JPH03502935A - 組換え的に調製された官能的な合成タンパク質ポリマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 え・にｆｉＪＪ　　　た　　・な ム　　ンパク　ポ１７− ゛　る　　のクロス−！ファレンス 本出願は、１９８６年１１月４日に出願された出願番号第９２７．２５８号の一 部継続出願である、１９８７年１０月２９日に出願された出願番号第１１４，６ １８号の一部継続出願である、１９８８年１１月９日に出願された出願番号第２ ６９，４２９号の一部継続出願である。 庄−一輪 狡歪立訪 本発明は、生物学的及び化学的活性構造ポリマーに基づくアミノ酸の高分子量ポ リマーの調製に関する。 ■−−景 組換えＤＮＡ技法は、天然の遺伝子の単離及び種々の宿主細胞におけるそれらの 遺伝子の発現に適用されて来た。典型的には、この技法は、生物学的活性ポリペ プチド、たとえばインターフェロン又はペプチドホルモン（これらは、他の手段 によりを用な量、生成するためには実用的でない）の生成に利用されて来た。天 然の遺伝子を単離し、−１／　　ビトロで部位特異的突然変異誘発の技法を用い て、これらの遺伝子を変え、そしてそれによって生成されるポリペプチドを変更 することによって、変性されたタンパク質を生成することもまた可能である。他 のポリペプチドは、いくつかの天然に存在しない分子のキメラ分子である新規の ポリペプチドを生成するために種々の天然の遺伝子の断片を組合すことによって 創造されて来た。 ＤＮＡの化学合成のための効果的且つ自動化された方法の出現により、完全な遺 伝子を合成し、そしてその合成の間、意思によりそのような合成遺伝子を変性す ることが可能になって来た。しかしながら、これらの種々の技法は、天然のポリ ペプチドの天然の又は変性された変種の生成に適用されて来た。これらの技法を 用いて、実質的に新規のポリペプチドを創造するひじょうに少ない試みが存在す る。天然において、ポリペプチドは、広範囲の化学的、物理的及び生理学的特徴 を有する。それにもかかわらず、既知の天然に存在するポリペプチドが適切でな い商業的な用途が存在する。 生物技法は多方面にわたっているが、通常、それは天然に存在する生成物又は天 然に存在する分子の変性へのその適用に制限されて来た。対照的に、有機化学合 成の１つの大きな強さは、安価な炭素材料を広範囲のポリマー分子、たとえば天 然に存在する分子、但し、最っとも重要なことには、完全に新規の化学構造物、 たとえばポリプロピレン及びポリアクリレート（天然に存在する分子と関係しな い限定的且つ予測される化学性質を存する）への転換能力である。 そのような材料、特にアミノ酸の反復配列を含む高分子量ポリマーは、生化学的 手段により生成するのは難かしいことがわかった。アミノ酸の反復単位を含む大 きなペプチドを生成するのに必要な遺伝子は、不安定であり、そしてしばしば、 遺伝子における反復単位の欠失を引き起こす分子間組換えを受ける。有機合成に より利用できる生物学的工程に類似する工程によりポリマー分子を生成する生物 工学の進歩は、生物工学の適用の範囲を有意に広くするであろう。 ゛　　　　の　　　な− 縦に並んだ４個までの複数のラクトースオペロンのクローニングは、５ａｄｌｅ ｒ７！　ｅ　、、　Ｇｅｎｅ、　（１９８０）旦：２７９〜３００により開示さ れる。高い反復性のサテライ１−ＤＮＡを含むハイブリッド細菌プラスミドは、 Ｂｒｕｔｌａｇ　ｆｌｅ、、　Ｃｅ１１．　　（１９７７）Ｈ１５０９〜５１９ により開示される。細菌におけるポリ（アスパルチル−フェニルアラニン）の合 成が、Ｄｏｅ１７ｊ＆、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　 　（１９８０）旦：　４５７５〜４５９２により開示される。 プロリンポリマーの生成をコードするプラスミドをクローニングすることにより プロリン含有量を富化するための方法は、Ｋａｎｇａｓ星り、、釦吐印ｄ　ａｎ 虹堕畦匹阻明狂り肚躾吐凰旦■。 （１９８２）４３　：　　６２９〜６３５により開示された。プラスミドレプリ コン内に安定して維持され得る高い反復性ＤＮＡ配列の長さに対する生物学的制 限が、Ｇｕｐｔａ　ｆｌよ、、旦し６重山庶匡旺。 ６０２〜６０９ページ、９月、１９８３により論議される。 １１食！ｈ 構造成分（該構造成分は、特定の機能能力を有する異なったアミノ酸配列により 分離される）を形成する、相互作用する反復性オリゴマ一単位又は鎖を有するポ リペプチドの生成のための方法及び組成物が提供される。（“鎖”とは、定序配 列を実質的に有する第二鎖と一列に並ぶことができる定序配列を意味し、たとえ ば疎水性配列は疎水性配列と一列に並び、そして親水性配列は親水性配列と一列 に並ぶ。）反復単位の成分は、環境、たとえば溶液、気体、ゲル及び同様のもの と相互作用するために介在単位の利用性を可能にする構造体を提供し、ここで前 記介在配列は、前記該と比べて他の分子と相互反応するために立体的阻害性を実 質的に有さない。 長い核酸配列は、個々の多くの反復ペプチド単位を発現する核酸オリゴマーを合 成することによって構築され、そして前記オリゴマーは、所望する長さのポリヌ クレオチドを供給するために連結される。相対的に等しく間隔を置かれて存在す る特異的制限部位を提供することによって、追加の配列が、反復鎖の間に転向又 は他の機能的な存在性を提供する部位で導入され得る。次にその得られた核酸読 み取り枠が、所望するタンパク質生成物の発現のために適切な発現ベクター中に 導入され得る。 背淀漫１」じｌ謹 鎖を形成する反復性の比較的短いアミノ酸配列単位のオリゴマーである新規ポリ ペプチドが供給され、ここで前記該は、種々の機能のためにポリペプチドの環境 に利用できる配列をもたらす異なったオリゴマ一単位により分離される。 本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、基本構造を提供するため に一列に並ぶことができる鎖を供給する。その鎖は、多かれ少なかれ直線コンホ ーメーションのタンパク質鎖セグメントであろう。その鎖は、逆に又は直接直線 をなして一列に並べられており、ここで多くの鎖が、媒体中における溶質又は成 分に近づきやすいように、核間の機能物として反復配列よりも他の配列により分 離される。それらの鎖は、天然に存在するポリマーの反復単位に主に基づかれ、 ここで前記反復単位は、一般的に、少な（とも３個のアミノ酸であり、そして同 じアミノ酸を２度包含することができる。 本発明のポリマーを用いて、種々の目的のために種々の構造体を供給することが できる。反復単位及び既知のポリマー構遺体とのそれらの関係に依存して、類領 する機械耐引張特性が達成され得、そして特定の目的のために変性され得る。 本発明のポリマーは、繊維、フィルム、膜、接着剤、エマルジョン及び同様のも のを製造するために単独で使用され得、又は前記生成物の複合材料、ラミネート 又は組合せを形成するために他の化合物又は組成物と共に使用され得る。 ポリマー中の構造的に整合された要素は、β−シート、α−ヘリックス、動的な β−螺旋形状物、コラーゲンヘリックス、タイプＩ又は■又はそれらの組合せで あり、ここで異なった配列のものであり、そして通常、整合された要素に関係し ないであろう介在要素が存在するであろう。大部分、これらの介在配列は、ルー プ又は回転状のものであろう。 本発明の遺伝子は、同じアミノ酸配列単位をコードするＤＮＡ配列のマルチマー を含んで成り、ここで異なったアミノ酸単位をコードする複数の異なったマルチ マーは、ブロックコポリマーを形成するために一緒に結合され得る。個々の単位 は、３〜３０個のアミノ酸（９〜９０ｎｔ）　、より普通には３又は４〜２５個 のアミノ酸（９〜７５ｎｔ）　、特に３又は４〜１５個のアミノ酸（９〜４５ｎ ｔ）　、より特定には３又は４〜８個のアミノ酸（９〜２４ｎｔ）を有し、通常 、同じ単位に少なくとも２度出現する同じアミノ酸（一般的に、少なくとも１つ のアミノ酸により分離される）を有する。同じアミノ酸配列をコードするマルチ マーの単位は、同じアミノ酸配列を達成するためにコドン冗長性を鯨りに、複数 のヌクレオチド配列を含むことができる。 鎖中の単位は、一般的に少なくとも約２５〜約２００個のアミノ酸、通常約２５ 〜約１００個のアミノ酸、好ましくは約３０〜７５個のアミノ酸のものであろう 。鎖を分離する他の配列は一般的に、少なくとも約４個、より普通には６個〜約 ５０個、通常約３０個、より好ましくは約２０個のアミノ酸を有し、ここでより 長い配列は、ＮからＣの方向に鎖の整合を伴って、平行でない鎖よりもむしろ平 行な鎖と関連される。 大部分、本発明のＮＡ組成物は、下記式により示され：Ｋｍ（Ｗ（Ｍ）Ｊｘ（Ｎ ）ｒＹｙ）＝Ｌ＃ここで： には、約１〜１００個、通常１〜６０個のアミノ酸のアミノ酸配列をコードする ＤＮＡ配列であり、アミノ酸の合計数の約２０％よりも少ない、より一般的には 約１０％よりも少ないいづれかの配列であり、そして特に、マルチマー構造遺伝 子が読み枠を整合して他のＤＮＡ配列に融合されている天然に存在する配列であ り（Ｋは開始メチオニンコドンを有するであろう。）； には０又は１であり； Ｗは下記式を有し： Ａは、配列に少な（とも２度出現するように、少なくとも１個のアミノ酸を通常 有する同じアミノ酸配列単位を、それが出現するごとにコードするＤＮＡ配列で あり、ここでＡは一般的に約９個のヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、より普 通には約９又は１２個〜７５個のヌクレオチド、好ましくは約９又は１２〜４５ 個のｎｔ、より好ましくは約９又は１２〜２４個のｎｔのものであり； ここで、少なくとも２個の異なったＡ〜通常１０個の異なったＡ、より普通には ６個の異なったＡが存在し、そしてこれらは同じアミノ酸配列をコードするが、 しかし少なくとも１つのヌクレオチドでお互い異なり、そして１０個はどのヌク レオチドで異なり、通常約５個以上のヌクレオチドにより他のＡ配列と異ならず 、それぞれの異なったＡは通常、少なくとも２度反復され；少なくとも２個の異 なったコドンたとえばＧＧＣ及びＧＧＡが、同じアミノ酸配列単位をコードする 異なったＡにおいて、同じアミノ酸のために、たとえばグリシンのために使用さ れ； ｎは、少なくとも２、通常少なくとも約８〜約２５０、通常的２００、時々約１ ２５であり、そして多くの場合、約５０を越えず； Ｂは、Ａ単位によりコードされるアミノ酸配列単位以外のアミノ酸配列をコード するＡと異なったＤＮＡ配列であり、そしてＡ単位のオリゴマー間で結合単位と して作用しくＢは、一般的に約３〜４５個のｎｔ（１〜１５個のアミノ酸）、よ り普通には約３〜３０個のｎｔ（１〜１０個のアミノ酸）を有するであろう）； ここで、遺伝子に出現するＢ単位は同じであっても良く又は異なっても良く、通 常約１０個よりも多くない異なったＢ単位、より普通には約５個よりも多くない 異なったＢ単位が存在し、ここでＢ単位は１〜４５個のｎｔ、より普通には約１ 〜１５個のｎｔで異なり、ここでそれらの異なったＢは、同じか又は異なったア ミノ酸配列をコードすることができ７ＰはＯ又はｌであり、そして連続したＡ単 位が存在することに異なり ９は少なくとも１の整数であり、そしてＡ及びＢにおけるヌクレオチドの数、及 びｎ及びｐの値により変化し、可変性ｑは、構造遺伝子のマルチマ一部分のため に少なくとも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５０個のｎｔ、 より好ましくは少なくとも４５０個のｎｔ及び最っとも好ましくは少なくとも９ ００個のヌクレオチドを供給するために選択され、そしてヌクレオチドの数は、 通常、約１０，０００個を越えず、より普通には約８．０００個を越えず、一般 的に、約９００〜６．０ＱＯ個、より普通には約５，０００個までの範囲で存在 し；そしてＭは、３〜１５０個のｎｔ、通常６〜９０個のｎｔのＤＮＡヌクレオ チド配列であり、通常、生物学的又は化学的機能又は活性をもたらす天然又は合 成の配列を供給する官能配列をコードするいづれかのアミノ酸配列をコードする ことができ；ｍ及びｆは同じであっても良く又は異なっていても良く、官能基が ポリマー中に存在するかいづれかに依存して０〜３、通常Ｏ〜２であり、異なる 場合、通常１〜２であり、それらの同じ又は類似する官能基は隣接した態様で組 合され得、ＸはＷと同じであっても良く又は異なっていても良く、通常異なって おり、そして下記式を有し：［（Ａ’）、、１　（Ｂ’）ｐＩ］ｎｔここで： Ａ’ｌ　Ｂ　’＊　ｎ　’＋　ｐ　’及びｑｔはそれぞれＡ、Ｂ、ｎ、ｐ及びｑ と同じあっても良く又は異なっていても良く、少なくとも１つは異なっており、 ここで類似する記号はそれらの対応するものと同じ定義内にあり； ＸはＯ又は１であり； Ｎは、Ｍと同じであっても良く又は異なっていても良く、そしてＭと同じ定義内 であり； ＹはＷと同じであっても良く又は異なっていても良く、通常異なっており、そし て下記式を有し：［（Ａ”）、よ（Ｂ”）　ｐｚｌ。 ここで： Ａ　”、　Ｂ　”１　ｎ　”１　ｐ　”及びｑｔはそれぞれＡ　、　Ｂ　、　ｎ 　、　ｐ及びｑと同じであっても良く又は異なっていても良く、少なくとも１つ は異なっており、ここで類似する記号はそれらの対応するものと同じ定義内にあ り； ｙは０又は１であり； ＬはＫと同じであっても良く又は異なっていても良く、Ｋの定義内にあるが、し かし開始メチオニンコドンを欠き；ｉはＯ又は１であり； ｉは１〜１００、通常１〜５０、より普通には１〜３０であり、特にＸ及びｙが ０である場合、１であり；Ｘ又はｙが１である場合、ｑ　、　ｑ’及びｑｔは合 計少なくとも２、通常少なくとも５〜約５０、通常的３０であろう。 ヌクレオチドの合計数は、少なくとも９０個、通常少なくとも約１５０個、好ま しくは少なくとも約９００個のｎｔであり、そして２０Ｋｎ　ｔ　（キロヌクレ オチド）、通常約１５ｎｔ以下、より普通には約１０Ｋｎｔ以下である。 上記ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、下記式を有し： Ｋｋ’　　（Ｗ’　　Ｍ’　　Ｘ、’　　Ｎ’　　Ｙア′　）五り、　　１ここ で： Ｗ′は次の式を有し： ［（Ｄ）　、　（Ｅ）　ｐ］　＊ ここで：ＤはＡによりコードされるアミノ酸配列であり、そして従って、１個の アミノ酸をコードするコドンを定義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な限 界を有し；ＥはＢによりコードされるアミノ酸配列であり、そしてコドンを定義 する３個のヌクレオチドに基づいて数的な限界を有し、ここで個々のＥは、Ｂの コードに依存して、同じであっても良く又は異なっていても良く； そして、ここで、同様のＫ　Ｉ　　、　Ｗ　ｌ　　、　Ｍ　／　　、　Ｘ　／　 　、　Ｎ　’　　。 Ｙ′及びＬ′は、それぞれに、Ｗ、Ｍ、Ｘ、Ｎ、Ｙ及びＬによりコードされるア ミノ酸配列である。しかしながら、Ｋ及びＬの場合、続くプロセッシング、たと えばプロテアーゼ処理、臭化シアン処理、等が、Ｎ−又はＣ−末端非マルチマー 鎖の一部又は完全な除去をもたらすことができる。 ｎ、ｐ、ｑ、に、ｉ及びｌは、前に示されたのと同じ定義を有する。 同じ組成物（Ａ）を有する反復マルチマ一単位を有する特定のポリマー組成物は 、Ｘ及びｙがＯである下記式を有し二Ｋｋ’　［（Ｄ）−（Ｅ）ＰＩＪ＃　’こ こで、すべての記号は前で定義された通りであり：そして ＤＮＡ配列は下記式を有し： Ｋｋ　　［（八）−（Ｂ）−］　ＪＪ ここで、すべての記号は前で定義された通りである。 ２〜３個のマルチマーブロックの反復単位を有するコポリマー組成物をコードす る特定のＤＮＡ配列は、下記式を有し：Ｌ　（Ｗ”　Ｍ”　Ｘ”　Ｎ”　Ｙｙ” 　）　＝　”　Ｌｌここで、Ｗ　ＩＩは下記式を有し： ［（Ａ”）、３（ａ’）、ｓＬｚ’ ここでＡ３は４〜８、通常４〜６個のコドンのものであり、さもなければＡの定 義内にあり； Ｂ３は２〜１２、通常２〜１０であり；Ｂ３は２〜８、通常４〜６個のコドンの ものであり；ｐ３は０又は１であり； ｑコは約２〜２５、通常２〜２０であり；Ｘ″及びｙ　／／はＷ　ｒｒと同じで あっても良く又は異なっていても良く、Ｗ″と同じ定義内にあり： Ｍ　／／及びＮ　ＯはＭ′及びＮ′の定義内にあり；ｉ　ＩＩは少なくとも２、 通常少なくとも５〜約７５、通常的５０、一般的に３０であり； そして他の記号は前で定義された通りである。 たった１つのマルチマータイプが存在する場合、好ましい式は、下記式に単純化 され： に工（Ｗ”（Ｍ”）、、）ｉヵＩ、”１　ｍここで−に′″は、約１〜８０個の アミノ酸、通常１〜５０個のアミノ酸のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列で あり、一般的にアミノ酸の合計数の約２０％よりも少なく、より一般的にはアミ ノ酸の合計数の約１０％よりも少なく、そして特に、マルチマー構造遺伝子が読 み枠を整合して他のＤＮＡ配列に融合されている天然に存在する配列であり、存 在するなら、Ｋ”は開始メチオニンコドンであり； に０は０又は１であり； Ｗｌは下記式を有し： ［（Ａ”）　、、　（Ｂ”）　ｐ、］　、。 ここで： Ａ”は、配列に少なくとも２度出現するように、少なくとも１個のアミノ酸を通 常有する同じアミノ酸配列単位を、それが出現するごとにコードするＤＮＡ配列 であり、ここでＡは一般的に約９個のヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、より 普通には約９又は１２個〜７５個のヌクレオチド、好ましくは約９又は１２〜４ ５個のｎｔ、より好ましくは約９又は１２〜２４個のｎｔのものであり； Ａ”は同じであっても良く又は異なっていても良く；便利には、２個の異なった Ａ′″、通常６個以下の異なった八〇が存在し、同じアミノ酸配列をコードする が、しかし少なくとも１個のヌクレオチドによりお互い異なり、そして１０個は どのヌクレオチドにより異なることができ、通常、約５個以上のヌクレオチドに より他のＡ“配列と異なることができず、個々の異なったＡｏは通常、少なくと も２度、反復され；多くの場合、同じ単位における同じアミノ酸、たとえばグリ シンのために使用される２個の異なったコドン、ＧＧＣ及びＧＧＡを使用するこ とが好都合であり；ｎｏは、少なくとも２、通常少なくとも約４〜約５０、通常 的４０、時々約３５であり、そして多くの場合、約１０を越えず、Ｂ”は、Ａ１ 単位によりコードされるアミノ酸配列単位以外のアミノ酸配列をコードするＡと 異なったＤＮＡ配列であり、そしてＡ８単位のオリゴマー間で結合単位として作 用しくＢ”は、一般的に約３〜４５個のｎｔ（１〜１５個のアミノ酸）、より普 通には約３〜３０個のｎｔ（１〜１０個のアミノ酸）を有するであろう）； ここで、遺伝子に出現するＢ９単位は同じであっても良く又は異なっても良く、 通常約１０個よりも多くない異なったＢ＊単位、より普通には約５個よりも多く ない異なったＢ８単位が存在し、ここでＢ単位は１〜４５個のｎｔ、より普通に は約１〜１５個のｎｔで異なり、ここでそれらの異なったＢ１は、同じか又は異 なったアミノ酸配列をコードすることができ；ｐ＊はＯ又は１であり、そして連 続した（Ａ”）、１．単位が存在することに異なり； ｑｏは少なくとも１の整数であり、そしてＡ１及びＢ１におけるヌクレオチドの 数、及びｎ“及びｐ９の値により変化し、可変性ｑ＊は、その鎖のために少なく とも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１２９個のｎｔ、より好ま しくは少なくとも５００個のｎｔ及び通常約５０１個以下のｎｔを供給するため に選択され、 Ｍ′″は、少なくとも９個のｎｔ、通常約１５個のｎｔ〜約１５０個（７）　ｎ 　ｔ　、通常約９０個のｎｔ、通常約９〜９０個のｎｔのヌクレオチド配列であ り； Ｂ９は１〜３、通常１〜２であり、ここでＭｌは同じであっても良く又は異なっ ていても良く； ビは少なくとも２〜１００、通常的５０、好ましくは少なくとも約３〜約３０で あり； 個々の１１番目の単位のために、ｍ“は０又は上記に示されたような整数であり 、Ｍ′の合計数が１からｉに変化できるように、少なくとも１単位のための整数 であり；Ｌｏはに１の定義内にあり、但し、Ｌｏは開始メチオニンコドンを有さ ず； ２“は０又は１である。 ヌクレオチドの合計数は、少なくとも１３２個のｎｔ、通常少なくとも９００個 のｎｔ〜約１０．０００個のｎｔ、通常的５，０００個のｎｔである。 上記ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、次の式を有し： Ｋ”ｍ−（Ｗ”（Ｍ”、−））ｉゆＬ＄５゜ここで： Ｗ″″は次の弐を有し： Ｄ”は、Ａ′″によりコードされるアミノ酸配列であり、そして従って、１個の アミノ酸をコードするコドンを定義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な制 限を有し；Ｅｏは、Ｂｏによりコードされるアミノ酸配列であり、そして従って 、コドンを定義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な制限を存し、ここで個 々のＥは、Ｂのコードに依存して同じであっても良く又は異なっていても良く； Ｋ　Ｂ６　、１．　Ｂ１１及びＭ″″は、Ｋ”、Ｌ”及びＭｌによりコードされ るアミノ酸配列であり、そして従って、１個のアミノ酸をコードするコドンを定 義する３個のヌクレオチドに基づいて数的な制限を有し；に１は１〜１００個の アミノ酸のものであり、任意に開始メチオニンを含み、そしてＬは１〜１００個 のアミノ酸のものであり、そしてＭ”は３〜５０個のアミノ酸のものであり、特 に天然に存在する配列を含み；そしてｋ”　　、１”　、ｍ”　、ｉ”　　、ｎ ”　　、ｐ”及びｑｌはすでに定義されている。 本発明の組成物は０通常、少なくとも約３にドルトン、通常５にドルトン、時々 少な（とも１５にドルトンの分子量を有し、そして５００にドルトンはどの高さ の、通常３００にドルトンを越えない、より普通には約２５０にドルトンを越え ない分子量を有する。 コポリマー、特にブロックコポリマーが調製され得る。そのコポリマーは、ポリ マーの化学的及び物理的、たとえば機械的性質を調節することに高い柔軟性を付 与することに種々の利点を提供し、適切な機能を導入し、そして異なった反復単 位間の相互作用により独特の化学的及び物理的性質を生成することができる。 通常使用されるマルチマーの組合せは、たとえば次の通りである：　（（Ａ’″ ）、、（Ｂｂ）、）、　、ここで記号Ａ、Ｂ、ｎ、ｐ及ｑは前で定義された通り であり、そしてａ及びｂは、異なったマルチマーが関与されることを示し、ここ でａ及びｂは１〜３の範囲であり、そしてａ及びｂは同じ数に等しくても良い。 これは、Ａ１及びＢＩが、他のそれぞれのＡ′及びＢ′のように、関係されるこ とを意味する。 組合せは、柔軟性を高めるために硬質及び軟質グループを用いること、絹及びエ ラスチンマルチマーの組合せ、表面に強い結合を付与するために接着剤様タンパ ク質を導入することによって、コラーゲンの構造性質に変化を付与すること、又 は同様のものを包含する。 コポリマーは通常、少なくとも約５にドルトン、より普通にはＩＯＫドルトン〜 通常約５００　Ｋドルトン、より普通には３００にドルトンの分子量を有するで あろう。 整合されていない配列は、マルチマー内に同じであっても良く又は異なっていて も良く、又は異なったマルチマーにおいて同じか又は異なった整合配列のもので あり得る。 使用されるヌクレオチド配列は、反復単位が上記のように同じアミノ酸のために 異なったコドンを有するように、合成されるであろう。通常、少なくとも約２５ ％、より普通には少なくとも約４０％及び一般的に少なくとも約６０％〜約９５ ％、好ましくは約９０％の、反復単位をコードするヌクレオチド配列が同じであ ろう。初期構造物が自発的な組換えでき事を受けるために実験的に示される、こ れらの範囲内に高い変化が用いられるであろう。 種々の天然タンパク質は、反復構造体、たとえばＣ−Ｘ−Ｙ（ここでＸはいづれ かのアミノ酸、しばしばａｌａ又はｐｒ。 に等しくそしてＹはいづれかのアミノ酸、しばしばｐｒｏ又はヒドロキシ−ｐｒ ｏに等しい）反復単位を有するコラーゲン、ＶＰＧＧ、　ＶＰＧＶＧＡ及び／又 はＡＰＧＶＧＶ単位を有するエラスチン、疎水性脂肪族又は芳香族残基により一 貫して占められる位置１及び４を有する７個のアミノ酸のオリゴペプチド、たと えばＡＫＬＫＬＡＥ又はＡＫＬＥＬＡＥから成る、いわゆる“七個−組”の反復 単位を有するケラチン及び配列、 Ａ−に−Ｐ−Ｐ”−５−Ｔ−Ｙ−Ｘ−Ｐ−Ｐ”−Ｐ−５−Ｔ−Ｙ−Ｘ−Ｋ　（Ｐ “はヒドロキシプロリンであり、そしてＸは芳香族アミノ酸、特にＬ−ｄｏｐａ であり；アメリカ特許第４．５８５．５８５号及び第４，６８７．７４０号を参 照のこと）内にあるデカペプチド又はヘキサデカペプチドと付着するムセル（ｍ ｔ＋５Ｓｅｌ）を有する。反復単位は、個々に又は組合して使用され得、ここで 個々の単位は特定のパターンで変えられ、又は個々の鎖が供給され得る。 反復単位として５ＧＡＧＡＧ　（Ｃ，−グリシン、Ａ＝アラニン：Ｓ＝セリン） を有するポリペプチドが、特に興味の対照である。 この反復単位は、天然に存在する絹フイブロインタンパク質に見出され、そして これはＧＡＧＡＧ（ＳＧＡＧＡＧ）ｓＳＧＡＡＧＹ　（Ｙ　＝チロンシ）として 示される。 核間の介在オリゴマー又は変動体（ｔｕｒｎｓ）に関しては、種々の配列が、ポ リマーの所望する目的に依存して使用され得る。従って、その介在配列は、整合 されておらず、柔軟であり、接近性であり、官能性であり又はそれらの組合せを 有する。従って、その鎖配列に関連する介在配列は、形成され、二次加工され、 押出され、紡糸され、織られ、被覆され又は同様にされ得る広範囲の種類の生成 物を供給するように企画され得る。介在配列は、リガンドを供給し、そして抗体 、天然に存在する受容体、非アミノ酸分子又は同様のものを結合するように作用 することができる。この場合、ポリマー構遺体は、アフィニティーカラムとして 作用する広範囲の種類の分子を特異的に結合するために使用され得、そして診断 、センサー、細胞分離、抗トロンポン形成性質を有する装置被膜、細胞支持体同 様のものに使用される。 介在配列は、化学的架橋部位のために化学的活性アミノ酸を供給し、そして官能 ペプチド、合成又は天然のポリマー又はタンパク質、非アミノ酸分子及び同様の ものを共有結合するように作用することができる。介在配列は、天然に存在する 配列又は変性された天然に存在する配列である。天然に存在する配列は、種々の 機能を有する広範囲の種類の源に由来する。そのような配列は、たとえばテナス シン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）からの細胞増殖阻害配列（Ｃｈｉｑｕｅｔ−Ｅｈｒｉ ｓｍａｎｎＺ＆、＋　（１９８Ｂ）Ｃｅｌ１５３　：　３８３〜３９０）　；　 ７　イブロネクチン（−ＲＧＤ−、−ＲＥＤＶ−）からの細胞増殖促進付着因子 ；　Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ　ｆｔｅ、＋　（１９８８）　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｔｏｌ　 ：　１０３　：　２６３７〜２６４７）フィブロネクチン（−ＲＧＤ−）　：　 ５ｕｚｕｋｉ星煮、、　（１９８５）ＥＭＢＯ，Ｊ、　４　：　２５１９〜２５ ２４　）ラミニンＢ１（−ＹＩＧＳＲ）　；　ＷＯ３９１０３３９２、コラーゲ ン；　Ｇｒａｆ　ｆｉｌ　ｅ　、　、　（１９８７）堡旦弧：９８９〜９９６、 ビトロネクチン（−ＸＡＰ−）　：細菌接着側（−ＳＬＦ、　−ＡＩＦ−）（Ｊ ａｃｏｂｓ星＆、、　（１９Ｂ？）　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ■皿ニア３５〜 ７４１）　；成長ホルモン及びインシュリン；細胞機能活性剤、たとえば主な組 織適合性複合体抗原、クラス■及び■、特にα１．α２．β１、及びβ２領域、 たとえばＨＬＡ−Ａ２アミノ酸５０〜８０及び１４０〜１７０（Ｂｊｏｒｋｗ＋ ａｎ７７＆、、　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２９　：５１２〜５１８）及 びＨＬＡ　−Ｄアミノ酸１〜９０　（Ｔｏｄｄ７！と＋ｌ　　（１９８８）Ｓｃ ｉｅｎｃｅ　２４０　：　１００３〜１００９）　　；増殖因子ドメイン、たと えばＥＧＦ、　ＴＧＦ及びＶＧＦ、　ｆＬ−１〜８、特に−２及び−４、及びエ リトロポエチン；ウィルス付着配列、たとえばヒトＣＤ４アミノ酸３５〜６０（ ＣＩａｙｔｏｎ星＆、、　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３５　：　３６３〜 ３６６）非タンパク質分子の結合を促進する配列、たとえばビトロネクチンのヘ パリン結合ドメイン、金属結合ドメイン、たとえばメタロチオネイン、グルコー ス及び他の糖結合ドメイン、たとえばレクチン、毒素、たとえばアブリン、リシ ン及びジフテリア毒素のＢ鎖、サフラトキシン又はそれらのフラグメント、等、 及び解毒のための毒物又は毒素結合ドメイン；及び翻訳後変性のための化学的活 性アミノ酸又はアミノ酸配列、たとえばＮ−結合グリコシル化のためのＮ−Ｘ− ３及び化学的変性のためのアミノ酸、Ｃ，Ｍ、Ｈ，に、Ｒ，Ｄ、Ｅ、Ｗ。 Ｆ、Ｙ、Ｎ及びＱであり得る。 介在配列とし°この特定の興味の配列は次のものを含む：ＤＰＧＫＧＸＹ ここでＸ及びＹの少なくとも１つはＣであり；ＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡＧＹ　。 ＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫ及び ＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ　　； ここで保存性置換が官能部位以外で作られ得る。 システィン生成物に関しては、マルチマ一単位に２又は３個のシスティン、好ま しはマルチマ一単位のそれぞれの末端に隣接するシスティンを有することが所望 されるであろう。 化学的切断のためには、ジペプチドＤＰ又はＥＰが所望される。 対象の他の配列は、微生物、たとえばウィルス、細菌、菌類及び原生動物のエピ トープ、リン酸化部位、ペプチダーゼ認識部位又は同様のものである。 介在配列を有する反復単位を含むコポリマーの調製における遺伝子工学の使用は 、異なった単位、個々のマルチマーにおける単位の数、それらの間の空間及びマ ルチマー組合せアセンブリーの反復体の数の適切な選択により、性質を変えるた めの強力な方法である。従って、主要マルチマーの数及び配置を変えることによ って、種々の異なった物理的及び化学的性質が達成され得る。 ブロックコポリマーの使用の例は、同じモノマ一単位のみを有するポリマーとは 異なる性質を有する生成物を供給するために、組単位及びエラスチン単位の組合 せである。 構造遺伝子を調製するためには、種々のアプローチが使用され得る。オリゴマー を調製するためには、ＤＮＡの相補的類が合成され、その結果、ハイブリダイゼ ーションに基づいて、適切な末端を有する二本鎖ＤＮＡが得られる。所望により 、個々のオリゴマ一単位は同じであり、その結果、単一段階で、コンカテマーが ハイブリダイゼーションの条件に依存して得られる。通常、次の例に記載されて いるような従来のアニーリング及び連結条件が使用されるであろう。 所望により、２種の異なったオリゴマ一単位が調製され、ここでそれらの２種の 単位の末端は他の端と相補的な末端であるが、しかし同じ単位の末端は、−緒に 結合することができない。この方法で、個々のオリゴマ一単位を構築し、そして 次に、それらを−緒に結合し、コンカテマーを形成することができ、ここで介在 結合配列がそれらの末端により少なくとも一部、定義される。構造物に依存して 、５′末端が、開始コドンメチオニンを提供し、又は構造遺伝子が５′末端でユ ニーク配列（場合によっては、酵素的又は化学的処理により切断され得る）を供 給することができるアダプターに連結され得、又は融合生成物を供給するために 、宿主に通常内在する遺伝子の部分に読み枠を整合して挿入され得る。アダプタ ー又は切断された遺伝子と対象の構造遺伝子の５′末端との間に適切な相補的末 端を供給することによって、配列は、所望するタンパク質を供給するために読み 枠を整合して連結され得る。アダプター又は融合タンパク質を用いることによっ て達成され得る利点は、特別な目的、たとえば結合、分泌、他のタンパク質との 複合体形成、アフィニティー精製又は同様のもののために特異的配列を有するこ とを包含する。その３′領域は、類似する機能を付与するために一同様にして変 性され得る。 構造遺伝子がいったんアセンブリーされた後、すぐにそれはクローン化され得； 特に配列の長さに関して、所望する遺伝子を有するクローンが単離され得；そし てその遺伝子が除かれ、そして発現のための配列に連結するために使用され得る 。 発現構造体は、構造遺伝子の転写及び翻訳開始及び終結間Ｍ’ｐＨ域５′及び３ ′をそれぞれ含むであろう。すでに示されたよ・うに、これらの領域は、融合タ ンパク質を用いることによって創造され、ここで対象の構造遺伝子が、その開始 コドンから下流で及びその開始コドンと読み枠を整合して、異なった構造遺伝子 中に挿入される。他方、発現宿主に使用するための広範囲の種類の遺伝子からの 種々の転写及び翻訳開始領域が利用され、その結果、これらの転写及び翻訳開始 領域が、対象の構造遺伝子の転写及び翻訳開始を付与するために対象の構造遺伝 子に連結され得る。転写開始領域として同じ遺伝子から又は異なった遺伝子から である広範囲の種類の終結領域が利用できる。多くの構造体が文献に開示されて おり、そしてそれらの同じ方法が、対象の遺伝子に適用され、そして他の構造遺 伝子と共に使用されて来た。 誘発性転写開始領域の使用が特に興味の対象である。この場合、宿主株は、所望 する生成物の有意な発現の前、高い密度に増殖せしめられ得る。誘発性転写の提 供は、ペプチドが宿主より分泌されるよりもむしろ細胞宿主に保持される場合、 特に有用である。 多くの誘発性転写開始領域が存在し、又は特定の情況に使用され得る。誘発性領 域は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を誘発するために特定の化学物質、たとえば イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）により制御され得る。他の誘発性領 域は、左及び右のλプロモーター；種々のアミノ酸ポリシストロン、たとえばヒ スチジン及びトリプトファン；温度感受性プロモーター；及び調節遺伝子、たと えばｃＩ”８５７を包含する。 都合良く使用され得る他のシステムは、転写開始領域の組合せの使用である。所 望する遺伝子の発現を調節するが、しかし内在性ＲＮＡポリマラーゼと共に機能 しないことによって発現宿主において機能性でない第一転写開始領域が使用され る。次に、第二転写開始領域、たとえば誘発性領域がＲＮＡポリマラーゼの発現 を調節するために使用され、これにより、前記第一転写開始領域が官能的になる 。この場合、発現は、外来性ＲＮＡポリマラーゼの発現を制御する調節領域の活 性化に基づいてのみ生じる。このシステムは、Ｔ７フアージ転写開始領域、特に Ｔ７フアージの遺伝子９及び１０の開始領域により例示され得る。 他のシステムは、環境、たとえば栄養物の欠乏、温度、浸透圧、塩度又は同様の ものの変化に基づく環境変化を受ける突然変異体の使用に頼る。このシステムを 例示すると、胞子形成することができるが、しかし胞子形成に関与される生成物 の発現を開始せしめるこれらの成分を生成することができるＢ工」コ（九ユノヨ （Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）の株が得られる。従って、培地の条件の変化により、 胞子形成に関係する転写開始領域が活性化されるであろう。この情況において、 宿主は、発現を開始するために、必要な誘発性物質又は活性化物質を供給する。 特定の宿において遺伝子の転写及び翻訳の誘発性調節を提供するための種々の他 の技法が存在する。 大部分、宿主は、細菌、藻類、菌類、繊毛菌類、植物又は動物組織培養細胞、等 から選択された単細胞生物、たとえば原核生物又は真核生物であろう。代表的な 宿主は、Ｅ、コリＣＨＯ細胞、Ｈｅ１ａ細胞、等を包含する。他方、完全な植物 も使用され得る。 単独で又は転写に関与するいづれかの補助遺伝子と共に、所望する遺伝子の発現 のための発現構造体が、通常、発現宿主中への導入のために適切なベクターに連 結されるであろう。 多数のベクターが商業的に入手できる。それらのベクターは、１又は複数のユニ ーク制限部位、宿主における染色体外維持のための複製システム及び宿主に対す る選択的圧力を可能にする１又は複数のマーカーを有することによって通常、特 徴づけられる。マーカーは、相補性、栄養要求性宿主への原栄養性、生物殺生物 質、たとえば抗生物質、たとえばペニシリン又はカナマイシンに対する耐性又は 同様のものを提供することができる。多くの場合、選択的な圧力よりもむしろ、 遺伝子を含む特定のコロニーの検出を可能にするマーカー遺伝子が使用される。 この情況は、β−ガラクトシダーゼのための遺伝子により例示され、ここで着色 された生成物を供給する基質が使用される。 いづれか補助遺伝子を含む発現構造体は、既知の技法、特に制限、挿入及び連結 を用いて発現ベクター中に導入され得る。 次に、発現構造体は、適切な宿主の形質転換のために使用され得る。宿主に依存 して、損なわれていない細胞又はプロトプラストのいづれかが使用され、ここで 形質転換又は接合が行なわれる。便利には、カルシウム−リン酸塩−沈殿性ＤＮ Ａ又は非イオン性界面活性剤が、宿主中にプラスミドを導入するために使用され 得る。宿主の形質転換のためにベクターを使用する必要がないことは好ましい。 なぜならば、裸のＤＮＡがゲノム中への組込みのために導入され得るからである 。しかしながら、組込みが所望される場合でさえ、組込みの高い効率が、ベクタ ーを用いて達成され、従って、ベクターの使用が好ましい。 ベクターの性質に依存し、発現構造体は染色体外要素上に維持され又は宿主中に 組込まれるようになる。組込みが所望される場合、宿主の染色体における配列に 相同の配列を有することが、原核生物又は真核生物により通常所望されるであろ う。通常、その配列は、少なくとも約２００ｂｐ〜約５０００ｂｐ、普通には約 ２０００ｂｐであろう。相同の配列の選択は、い（分、任意であるが、しかし、 宿主が栄養要求性突然変異体であり、そしてその相同性が原栄養性を付与する場 合、相補性のために用いられ得る。 次に、形質転換体又は組込み体が、適切な栄養培地中で高密度に増殖され、続い て、発現構造体の転写システムの性質に従って、転写が誘発される。所望するタ ンパク質が細胞質に保持される場合、これらの細胞は収穫され、溶解され、そし てタンパク質の使用に依存して、タンパク質はさらに、従来の技法、たとえばク ロマトグラフィー、溶媒−溶媒抽出、アフィニティークロマトグラフィー及び同 様の技法に従って精製され得る。 次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。 実−一一一狡 Ａ、小規模。プラスミドＤＮＡを、煮沸方法又はアルカリ溶解方法（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　ｆｌｅ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｆｎｇＨａｒｂｏｒ、　（１９８２））のい づれかにより、培養物１．５　ｄから調製した。 Ｂ、大規模。プラスミド担持株を、適切な抗生物質を含むルリアブイヨン１２中 で一晩増殖せしめた。細胞を、１０．０ＯＯＸｇで５分間、遠心分離により集め 、そして氷で冷却されたＴＥ　（１０ｍＭのトリス−Ｈ（１／！、ｐｔｒａ、１ ＋ｎＭのＥＤＴＡ）　１０ｄ中に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、ＴＥＳ　 （ＴＥ及び２５％（Ｗ／Ｖ）スクロース）４ｄに再懸濁し、そして渦動すること により均質化した。サンプルを、次の段階のために氷上に保持した。リゾチーム （１０■／ｄ、ｌｄ）を、細胞懸濁液に添加し、そして５分間インキュベートし 、その後、０．５ＭのＥＤＴＡ　ＣｐＨ８）　２　ｄを添加した。１０分のイン キュベーション後、５０Ｍｌ１のブロテイナーゼＫ（４０■／Ｍ１）を添加し、 続いて１０分後、溶解緩衝液（０，１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１ｍＨの ＥＤＴＡ、　５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐ）１８）１５ｄを添加した。１５〜 ２０分後、細胞溶解物を、３５，０ＯＯＸ　ｇで９０〜１２０分間、遠心分離し た。上清液（１９，８ｄ）を、ＣｓＣ１２２０ｇ及びエチジウムプロミド（１０ ■／ｄ）４００ｍを有するプラスチック管に移した。溶解した後、その混合物を 、２つのポリアロマ−超遠心分離管に分け、熱により密封し、そして６０．００ ０ｒｐ−で２４時間、Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｔｉ６５モーターで遠心分離した。低い プラスミドＤＮＡバンドを皮下注射針により管から除いた。エチジウムプロミド を、同体積のＮａＣｌ飽和イソプロパツールにより３度、抽出した。２体積のＨ ，Ｏを、そのＤＮＡ溶液に添加し、そして次にＤＮＡをエタノールにより沈殿せ しめた。 λ　二４゛ＤＮＡのｕ、　ＪＭ　１０３の培養物を、約０．２の００６゜。に増 殖せしめ、そして次に２−のアリコートに分けた。 個々のアリコートを、Ｍ１３の新鮮なプラークにより感染せしめ、そして激しく 振盪しなから３７°Ｃで約６時間インキュベートした。次に、細胞をペレット化 し、そして上清液を続く感染のために保存した。二本鎖ファージＤＮＡを、煮沸 方法（Ｍａｎｔａｔｉｓ　星煮、）により抽出した。 ３、盈ｆｙパｆ１．フェノール抽出を、便利な体積、典型的には１００ＩＪＩ〜 １０ｄのＤＮＡサンプルに対して行なった。 ＤＮＡサンプルを、０．０１Ｍのトリス−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）　、１＋ｉＭ のＥＤＴＡ溶液に希釈し、そして同体積の水飽和フェノールを添加した。サンプ ルを、短く渦動し、そして氷上に３分間、置いた。マイクロッエージにより３分 間、遠心分離した後、水性層を新しい管に除き、そして同体積のクロロホルム： イソアミルアルコール（２４：１）により１度抽出した。 ４０．丑１２仁二王住Ｕ役。水性緩衝液中、ＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮 した。ＤＮＡサンプルに、３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７，５）　１　／１０体 積及び冷エタノール２〜３体積を添加した。ＤＮＡを一７０°Ｃで３０分間、又 は−２０°Ｃで一晩沈殿せしめ、そして次にマイクロッエージにより４　”Ｃで １５分間の遠心分離によりペレット化した。そのペレットを、冷８０％エタノー ル２００Ｉにより１度洗浄し、そして再び４°Ｃで１０分間ベレット化した。空 気乾燥又は凍結乾燥の後、そのベレットを適切な緩衝液に再懸濁した。 ５、　ＤＮＡのホスフ　　−ゼ几　。ＤＮＡのホスファターゼ処理を、ウシ小腸 ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａｅ）１ｍ（２５単位 ）を制限酵素消化反応に直接添加し、そして３７°Ｃで３０分間、インキュベー ションを続けることによって行なった。ホスファターゼを６５°Ｃで６０分間不 活性化し、その後、フェノール抽出により除タンパク質を行なった。 ６、　ＤＮＡボリマー−ゼＩによ　フィル−イン　゛。ＤＮＡを、５０ｍＭのト リス−Ｈ（／！　（ｐＨ７，４）　、５０ｍＭのＫＣｊ！、５＋ｓＭのＭｇＣｆ ｌｚ及び４００団のそれぞれ４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む緩衝液 に再懸濁した。１０単位のフレノウＤＮＡポリマラーゼ（ＢＲＬ）を添加し、そ してその反応を室温で１５分間進行せしめた。次に、ＤＮＡをフェノール抽出し 、そしてエタノール沈殿せしめた。 ７、　Ｔ４ボｌヌクレオチドキ　−ゼ　心。この反応（１０ｊ１１）は次のもの を含んだ：］゛４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）、ＤＮＡ１５０ｎｇ、１ ０×キナーゼ緩衝液（０，７Ｍのトリス−Ｈ（／！、ｐＨ７，６，０，１Ｍ　（ Ｄ　ＭｇＣｌ　ｚ、５０＋ｍＭ（７）ＤＴＴ）　１Ｊ１１及び［”Ｐｌ　−ＡＴ Ｐ（２００〜３００μＣｉ）。これを３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そ して次に、そのＤＮＡをＮＡＣＳカラム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ　）を用いて精製した。 ８、　　　エンドヌクレアーゼによる′　。ＤＮＡを、１×”　Ａ　Ａ″緩衝液 ［１０ＸＡＡ緩衝液は、３３０ｍＭのトリス−アセテート、ｐＨ７，９，６６０ ｍＭの酢酸カリウム、１００ｎ＋Ｈの酢酸マグネシウム、５０Ｍのジチオトレイ トール（ＤＴＴ）及び１■／Ｉｄのウシ血清アルブミン（ヌクレアーゼを含まな い）である〕中で、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮ　）により消化した。可能 な場合、ＤＮＡの濃度を１■／２５ｐｌ以下に維持した。インキュベーションは 、はとんどの制限エンドヌクレアーゼのために３７℃で１〜４時間であった。但 し、Ｂａｌ　Ｉ　、　Ｂａｌ　Ｉ及びＮａｅ　１消化は一晩インキュベーション が行なわれた。 ９、−叫下コ！のｆヱ諧゛ロースゲノＬ／Ｊ−気１１防。ゲル分析のためのＤＮ Ａサンプルに、０．２体積の負荷緩衝液（５×電気泳動緩衝液、０．０１％のブ ロモフェノールブルー染料、５０ｍＭのＥＤＴＡ及び５０％のグリセロール）を 添加した。次に、サンプルを、１．０％（Ｗ／Ｖ）のアガロースゲルを含む水平 浸水電気泳動のレンズ中に添加した。電気泳動緩衝液は、ＸＸＴＡＣ又は１／２ 　Ｘ　ＴＢＥのいづれかであった。ＩＸＴＡＣは、４０ＩＩＩＭのトリス−塩基 、１０ｅ＋ＭのＥＤＴＡ　（酢酸によりｐ）１７．８に調節されている）の溶液 である。ｌ／２　Ｘ　ＴＢＥは、０．０４５Ｍのトリス−塩基、０．０４５Ｍの 硼酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、、　　（ｐＨ８）である。ゲルは４０〜５０Ｖで１８ 時間、作動され、次に除去し、そして０．５ｍｒ／ｄのエチジウムプロミドによ り３０分間、染色した。ＤＮＡバンドを、長い波長のＵＶ）ランスイルミネータ ー上で可視化した。 １０、　公皇ｙガロづ」泳動。この方法及び材料は、分析用アガロースゲル電気 泳動のための方法及び材料と同じである。唯一の差異は、精製されるＤＮＡフラ グメントの大きさに依存して、０．５〜２．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度範囲の低い融 点のアガロースの使用である。ＤＮＡ制限フラグメントを、エチジウムプロミド により可視化した後、Ｌ　Ｍ　Ｐアガロースゲルから切断した。 １１、　ｎ。ＤＮＡを含むゲルフラグメントを、７０℃で５分間、溶融し、そし てＴＲＩ　（１０ｍＭのトリス−ＨＣｊ！　５ｐｉ（７，５，０，２ＭのＮａＣ ｊ！）により約５倍に希釈した。そのゲル溶液を、ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ　） に適用した。カラムを同じ緩衝液５ｔｄによた洗浄した。結合されたＤＮＡを、 １０００ｂｐよりも小さなりＮＡフラグメントのためにＴＥ　２　（１０ｍＭの トリス−Ｈ（Ｊ　、　ｐＨ７，５，１，０ＭのＮａＣ１，）　３００１又はそれ よりも大きなフラグメントのためにＴＥ　３　（１０ｍＭのトリス−ＨＣｆ、ｐ Ｈ７，５，２ＭのＮａＣｌ２）３００　ｄにより希釈した。その希釈されたＤＮ Ａを、エタノール沈殿により濃縮した。 １２、−ＤＮＡリガーゼ、付着端を連結するための反応は次のものを含んだ＝１ ■のＤＮＡ、ＩＸＡＡ緩衝液（上記段階８を参照のこと）、１＋ｍＭのＡＴＰ及 び２０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）　（最終反応体積２０ｍ中におい て）連結を、１５°Ｃで１６〜１８時間又は室温で１〜２時間、進行せしめた。 プラント末端連結のためには、その反応は、反応体積２０ｍ中に、１ｉｔｇのＤ ＮＡ、　２５ｍＭのトリス−）ＩＣ／！、ｐＨ７，５，５ｍＭの台ｇＣｊ２ｚ　 、５ｔａＭのＤ　Ｔ　Ｔ　、　０．２５ｍＭ　（７）　スヘ）レミジン、２００ ｍｇ　＜７）　Ｂ　Ｓ　Ａ　、　　Ｉ　ＮＭ（７）　へキサミンコバルトクロリ ド（ＨＣＣ）　、０．５　ＭのＡＴＰ及び４００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ ＮＥＢ　）。連結は、室温で３０分〜１時間、進行せしめられた。 のノー １、Ｍｊ］ｄ灸二コーンビーントＥ　コｔ　　のｆ′。殺菌したしブイヨン２０ ０ｄの培養物を、少量（ループいっばい）の旦−ユユ細胞により接種した。これ を、００．。。が約０．５に達するまで、３７°Ｃで振盪しながらインキュベー トした。培養物を氷上に１０分間置き、そして６．ＯＯＯＸｇで１０分間、遠心 分離した。細胞ベレットを、氷で冷却された１００ｄの０．１ＭのＭｇＣｌ　を 中に再懸濁し、３０〜４０分間、氷上に維持し、そして再び遠心分離した。その ベレットを２Ｊｄの氷により冷却された１００ｍＭのＭｇＣｌ　を中に再懸濁し 、殺菌した試験管に移し、そして２４時間、氷上でインキュベートした。次に、 コンピテント細胞をアリコートし、そして−７０℃で保存した。 ２、　　Ｅ　　コ１のノ　−　。凍結コンピテント細胞のアリコートを、氷上で 融解した。細胞５０Ｊに、０．１〜１　ｔｒｉのＤＮＡを添加し、そしてその混 合物を３０分間、氷上でインキュベートした。試験管を氷から取り出し、そして ４２°Ｃの槽中に２時間、置いた。Ｌブイヨン（ＩＩＩＩｌ）を添加し、そして その形質転換混合物を、所望する温度（通常３０゛Ｃ又は３７°Ｃ）で２時間、 振盪しながらインキュベートした。次に、形質転換物の１／１０を、適切な抗生 物質を含むしブイヨンプレート上に置き、そして必要なら、ＸＧＡＬ及びＩＰＴ Ｇを添加した。 −ンバＷ　　　びタンパク　の　　 １、　　工・にム　　れたペプチドに・　る　　の札１゜配列（ＧＡＧＡＧＳ） 　５ＧＡＡＧＹの合成ペプチドを、Ｋａｇｅｎ及びＧ１１ｃｋ（１９７９）のグ ルタルアルデヒド方法を用いてＢＳＡに結合した。 結合の程度を、少量の放射性ヨード化された合成ペプチドを用いてモニターした 。完全フロインドアジュバント中、１■／ｄの濃度でのペプチド接合体を用いて 、０日目でウサギを免疫化した。動物を、３日目で不完全フロインドアジュバン ト中、抗原により再注射し、そして６日目で力価せめした。 陽性血清を、抗原として合成ペプチドを用いるマイクロタイターＲＩＡを用いて 検出した。Ｋａｇｅｎ及びＧｌ　ｉｃｋ　（１９７９）　。 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ＋　Ｊａｆｆｅ及び Ｂｅｒ＋＊ａｎ　（出版者）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　３２８ページ を参照のこと。 ＳＬＰ　ＩＩＩ配列（Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｇ）ｓニ対応する５３個（７）７ミノ酸 のペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓａｓペプチド合成機により 調製した。 ３６×０の分子量を有するこの材料の収量は、約０．５ｇであった。そのペプチ ドをウシ血清アルブミンに結合した。この材料を、ウサギにおける抗体の調製の ためにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ。 に送った。ＳＬＰ　ＩＩＩ配列の合成ペプチドと反応した抗血清を得た。これら の抗血清は、ｇｌｙ−ａｌａ配列を含む融合ペプチドの検出のために有用であっ た。 上記方法の後、免疫原として使用するためにキーホールリンペット（Ｋｅｙｈｏ ｌｅ　ｌｔｗｐｅｔ）ヘモシアニンに結合された、配列（ＧＡＰ　［ＧＰＰ］　 ４）　ｔ　（ＣＬＰ部分）及びフィブロネクチンの式ＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧ ＤＳＰＡＳＳＫＤＩＳＩＮＹＣ（ＰＣＢ部分）を有する追加の抗原を合成した。 次に、ＰＣＢ及びＣＬＰペプチドに結合されるポリクローナル抗血清を調製した 。 ２、　　ンバク　のボ１アク１ルアミ゛ルＷ。増殖培養物からの約１０９個の旦 、且ユ細胞を、１０．０００Ｘ　ｇで５分間、遠心分離によりベレット化した。 その細胞ベレットを、２×サンプル緩衝液（１００ｍＭのトリス−Ｈｅ２、ｐＨ ６，８，４％ＳＤＳ、１０％Ｂ−メチルカプトエタノール、６０％グリセロール 又はスクロース）１００〜５００ｐ！に再懸濁し、そしてＴｅｋｍａｒ音波破壊 機を用いて３０秒間、音波処理した。サンプルを約５分間、煮沸し、そしてその 細胞破壊物２０〜１００ｉ１１を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７，５〜 １６％（Ｗ／Ｖ））上に負荷した。ゲルは、ＬａｅＩＩｎｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ 、　２７　：　８０〜６８５（１９７０））の方法に従って調製された。ゲル中 のタンパク質を、１０％メタノール、７．５％酢酸中、２％クーマシーブリリア ントブルーにより１時間、染色し、そして１０％メタノール、７．５％酢酸によ り一晩、脱色した。 ３、ル　のタンパク　のイムノプロット、タンパク質の電気泳動の後、フランギ ングガラスプレートの１つを、ポリアクリルアミドゲルから除いた。ゲル表面を 、移行用緩衝液（２５ｍＭのトリス−Ｈｅ２．１９２ｍＭのグリシン、２０％の メタノール）により湿潤した。ニトロセルロース紙片（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、　 ５Ｍ１１３０７）を、移行用緩衝液により飽和し、そしてゲル上に置いた。フィ ルターとゲルとの間の空気胞を除去した。ゲル及びニトロセルロースフィルター を、製造者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）により特定されるようにして、トランスファ一 単位に置いた。トランスファーを、２００ｍＭで３〜４時間、進行せしめた。次 に、ニトロセルロースフィルターを除き、そしてＡｍ１ｄｏ−Ｓｃｈ智ａｒｔｚ （０，０５％のアミドブラック、４５％の脱イオン水、４５％のメタノール、１ ０％の酢酸）により３分間、染色し、そして水中で脱色した。フィルターを、“ ＢＬＯＴＴＯ″（５％（Ｗ／Ｖ）の非脂肪ドライミルク、５０ｍＭのトリス−１ ’ｌｃｆ　、　ｐＨ７，４，０，９％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣ１，０，２％（ｗ／ｖ 　）のアジ化ナトリウム）中において室温で少なくとも１０分間インキュベート した。フィルターを、０．５　ＸＢｌｏｔｔｏ　（２，５％の非脂肪ドライミル ク、５０１のトリス−ＨＣｊ＃ｐＨ７，４，０，９％のＮａＣ／！、０．２％の アジ化ナトリウム）中に希釈された血清（１：５０〜１：５００）中に置き、そ して約１６時間、室温で軽く撹拌した。そのフィルターを、Ｔ　Ｓ　Ａ　（５０ ＋＋Ｈのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，０，９％のＮａＣｊ２．０．２％のアジ 化ナトリウム）により５回、１時間洗浄した。 プロットを、Ｉ　Ｘ１０’ｃｐ＠の１２ＳＩ−プロティンＡを含む０．５ｘ　Ｂ ＬＯＴＴＯ溶液１５ｄ中に置き、そして室温で２時間、軽く撹拌した。そのフィ ルターを、ＴＳＡにより最少７回、２時間洗浄し、脱イオン水により１度すすぎ 、そして空気乾燥せしめた。プロットをサランラップにより被覆し、オートラジ オグラフィー処理した。 ４．１ま左直立捉。アミノ酸組成物を、Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ及びＭｅｒｅｄｉ 　ｔｈ　（１９８４）のＰＴＣ誘導方法により決定した。タンパク質サンプルを 、１０８℃での５．７Ｎの一定の煮沸ＨＣｆにより２４時間、真空下で加水分解 した。ＰＩＴＣとの反応の後、アミノ酸誘導体を、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａ ｒｄ　１０９０システム及び移動性基礎として０．１　ＭのＮＨ４０ＡＣ（ｐＨ ６−７８）中、０〜５０％のアセトニトリルの線状グラジェントによる５ｕｐｅ ｌｃｏ　Ｃ１８カラム（４，６ｗｘ２５ｃｍ＋）を用いてＨＰＬＣ逆相クロマト グラフィーにより２５４ｎａ＋で検出した。Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｒ，［、 、及びＭｅｒｅｄｉｔｈ、　Ｓ、Ｃ，（１９８４）Ａｍｉｎｏ　Ａｎａｌｙｓｉ ｓ　ｂｙ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｈａｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　 ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｆｒａｐｈｙ、、　Ｌ！ＡＸ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、１３７　：　６５〜７４を参照のこと。 ５、　アミノ　　　１の　　。Ｎ−末端アミノ酸配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａガス相タンパク質配列決定機を用い て自動エドマン分解により決定した。ＰＴＨアミノ酸誘導体を、Ｈｅｗｌｅｔｔ 　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０システム及び複合グラジェント緩衝液システムを有 するＡｌｔｅｘ　ｅ１８カラム（２ｍＸ２５ｃｍ＋）を用いて、逆相肝ＬＣによ り分析した。 ６、≦１±上金威。合成ペプチドを、製造業者による供給されるような標準の対 称無水物化学を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ 　４３０Ａペプチド合成機による固相合成により調製した。それぞれの段階での 結合収率を、５ａｒｉｎ　星？、＋（１９８１）の定量ニンヒドリン方法により 決定した０合成ペプチドを固体支持体から切り出し、そしてアミノ酸阻止グルー プを、無水ＨＦ　（Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、　１９８４）を用いて除い た。粗ペプチドを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０上でのクロマトグラフィー処理 により脱塩化した。５ａｒｉｎ、　Ｖ、に、、　Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ、Ｈ，、Ｔ ａｍ、　Ｊ、Ｐ。 及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　（１９８１）＋　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、２３７　：　７２７〜９３６＋Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｊ、Ｍ、及びＹｏｕｎ ｇ、　Ｊ、Ｄ、（１９８４）＋　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄ。 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、 　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　ＩＬ、　８５〜８９ページを参照のこと。 金裁Ｊひしく友汰 １、　インビトロＤＮＡ人　。Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホラミシト、調整さ れた多孔性ガラスカラム及びすべての合成試薬を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅ＋ｓｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから得た。 合成オリゴヌクレオチドを、１０倍過剰の保護されたホスホラミシト及び合成支 持体カラムに結合されたヌクレオチド１μモルを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成機によるホスフィツトト リエステル方法により調製した０合成のために使用される化学は、合成機と共に 使用するために推薦される標準方法であり、そしてＭａｔｌｅｕｃｃｉ　ｆｌ　 煮、、　Ｊ、Ａｍｅｒ。 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　１０３　：　３１８５〜３３１９（１９８１）に記載さ れている。固体支持体からのオリゴマーの保護解除及び切断は、ＭｃＢｒｉｄｅ 　ｆＺ−煮、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　２４　：　２４ ５〜２４８（１９８３）により記載されるような標準方法に従って行なわれた。 　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅｏ＋５（１９８４）により推薦されるよ うな除去された保護基の光学密度により測定されるような合成の反復収率は、９ ７．５％以上であった。 粗オリゴヌクレオチド混合物を、１９８４年１１月９日のＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　（使用者会報第１３号）に記載されるよ うにして分離用ゲル電気泳動により精製した。アクリルアミドゲル濃度は、オリ ゴマーの長さに依存して、１０〜２０％に変化した。精製されたオリゴマーを、 Ｕｖシャドウィング法により同定し、ゲルから切り出し、そして粉砕及びソータ 方法（Ｓｍｉｔｈ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｎｏｌｏ　　、　６５：　 　３７１〜３７９（１９８０））により抽出した。 ２、旦凡人■Ｅ■夾定。ＤＮＡ配列を次の方法により決定した。対象の領域を含 むフラグメントを、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９（Ｍａｎｉａｔｉｓ　− １ｅ　、　、　１９８２、及びＮｏｒｒａｎｄｅｒ　ｑ？、、　１９８３）の複 数のクローニング部位中にクローン化した。 −末鎖ＤＮＡを調製し、そしてラベルとして３５３−デオキシアデノシン−５′ −（α−チオ）−トリホスフェート（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ） を用いてプライマーエクステンシラン法（Ｓａｎｇｅｒ　ｆｌ　ｅ　、　、　１ ９７７及びＢｉｇｇｉｎ７ｊ　ｅ　、、　１９８３）により配列決定した。多（ の場合、逆転写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）が、Ｚａｇｕｒ ｓｋｙｇ？、（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈ、（１９８５）　　：　８９〜９ ４）により利用されたジデオキシ：デオキシヌクレオシブトリーホスフェート比 を用いて、プライマーを延長するために使用された。 ３２Ｐ又は３５３のいづれかによりラベルされたデオキシアデノシントリホスフ ェートを、これらの反応に使用した。いくつかのＧ−Ｃに冨む酸列に現われる圧 縮人工物がＧ反応からデオキシグアノシントリホスフェートを排除することによ って、及び代わりに、３７．５−の最終濃度でデオキシイノシントリホスフェ− ）　（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて克服された。他の混合物に おいては、Ｇ反応におけるジデオキシＧＴＰの濃度は０．５ｍＭであった。すべ ての配列決定は、８Ｍの尿素を含む６又は８％ポリアクリルアミドゲル上で行な われた（Ｓａｎｇｅｒｇ＆、　１９７８）　、配列決定のために使用されるブラ イマーは、Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｃａｌｓから入手された。データの保存 及び分析は、ＤＮＡ５ｔａｒ及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、の両者からのソフトフェアーを利用した。 主酵条且 発酵器は、１０１の作業体積を有する１５１のＣｈｅｍａｐである。 培養条件は次の通りである：温度−３０°Ｃ，ｐＨ＝６．８　；　２．５ＭのＮ ａＯＨがｐＨｆｆ１節のために使用される。ヘッドスペース圧力は、０．１バー ル以下である。溶解された酸素は５０％で調節される。 空気の流れは、０．５ｆｌ１分〜２０！／分に変化する。撹拌速度は、２００〜 １５００ｒｐｍであった。 発酵器を、撹拌しながら３０°Ｃで１５時間、培地Ａで増殖される１０％（Ｖ／ Ｖ）の植え込みにより接種する。 培地Ｂは、発酵器培地であった。開始体積は５１であった。 グルコース濃度が１％に達した時、培地Ｂの濃縮溶液（５×）を、グルコース濃 度を約１％で維持するために発酵器に添加した。培養物が６０．０の００．。。 に達した時、その温度を１０分間４２°Ｃに上げ、次に２．５時間３９°Ｃに下 げた。次に、細胞を遠心分離により収穫し、そして処理するまで一７０°Ｃで凍 結した。 培１９！とム」」ｌヒ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０トリプトン　　　 　　　　　　　　　　１０酵母抽出物　　　　　　　　　　　　５カナマイシン 　　　　　　　　　　５Ｘ１０−”１地ｌ ＮＨ，Ｃｌ　　　　　　　　　　　　　　　４．５ＫＨｚＰＯｎ　　　　　　　 　　　　　　　　０．７６ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，１８ ＫｚＳＯｎ　　　　　　　　　　　　　　　０．０９ＣａＣ１２ｔ　　　　　　 　　　　　　　　２４　Ｘ　１０−’ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ０　　　　　　　　　 　７．６Ｘ１０−”微量元素　　　　　　　　　　　　０．５ｍカザミノ酸　　 　　　　　　　　　　２５酵素抽出物　　　　　　　　　　　　５グルコース　 　　　　　　　　　　　　２０カナマイシン　　　　　　　　　　５Ｘ１０−３ ＳＬＰＩ［Ｉ’　　−のアセンブＩ−び１．５ＬＰＩＩ［’　　−アセンブリー 　るためのス　ムの　・。 ＳＬＰ　Ｉ［Ｉは、絹フイブロイン分子にひじょうに類似する。なぜならば、そ れは規則的な間隔（約６０個の残基）でアミノ酸チロシンを含むからである。Ｓ ＬＰ　ＩＩＩ遺伝子を、小さな部分からアセンブリーした。まず、長さ約６０ｂ ｐのＤＮＡの３個の二本鎖断片を化学的に合成した。個々の断片を、バクテリオ ファージＭｌａ中への挿入によりクローン化し、そしてそのＤＮＡ配列を確証し た。次に、これらの断片を、ベクターから除き、そして特定の順序で一緒に連結 した。約１８０ｂｐのこの結合は、ＳＬＰ　Ｉ［Ｉ“モノマー”と命名される。 次に、′モノマー”を特定の順序で連結し、ＳＬＰ　ＩＩ［のシマー、トリマー 、テトラマー、等を生成した。次に、それらのマルチマーは、ｓｔｐ　ｍタンノ 寸り質を検出するためにプラスミド発現ベクター中に直接、又は初め、アダプタ ープラスミド中にクローン化された。アダプターへのＳＬＰ　ｎ［ＤＮＡの挿入 は、追加の遺伝子操作を可能にし、そして後で、さらに記載される。アセンブリ ースケム番よ、次の通りに描かれる： 二本鎖ＤＮＡ断片の合成− ５ＬＰ　ＩＩＩ遺伝子の３種の断片のＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列が、第２ 表に示される。 ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＣＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＣＡＧＡＧＳＧ ＡＧＡ 二本ｇＤＮＡ配列は、５′から３′の方向に示されている。 配列によりコードされるアミノ酸（ｇ−グリシン、ａ＝アラニン、Ｓ−セリン、 ｙ＝チロシン）は、個々の断片のすぐ下に示されている。 上記６種の一本鎖が合成された１合成の後、ＤＮＡの鎖を精製し、そして相同の 鎖をアニールした６個々の鎖約ＩＩ（０，５ｇ）を、１．５ｄのポリプロピレン Ｅｐｐｅｎｅｏｒｆ管中で、１０ＸＡＡ（例１のセクション８で定義された１０ ｘＡＡ）２ｔｄ、緩衝液及び殺菌された脱イオン水１６Ｉｌｌと共に混合した。 その管を、煮沸槽（ｌｆｆｉのビーカーにおいて５００ｍ）に１０分間置き、そ して次にそのビーカーをホットプレートから除き、そしてベンチ上で室温に冷却 した。これは、約１〜２時間を要した。 個々の３種の二本鎖断片を、Ｍ１３＋ａｐｌＢ中に別々にクローン化した。断片 １を、複数のクローニング部位のＳｅａ　Ｉ及びＢａｍＨＩ制限部位間に連結し た。断片２を、シ徂Ｈ１及びＰｓｔ１部位間に連結した。そして、断片３を、Ｐ ｓｔ１部位とＦＩｉｎｄＩ［Ｉ部位間に挿入した。それぞれのクローンは次のよ うに命名された：　Ｍ１３ｍｐ１８．１．　Ｍ１３ｏ＋ｐｌＢ、２．　Ｍ１３ａ ＋ｐ１８．３　、そのＤＮＡ配列を、それぞれのクローン化された断片のために 決定した。正しいＤＮＡ配列を有するそれぞれの断片の１つの代表的な断片を回 収し、そして次の段階：“モノマー゛°のアセンブリーのための材料として使用 した。 ２、　５ＬＰ　ＩＩＩの“モノマー”のアセンブＪ、ＤＮＡ断片２及び３を、制 限酵素によるＭ１３クローンの消化により単離し：断片２のためには、Ｍ１３ｍ ｐｌＢ、２をＢａ＋ｍＨＩ及びＰｓｔＩにより消化し；断片３のためには、Ｍ１ ３ｓ＋ｐ１８．３をカル■及び影ｎｄｌ［ｉにより消化した。これらの２種の断 片を精製し、そしてＢａａ＋ＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌにより初めに消化されたＭ １３＋ａｐ１８．１の等モル量と共に一緒に混合した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを 添加し、１−２−３の順序で相同のオーバーラツプ末端を連結した。付着端のハ イブリダイゼーション特異性により、３種の断片を、この順序でのみ効果的に連 結した。Ｍ１３ｍｐ１８．１．２．３と命名されたアセンブリー中のクローン化 された“モノマー”のＤＮＡ配列は、正しいことが決定され、そして上記第２表 に示された。 ３、　　ＳＬＰ　ＩＩＩの“モノマー”のマルチマー化。多量の“モノマー”構 造遺伝子を調製するために、まず、プラスミドベクターｐＵｃ１２中に“モノマ ー”をサブクローン化した。 Ｍ１３ｍｐ１８．１．２．３を、以遠Ｒ１及びＨｉｎｄＩ［［制限酵素により消 化した。ＳＬＰ　ｌ［“モノマー”をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ ｄＩ［［により消化されたｐＵｃ１２中に連結した。その得られたプラスミドＤ ＮＡを調製し、′モノマー”をＢａｎ　Ｉ　　ＲＥＮによる消化によりベクター から開放し、そしてそのフラグメントをゲル精製した。 マルチマーを構成するために、Ｂａｎ　Ｉ末端を有する“モノマー”ＤＮＡを、 連結により結合した。非パクンドローム性末端Ｂａｎ　Ｉ認識配列は、前部から 後部（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）の順序でのみ結合を可能にする。マルチマー 化の程度を、ゲル電気泳動及びエチジウムプロミドによるＤＮＡの染色によりモ ニターした。２０個以上の単位のマルチマーを、この方法により得た。 ４．５ＬＰＩ［［のマルチマーのクローニング。プラスミドｐＣＱＶ２（Ｑｕｅ ｅｎ７ｊ＆、、　Ｊ、Ａ　　１．Ｍｏ１．Ｇｅｎ、、　２：　１〜１０（１９８ ３））を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｎＨ１制限エンドヌクレアーゼにより消化し、そ して約９００ｂｐのフラグメントを精製した。このＤＮＡフラグメントは、バタ テリオファージλｃ　Ｉ　−８５７レプレッサー遺伝子、隣接して結合された左 側の方のプロモーター、Ｐ６及びｃｒｏ遺伝子の開始部分を含む。プラスミドｐ ＳＹ３３５（Ｆｅｒｒａｒｉｒ、（？、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　 １６１　：　５５６〜５６２（１９８５）にｐＪＦ７５１として記載される）を ＥｃｏＲＩ及びＢａｎ＋ＨＩ制限酵素により消化し、そして続いて、ｐＣＱＶ　 ２の約９００ｂｐのＤＮＡフラグメントに連結した。この構成がら得られたプラ スミド、ｐｓＹ７５１は、３７°Ｃ及び４２℃でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を 発現する（但し、３０″Ｃでは発現しない）。 このアプローチにおいては、ＳＬＰ　ＩＩＩ遺伝子がまず、中間プラスミドにお ける“アダプター”配列中にクローン化され、そして次に、発現システムにサブ クローン化される。そのアダプター配列は、次の有用な特徴を有する：ユニーク な中央（ＤＢａｎｌ　　ＲＥＮ部位、Ｒａｎ　Ｉのいづれがの側に対する３種の ユニークなＲＥＮ部位、メチオニン、アスパラギン酸−プロリン又はアルギニン アミノ酸のいづれがでのタンパク質切断のための情報コード及び小さなサイズ。 Ｂａｎ　Ｉ部位は、Ｂａｎ　Ｉ部位を有するＳＬＰ　Ｉ［ｒマルチマーのための 挿入の点である。 アダプターを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０Ａ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｚｅｒにより合成し、Ｍ１３ｎ＋ｐｌＢにクローン化し、そしてＤＮＡ配 列を確かめた。次に、そのアダプターを、Ｂａｎ　Ｉ　ＲＥＮ部位を欠く特異的 に構成されたプラスミドベクター中にサブクローン化した。受は入れプラスミド と、次のようにして構成した。プラスミドｐＪＨＩＯＩ（Ｆｅｒｒａｒｉｊｊ＆ 、、　１９８３）をＡｈａＩＩＩ制限酵素により部分的に消化し、そして再連結 した。旦、ユｆｉ　ＨＢＩＯＩの形質転換体を、クロルアンフェニコール（１２ ，５■／ｄ）を含ム媒体上で選択した。いくつかの単離体の制限分析の後、１っ のプラスミド、ｐＳＹ３２５を選択した。このプラスミドは、クロルアンフェニ コール−耐性遺伝子及びｐＪＨｌｏｌの複製起点（ｐＢＲ３２２からの）のみを 含む。υ＋ｏｎにより完全に消化した後、ｐＳＹ３２５を、ゲル精製されたアダ プターにより連結した。 その結果は、アダプター−プラスミド、ｐＳＹ９３７であり、そしてその新しい ＲＥＮ部位を確かめた。 ＳＬＰ　ｍマル−５−マー４、ｐＳＹ９３７のＢａｎ　１部位中にクローン化し た。陽性のクローンを、コロン−ハイブリダイゼーションにより及びハイブリダ イゼーションのためのＤＮＡプローブ（第２表に示されるプローブ配列）として のＳＬＰ　Ｈの断片ｌの低い鎖により同定した。陽性クローンを、挿入されたマ ルチマーの大きさについてゲル電気泳動により特徴づけた。最後に、ＳＬＰ　Ｉ ＩＩ配列を、フランキングアダプター領域におけるＲＥＮ部位を用いて、発現プ ラスミドの特異的位置にサブクローン化した。 ＳＬＰ　ＩＩＩタンパク質は、次のアミノ酸組成を有した：ＳＬＰ　ＩＩＩ　　 　１１７８　ＡＡ　　　　　　ＭＷ　８３．０００（ｆｍ）　ＤＰＶＶＬＱＲＲ ＩＩＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭＧＡＧＳ　（ＧＡＧＡＧ Ｓ）、　ＧＡＡＧＹ［（ＧＡＧＡＧＳ）９　ＧＡＡＧＹ］、ＧＡＧＡＧＳＧＡＧ ＡＧＳＧＡＧＡＭＤＰＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫ（ｆｓ）は、開 始コードを示す。 ＳＬＰ　Ｉ［Ｉ　　　ベタ　− １ラスミＦＤＮＡ　ｐｓＹ１０８６　ハ、ＳＬＰ　ＩＩＩ（７）１９反復体（３ ，５Ｋｂ）■及びハラ■により消化し、そしてこのフラグメントをアガロースゲ ル電気泳動により分離した。次に、精製されたＳＬＰ■マルチマーを、Ｐｖｕ　 ｎ　ＲＥＮにより消化されたプラスミドｐｓＹ７５１にクローン化した。い（つ かのクローンを分析し、そして１つのクローン（ｐｓＹ１００８）を選択し、発 現実験及びＳＬＰ■精製に使用した。 ｐｓＹ１００８のアンピシリン薬物耐性遺伝子を、ｐｓＹｌｏｌｏ（ル１１及び ジ狙ＩによるｐＳＹ６３３の消化及びｐＵＣ４にのＨｉｎｃｌＩ消化により得ら れたＫａｎ”の挿入により生成された）からのカナマイシンマーカーにより置換 し、そして得られたプラスミドをｐｓＹ１１８６と命名した。プラスミドｐｓＹ １１８６のＳＬＰ　Ｉ［Ｉ部分のＲａｎ　Ｉにより除去することによって、新規 プラスミド、ρ５Ｙ１２６２を生成した。このプラスミドは、モノマーの重合に より得られたＢａｎ　Ｉ末端を含むフラグメントの直接的な連結を可能にするユ ニークなりａｎ　１部位を含む、このプラスミドを用いて、次のタンパク質：５ ＥＬＰ１　、２　、３及びＳＬＰ　４のための挿入体を含むプラスミドを生成し た。 ＳＬＰ　　ｌ１１Ｆの　　　　び　　ＩＪｉＵ！！ｊＢＪＬ−Ｅ、コリは、次の 培地に培養される：−一双一一分一一　　　　　　　ｌＺ工酵母抽出物　　　　 　　　　　　　２０カサミノ酸　　　　　　　　　　　２０ペプトン　　　　　 　　　　　　　２０ゼラチンペプトン　　　　　　　　２０ＫＨ！Ｐ０．　　　 　　　　　　　　　　　２ＫｚＨＰＯｍ　　　　　　　　　　　　　　　２Ｎａ ｔＨＰＯ４”ｙｕｚｏ　　　　　　　　　　　２グルコース　　　　　　　　　 　　　２アンピシリン　　　　　　　　　　０．１３０°Ｃで増殖された一晩の 培養物（５００Ｍｌ−１ｆ　）を用いて、５００２の発酵器中に含まれる培地３ ７５！を接種した。発酵器条件は、１００ｒｐ−回転速度計読み、５ｐｓｉの容 器背圧及び溶解されたＯｚを５０％以上で維持するための１７０　ｆ　７分の空 気の流れを包含する。 グルコース（Ｉｇ／／り及びアンピシリン（０，０５ｇ／ｉりを、培養物が１． ０のＯＤ５．。に達した時及び２．０に再び達した時、発酵物に添加した。培養 物が２．０の０Ｄｂｓｏに達した場合、温度を４２°Ｃに１０分間上げ、そして 次に３８°Ｃに２時間下げた。 次に、培養物を１０°Ｃに栄、冷せしめ、そして細胞を連続した遠心分離により 収穫し、そして処理するまで一７０°Ｃで凍結した。 ２つの発酵からの収量は、７．３　ｋｇ及び５．２ｋｇの湿量の細胞であった。 他の培地も使用され得、そして種々のプラスミドと共に、種々の選択条件（すな わち、アンピシリンとカナマイシンとの置換）が付与されることが注目されるべ きである。これらの条件は、実験室規模の発酵（１０！の体積）に使用されて来 た。 週１１１畦・ １火上。細胞を融解し、そして１ｋｇ湿量１５０ｍＭのトリス−Ｈｌ、ｐＨ１， ０，１ｍＭのＥＤＴＡ溶液６２の濃度に懸濁し、そして８０００ｐｓ　ｉでのＡ ＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ細胞粉砕機を２回通すことにより破壊した。この溶解工程の 間、細胞を水浴により冷たく維持した。次に、細胞溶解物を遠心分離機、たとえ ば４°Ｃで操作される５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ冷却遠心分離機におけるＴＺ　 −２８０−ターにより連続して２６．０００Ｘ　ｇで遠心分離した。これらの条 件下で、生成されるＳＬＰ　ＩＩＩの９０％以上がベレットに見出され得る。上 清物は、下記のようにしてＮＨ４５Ｏｄ沈殿法により回収され得るある生成物を 含む。ベレットは、下記のようにしてＬｉＢｒにより抽出される。 立法１．凍結細胞を融解し、そして１ｋｇ湿量１５０ｗａＭのトリス−ＨＣｌ１ ＳｐＨ７，０，１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液６！の濃度に再懸濁し、そして５ｅＭの Ｉ’ＭＳＦによりプロテアーゼ活性を阻害した。細胞をこの緩衝液中において、 室温で０．５〜２時間撹拌し、次にリゾチームを添加し、１ｇ／２の濃度にし、 そしてインキュベーションを２０分間続けた。次に、β−メルカプトエタノール を添加し、７０ｍＭにし、そして次に、界面活性剤ＮＰ４０を、続けてその細胞 懸濁液を撹拌しながら、２０分間にわたって添加し、１％の最終濃度にした。Ｍ ｇＣｌ　ｚを添加し、５０ｍＭにし、続いて１■／ｊ２の濃度でのＤＮＡ、、を 添加し、そしてインキュベーションを室温で２０分間続けた。次の細胞溶解物を 、方法１におけるようにして、２６，０ＯＯＸ　ｇで続けて遠心分離し、そして 上滑液を集め、そして２６．０００Ｘ　ｇで２回目の遠心分離を行なった。この ２回目の遠心分離から得られる上清物は、合計く５％のＳＬＰ　ＩＩＩを含み、 そして下記のようにしてＮＨ４５Ｏ，により回収され得る。第１回及び第２回の ２６，０ＯＯＸ　ｇ遠心分離から得られるベレットを組合し、そして下記のよう にしてＬｉＢｒにより抽出した。 方迭主。この方法のために、Ｔ７フアージリゾチームをコードする第ニブラスミ ドを含む旦−ｍの株を用いた。このプラスミドは、ＳＬＰ　ＩＩＩ遺伝子及び耐 薬物決定基をコードするプラスミドと適合できる。その株を、初めの２つの方法 におけるのと同じ培地及び同じ条件下で増殖せしめる。しかしながら、細胞内の Ｔ７リゾチームの生成により、それらの細胞壁が弱くなり、そしてそれらは、＞ １００＋ｗＭへのＥＤＴＡの添加及び０．５〜１．０％（Ｖ／Ｖ’）の濃度への ＮＰ４０の添加により発酵の完結で容易に溶解され得る。溶解はまた、ＮＰ４０ の代わりに発酵ブイヨンへのクロロホルム（２０ｄ／ｌ）の添加により達成され 得る。他方、細胞は、溶解の前、遠心分離により集められ、初めの２つの方法に 記載されるようにして１ｋｇ湿量／６２のトリス−ＥＤＴＡの濃度に再懸濁し、 そして次に、ＮＰ４０又はクロロホルムの添加により溶解した。いづれかの方法 による細胞溶解の後、溶解物を、初めの２つの方法に記載２６．０００Ｘｇで連 続して遠心分離した。これらの方法に関しては、ベレットのＬｉＢｒ抽出法及び 上清物のＮＨ，ＳＯ，沈殿法を用いて、生成物を回収した。 銭ＰＩ［Ｉ■■製 上記のようにして２６．０００Ｘ　ｇでの細胞溶解物の遠心分離により得られた ベレットを、等体積の９ＭのＬｉＢｒにより抽出した。塩溶液を添加し、そして ベレットを室温（ＲＴ）で撹拌することによって均等に懸濁した。均等な懸濁液 が得られた後、その混合物をＲＴで１時間撹拌する。次に、その混合物を、４° Ｃ又はＲＴで、２６．０００ｘ　ｇで連続して遠心分離し、ベレット及び上滑液 画分を生成する。上清物を保存し、そしてベレットを上記のような同体積の９Ｍ のＬｉＢｒにより再抽出する。１時間の混合の後、その混合物を、２６．０００ Ｘ　ｇで遠心分離し、そしてこの遠心分離からの上清物を、初めのＬｉＢｒ抽出 からの上清物と組合し、そして４℃で一晩放置する。細胞溶解物の２６．ＱＱＱ Ｘｇでのベレットに含まれるＳＬＰ　ＩＩ（の約９０％を、この方法を用いてＬ ｉＢｒにより抽出する。 ＬｉＢｒ抽出物を、４°Ｃで一晩放置した後、沈殿物が形成し、２６、ＯＯＯＸ ｇで遠心分離により除かれ、そして捨てられる０次に、上清物を透析バッグに置 き、そして数回のａｕｔｏの交換により２日間、透析する。ＬｉＢｒは透析によ り除かれるので、ＳＬＰ　ＩＩＩ生成物は透析バッグに沈殿する。その沈殿物を 遠心分離により集め、そしてｄＨｚｏにより２〜３度洗浄する。最終的に洗浄さ れた生成物を遠心分離し、そして凍結乾燥せしめる。 ２６．０ＯＯＸ　ｇでの上滑液画分からＳＬＰ　ＩＩＩの回収のために、ＮＨ４ ５Ｏ，沈殿法を用いる。固体ＮＨ４ＳＯ４と、３８％飽和が達成されるまで（２ ３１ｇ／ｉり、４°Ｃで維持されているサンプルにゆっくりと添加する。次にそ の混合物を４°Ｃで２〜３時間、撹拌する。沈殿物を、連続した流れの遠心分離 機での遠心分離により回収し、そして同体積の蒸留水又は０．５％ＳＤＳ水溶液 により４〜５度洗浄する。個々の洗浄の後、沈殿物を連続した遠心分離により回 収する。ペレットは、汚染タンパク譬が除かれるので、連続的な洗浄によります ます白色になる。 ＳＬＰ　Ｉ［を洗浄ペレットとして回収し、そして凍結乾燥せしめる。 ＳＬＰ　Ｉ［Ｉのト１プシン几 ＳＬＰ　ＩＩＩを、５０ｍＭ（７）　）　！Ｊ　ス−ＨＣｊ２．　ｐＨ８，０， ０，１Ｍ（７）　ＮａＣ１緩衝液に懸濁し、そして３７℃の水浴に置き、そして ＴＰＣＫ処理されたトリプシン溶液を前記懸濁液中に混合した。最終トリプシン 濃度は０．１％であった。３時間後、その溶液を１６，０００×ｇで１５分間遠 心分離し、そのペレットを、まず半分に等しい体積の０．５％ＳＤＳ水溶液、次 に蒸留水により洗浄した。 個々の洗浄の後、ペレットを遠心分離により回収した。最終生成物を水に再懸濁 し、そしてさらに分析のために４℃で維持した。 トリプシン処理により、ＳＬＰ　ＩＩＩを９９．４％の純度に精製した。 ＳＬＰ　ＩＩ［の　　パ 精製された絹様タンパク賞の物理的測定を、微生物学的に生成された反復アミノ 酸ポリマーが天然に存在するポリマーの性質を完全にまねることを確立するため に、−夾≠」ε乙２）、１ｉ（Ｂｕ励刀口阻吐）絹の物理的測定と比較した。物 理的測定は１．に、、１．Ｉ？、−じ７７、−Ｆ−ＩＪ−絹フィブロインの結晶 領域のための逆平行類プリーツシートコンホメーションのモデルを確かめるため に行なわれた（Ｍａｒｓｈ、　Ｃｏｒｅｙ及びＰａｕｌ、ｉｎｇ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ。 Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｃｔａ（１９５５）１６　；　Ｐａｕｌｉｎｇ及びＣｏｒｅ ｙ＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９５３）３９　：　２４７）。ＳＬＰフィルムから得られる Ｘ−線回折パターンの予備分析は、Ｆｒａ　ｓｅｒ、　ＭａｃＲａｉ及びＳｔｅ ｗａｒｄ（１９６６）により記載された分析と一致する。ＳＬＰ　ＩＩＩの円二 色性（ＣＤ）及びフーリエ交換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析は、ひじょうに延長さ れたβ及びβ一回転コンホメーションと一致する。 ＳＬＰ　ＩＩ［から得れたスペクトルと種々の溶媒中における天然に存在する絹 フィブロインのスペクトルとの比較（Ｉｓｕｋａ及びＹｏｕｎｇ、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９６６）５５　：　１１７５）は、溶 液におけるＳＬＰ　ＩＩＩが、絹フィブロインに見られるランダム及び高い定序 構造体の混合物から成ることを指摘する。 このデータは、ＳＬＰ　ＩＩＩが、高い結晶性ドメイン中にパックできる延長さ れたβ鎖を含むことを示す。このデータはまた、間道なβ一回転（逆回転）コン ホメーションの存在を示す。 Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ　（１９７４）　、前記により開発された二次構造予 測のための数字を用いてのＳＬＰ　Ｉ［［のアミノ酸配列のコンピューター分析 は、ＡＧＹＧ配列がβ一回転傾向を有することを示す。 玉主表 （ＡＧ）ｌ１９．４２　　　　６．９５　　　　８．８７（ＡＧＡＧＳＧ）。　 　　　　　　　　　　　　９．３９　　　　６．８５　　　　９．０５ＣＴＰ画 分　　　　　　　　　９．３８　　　６．８７　　　９．１３Ｎａｔｉｖｅフイ ブロイン　　　　　９．４０　　　６．９７　　　９．２０ＳＬＰ　　Ｔｌｌ　 　　　　　　　　　　　　　　　９．３８　　　　６，９４　　　　８．９７Ｆ ｒａｓｅｒｆｉ　５　、、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９６６）１９　：　 ５８０に引用されている。 貫［ ＰＣＢ−５ＬＰ　ＩＩＩの 企−亘 ＳＬＰ　Ｉ［ｒポリマー（上記及びまた１９８７年１０月２９日に提出された出 願番号第１１４，６１８号、ＰＣＴ／ＵＳ／８７１０２８２２を参照のこと）を 選択した。なせならば、それは、有用な生成物の二次加工を可能にし；広範囲の 種類の適用のために良好な構造特性を有し；相互作用核間にβ一回転構造を有し ；そしてその回転配列と他の配列との置換を可能にする予測される構造を有する からである。フィブロネクチン細胞−結合ドメイン、すなわちアミノ酸１４０５ 〜１５１２は、強い回転傾向を有し、そして細胞付着性を提供するトリペプチド ＲＧＤを有し、隣接するβ−鎖核間親水性ループ内に存在することが予測される 。 この提案されたループ構造を補う１０個のアミノ酸配列（フィブロネクチン細胞 結合又はＰＣＢ配列として言及される）が、ＳＬＰ　ＩＩＩ主領内の挿入される アミノ酸の官能ブロックを構成するために選択された。　ＳＬＰ　ＩＩＩ主鎖内 の挿入部位を、回転構造を付与することがまた、予測されるアミノ酸配列ＧＡＡ ＧＹに対応するように選択した（Ｃｈｏｕ及びＦａｓｓｍａｎ（１９７４）　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔＤｌ：２２２〜２４４）。この企画は、ＰＣＢ構造の保存を 可能にし、そして同時に、ＳＬＰ　ｍ　（ＧＡＧＡＧＳ）　９β−鎖結晶−バッ キングドメインの最小の破壊を引き起こす。 ＤＮＡム　　び′　− ５ＬＰ　ＩＩＩ遺伝子モノマーは、提案された回転構造体、ＧＡＡＧＹをコード する配列内にＰｓｔｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、この部位を用いて、 ＰＣＢ配列の１０個のアミノ酸をコードする合成りＮＡを挿入した。３６個の塩 基の長さの、ＰＣＢ部位を含む２種の相補的ＤＮＡ鎖を、合成し、それらは下記 に示される配列から成る： これらのオリゴヌクレオチドを、例１に記載される方法に従って精製し、そして ｐｓＹ１３０４のＬ匹１部位中にクローン化した。　ｐｓＹ１３０４はＳＬＰ　 Ｉｆの単一のモノマー遺伝子フラグメントを含む、　ｐｓＹ１３０４　ＤＮＡを Ｐｓｔｌにより消化し、そしてＰＣＢオリゴヌクレオチドの混合物と連結した。 その連結反応生成物を、Ｅ、コリ細胞中に形質転換した。そのプラスミドを含む コロニーを、抗生物質クロラムフェニコールを含む細菌培養プレート上で選択し た。個々のコロニーを増殖せしめ、そしてプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＮ ｈｅ　Ｉによる制限消化によりＰＣＢオリゴヌクレオチド配列の存在について分 析した。この制限部位を含むプラスミドを、ＤＮＡ配列決定にゆだね、そして２ 種の候補体は正しいことが示された。これらのｐｓＹ１３２５及びコードされた アミノ酸配列の１つの一部のヌクレオチド配列は、次の通りに示される：ｌ　　 　　　　　　　　　　Ｌ５　　　　　　　　　　　　３０ＰＣＢ　−ＳＬＰモノ マー遺伝子フラグメントを、Ｂａｎ　Ｅによる消化、アガロースゲル電気泳動及 びＮＡＣＳ精製（例１の１１）によりｐｓＹ１３２５から精製した。そのモノマ ー遺伝子フラグメントを自己連結し、そしてＢａｎ　Ｉにより消化されたｐＳＹ ９３７中にクローン化した。この連結の生成物を、旦−ユニ中に形質転換し、そ してクロラムフェニコール上での増殖について選択した。個々のコロニーからの プラスミドＤＮＡを、Ｎｒｕ　Ｉ及びＥｃｏＲＶによる消化及びアガロースゲル 上での電気泳動により複数のＦＣＢ　−ＳＬＰモノマーフラグメントを含む挿入 体について分析した。２つの挿入体（１つは約２．１ｋｂ及び他は２．８ｋｂで ある）を含む１つのクローンを同定した。両挿入体を個々にクローン化し、そし て発現ベクターｐｓＹ７５１にトランスファーした。プラスミドｐｓＹ１３２５ をＮｒｕ　Ｉ及びハラ■により消化し、そして２．１及び２．８ｋｂの挿入体バ ンドを精製した。 これらのＤＮＡフラグメントを、Ｐｖｕ　ＩＦによりすでに消化されているｐｓ Ｙ７５１に連結した。この反応の生成物を旦−ユニ中に形質転換し、そして抗生 物質アンピシリン上での増殖により選択した。個々のコロニーからのプラスミド ＤＮＡを、ＰＣＢ　−ＳＬＰポリマー遺伝子の存在について制限消化により分析 した。それぞれ２．１及び２．８ｋｂの挿入体を含む２種のクローン、ｐｓＹ１ ５２０及びｐｓＹ１５２１を同定した。 二底春立■１ ｐｓＹ１５２０及びｐｓＹｌ、５２１を含むＥ、コリ細胞を、５０■／ｄのアン ピシリンを含むＬＢ培地中において３０°Ｃで、０．７の００．。 まで増殖せしめた。　　ＰＣＢ−５ＬＰポリマータンパク賞の生成を堵畏温度を ４２°Ｃに１．５時間上けることによって６兄した。細胞を遠心分離により収穫 し、そしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びβ−メルカプトエタノールを 含むサンプル緩衝液中において１００℃で５分間、加熱することにより溶解した 。 り質を、蒸留水による４倍希釈により選択的に沈殿せしめた。 残る上滑液を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）、１＋＋ＭのＢＤＴＡ、１ｎＭ のＰＭＳＦ溶液に対して透析した。沈殿したタンパク質を遠心分離により集め、 脱イオン水に再懸濁し、そしてアミノ酸組成について分析した。この半一精製さ れた両分の組成は、このポリマーに存在するアミノ酸の組成的な含有率により決 定される場合、約９０％のＰＣＢ　−ＳＬＰであることを示した。これらのアミ ノ酸の割合は、ＰＣＢ　−ＳＬＰポリマー遺伝子のＤＮＡ配列により予測される 割合とひじょうに相互関係した。 ・ゞ　のア・・セイ ＰＣＢ　−ＳＬＰポリマータンパク質が細胞付着活性を示すかどうかを決定する ために、半一精製されたタンパク質を、ニトロセルロースフィルター上に固定し 、そして哺乳類組織−培養細胞と共にインキュベートした。ｐｓＹ１５２０．　 ｐｓＹ１５２１又はｐｓＹ１１８６（ＳＬＰ　ｍをコードするプラスミド）を含 むＥ　コリ細胞からの溶解物タンパク質を、ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ上で電気泳動せ しめ、そして電気プロットによりニトロセルロースフィルターに移した。これら のフィルターを、）ｌａｙｍａｎ　ｑζ−（１９８２）　ＭＲＬの方法の変法を 用いて、細胞付着性を促進するそれらの能力について試験した。フィルターを、 軽く撹拌しながら、ＰＢＳ　（１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）　、 １５０ｍＭのＮａＣｊｌり中で数度清浄し、そして５％コンデンスミルクを含む ＰＢＳ中に１時間飽和せしめた０次に、フィルターを、抗−３ＬＰ又は抗−ＦＣ Ｂ血清（１：１００希釈度の血清）を含むＰＢＳ中、５％コンデンスミルク又は ＰＢＳのみにおける５％コンデンスミルク又はＰＢＳのみにおける５％コンデン スミルクと共に３７°Ｃで２時間インキュベートした。フィルターをＰＢＳによ り２度洗浄し、そして細胞と共にインキュベートした。 細胞を、０．１％のトリプシン溶液における半集密的細胞単層の再懸濁により調 製した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地においてＯｏｃで３０分 間インキュベートした。細胞を遠心分離しく但し、Ｈ９リンパ球が沈殿された） 、ＰＢＳにより洗浄し、そして最後に、血清を含まないＤＭＥ培地に２．５Ｘ１ ０ｈ個の細胞／ｄの密度で再懸濁した。フィルターを、平らなプラスチック皿に 細胞懸濁液と共に積層し、そしてｃｏ２インキュベーター中において３７°Ｃで １時間インキュベートした。フィルターをＰＢＳ中で２度洗浄し、非結合細胞を 除去し、そして３％ホルムアルデヒドに固定した。フィルターを、４５％メタノ ール、１０％酢酸、４５％水におけるアミドブラックにより３分間染色し、そし て９０％メタノール、２％酢酸、８％水中で脱色した。 眼での検査によれば、ピロ（Ｖｅｒｏ）細胞（アフリカグリーンモンキーの腎臓 の上皮細胞）と共にインキュベートされたフィルターは、ひじょうに染色された 領域を含んだ。これらの領域は、抗−３ＬＰ及び抗−ＦＣＢ抗体を含む平行フィ ルターへの反応性により決定されるように、ＰＣＢ　−ＳＬＰタンパク質バンド の位置に対応した。そのフィルターの同じ部分の顕微鏡検査は、濃い染色が細胞 の付着によることを示した。 バックグラウンド以上の細胞は、他のＥ　コリ溶解物のタンパク質バンドを含む フィルターのいづれが他の部分に結合されなかった。細胞は、ＳＬＰ　ＩＩＩタ ンパク質バンドに対応する領域でフィルターに付着されなかった。予測されるよ うに、Ｈ９リンパ球と共にインキュベートされる場合、フィルターへの細胞の特 異的結合は観察されなかった。 細胞付着に対するタンパク質濃度の効果及び特異的抗体によるフィルター及び細 胞の種々の前処理の効果を決定するために、ドツト−プロット細胞結合アッセイ が開発された。そのアッセイは上記のようにして行なわれた。但し、既知濃度の 手積製されたＰＣＢ　−ＳＬＰ及びＳＬＰ　ＩＩＩタンパク質が５ｃｈｌｅｉｃ ｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌ　１　　ドツト−プロットマニホールドを用いて、ニト ロセルロースフィルタードツトに直接適用された。それぞれのサンプルを、連続 する第１のドツトが１０ｇのタンパク質を含み、そして続くドツトがこのサンプ ルの連続する２倍の希釈物を含むように適用した。それぞれｐｓＹ１５２０及び １５２１からの７５Ｋｄ及び９５ＫｄのＰＣＢ　−ＳＬＰタンパク質の両者は、 低濃度でベロ細胞付着を促進せしめた。細胞付着を促進するために必要とされる ７５ＫｄのＰＣＢ　−ＳＬＰタンパク質の最少量は、０．０５１１ｇ／ｃｉａで あった。９５ＫｄのＰＣＢ　−ＳＬＰタンパク賞のためには、その最少量は０． ２ｘ／ｃ１ｉであった。１２．５１１ｇ／ｄでさえ、ＳＬＰ　ＩＩＩ含有ドツト に、はとんどの細胞が付着されなかった。ＰＣＢ　−５ＬＰタンパク質への細胞 付着は、抗−ＦＣＢ又は抗−５ＬＰ抗体と共にそのフィルターを予備インキュベ ートすることにより阻害された。細胞付着は阻害されるが、しかし、３００尾／ ｄの濃度でＰＣＢペプチドと共に細胞を予備インキュベートすることによっては 阻害されなかった。 ＳＬＰ　ＩＩＩモノマー配列へのＰＣＢの１０個のアミノ酸の導入は、タンパク 質ポリマーを構成し、このタンパク質の精製及び溶解性特徴は、ＳＬＰ　Ｉ［Ｉ タンパク質ポリマーの特徴とはそれ程、異ならず、そして細胞付着を促進する能 力の追加の特性を含む。対象のタンパク譬ポリマーは、単独で又は他の化合物又 はタンパク質ポリマー、合成又は天然のポリマーと一緒に、細胞付着を促進する 繊維及びフィルムに配合され得る。ＰＣＢ−ＳＬＰの生物学的活性は、変性に対 して化学的に耐性である。 細胞付着は、高濃度の界面活性剤及びカオトロピック変性剤による１００°Ｃで の処理の後、ＰＣＢ　−ＳＬＰタンパク質に生じる。 この安定性は、生物活性物質の調製に使用される殺菌方法を促進する。細胞及び 組織培養物の増殖及び分化を増強するた・めの固体−支持細胞−付着マトクック スは、そのような物質の直接の用途である。対象のポリマーは、他の物質又は支 持体上に容易に付着され、細胞−結合表面を提供する。種々の形、たとえば繊維 、膜、フィルム、等での細胞−付着ポリマーは、激しい撹拌への細胞損傷を回避 しながら、栄養物への暴露を高める、軽（混合した液体増殖培地内に生成細胞を 懸濁する生物反応体に使用され得る。対象の物質は、織布、フィルム又は膜に製 造され又はそれらの上に被覆され、そして治療工程に関与される細胞の付着によ り治療を促進する創傷用包帯として使用され得る。さらに、対象のタンパク質は 、装置の４ｙ　　ビトロ及び／又は不ヱ　旦主コロニー化を促進し、従ってその 官能性質を改良するために、血管、関節、朧、靭帯又は同様のものの４ｙ＋＝− ｆ置換に向けられる人工補てつ装置の壁中に配合され又はその上に付着され得る 。さらに、対象のタンパク質は、移植物、キャリヤー、コーチング又は同様のも のとして眼に通用され得る。 ＳＬＰ　３−　Ｃ，、（ＳＬＰ−Ｃ） 、に：　　なｍ　　口　、％＋二二■企ム・タンパク質鎖内に含まれる多くのア ミノ酸は、特定の有機及び無機試薬を用いて化学的に変性され得る。これらのア ミノ酸のいくつかは、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタメート（Ｅ）、 アスバーテート（Ｄ）、システィン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、 ヒスチジン（Ｈ）及びチロシン（Ｙ）である。特定の反応が、特異的位置での鎖 に追加の分子を付加する目的のために行なわれるタンパク質ポリマーを構成する ために又は同じ又は異なったポリマーの鎖を一緒に結合し、又は適切な表面に鎖 を結合するために、５ＬＰ−Ｃが企画された。ＳＬＰ　３の５９個のアミノ酸の 絹様モノマーを、アミノ酸配列ＧＡＧＣＧＤＰＧＫＧＣＣＶＡを含むように変性 した。その包含配列の特徴は次の通りである：　ｌ、ＧＡＧＣ及びＧＣＣＶのテ トラペプチドが、′４Ｎ様アミノ酸を端に有するＢ−鎖構造に適合し、そしてス ルフヒドリルが、酸化下で反応性であり、そして共有架橋結合され得るシスティ ンを含み、２．０ＰＧＫはＢ−鎖構造に適合せず、従って絹様鎖内で整合されて いない構造を付与する。この後者の配列は、さらに、２種の化学的に変性可能な 追加の残基、アスバーテート及びリジンを供給する利点を有し、そして特異的な 化学的ペプチド切断に影響されやすいジペプチドＤＰを含む。 １Ａ二≧づ列ｌ戊・ ２種の下記オリゴヌクレオチド鎖を、方法のセクションに記載されているように して合成し、そして精製した：これらの２種のオリゴヌクレオチド鎖をアニール し、そして均匹Ｉ　　Ｉ？ＥＮにより消化されたプラスミドｐｓＹ１３０４　（ ｐＳＹ９３７におけるＳＬＰ　３モノマー）のＤＮＡと連結した。 この連結反応の生成物を、旦−ユユ鎖ＨＢ　１０１中に形質転換した。形質転換 体からのプラスミドＤＮＡを、精製し、そしてＢａｎ　Ｉにより消化し；正しい 大きさの挿入体を含むクローンを、配向の決定のためにＰｓｔＴ及びＥｃｏＶ　 ＲＥＮにより消化した。正しいクローンからのプラスミドＤＮＡを配列決定した 。 プラスミドｐＰＴＯ１０３（第４表に示される）は、所望するＳＬＰ　−Ｃモノ マー配列を含み、オリゴヌクレオチド（１）及び（２）は、濃い字で下記に示さ れ、そして下線を引かれている。 １表 ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＧ−３’ ＣＣＴＴＣＧＣＣτＣＧＣ−５’ ｐＰＴＯ１０３からのプラスミドＤＮＡをＢａｎ　Ｉ　　ＲＥＮにより消化し、 その消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動によりそしてＮＡＣＳカラム（ 方法のセクションを参照のこと）により精製した。その精製されたフラグメント を、ＲＥＮ　Ｂｊμ■によりすでに消化されているプラスミドρ５Ｙ１２６２に 連結した。この連結反応の生成物を、Ｅ、コリ鎖ＩＩ　８１０１中に形質転換し た。 形質転換体を、耐カナマイシン性について選択した８個々の形質転換体からのプ ラスミドＤＮＡを、５ＬＰ−ＣマルチマーＤＮＡ挿入により大きさを高めるため に精製し、そして分析した。約１．　ＯＫｂｐ〜５．４　Ｋｂｐの大きさのいく つかのクローンが得られた。６種のクローン（ｐＰＴ０１０５→ｐＰＴＯ１１０ ）が５ＬＰ−Ｃの発現に使用するために選択された。 主−屋・ ３０°Ｃで増殖された一晩の培養物を用いて、２５０１７ｄ！のフラスコに含ま れる５０Ｍ１の培地を接種した。カナマイシンを５０ｎ／ｄの最終濃度で添加し 、そしてその培養物を３０’Ｃで撹拌（２００ｒｐｍ）　Ｌ、なからインキエベ ートした。培養物が０．８の００．。。に達した時、その４Ｍ！を、４２℃であ らかじめ暖められた新しいフラスコに移し、そして同じ温度で約２時間インキ、 １ベートした。培養物（３０°Ｃ及び４２°Ｃ）を氷上で急冷せしめ、そしてＯ Ｄ６゜。を取る。１．０の００６゜。のアリコートに分けられた細胞を、遠心分 離により集め、そしてＳＬＰ抗体を用いてドツトプロット及びウェスターン分析 を行なうために使用した（方法のセクションを参照のこと）、精製及びアミノ酸 分析のためには、多量の培養物が使用された。 立−丘。 プラスミドｐＰＴ０１０５を含む旦−ユユ株ＨＢＩＯＩを、３０℃で０．７のＯ Ｄ６゜。になるまで増殖し、そして次に、４０μＣｉ　／　ｊ２１２の３５３− システィンの添加の後、４２°Ｃで２．０時間、増殖した。 これらの細胞から生成されるタンパク質を、３ＳＳ−システィンの検出のために 及びＳ　Ｌ　Ｐ抗体への反応性のためにＳＯ５−ＰＡＧＥにより分析した（方法 のセクションを参照のこと）。再分析においては、強い反応性バンドが、約１５ ０ＫＤの見掛の分子量をもって観察された。 ｐＰＴｏ　１０５　　　Ｓｉ、Ｐ−Ｃタンパク質　託コ３ＡＡ　　　ＭＷ９７， ０７７！’、Ｄ　Ｐ　’７′ｖＬＱＲＲＤＷ　ＥＮ　ＰＧ　ＶＴＯＬＮＲＬ記Ｐ 　？　Ｆ−Ａ、Ｓ　Ｄ　Ｐ　ＭＧ　ＡＧ　Ｓ　［ＧＡＧ　ＡＧ　Ｓ@ｌ　６ ［ＧＡＡ（ＧＡＧＣＧ：ＩＰＧＫＧｃｃ）ＶＡＧＡＧＹｆＧＡＧＡＧＳ　）ｇ　 １１６ＧＡＡＧＡＧ　ＣＧ　Ｄ　ＰＧ　ＫＧＣＣＶＡＧＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧ　 Ｓ　）　２　ＧＡＧＡＨＤＰＧＲＹＱＬＳＡＧＲＹＥＹＱＬＶＷＣpＫ　Ｚ ＳＬＰ　３−ラミニン細胞結合（ＳＬＰ−Ｌ　）の・　のための　　　・に′　 なポ寡マーの人　。 ヒトラミニンＢｌ、すなわち細胞が付着し、そして増殖するある細胞外基部膜の タンパク質成分のアミノ酸配列は、神経細胞のための受容体付着部位を付与する ことに包含されたペンタペプチド、ＹＩＧＳＲを含む。２種の絹様ポリマー（１ つは、それぞれペンタペプチドを含む１２個のアミノ酸配列であり、そして他は 同じような１４個のアミノ酸配列である）を企画した。　　５ＬＰ−Ｌｌと命名 された第１ポリマーにおいては、ＳＬＰ　３（７）５９個ノアミノ酸モノマーが 、配列ＹＣＥＤＧＹ　ＩＧＳＲＣＤ　（７）包含により、そのチロシン残基の近 くで中断された。ＳＬＰ　−Ｌ２においては、その包含配列はＬＣＶＳＥＰＧＹ 　［ＧＳＲＣ口であった。それらはＢ−鎖構造に適合しないので、紐様鎖のＢ− 鎖構造体内に組込まれる場合、再配列は整されていないループを形成するに違い ない、　　５ＬＰ−Ｌｌ及び５ＬＰ−Ｌ２は、培養において及び４７　　旦工で 神経細胞の付着のための合成支持体を供給するように企画されている。傷つけら れた神経の再生のための神経管中へのこれらのポリマーの配合は、１つの可能な 適用である。 」υヨ」［月１戊・ 下記のような２種のオリゴヌクレオチド鎖を、方法のセクションに記載されてい るようにして、合成し、そして精製した： これらのオリゴヌクレオチド鎖を、アニールし、そして力＋ｔｌ　　ＲＥＮによ りすでに消化されたプラスミドｐｓＹ１３０４　（ＷＯ８８１０３５３３、６５ ページを参照のこと）に連結した。 この連結反応の生成物により、旦−ユユ鎖）ＩＢＩＯＩを形質転換した。形質転 換体のプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＢａｎ　Ｉにより消化し；正しい大き さの挿入体を含むクローンを、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＶ　ＲＥＮにより消化し、 正しい配向を決定した。正しいクローンからのプラスミドＤＮＡを配列決定した 。プラスミドｐＴＯ１２０（第５表に示される）は所望する５ＬＰ−Ｌｌモノマ ー配列を含み、オリゴヌクレオチド（ｉ）及び（ｉｉ　）は濃い字で下記に示さ れ、そして下線を引かれている。 芽」Ｌ聚 ｐＰＴＯ１２０からのプラスミドＤＮＡをＢａｎ　Ｉ　　ＲＥＮにより消化し、 そしてその消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。　２１ ６ｂｐの５ＬＰ−Ｌｌ遺伝子フラグメントを切り出し、そしてＮＡＣＳカラム（ 方法のセクションを参照のこと）により精製した。精製されたフラグメントを、 ＲＥＮ　Ｒａｎ　Ｉによりすでに消化されているプラスミドｐｓＹ１２６２に連 結した。 この連結反応の生成物を用いて、旦−ユ史株ｆｌＢ１０１を形質転換した。耐カ ナマイシン性を有する形質転換体を選択した。 個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＳＬＰ　−Ｌｌの複 数ＤＮＡ挿入による大きさの増大を分析した。 １　Ｋｂｐ〜４　Ｋｂｐの大きさのいくつかのクローンを得た。約３．０Ｋｂｐ の挿入体を有する１つのクローンｐＰＴＯ１２３を、発現及びタンパク質分析の ために選択した。 」堕二４坐揚底・ 下記追加の２種のオリゴヌクレオチド鎖を、前記方法のセクションに記載される ようにして合成した：１ｉｉ）５’−ＣＴＳτＧＴＧＴＴＡＧＣＧＡＡＣＣＣ− ３’ｉｖ）　　３’−ＡＣＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＧＧ　　−５ ’これらのオリゴヌクレオチド鎖を、アニールし、そしてＰｓｔＩ及びＳｍａ　 Ｉ　　ＲＥＮにより消化されているプラスミドｐＰＴＯ１２０と連結した。クロ ラムフェニコールに耐性の形質転換体コロニーからのプラスミドＤＮＡを精製し た。　ＲＥＮ　Ｐｓｔ　Ｉにより消化されない１つのプラスミド、ｐＰＴＯ１２ １（第６表を参照のこと）を、配列決定し、そして所望するＳＬＰ　−Ｌ２モノ マー遺伝子フラグメントであることがわかった。オリゴヌクレオチド鎖（ｉｉｉ ）及び（ｉｖ）は、下記に濃い字で示され、そして下線を引かれている。 ＡＧＣＧＧＡＧＣＧ−３’ ＴＣＣ，ＣＣ”、ＣＧＣ−５’ ｐＰＴＯ１２１からのプラスミドＤＮＡを、地組Ｉ　　ＲＥＨにより消化し、そ してその消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離する。　２２２ ｂｐのＳＬＰ　−Ｌ２遺伝子フラグメントを、切り出し、ＮＡＣＳカラム（方法 のセクションを参照のこと）により精製した。精製されたフラグメントを、Ｒ［ ！Ｎ　Ｂａｎ　Ｉにより消化されているプラスミドｐｓＹ１２６２に連結した。 この連結反応の生成物を用いて、Ｅ、コリ株Ｉ　Ｂ　１０１を形質転換する。 カナマイシンに対して耐性の形質転換体を選択する０個々の形質転換体からのプ ラスミドＤＮＡを、精製し、そして５ＬＰ−Ｌ２の複数のＤＮＡ挿入による大き さの増大を分析する。ＩＫｂｐ〜４　Ｋｂｐの大きさのいくつかのクローンを得 る。 工江見二しΔ発現・ ３０℃で増殖された一晩の培養物を用いて、２５０ｄのフラスコに含まれる５０ ｄの培地を接種した。カナマイシンを５０９／ｍ２の最終濃度で添加し、そして その培養物を３０°Ｃで撹拌（２００ｒｐａ＋）　シながらインキュベートした 。培養物が０．８の００．。。に達した時、その４０ｄを、４２°Ｃであらかじ め暖められた新しいフラスコに移し、そして同じ温度で約２時間インキエベート した。培養物（３０℃及び４２°Ｃ）を氷上で急冷せしめ、そして００、。。を 取る。１．０の００．。。のアリコートに分けられた細胞を、遠心分離により集 め、そしてＣＬＰ抗血清を用いてドツトプロット及びウェスターン分析を行なう ために使用した（方法のセクションを参照のこと）。精製及びアミノ酸分析のた めには、多量の培養物が使用された。 ｐＰＴｏ　１２３ＳＬ’Ｐ−Ｌｌタンパク質　１０６６　ＡＡ　　　潤８１，８ ００ＫＤＰＷＬＱＰ＋：　　’ＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＥＰＰＦＡＳＤＰＭ ＧＡＧＳ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　−［ＧＡＡＶＣＥＰＧＹＺＧＳＲＣＤＡＧＹ　 （ＧＡＧＡＧＳ　ｌ　ｇ　］　Ｌ　３ＧＡＡＶＣ三ＰＧ’ｉ　Ｘ　ＧＳＲＣＤＡ ＧＹ　（ＧＡＧＡＧ　Ｓ　）　−）ＧＡＧＡＨＤＰＧ：（ＹＱＬＳＡＧＲ”Ｅ’ ？ＱＬＶＷ（ＱＫ@： ５ＬＰ−Ｌ２タンパク質 ＭＤＰＷＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬ、、ＡＥＰ　Ｐ　ＦＡ　Ｓ　ＤＰ ＭＧＡＧ　Ｓ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　６！ＧＡＡＬＣＶＳＥ？Ｇ”１ＸＧＳＲＣ ＤＡＧＹ（ＧＡＧＡＣ５Ｉ９］１１ＧＡＡＬＣ’／　Ｓ　ＥＰＧ　Ｙ　Ｉ　ＧＳ 　ＲＣＤＡＧ　’ｌ　（ＧＡＧＡＧ　Ｓ　）　２　ＧＡＧＡＭＤＰＧ　ＲＹＱＬ ＳＡＧＲＹＥ（xＱＬＶＷＣＱＫ　Ｚ ＣＬＰ及びＣＬＰ　−ＣＢ 可゛　ゼル　　　　　　るコーー゛ン　ポ１マーの八　。 化学的に加水分解された天然コラーゲンを、他の用途の中で写真及び医学的用途 に使用されるゼラチンを生成するために、加熱し、そして冷却することによって 変性し、そして再生することができる。この現象を担当するコラーゲンの鎖特性 は、トリプルへりックスとして命名されるコンホメーションを有する核間凝集体 を自発的に形成するその能力である。 ヘリックスは、グリうメンにより占められる第３残基ごとの位置でペプチド主鎖 にひじょうに近い位置から生じる鎖とグリシン間の２つの位置でプロリン及びヒ ドロキシプロリンにより供給されるねじれとの間の弱い相互作用により安定化さ れる。３種のねじれ鎖の幾何学は、トリプルへリックス内の水系結合を可能にす る。その構造は、弱くなり、そして水、小さな有機及び無機分子、他のタンパク 質及び細胞との相互作用に容易に影響されやすくなる。コラーゲンは多くの異な ったアミノ酸配列から成るけれども、多くの構造的に安定するセグメントの１つ は、処理されたコラーゲン鎖のアミノ及び終結端で存在する。これらの末端は、 反復するトリペプチド配列ＧＰＰ　（２番目のＰはしばしばヒドロキシル化され る）からほとんど独占的に成る。コラーゲン様ポリマーＣＬＰは、反復するＧＰ Ｐ）リベプチドから主に構成される（個々のモノマーセグメント内に８個）。遺 伝子の全体の反復性を低め、そしてＤＮＡを良好に操作するために使用され得る 追加のコドンの使用を可能にするために、他のトリペプチドが含まれた。これら は、ＧＡＰ　（２度）、ＧＰＡ　、　ＧＰＶ及びＧＳＰ”ｉ’あった。これらの トリブレットのすべては、天然のコラーゲンに存在するが、但し、ＣＬＰに使用 される配列には存在しない。ＣＬＰの性質は、高温で熱可逆性ゲル化を受けるタ ンパク質ポリマーを生成するように企画され、そして非免疫原性であった。ヘリ ックスの高い安定性は、ＣＬＰから製造される繊維又は膜に高い引張り強さを付 与するはずである。これらの鎖性質は、堅い支持体に適用される場合、柔軟なコ ーチングとして作用する。水溶液中でのヒドロゲルコロイドの創造を可能にする 。ＣＬＰの単純な配列のために、その光学吸光度は、２２０ｎ＋ｍ以下の波長で 最小であるべきである。 ・　　　を　すｉ粟軟ユニ±ｌグせ旦立企Ｉ。 コラーゲン様ポリマーの種々の配合性質は、移植可能な装置に使用される生物材 料としてそれらを理想的にする。補てつの表面上のコーチングとして又は装置自 体の構造成分として、ＣＬＰは、改良された血液及び細胞の相互作用を提供する ことによって組織結合を促進せしめることができる。後者の機能は、細胞受容体 のためにリガンドとして作用する特異的アミノ酸配列により天然のコラーゲンに 媒介される。細胞付着活性を有するＣＬＰポリマーを創造するためには、配列Ｇ ＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰが、ＣＬＰモノマー配列配列台まれ た。疎水性ＧＰＰコラーゲン様フランキング配列に比べて、２１個の高く荷電さ れた親水性アミノ酸のブロックは、細胞との相互作用を受けやすい不安定化され た柔軟ならせん領域を形成するはずである。移植された装置の表面の表皮化の進 行は、その寿命及び安全性を高める適合性及び拒絶特徴を改良するであろう、対 象の組成物は、新生血管形成を可能にする創（ｇ　用包帯、眼への適用物、人工 器官のためのマトリックス及び同様のものとして使用され得る。 ＣＬＰモノマーの創Ｋ。 ＣＬＰ　（コラーゲン様タンパク質）合成遺伝子を、小さな部分からアセンブリ ーした。まず、下記のような４０〜６０ｂｐの長さのＤＮＡの３本の二本鎖断片 を、化学的に合成した：ＧＣＣＡＣＧ（１；ＧＧＡＣＣＡＧＧＣＧＧＡＣＣＡＧ ＧＣＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＴＧ 断片Ａ及びＣ（矢印の後の断片Ｃの配列はＣＬＰをコードしないが、しかし受容 体プラスミドの複数のクローニング部位の変性である）を、適切なＲＥＮにより 消化されているプラスミドｐＵｃ１９中に別々にクローン化した。そのＤＮＡ配 列を確かめ、そして正しい配列を担持する２種のプラスミド、ｐＰＴｏｌｌｌ及 びＰＰＴＯ１１２を選択した。断片Ｂを、坦頃■及びＳａｇａ　Ｉ　　ＲＥＮに より消化されているｐＰＴＯｌｌｌに連結した。プラスミドｐＰＴＯ１１３を配 列決定し、そして正しいことが見出された。 プラスミドｐＰＴＯ１１２及びｐＰＴＯ１１３を、適切なＲＥＮにより消化し、 断片Ｃ及び断片Ａ＋Ｂをそれぞれ開放した。精製の後、これらのＤＮＡフラグメ ントを、Ｂａｎ　Ｉ及びＢｃｏＲＶ　ＲＥＮにより前もって消化されたｐＳＹ９ ３７に連結した。この連結反応の生成物を用いて、Ｅ、コリ株ＨＢＩＯＩを形質 転換した。形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＢａｎ　Ｉによ り消化し；正しい大きさの挿入体を含むクローンを配列決定した。プラスミドｐ ＰＴＯ１１６は、断片Ａ＋Ｂ＋Ｃのために示される所望する配列を含んだ（第７ 表を参照のこと）。 下記のような２種のオリゴヌクレオチド鎖を、前記方法のセクションに記載され るようにして合成した：それらの２種のオリゴヌクレオチド鎖を、アニールし、 そ（ｐｓＹ９３７におけるＣＬＰモノマー）のＤＮＡに連結した。 この連結反応の生成物により、旦−ユユ鎖ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換 体のプラスミドＤＮＡを精製し、Ｒａｎ　Ｉにより消化し；正しい大きさの挿入 体を含むクローンを、楔■及びｊｌｌ　　ＲＥＮにより消化し、正しい配向を決 定した。正しいクローンからのプラスミドＤＮＡを配列決定した。プラスミドｐ ＰＴＯ１１？（第８表に示される）は所望するＣＬＰ　−ＣＢモノマー配列を含 み、オリゴヌクレオチド（ｉ）及び（ｉｉ　）は濃い字で下記に示され、そして 下線を引かれている。 ＧＡＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＡ ＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＰＰＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ ＧＰＡＧＰＶＧＳＰＧＡ ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＴＡＧＧＴＡＧＣＣＣＣにＧＴＧＣＣ−３’ ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＣＣＡＧ（−ＴＣＡＴＣＣＡＴＣＧＧＧＧＣＣＡＣＧＧ　− ５’ＣＬＰ　　びＣＬＰ　−ＣＢの　　。 ３０°Ｃで増殖された一晩の培養物を用いて、２５０ｄのフラスコに含まれる５ ０ｄの培地を接種した。カナマイシンを５０ｎ／−の最終濃度で添加し、そして その培養物を３０°Ｃで撹拌（２００ｒｐｍ）　Ｌながらインキュベートした。 培養物が０．８の００６０゜に達した時、その４０−を、４２°Ｃであらかじめ 暖められた新しいフラスコに移し、そして同じ温度で約２時間インキュベートし た。培養物（３０°Ｃ及び４２℃）を氷上で急冷せしめ、そして００６゜。を取 る。１．０の００．。。のアリコートに分けられた細胞を、遠心分離により集め 、そしてＣＬＰ抗血清を用いてドントブロント及びウェスターン分析を行なうた めに使用した（方法のセクションを参照のこと）。精製及びアミノ酸分析のため には、多量の培養物が使用された。 ｐＰＴＯ１２２ＣＬＰタンパク質　　７６０　ＡＡ　　　　　ＭＷ　６３，８０ ０ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ（（ ＧＡＰ　（ＧＰＰ）　３］　ｚＧＰＶＧｓＰ　）ＧＡＭＣＡＨＲＹＱＬＳＡＧＲ ＹＨＹＱＬシーＣＱＫＺｐＰ丁０１２７　　　　ＣＬＰ−ＣＢ　タンパク質　８ １４　ＡＡ　　　ＭＷ　７０，５６０ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬ ＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ（（ＧＡＰ　（ＧＰＰ）　：ｌ］　ｔ　（ＧＬＰ ＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡ）ＧＰＶＧＳＰ　）ＣＡＭＣＡ） ＩＲＹＱＬＳＡＧＲＹＨＹＱＬＶＷＣＱＫＺ上記方法の後、他のポリマーを調製 する。これらのポリマーは、細胞表面受容体と相互作用するりガント配列を含む ことによって細胞機能に影響を及ぼす。これらのポリマーは、ヒトラミニンＢ１ からの神経細胞付着促進配列ＹＩＧＳＲをコードするオリゴヌクレオチドを、Ｓ ａｍ　１部位でのＥＬＰ　　Ｔのタンパク質ポリマー配列中に挿入することによ って調製される。 さらに、ポリマーは、ヒトＭＨＣクラスＩ　　ＨＬＡ−Ａ２からのＴ細胞受容体 結合配列、 ＰＥＹＤＧＥＴＲＫＶＫＡＨ５ＱＴＨＲＶＤＴＬＲＹ　（残基５７〜８４）及び ＴＲＫＷＡＡ）ＩＶＥＱＬＲＡＹＥＧＴＶＥＷＲＹ　　（残基１４３〜１７１） をコードするオリゴヌクレオチドを、Ｐｓｔ１部位を含む遺伝子位置で、他の態 様によりＳＬＰ　Ｉポリマー中に挿入することによって調製される。 これらのポリマーは、化学反応性の活性を示し、そしてそれら自体と又は他のポ リマー又は材料と架橋する。これらのポリマーは、配列ＤＰＧＫ、　ＮＰＧＣ又 はＲＰＧＥをコードするオリゴヌクレオチドを、合成ポリマー遺伝子、ＳＬＰ　 ＩＩＩのＰｓｔＩ部位中に挿入することによって調製される。化学的に反応性の ポリマーの他の例は、配列ＧＡＧＤ、　ＧＡＧＣ又はＧＡＧＫをコードするオリ ゴヌクレオチドを合成ポリマー遺伝子のＢａｎ　１１部位中に挿入することによ って、又は配列ＧＥＧＶＰ、　ＧＣＧＶＰ又はＧＫＧＶＰをコードするオリゴヌ クレオチドを合成ポリマー遺伝子ＥＬＰ　ＩのＳｅａ　Ｉ部位中に挿入すること によって調製される。合成ポリマー５ＬＰＩＶ及びＥＬＰ　　Ｉは、前記ＰＣＴ 出願に記載されている。 追加の組成物を、上記方法に従って調製する。これらの組成物は下記のものを包 含する： 瀘ｊ」ＰＬ乙二 ＳＬＰ　　Ｉ　　　　　［（ＡＧＡＧＳＧ）＋３ＴＬＥＤＰＲ）ｎＳＬＰ　　ｍ 　　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）　９ＧＡＡＧＹ］　ｎ５ＬＰ　　４　　　　　　 ［（ＧＡＧＡＧＳ）　６］　−５ＬＰ　　５　　　　　　［（ＧＡＧＡＧＱ）　 ｂ）□ＳＬＰ　　６　　　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＧＹＧＡＧＹｌ− ＥＬＰ　　１　　　　　　［（ＶＰＧＶＧ）４］。 ＣＬＰ　　Ｉ　　　　　（［ＧＡＰ　（ＧＰＰ）　４］　＊ＧＰＡＧＰＶＧＳＰ 　）　−ＫＬＰ　　１　　　　　（［（ＡＫＬＫＬＡＥ）（ＡＫＬＥＬＡＥ）１ ．］　。 コポリマー ５ＺＬＰ　Ｏ（ＥＢＳＩ）　　［（Ｇ−’ＧＶＰ）Ｂ・（ＧＡＧＡＧＳ）２１ｎ Ｓｘ−ＬＰ　ｌ　　　　　［ＧＡＡ（ＶＰＧ”ＪＧ　）　４ＶＡＡＧＹ　（ＧＡ ＧＡＧＳ　）　９］　ｎＳＥ”−２２（（ＧＡＧＡＧＳ）６ＧＡＡＧＹ（ＧＡＧ ＡＧＳ）５（ＧＶＧＶＰ）８］ｎ５ＥＬＰ　３　　　　　［（ＧＶＧＶＰ）ｓ（ ＧＡＧＡＧＳ）８］ｎ１１団ＰＬ三二 ５ＬＰ−Ｃ［Ｉ　ＧＡＧＡＧＳ　）　９ＧＡＡＧＡＧＣＧＤＰＧＫＧＣＣＶＡＧ ＡＧＹ　］ｎ５ＬＰ−Ｆ　　　　　Ｉ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　９ＧＭｖＴＧＲＧ ＤＳＰＡＳＭＧＹ　Ｉ　ｎ５ＬＰ−Ｌｌ　　　　　（ＧＡＡＶＣＥＰＧＹＩＧＳ ＲＣＤＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　９］ｎ５ＬＰ−Ｌ　２　　　　　［ＧＡＭ 、Ｃ’ＶＳｘ−Ｘ？ＧＹ　Ｚ　ＧＳＲＣＤＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　ｇ　］ 　ｎ５ＬＰ−Ｖｌ　　　、　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＡＲＰＳＬＴＫＫ ＱＲＦ’ＲＥＲＮＲＫＧＹＲ５ＱＲＧＨ５ＲＧＲＮＱＮＳＲＲＰＳＡＡＧＹｌｎ ＳＬＰ−７２［（ＧＡＧＡＧ　Ｓ　）　９　ＧＡＡＡＲＰＳＬＴＫＫＱ「四戎肚 ＧＹＲ５ＱＲＧＨ５ＲｆｔＰｓＡＧＹ］ｎ ５ＬＰ−Ｆ−Ｌｌ　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡ ＡＶＣＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡＧＹＩ。 ５ＬＰ−Ｆ−Ｌ２　　　　［Ｉ　ＧＡＧＡＧＳ　）　９ＧＡＡ−、−５ＲＧＤＳ ＰＡ５ＡＡＬＣＶＳＥＰＧＹ　ＩＧＳＲＣＤＡＧＹ　１ｎＳＥＬＰ２−５ＬＰＦ 　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）５（ＧＶＧＶＰ）ｓ（ＧＡＧＡＧＳ）６ＧＡＡＶＴＧ ＲＧＤＳＰＡＳＡＧＹＩｎ ＳＥＬＰ３−５ＬＰＦ　　　［ＴＧＡＧＡＧＳ１８（ＧＶＧＶＰ）８（ＧＡＧＡ ＧＳ）９ＣＭＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＧＹＩｎ ＳＬＰＣ−５ＬＰＦ　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＧＡＧＣＧＤＰＧＫＧＣ ＣＶＡＣＡＧＹ（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡ５ＡＡＧＹ　ｌｎ ボッマー　ＣＬＰ ＣＬＰ／ＣＢ　　　　　（［ＧＡＰ　（ＧＰＰ　）　４１２（ＧＬＰＧＰＫＧＤ ＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ　）ＧＰＡＧＰＧｓｐ　）。 ＣＬｐ−Ｆ　　　　　（［ＧＡ：１ｔｃｐｐ　）　４］　２ＧＰＡ　（ｖＴｃａ ｃＤｓｐＡｓＡＡ）ＧＰＶＧＳ：ｌ　）。 （−ｐ−ｒ、１　　　　　（［ＧＡ：’　（（ａ？？　ｌ□］、、；ｐＡ（Ｘ！ （ΣＰ＋：ＹＴＧＳＲＣＤＡ）ＧＴｌｔ７ＧＳ：））。 ＲｓｏｓｓｉＲｐｓｃｐｖｃｓｐ）。 ＣＬＰ−Ｖ２　　　　（（ＧＡＰ　（ＧＰＰ　）４　］　２ＧＰＡＡＲＰＳＬＴ ＫＫＱＲＦ’ＲＨＲＮＲＫＧＹＲ５ＯＲＧＨ５ＲＲＰＳＧＰＶＧＳＰ　）。 ＣＩ、Ｐ／Ｃ３−Ｆ　　　（［ＧＡＰ［ＧＰＰ）４１２（Ｇｌ、ＰＧＰＫＧＤＲ ＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＩ（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡ）ＧＰＶＧＳＰ ）ｎＣＬＰ／ＣＢ−Ｌｌ　　　（［ＧＡＰ（ＧＰＰ）４ｔ□（ＧＬＰＧＰＫＧＤ ＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡ）（ＶＣＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡ　）ＧＰＶ ＧＳＰ）ｎＣＬＰ／ＣＥ−Ｌ２　　　（（ＧＡＪｌ（ＧＰＰ）４）２（Ｇｌ、Ｐ ＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＩ）ＧＳＰＧＰＡ）（Ｌｃｖｓｚｐｃｎｃ、５Ｒｃ ｐＡ）ｃｐｖｃｓｐ）。 ＣＬＰ／ＣＢ−Ｆ−ｒ、ｌ　　（［ＧＡＰ（ＧＰＰ）４１２（ＧＩ、ＰＧＰＫＧ ＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡ）（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡ　）　（Ｖ ＣＥｐＧｙ工５ＲＣＤＡ　）ＧＰＶＧＳＰ　）ＣＬＰ／ＣＢ−Ｆ−１，２（［Ｃ ＡＰ（ｃｐｐ）４］２＜ｃｒ、、ｐｃｐＫｃ、ＤＲｃｏＡｃｐｚＧＡＤＧｓｐｃ ｐｐ、＞（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡ　）　（ＬＣＶＳＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡ 　）ｃｐｖｃｓｐ　）。 ボｌ　７−　　ＡＤＨＥＳＩＶＥ ＫＬＰ−Ａ　　　　（［（ＡＫＬＫＬＡＥ　＞　Ｔ　ｐｓｒ、ユ明）４ＧＲＧＧ ＳＦＧＧＳＳＹＧＧＧＳ　）。 ＡＬＰ　ｌ　　　　　　［（ＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴ）３］ｎ５ＬＰ−ＡＬＰ　　 　　［（ＧＡＣＡＧＳ）９ＧＡＡＶ（ＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰ）３．ＩＩＴＡＧＹ ］ｎｍｚｌＣＩ、Ｐ−ＡＬＰ　　　　（（ｃＡＰｃｃｐｐ）４］２（ＴｎｃＡＫ ｐｓｙｐｐ）３ｒｎａｐＡｃｐｖｃｓｐ）ｎｍ２１土ｊ」輩り乙二 ＳＬＰ　工［（ＡＧＡＧＳＧ）１３ＴＬＥＤＰＲ，Ｉｎ５ＬＰ　ＸＸ工　　　　 （（ＧＡＧＡＧＳ　）　９ＧＡＡＧＹ　］　Ｉｎ５ＬＰ４　　　　　　［（ＧＡ ＧＡＧＳ）６］ｎ５ＬＰ　５　　　　　　［（ＧＡＧＡＧＱ）６］。 ＳＬＰ　ｏ　　　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ　ｌ　９　ＧＡＡＧＹＧＡＧ’Ｚ　］ 　ｎＥＬｚ’　ｌ　　　　　［（ＶＰＧＶＧ）４．ｉ。 ＣＬＰ　工（［ｃａｐ（ｃｐｐ＋４＋２ｃｐＡａｐｖｃｓｐ）。 ＫＬ？　＝　　　　　（［に＋、ｇＬＫＬＡａ）（■ＬＥＬＡＥ　）　］　４） 。 ユ」巳ヒ乙： ５ＥＬＦ　Ｏ（三ＢＳＩＩ　　［（ＧＶＧ￥Ｐ）８ｆＧＡＧＡＧｓ）２］。 ５ＥＬＰ　１　　　　　［ＧＡＡ（ＶＰＧＶＧ）　ＶＡＡＧＹ（ＧＡＧＡＧＳ） ９）。 ５ＥＬＰ　２　　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）６ＧＡＡＧＹ（ＧＡＧＡＧＳ　：Ｔ ＧＶＧＶＰ）８）ｎＳｃＬＰ　３　　　　　［（ＧＶＧｖＰ）　（ＧＡＧＡＧＳ 　）　ｓ　ｌ　ｎ１１目ＰＬ乙二 ５ＬＰ−Ｃ［（ＧＡＧＡＧＳ　）９ＧＡＪｋＧＡＧＣＧＤＰＧＫＧＣＣ’ＶＡＧ ＡＧＹ　］Ｉｎ５ＬＰ−Ｆ　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＶＴＧ’ＲＧＤ ＳＰＡＳＡＡＧＹ　１ｎＳＬＰ−Ｌｌ　　　　　［ＧＡＡＶＣＥＰＧＹＩＧＳＲ ＣＤＡＧＹ　（ＧＡＧＡＧＳ　）　９］ｎ５ＬＰ−Ｌ２　　　　　［ＧＡＡＩ、 ＣＶＳＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡＧＹ　（ｃＡｃＡｃｓ　）ｇ　］Ｉｎ５ＬＰ−Ｖ １　　　　　　　　［（ＧＡＣＡＧＳ）　９ＧＡＡＡＲＰＳＬＴＫＫＱＲＦＲＨ ＲＮＲＫＧＹＲ５ＱＲＧＥＳＲＧＲＮＯＮＳＲＲＰＳＡＡＧＹ　］Ｉ ＳＬＰ　−１２［（ＧＡＧＡＧＳ　）　９ＧＡＡＡＲＰＳＬＴＫＫＱＲＪ″ＲＨ Ｒ皿ＫＧＹＲ５ＱＲＧＨ５四ＰＳＡＧＹ　ｌ。 ５ＬＰ−Ｆ−Ｌｌ　　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡ ＡＶＣＥＰＧＹ工ＧＳＲＣＤＡＧＹ　１ｎＳＬＰ−Ｆ−Ｌ２　　　　ｔ＋ｃＡｃ ＡＧｓ）９ｃＡＡｖＴｃｉｃＤｓｐｘｓＡＡＬｃｖｓｒ：ｐｃｙｘｃｓｐｃｐＡ ｃｙ＋。 ５ＥＬＰ２−５ＬＰＦ　　　［（にＡＧＡＧＳ）５（ＧＶＧＶＰ）８（ＧＡＧＡ ＧＳ）６ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＧＹＩｎ ＳＥＬＰ３−５ＬＰＦ　　　［（ＧＡＧＡＧＳＩ８（ＧＶＧ￥Ｐ）８（ＧＡＧＡ ＧＳ）９ＧＡＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹＩ。 ５ＬＰＣ−５ＬＰＦ　　　［（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡＧＡＧＣＧＤＰＧＫＣ； ＣＣＶＡＧＡＧＹ（ＧＡＧＡＧＳ）９ＧＡＡｖＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡＧＹ１ｎ ボｉマー　ＣＬＰ ＣＬＰ／ＣＢ　　　　　（［ＧＡＰ　（ＧＰＰ　）　４］　２（ＧＬＰＧＰＫＧ ＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ　）ｃｐＡｃｐｖｃｓｐ　）。 ＣＬＰ−Ｆ　　　　　（［ＧＡＰ　Ｉ　ＧＰＰ　）　４］　２ＧＰＡ　（ＶＴＧ ＲＧＤＳＰＡＳＡＡ　）ＧＰＶＧＳＰ　）。 ＣＬｒ’−Ｌｌ　　　　　（［ＧＡＰ　ＴＧＰＰ　）　４］　２ＧＰＡ　（ＶＣ ＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡ　）ＧＰＶＧＳＰ　）。 ＣＬＰ−Ｌ　２　　　　　（（ＧＡＰ　（ｃｐｐ　４４］　２ＧＰＡ　（ＬＣＶ ＳＥＰＧＹ　工ＧＳＲＣＤＡ　）ＧＰＶＧＳＰ　）。 ｐｃＬｐ−ｖｌ（［ＧＡＰ　＜ａｐｐ　）　４］　２ｃｐＡＡＲｐｓＬＴＫｘｏ ＲＦＭＲｘＫｃＹｕｓｏＲｃａｓａｃＲＮｏｓｓＲＲｐｓｃｐｖｃｓｐ　）ｎＣ ＬＰ−Ｖ２　　　　　（［ＧＡＰ　（ＧＰＰ　）　４］　２ＧＰＡＡＲＰＳＩ、 ＴＫＫＯＲＦＲＨＲＮＲＪ（ＧＹＲ５ＯＲＧＨ５ＲＲＰＳＧＰＶＧＳＰ　）。 ＣＬＰ／ＣＢ−Ｆ　　　　（（ＧＡＰ（ＧＰＰ）４］２（ＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧ ＤＡＧＰＫＧＡＪ）ＧＳＰＧＰＡ）（響ＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡ　）ｃｐｖｃｓｐ 　）。 ＣＬＰ／ＣＢ−Ｌｌ　　　（ｒｃｖ（ｃｐｐ）４１２（ｃｒ、ｐｃｐＫｃｏＲｃ ｏＡｃｐｉ＜ｃＡＤＧｓｐｃｐＡ）（ＶＣＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡＩＧＰＶＧＳ Ｐ）ｎＣＬＰ／ＣＢ−Ｌ２　　　（［ＧＡＰ（ＧＰＰ）４］２（ＧＬＰＧＰＫＧ ＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡ）（ＬｃｖｓｚｐａｎｃｓＲｃｏＡ）ｃｐ ｖｃｓｐ）。 ＣＬＰ／ＣＢ−Ｆ−ＬＩ　　Ｃ［ＧＡＰ＋ｃｐｐ）４＋２（ＧＬｐｃ、ｐＫｃＤ ＲｃｓｏＡｃｓｐｙｃＡＤＧｓｐｃｐｘ）（ｖＴｃＲｃｏｓｐＡｓ、ｅＩＡ）　 ＋　ＶＣＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡ　）ｃｐｖｃｓｐ　）。 ＣＬＰ／ＣＢ−Ｆ−Ｌ２　　（［ＧＡＰ［ＧＰＰ）４＋２（ＧＬＰＧＰＫＧＤＲ ＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＩ（ＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＡＡ　ｌ　ｌ　ＬＣ ＶＳＥｌ’ＰＧＹＸＧＳＲＣＤＡ　）ＧＰＶＧＳＰ　）。 ボッマー　、 ＫＬＰ−Ａ　　　　　（［（ＮＣＬＫＬＡＥ）　［ＡＪＣＬＥＬＡＥ　）　］　 ４ｃｎｃｃｓｒｃｃｓｓｙｃｃａｓ　）。 ＡＬＰ　Ｌ　　　　（（ＹＫＡｊＣＰＳＹＰＰＴ　）３　］。 ］Ｓｒ、Ｐ−ＡＬＰ　　　［（ＧＡＧＡＧＳＩ９ＧＡＡＶ（ＴＹＫＡＫＰＳＹＰ Ｐ）３ｒｎＴＡＧＹＩ、　　ｍ１ＣＬＰ−ＡＬＰ　　　　（（ＧＡＰＩ　ＧＰＰ ）　３１２　（ＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰ　）　３ｍＧＰＡＧＰＶＧＳＰ　）　ｎ　 ｍ≧１構造的な能力、たとえば繊維、フィルム及び膜形成をもたらしながら、特 異的アミノ酸配列が環境に容易に利用できるようになされ得る、良好な構造特性 及び新規の能力を有するポリマーを製造するための強力な能力が提供されること が、上記結果から明らかである。従って、ポリマーは、構造特徴、たとえば良好 な引張り、たとえば機械的性質を有する製品形成を提供するために相互作用する 鎖から構成され、そして同時に、広範囲の種類の生物学的及び化学的用途に使用 され得るアミノ酸配列を供給する。本発明の組成物は、媒体物質としてアミノ酸 配列は、（ここで広範囲の種類の元素と特異的にキレート化することができ）、 精製媒体として、無機又は有機材料、たとえば炭素繊維、ナイロン繊維、ニトロ セルロース、等と組合される複合材料、ラミネート、接着剤として、細胞の増列 のためのフラスコ被膜として、アフィニティーカラムとして、生物学的材料のた めの支持体として及び同様のものとして、広範囲の種類の特異的結合物質を結合 するために使用され得る。 本明細書に引用されるすべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組 込まれている。 前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的にいくらか詳細に記載され ているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。 国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．製品に形成できる整合された構造体にアセンブリーすることができる反復単 位の鎖及び前記反復単位以外の介在オリゴペプチド（該ペプチドは整合されてい ないことを特徴とする）により連結される少なくとも２本の鎖を含んで成るタン パク質性ポリマー。
2. ２．前記反復単位が天然のポリマー及び約３〜３０個のアミノ酸の反復単位であ り、前記鎖が約２５〜１５０個のアミノ酸のものであり、そして前記介在オリゴ ペプチドが、前記鎖のそれぞれの間に介在し、そして約６〜３０個のアミノ酸の ものである請求の範囲第１項記載のポリマー。
3. ３．前記反復単位が、フィブロイン、エラスチン、ケラチン又はコラーゲンの反 復単位又は該反復単位のマルチマーの組合せである請求の範囲第１項記載のポリ マー。
4. ４．前記介在オリゴペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤ，ＤＰ，ＥＰ，ＤＰＧＫＧ ＸＹ（ここでＸ及びＹの少なくとも１つはＣである）、ＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤＡ ＧＹ，ＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫ又はＡＶＴＧＲＤＳＰＡＳを含み、ここで保存性 置換が官能部位以外で生ぜしめられ得る請求の範囲第４項記載のポリマー。
5. ５．前記ポリマーが、２種の異なった反復単位のマルチマーを含んで成るブロッ クコポリマーである請求の範囲第１項記載のポリマー。
6. ６．配列ＧＡＧＡＧＳ，ＶＰＧＶＧ又はＧＰＰ及びＧＡＰの少なくとも１つを有 し、そして製品に形成できる整合された構造体にアセンブリーすることができる 反復単位の鎖及び前記反復単位以外の介在オリゴペプチド（該ペプチドは整合さ れていないことを特徴とする）により連結される少なくとも２本の鎖を含んで成 るタンパク質性ポリマー。
7. ７．製品に形成できる整合された構造体にアセンブリーすることができる反復単 位の鎖及び前記反復単位以外の介在オリゴペプチド（該ペプチドは整合されてい ないことを特徴とする）により連結される少なくとも２本の鎖を含んで成るタン パク質性ポリマー（該ポリマーは同じか又は異なった反復単位の個々の鎖を有す る）をコードするＤＮＡ配列。
8. ８．前記反復単位が天然のポリマー及び約３〜３０個のアミノ酸のものであり、 前記鎖が約２５〜１５０個のアミノ酸のものであり、そして前記介在オリゴペプ チドが、前記鎖のそれぞれの間に存在し、そして約４〜５０個のアミノ酸のもの である請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列。
9. ９．記反復単位が、配列ＧＡＧＡＧＳ，ＶＰＧＶＧ、又はＧＰＰ及びＧＡＰの少 なくとも１つを有する反復単位又は該反復単位のマルチマーの組合せである請求 の範囲第７項記載のＤＮＡ配列。
10. １０．前記介在オリゴペプチドが、アミノ酸配列ＲＧＤ，ＤＰ，ＥＰ，ＤＰＧＫ ＧＸＹ（ここでＸ及びＹの少なくとも１つはＣである）、ＥＰＧＹＩＧＳＲＣＤ ＡＧＹ，ＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫ又はＡＶＴＧＲＤＳＰＡＳを含み、ここで保存 性置換が官能部位以外で生ぜしめられ得る請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列。
11. １１．複数システム及び請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を含んで成るベクタ ー。
12. １２．前記複数システムが原核生物のシステムである請求の範囲第１１項記載の ベクター。
13. １３．複数システム及び請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を含んで成る原核細 胞。
14. １４．製品に形成できる整合された構造体にアセンブリーすることができる反復 単位の鎖及び前記反復単位以外の介在オリゴペプチド（該ペプチドは整合されて いないことを特徴とする）により連結される少なくとも２本の鎖を含んで成るタ ンパク質性ポリマーの調製方法であって：原核細胞において機能的な複製システ ム及び前記原核細胞において発現でき、そして前記タンパク質性ポリマーをコー ドする遺伝子を含んで成る原核細胞を、適切な栄養培地で増殖し、それによって 前記タンパク質性ポリマーを発現せしめることを特徴とする方法。