JP6383721B2 - 創傷治癒剤 - Google Patents
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Description
本発明は、創傷治癒剤に関する。
熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創や、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒するためには、創傷部を適度な湿潤環境に保ち、細胞増殖を促す環境を作り出す必要がある。そのために患部に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、また、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部から脱離したり、菌感染の温床になる問題がある。
一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、従来の創傷治癒剤を用いた場合、生体防御反応の一つである異物反応が起き、創傷治癒過程である炎症期への移行を遅延させ、結果的に創傷治癒を遅延させる場合がある。よって、創傷治癒剤由来の異物反応が抑制される創傷治癒剤が求められている。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部から脱離したり、菌感染の温床になる問題がある。
一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、従来の創傷治癒剤を用いた場合、生体防御反応の一つである異物反応が起き、創傷治癒過程である炎症期への移行を遅延させ、結果的に創傷治癒を遅延させる場合がある。よって、創傷治癒剤由来の異物反応が抑制される創傷治癒剤が求められている。
本発明は、菌増殖を抑制し、かつ肉芽組織形成や上皮化を促進し、さらに異物反応が抑制される創傷治癒剤を提供することを目的とする。
本発明は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求めた上記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であり、上記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合が５０〜７０％である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制作用があり、肉芽組織形成や上皮化促進作用に優れ、異物反応が抑制されるという効果を奏する。
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であり、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうちアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の占める合計割合が５０〜７０％である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
本発明において、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）が効率よく細胞と相互作用し、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、長期的にゲル構造を保持することができる。また、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合並びにタンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合が上記範囲であることで、創傷治癒剤による異物反応が抑制される。また、本発明の創傷治癒剤は、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷に適用した際にゲル化し、創傷部を密閉することができ、菌の増殖を抑制することができる。また、ゲル化物は、湿潤環境を維持し、細胞の増殖を促すことができる。
本発明のタンパク質（Ａ）は、円二色性スペクトル法により求めたタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であるタンパク質である。通常、タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等により、タンパク質のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は異なる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、細胞との相互作用のしやすさ（以下、細胞親和性と略記する）の観点及び異物反応を抑制する観点から、６０〜８５％が好ましく、さらに好ましくは６５〜８０％、特に好ましくは７０〜７５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）を硫安沈殿、限外濾過、アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により、リフォールディングさせることによって増加させることができる。また、上記割合は、タンパク質（Ａ）を変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、下記測定法によって求める。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、細胞との相互作用のしやすさ（以下、細胞親和性と略記する）の観点及び異物反応を抑制する観点から、６０〜８５％が好ましく、さらに好ましくは６５〜８０％、特に好ましくは７０〜７５％である。
上記割合は、タンパク質（Ａ）を硫安沈殿、限外濾過、アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により、リフォールディングさせることによって増加させることができる。また、上記割合は、タンパク質（Ａ）を変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合は、下記測定法によって求める。
＜タンパク質のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらを合計し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合とする。
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらを合計し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合とする。
本発明において、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を複数個有していてもよく、アミノ酸配列（Ｘ’）を複数個有していてもよい。また、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なっていてもよく、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ’）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ’）の種類が異なっていてもよい。さらに、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）と、アミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を複数個有していてもよく、アミノ酸配列（Ｘ’）を複数個有していてもよい。また、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ）の種類が異なっていてもよく、タンパク質（Ａ）が複数個のアミノ酸配列（Ｘ’）を有している場合には、各アミノ酸配列（Ｘ’）の種類が異なっていてもよい。さらに、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）と、アミノ酸配列（Ｘ’）とを共に有していてもよい。
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。
アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
タンパク質（Ａ）は、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）がゲル化する観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：ポリペプチド鎖（Ｙ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖。
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｄ配列である。（なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｄ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列が好ましい。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）ｄ配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数は、ポリペプチド鎖（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）ｂ配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）ｃ配列が好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点、タンパク質（Ａ）がゲル化する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、アミノ酸配列（Ｘ）が連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、ポリペプチド鎖（Ｙ）における全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数のうちリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）で置換された合計割合は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）中の全アミノ酸数のうちリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）で置換された合計割合は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）を、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｈ又はＫ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
タンパク質（Ａ）中のポリペプチド鎖（Ｙ）とポリペプチド鎖（Ｙ’）との合計個数は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、細胞親和性の観点、異物反応を抑制する観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
タンパク質（Ａ）中に、アミノ酸配列（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、ポリペプチド鎖（Ｙ）の個数はその合計である。ポリペプチド鎖（Ｙ’）も同様である。
本発明においてタンパク質（Ａ）は、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうちアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合が５０〜７０％であるものであるが、細胞親和性の観点及び異物反応を抑制する観点から、合計割合は、５２．５〜６７．５％が好ましく、さらに好ましくは５５〜６５％である。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち、アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち、アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち、アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計割合を算出する。
アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「アミノ酸配列（Ｘ）の数×アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数」を求める。その合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝」を求める。
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてアミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計割合を算出する。
アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及びアミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の合計割合（％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝］／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
なお、タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）を有している場合には、以下のようにして上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」を求める。
まず、各種類のアミノ酸配列（Ｘ）について、「アミノ酸配列（Ｘ）の数×アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数」を求める。その合計値を、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）中のアミノ酸数｝」とする。
タンパク質（Ａ）が、複数種類のアミノ酸配列（Ｘ）に対応する複数種類のアミノ酸配列（Ｘ’）を有する場合も同様にして、上記式中の「｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝×｛アミノ酸（Ｘ’）中のアミノ酸数｝」を求める。
タンパク質（Ａ）において、全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合［｛タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数｝×１００］は、βターン率とランダムコイル率との合計割合を適度にする観点、細胞親和性及び異物反応を抑制する観点から、５〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４７．５％であり、特に好ましくは２０〜４５％である。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸数の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）のアミノ酸の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛タンパク質（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
タンパク質（Ａ）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点、細胞親和性の観点及び異物反応を抑制する観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、βシート構造率を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、βシート構造率を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
タンパク質（Ａ）が、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列を合計２個以上有する場合は、これらの間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。介在アミノ酸配列（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸数の占める割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数｝×１００］は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち介在アミノ酸配列（Ｚ）のアミノ酸数の占める割合［Σ｛（介在アミノ酸配列（Ｚ）中のアミノ酸の数）×（介在アミノ酸配列（Ｚ）の数）｝／｛タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数｝×１００］は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）、アミノ酸配列（Ｘ’）及び介在アミノ酸配列（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。タンパク質（Ａ）の水への溶解性向上の観点から、タンパク質（Ａ）の両末端の構造が、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）に末端アミノ酸配列（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。末端アミノ酸配列（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）では無いペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。末端アミノ酸配列（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数の占める割合は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち末端アミノ酸配列（Ｔ）のアミノ酸数の占める割合は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
タンパク質（Ａ）は、生物工学的手法により細菌を用いて製造することがある。このような場合、タンパク質（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、タンパク質（Ａ）は、末端アミノ酸配列（Ｔ）の他に、Ｎ又はＣ末端に、特殊なアミノ酸配列（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）（ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）（ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）（ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）において、タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち、上記介在アミノ酸配列（Ｚ）、末端アミノ酸配列（Ｔ）及び精製タグのアミノ酸数の占める合計割合は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、０〜２５％が好ましく、さらに好ましくは０〜２２．５％であり、特に好ましくは０〜１５％である。
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又はポリペプチド鎖（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又はポリペプチド鎖（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の数との比［ＧＡＧＡＧＳ配列（１）：｛アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）｝］は、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、１：２〜１：６が好ましく、さらに好ましくは１：２〜１：５である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によるタンパク質（Ａ）の分子質量は、細胞親和性の観点及びタンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にする観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは７０〜１２０ｋＤａである。
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続した（ＧＶＧＶＰ）８配列（１７）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）のバリン（Ｖ）のうち１個のアミノ酸がリシン（Ｋ）で置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−１）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約３０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（ＳＥＬＰ３）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ３０個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約１８０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質
（ｉｉｉ）（ＧＶＧＶＰ） ４ ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ） ３ 配列（６）を１３個、及び、（ＧＡＧＡＧＳ） ４ 配列（５）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（Ａ１１−１−２）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−２）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（Ａ１１−１−３）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−３）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−１）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約３０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（ＳＥＬＰ３）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ３０個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約１８０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質
（ｉｉｉ）（ＧＶＧＶＰ） ４ ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ） ３ 配列（６）を１３個、及び、（ＧＡＧＡＧＳ） ４ 配列（５）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（Ａ１１−１−２）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−２）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（Ａ１１−１−３）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が６個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−１−３）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質
（Ａ１１−２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が１２個連続したポリペプチド鎖の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）のポリペプチド鎖（Ｙ’１２）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−２−１）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質
（Ａ１１−２−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）とを有するタンパク質
具体的に、タンパク質（Ａ１１−２−１）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質
（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
具体的にタンパク質（Ａ１２）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）８配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）４０配列（２３）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１１０ｋＤａの配列（３１）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
具体的にタンパク質（Ａ１２）には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）８配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）４０配列（２３）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約１１０ｋＤａの配列（３１）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質
本発明の創傷治癒剤は、上記タンパク質（Ａ）及び水を含むものである。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、タンパク質（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％、特に好ましくは１５〜３０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、タンパク質（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、７０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜９０重量％であり、特に好ましくは７０〜８５重量％である。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、タンパク質（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜３０重量％、特に好ましくは１５〜３０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、タンパク質（Ａ）の水への溶解性の観点、タンパク質（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、７０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは７０〜９０重量％であり、特に好ましくは７０〜８５重量％である。
創傷治癒剤中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではない。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃で、２０分加熱して過熱滅菌した脱イオン水等が挙げられる。
本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書においてリン酸塩は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
リン酸塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
リン酸塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
創傷治癒剤のｐＨは、タンパク質（Ａ）の安定性の観点及び創傷治癒の観点から、５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくは６．０〜８．５である。
この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にでき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、異物反応を抑制することができる。
この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を適度にでき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、異物反応を抑制することができる。
本発明の創傷治癒剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。一例を下記に示す。
（創傷治癒剤の製造方法）
本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）が含まれていてもよい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）が含まれていてもよい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により無機塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
創傷治癒剤の患部への適用方法としては、菌増殖抑制、肉芽組織形成、上皮化促進及び拘縮抑制の観点から、患部の欠損部分を埋めるように注入することが好ましい。患部への適用方法の一例を下記に示す。
（創傷治癒剤の患部への適用方法）
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
上記（２）で使用するドレッシングの材質としては、特に限定されないが、ポリウレタン、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びナイロン等が挙げられる。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制の観点から、タンパク質（Ａ）及び水等を混合した直後は溶液状であるが、時間の経過、熱等の刺激を加える等により流動性が低くなりゲル化することが好ましい。
創傷治癒剤をゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、創傷治癒剤を２５℃〜８０℃にすることが好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、創傷治癒剤を使用する場合、適用時の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
創傷治癒剤をゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、創傷治癒剤を２５℃〜８０℃にすることが好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、創傷治癒剤を使用する場合、適用時の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
＜製造例１＞
［タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、タンパク質（Ａ）の一種である配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））を生産する方法を示す。
［タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、タンパク質（Ａ）の一種である配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））を生産する方法を示す。
○ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍＬフラスコ中のＬＢ培地５０ｍＬに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、培養液４０ｍＬを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍＬフラスコ中のＬＢ培地５０ｍＬに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）培養した。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、培養液４０ｍＬを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製物であるタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を得た。
集菌した大腸菌を用い、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製物であるタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を得た。
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃で、１６時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を得た。
タンパク質を脱イオン水に溶解して５ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃で、１６時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、９０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、２０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を得た。
○タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の同定
得られたタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いて、得られたタンパク質（Ａ１−１（ｉｉｉ）−ａ）をウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８０ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。また得られたタンパク質をアミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所社製）によるアミノ酸組成分析に供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％）、アラニン（１２．３重量％）、セリン（５．３重量％）、プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）は、ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリン（Ｖ）のうち１個がリシン（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個有し、かつ、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））であることを確認した。
得られたタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を下記の手順で同定した。
ラビット抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対するラビット抗６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いて、得られたタンパク質（Ａ１−１（ｉｉｉ）−ａ）をウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量８０ｋＤａの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。また得られたタンパク質をアミノ酸分析システム（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ島津製作所社製）によるアミノ酸組成分析に供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％）、アラニン（１２．３重量％）、セリン（５．３重量％）、プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）は、ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）中のバリン（Ｖ）のうち１個がリシン（Ｋ）に置換された（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個有し、かつ、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）のポリペプチド鎖（Ｓ１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２７）のＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））であることを確認した。
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で、５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体又は抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）が分解吸収され、無くなったと判断した。
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃で、５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン（以下、単に「メンブレン」ともいう）にトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗ＳＥＬＰ８Ｋ抗体又は抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）が分解吸収され、無くなったと判断した。
○βターン構造とランダムコイル構造との合計割合の測定
得られたタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。
タンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を算出した。結果を表２に示す。
得られたタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。
タンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍＬとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型：日本分光株式会社製）を用いて、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を算出した。結果を表２に示す。
＜製造例２＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
＜製造例３＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−３：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｃ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−３：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の３倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。溶出画分の３倍容量の脱イオン水による透析を残り５回、計７回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−３：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｃ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５−３：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の３倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。溶出画分の３倍容量の脱イオン水による透析を残り５回、計７回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
＜製造例４＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｄ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社製、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）にて精製し、溶出画分を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｄ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア社製、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）にて精製し、溶出画分を回収した。
＜製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−２２０」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ａ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−２２０」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）をそれぞれ１３個有し、これらが交互に化学結合した配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ａ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−２２０」を用いて、「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、上記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１０５ｋＤａの配列（２５）のタンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−２２０」を用いて、「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、上記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜製造例７＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００２」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合した配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ａ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００２」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ１５個有し、これらが交互に化学結合した配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ａ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜製造例８＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００２」を用いて、「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、上記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２４）のタンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００２」を用いて、「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、上記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ｂ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜製造例９＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約３０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００４」を用いること、及び、限外濾過装置を分子質量１０，０００カットの限外濾過装置に変更したこと以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１８）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約３０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−００４」を用いること、及び、限外濾過装置を分子質量１０，０００カットの限外濾過装置に変更したこと以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ４個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１８）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜製造例１０＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１８０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−０３０」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ３０個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１９）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１８０ｋＤａの配列（１９）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））をコードしたｐＰＴ０３４５−０３０」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ３０個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（１９）のタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造例１＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｅ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「５’’：アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｅ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
５’’：アフィニティクロマトグラフィー
「４：限外濾過」後のタンパク質を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
＜比較製造例２＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｆ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｆ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造例３＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｇ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１の「タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）の作製」において、「ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ））の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｇ）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造例４＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．２をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−２」を用いる以外は同様にして、（ＶＰＧＶＧ）４配列（２６）及びＶＶ配列をそれぞれ２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約３７ｋＤａの配列（２８）のタンパク質（Ｂ１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＥＬＰ１．２をコードしたプラスミドｐＰＴ０１０２−２」を用いる以外は同様にして、（ＶＰＧＶＧ）４配列（２６）及びＶＶ配列をそれぞれ２０個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約３７ｋＤａの配列（２８）のタンパク質（Ｂ１）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造例５＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）２配列（２９）をそれぞれ２９個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９３ｋＤａの配列（３０）のタンパク質（Ｂ２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「ＳＬＰ４．１をコードしたｐＳＹ１３９８−１」を用いる以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）及び（ＧＶＧＶＰ）２配列（２９）をそれぞれ２９個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約９３ｋＤａの配列（３０）のタンパク質（Ｂ２）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造例６＞
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１７ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ｂ３）をコードしたｐＰＴ０３４５−１０２」を用いること、及び、限外濾過装置を分子質量１０，０００カットの限外濾過装置に変更したこと以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ２個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約１７ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ｂ３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
製造例１において、「ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５」に変えて、「分子質量が約１７ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ｂ３）をコードしたｐＰＴ０３４５−１０２」を用いること、及び、限外濾過装置を分子質量１０，０００カットの限外濾過装置に変更したこと以外は同様にして、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）をそれぞれ２個有し、これらが交互に化学結合してなる分子質量が約１７ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（Ｂ３）を作製し、βターン構造とランダムコイル構造との合計割合を測定した。結果を表２に示す。
＜実施例１＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。
＜実施例２＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（２）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（２）を作製した。
＜実施例３＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｃ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（３）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｃ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（３）を作製した。
＜実施例４＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｄ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（４）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｄ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（４）を作製した。
＜実施例５＞
タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（５）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（５）を作製した。
＜実施例６＞
タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（６）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−２−１（ｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（６）を作製した。
＜実施例７＞
タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（７）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ａ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（７）を作製した。
＜実施例８＞
タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（８）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−３（ｉ）−ｂ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（８）を作製した。
＜実施例９＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（９）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉ））を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（９）を作製した。
＜実施例１０＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１０）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉ））を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１０）を作製した。
＜比較例１＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｅ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１１）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｅ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１１）を作製した。
＜比較例２＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｆ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１２）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｆ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１２）を作製した。
＜比較例３＞
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１３）を作製した。
タンパク質（Ａ１１−１−１（ｉｉｉ）−ｇ）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１３）を作製した。
＜比較例４＞
タンパク質（Ｂ１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１４）を作製した。
タンパク質（Ｂ１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１４）を作製した。
＜比較例５＞
タンパク質（Ｂ２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１５）を作製した。
タンパク質（Ｂ２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１５）を作製した。
＜比較例６＞
タンパク質（Ｂ３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１６）を作製した。
タンパク質（Ｂ３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１６）を作製した。
＜評価１＞
（タンパク質のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１６）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合もしくはゲル化するまでに２時間以上を要する場合はゲル化しないと判断した。結果を表３に示す。
（タンパク質のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１６）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合もしくはゲル化するまでに２時間以上を要する場合はゲル化しないと判断した。結果を表３に示す。
＜評価２＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１６）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１６）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
＜評価３＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０６個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１６）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表３に示す。
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０６個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１６）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表３に示す。
＜評価４＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの炎症性細胞浸潤スコアリング試験）
評価２において、治療期間７日目で検体を犠死させる以外は同様にして、それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１３個作製した。作製した病理標本について、肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合を、以下の５段階の評価基準で評価し、スコアリングした。結果を表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１３個の平均値である。下記点数が高いほど、創傷治癒剤に対する炎症性細胞の浸潤が抑制され、異物反応を抑制できていることを示す。
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態
２点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が７５％以上
３点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が５０％以上７５％未満
４点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が２５％以上５０％未満
５点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が２５％未満
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの炎症性細胞浸潤スコアリング試験）
評価２において、治療期間７日目で検体を犠死させる以外は同様にして、それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１３個作製した。作製した病理標本について、肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合を、以下の５段階の評価基準で評価し、スコアリングした。結果を表３に示す。なお、評価結果は、病理標本１３個の平均値である。下記点数が高いほど、創傷治癒剤に対する炎症性細胞の浸潤が抑制され、異物反応を抑制できていることを示す。
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態
２点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が７５％以上
３点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が５０％以上７５％未満
４点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が２５％以上５０％未満
５点：肉芽組織と一体化していない創傷治癒剤に隣接している細胞数のうち、炎症性細胞の割合が２５％未満
表３の結果から、本発明の創傷治癒剤は、肉芽組織形成、上皮化に優れており、菌増殖抑制に優れていることがわかる。さらに創傷治癒剤に対する炎症性細胞の浸潤が抑制されていることから、異物反応を抑制していることが分かる。
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制効果、肉芽組織形成、上皮化促進作用に優れており、また、異物反応を抑制する。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を治癒する創傷治癒剤として有効である。
Claims (4)
- ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求めた前記タンパク質（Ａ）のβターン構造とランダムコイル構造との合計割合が６０〜８５％であり、
前記タンパク質（Ａ）の全アミノ酸数のうち前記アミノ酸配列（Ｘ）のアミノ酸数及び前記アミノ酸配列（Ｘ’）のアミノ酸数の占める合計割合が５０〜７０％であり、
前記タンパク質（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質（Ａ１１−１−１）、（ＧＡＧＡＧＳ）６配列（２２）と（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（６）とを有するタンパク質（Ａ１１−１−３）、及び、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）６ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）５配列（２１）とを有するタンパク質（Ａ１１−２−１）からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）及びＧＶＧＶＰ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）で置換されたアミノ酸配列。 - 前記タンパク質（Ａ）が、配列番号１８のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２４のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号２５のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、配列番号２７のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である請求項１に記載の創傷治癒剤。
- タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量が１５〜２００ｋＤａである請求項１又は２に記載の創傷治癒剤。
- 創傷治癒剤の重量を基準として、前記タンパク質（Ａ）が５〜３０重量％、水が７０〜９５重量％である請求項１〜３のいずれかに記載の創傷治癒剤。
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