：大肠杆菌原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统或昆虫杆状病毒表达系统。

9.权利要求1～6任一项所述融合蛋白或利用权利要求7或8所述制备方法制备得到的融合蛋白在促进干细胞增殖中的应用。

10.权利要求1～6任一项所述融合蛋白或利用权利要求7或8所述制备方法制备得到的融合蛋白在延缓干细胞衰老中的应用。