RU2584348C2 - Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления - Google Patents

Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления Download PDF

Info

Publication number
RU2584348C2
RU2584348C2 RU2014103549/15A RU2014103549A RU2584348C2 RU 2584348 C2 RU2584348 C2 RU 2584348C2 RU 2014103549/15 A RU2014103549/15 A RU 2014103549/15A RU 2014103549 A RU2014103549 A RU 2014103549A RU 2584348 C2 RU2584348 C2 RU 2584348C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
collagen
procedure
collagen sponge
protective agent
sponge
Prior art date
Application number
RU2014103549/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014103549A (ru
Inventor
Шаньшань ВАНЬ
Original Assignee
Шаньшань ВАНЬ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Шаньшань ВАНЬ filed Critical Шаньшань ВАНЬ
Publication of RU2014103549A publication Critical patent/RU2014103549A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2584348C2 publication Critical patent/RU2584348C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/102—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/21—Acids
    • A61L2300/214—Amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/23—Carbohydrates
    • A61L2300/232—Monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding

Abstract

Изобретение относится к медицине. Композиционная коллагеновая губка предназначена для остановки кровотечения, а также для стимулирования роста и пролиферации клеток. Губка содержит коллаген, факторы роста клеток и защитный агент в количестве 10%-50% масс., где защитный агент содержит аминокислоты, сахариды и альбумин в массовом отношении 1-11:1,25-17,5:1-7,5. Способ изготовления губки включает этап вирусной инактивации, который включает две стадии: первая стадия представляет собой вирусную инактивацию органическим растворителем/детергентом; вторая стадия представляет собой 30-120-минутную обработку раствора губки на водяной бане при 90-100°C, и ее проводят в присутствии защитного агента. Технический результат заключается в том, что губка имеет водопоглощающую способность более чем 52 раза на основании массы губки и имеет модуль упругости более 70,0 Н/см2. Губку можно подвергать вирусной инактивации в течение продолжительного времени при высокой температуре, в то время как биоактивность коллагена и факторов роста поддерживается. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 пр., 11 табл., 3 ил.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение лежит в области биомедицинских материалов и относится к композиционной коллагеновой губке и способу ее изготовления. Композиционную коллагеновую губку применяют для остановки кровотечения из раневых поверхностей организма человека и животного и для стимулирования роста и пролиферации клеток, а также для восстановления тканей сосудов и органов.
Уровень техники
В области медицины заживление ран и послеоперационные рост и регенерация организма представляют собой взаимосвязанные патологические и физиологические процессы, которые включают серии биохимических, физиологических и морфологических изменений в организме. Таким образом, когда организм поврежден, на коже и поверхностях органов часто появляются дефекты. В случае когда клетки невозможно восстановить, на поверхности тела могут возникать такие состояния как инфекция, нагноение или некроз пересаженных лоскутов и пересаженных кожных трансплантатов. Обычно, для того чтобы уменьшить вероятность таких явлений, в клинической практике часто применяют противоинфекционные способы лечения, например введение антибиотиков или наружное применение традиционной китайской и западной медицины, но коэффициент выживаемости клеток ткани на раневой поверхности организма очень низок, что приводит к неблагоприятным состояниям, таким как дефекты мышц, образование рубцов и продолжительный период заживления ран, и даже вызывает необходимость повторной операции.
Чтобы решить техническую проблему предотвращения неблагоприятных состояний ран и уменьшить частоту повторных операций с 1980-х годов были проведены обширные исследования и клинические испытания в отношении применения восстанавливающего эффекта факторов роста на раны организма и послеоперационные ткани организма. Концепция восстановления тканей организма, таким образом, развилась от простого заживления поверхностей тела до процесса восстановления клеток и тканей, который улучшает или восстанавливает эффект выживания клеток тканей за счет применения факторов роста при искусственном вмешательстве в естественный процесс заживления раневых поверхностей.
Коллаген, структурный белок, составляющий внеклеточный матрикс, представлен в виде белых прозрачных неразветвленных фибрилл, состоящих из нескольких типов гликопротеиновых молекул, и обладает четвертичной структурой. Единицей коллагена является тропоколлаген, молекула которого представляет собой тонкую трехнитевую спиральную цепь диаметром 1,5 нм и длиной 300 нм, как измерено посредством электронной микроскопии, и имеет относительную молекулярную массу 2,85×105. Она имеет стабильную трехспиральную пространственную структуру благодаря ее особому аминокислотному составу. Коллаген является кровоостанавливающим, слабоантигенным, разлагаемым и биосовместимым, применяется для изготовления биомедицинских материалов, а также в клиническом аспекте для остановки кровотечения и стимуляции роста клеток.
Факторы роста фибробластов (FGF) представляют собой митогенные, хемотаксические и регуляторые белки, представленные во всех клетках, связанных с заживлением ран, и стимулируют восстановление и регенерацию клеток мезодермального и эктодермального происхождения (например, эпителиальных клеток, гиподермальных клеток, фибробластов и сосудистых эндотелиальных клеток).
В US 2006/0236891, US 1978/4066083, US 20080268052 и US 2010/7754258 раскрыты способы изготовления коллагеновых мембран путем применения коллагенов, выделенных из ахилловых сухожилий или кожи животных, в то же время ни в одном из них не упоминаются средства для вирусной инактивации. Однако в клинической практике всегда существуют возможности перекрестного инфицирования патогенными микроорганизмами, инфекционными как для человека, так и для животных, например вирусом энцефалита В (EBV), вирусом гепатита Е (HEV), вирусом ложного бешенства (PRV), вирусом везикулярного стоматита (VSV) и стрептококком, которые все когда-то вызывали широко распространенные перекрестно-инфекционные заболевания человека и животных и бедственные последствия. Следовательно, продукты, изготовленные этими способами изготовления, имеют определенную угрозу безопасности при клинических применениях.
В CN 1228339 и CN 1511592 раскрыты композиционные коллагеновые губки, содержащие биологические факторы, но там применяли облучение для проведения дезинфекции во время изготовления этих губок. Что касается биоактивных материалов, облучение увеличивает температуру продуктов, приводя к денатурации этих биоактивных материалов, что не только снижает активность биоактивных материалов, но также приводит к образованию новых иммунологически активных материалов и, следовательно, вызывает ненужные проблемы при клиническом применении.
Более того, активность продукта уменьшается во время длительного хранения, что может повлиять на его клиническую эффективность и срок годности. Однако в вышеупомянутых патентных документах никаких защитных мер не предпринимали и не проводили никаких исследований, касающихся стабильности включенных биоактивных материалов, и эффективность вирусной инактивации также не была подтверждена.
Сущность изобретения
С целью решить вышеизложенные технические проблемы в настоящем изобретении предложена композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления. В частности, настоящее изобретение включает следующие аспекты.
1. В настоящем изобретении предложена композиционная коллагеновая губка, содержащая коллаген и факторы роста клеток и имеющая водопоглощающую способность более чем 52 раза.
2. Композиционная коллагеновая губка по п. 1, имеющая модуль упругости более чем 70,0 Н/см.
3. Композиционная коллагеновая губка по п.2, дополнительно содержащая защитный агент в количестве 10%-50% по массе относительно массы композиционной коллагеновой губки, где указанный защитный агент содержит аминокислоты, сахариды и альбумин в массовом отношении от 1 до 11 : от 1,25 до 17,5 : от 1 до 7,5, где аминокислоты представляют собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из лейцина, изолейцина, глицина, аланина и серина; и сахариды представляют собой по меньшей мере один сахарид, выбранный из глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы и маннита.
4. Композиционная коллагеновая губка по п. 3, где защитный агент добавлен таким образом, что конечная концентрация аминокислот, добавленных в раствор коллагена, составляет 2,0-22 мг/мл, предпочтительно 2,5-15 мг/мл; конечная концентрация сахаридов, добавленных в раствор коллагена, составляет 2,5-35 мг/мл, предпочтительно 3,0-15 мг/мл; и конечная концентрация сывороточного альбумина человека, добавленного в раствор коллагена, составляет 2-15 мг/мл.
5. Композиционная коллагеновая губка по п. 4, где защитный агент дополнительно содержит глицерин, который добавлен в раствор коллагена до конечной концентрации 1,0-15 мг/мл. Таким образом, когда композиционная коллагеновая губка содержит глицерин, массовое отношение глицерина к сахариду в защитном агенте составляет от 0,5 до 7,5 : от 1,25 до 17,5.
6. Композиционная коллагеновая губка, содержащая коллаген, факторы роста клеток и защитный агент, как он определен в любом из пп. 3-5.
7. В настоящем изобретении дополнительно предложен способ изготовления композиционной коллагеновой губки по любому из пп. 1-6, где этап очистки коллагена включает процесс очистки с использованием ионообменной хроматографии, которая представляет собой препаративную хроматографию на катионообменной смоле СМ52, и элюенты представляют собой растворы с рН 4,5, содержащие хлорид натрия в концентрациях от 0,2 моль/л до 0,8 моль/л и ацетат натрия в концентрации 0,1 моль/л.
8. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 7, где этап вирусной инактивации включает двухстадийную процедуру вирусной инактивации:
первая стадия вирусной инактивации представляет собой вирусную инактивацию органическим растворителем/детергентом;
вторая стадия вирусной инактивации представляет собой 30-120-минутную обработку композиционной коллагеновой губки на водяной бане при 90-100°С.
9. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 8, где органический растворитель/детергент представляет собой смесь полисорбата 80 и трибутил фосфата, и полисорбат 80 и трибутилфосфат добавляют в раствор коллагена в таких количествах, что конечная концентрация полисорбата 80 составляет 1% и конечная концентрация трибутилфосфата составляет 0,3%; предпочтительно в условиях, при которых концентрацию коллагена поддерживают при 30-70 мг/мл и рН поддерживают при 6,0-8,0, смешанный стерильный водный раствор, содержащий полисорбат 80 и трибутилфосфат, медленно добавляют в раствор коллагена до тех пор, пока конечная концентрация полисорбата 80 не составит 1% и конечная концентрация трибутилфосфата не составит 0,3%, и вирусную инактивацию проводят при 24-26°С в течение 6-8 часов.
10. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по любому из пп. 6-9, где вторую стадию вирусной инактивации проводят в присутствии защитного агента, который добавляют в раствор коллагена в таком количестве, что конечная концентрация аминокислот, составляющих защитный агент, составляет 2,0-22 мг/мл, конечная концентрация сахаридов составляет 2,5-35 мг/мл и конечная концентрация раствора альбумина составляет 2-15 мг/мл; предпочтительно защитный агент дополнительно содержит глицерин, так что конечная концентрация глицерина, добавленного к раствору коллагена, составляет 1,0-15 мг/мл.
Композиционная коллагеновая губка по настоящему изобретению может стимулировать регенерацию капилляров, местно улучшать кровообращение, ускорять заживление раневых поверхностей и является полезной для ожоговых раневых поверхностей (включая поверхностные второй степени, глубокие второй степени и грануляционные раневые поверхности), хронических раневых поверхностей (включая хроническую язву поверхности тела и т.д.) и свежих раневых поверхностей (включая травму, раневые поверхности на донорских участках кожи при трансплантации, операционную рану и т.д.). Продукт по настоящему изобретению, композиционная коллагеновая губка, может поддерживать стабильность биоактивных материалов в течение длительного хранения, имеет высокую водопоглощающую способность, большой модуль упругости и отличную гибкость и может обладать превосходными эффектами при клиническом применении.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлена фотография результатов электрофореза коллагена по настоящему изобретению. На Фиг. 1, а обозначает стандартный маркер относительных молекулярных масс; 6 обозначает стандартный образец коллагена; и в обозначает образец коллагена по настоящему изобретению.
На Фиг. 2 показано сравнение водопоглощающей способности образца по настоящему изобретению и таковой контрольного образца.
На Фиг. 3 показано сравнение модулей упругости образца по настоящему изобретению и контрольного образца.
Исходным материалом для коллагена по настоящему изобретению может быть свежая соединительная ткань млекопитающих или кожа свиней. В конкретном воплощении настоящего изобретения коллаген представляет собой коллаген I типа, выделенный из кожи свиней, и во время экстракции которого очистку проводят высаливанием в комбинации с хроматографией для получения высокоочищенного неиммуногенного коллагена, имеющего значительно улучшенные водопоглощающую способность и модуль упругости; коллаген, полученный в результате экстракции, подвергают двухстадийной вирусной инактивации для снижения риска контаминации получающейся в результате коллагеновой губки патогенными микроорганизмами и для уменьшения влияния на биоактивные материалы. Более того, при добавлении эффективного защитного агента полученный продукт, композиционная коллагеновая губка, будет очень стабильным.
В композиционной коллагеновой губке, предложенной по настоящему изобретению, коллаген применяется как матрикс, в котором равномерно распределены факторы роста, например основной фактор роста фибробластов (FGF), и содержание FGF на квадратный сантиметр композиционной коллагеновой губки может составлять от 200 ед. до 1500 ед.
Композиционная коллагеновая губка, изготовленная в соответствии с настоящим изобретением, может быть изготовлена в виде продукта, имеющего длину 2,5-10 см, ширину 2,5-5,0 см и толщину 0,3-2,0 см.
Композиционная коллагеновая губка, предложенная в настоящем изобретении, также характеризуется чистотой коллагена более чем 99,0%, водопоглощающей способностью более чем 52 раза и содержанием золы менее чем 1,0%.
Композиционная коллагеновая губка, предложенная в настоящем изобретении, имеет модуль упругости более чем 70,0 Н/см и поры, сформированные в ней, обычно имеют диаметр от 50 до 100 мкм. Губка может непрерывно высвобождать FGF на протяжении периода от 0 до 100 ч, с тем чтобы улучшить терапевтический эффект на раны.
С целью снижения риска наличия вирусов в продукте коллагеновой губки и для обеспечения безопасности продукта в способе изготовления коллагеновой губки по настоящему изобретению применяют следующую двухстадийную процедуру вирусной инактивации в дополнение к процедурам для более строгой проверки и контроля исходного материала.
Первая стадия S/D процедуры вирусной инактивации: вирусный инактиватор (например, растворитель/детергент (S/D)) добавляют в раствор коллагена, полученный после экстракции, для того чтобы инактивировать вирусы, покрытые липидной оболочкой. Конкретнее, в условиях непрерывного перемешивания при 50-200 об/мин водный раствор, содержащий полисорбат 80 и трибутилфосфат, медленно добавляют в раствор коллагена и гомогенизируют перемешиванием до тех пор, пока конечная концентрация полисорбата 80 не составит 1% и конечная концентрация трибутилфосфата не составит 0,3%, и затем вирусную инактивацию проводят при 24°С-26°С в течение 6-8 часов.
В отношении эпидемических вируса энцефалита В и вируса ложного бешенства, взятых в качестве индикаторных вирусов, вышеописанная процедура привела к инактивации этих индикаторных вирусов более чем на 4 логарифма, что соответствует требованиям безопасности.
В вышеописанной процедуре вирусной инактивации чрезмерно высокие концентрации коллагена будут влиять на результат вирусной инактивации, и, следовательно, концентрацию коллагена обычно поддерживают от 30 до 70 мг/мл, вышеописанную S/D процедуру вирусной инактивации проводят при рН 6,0-8,0.
Вторая стадия вирусной инактивации: продукт инактивируют при 90°С-100°С в течение 30-120 минут. Например, продукт упаковывают в материал из алюмопластика, помещают в камеру для инактивации на водяной бане и подвергают обработке на водяной бане при 90°С-100°С в течение 30-120 минут. Обработки вирусной инактивации, в которых применяют такой процесс инактивации на водяной бане вместо облучения, могут приводить к эффективной инактивации ДНК- и РНК-вирусов, не покрытых липидной оболочкой.
Во время второй стадии вирусной инактивации условия инактивации, 90°С-100°С и 30-120 минут, могут влиять на биоактивности коллагена и факторов роста. Чтобы решить эту проблему, на второй стадии вирусной инактивации по настоящему изобретению в раствор коллагена добавляют защитный агент, содержащий аминокислоты, сахариды и альбумин. Для того чтобы сделать получающуюся в результате композиционную коллагеновую губку мягче и эластичнее, в состав защитного агента может быть включено подходящее количество глицерина.
Аминокислоты или их соли, применяемые в защитном агенте, представляют собой одну или две аминокислоты или их соли, выбранные из лейцина, изолейцина, глицина, аланина и серина. Конечная концентрация аминокислот или их солей, добавленных в раствор коллагена, обычно составляет 2,0-22 мг/мл, предпочтительно 2,5-15 мг/мл.
Сахариды, применяемые в защитном агенте, представляют собой по меньшей мере один сахарид, выбранный из глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы и маннита. Конечная концентрация сахаридов, добавленных в раствор коллагена, обычно составляет 2,5-35 мг/мл, предпочтительно 3,0-15 мг/мл.
Если защитный агент содержит глицерин, конечная концентрация глицерина, добавленного в раствор коллагена, обычно составляет 1,0-15 мг/мл.
Когда продукт применяют в клинической практике, альбумин, применяемый в защитном агенте, предпочтительно представляет собой сывороточный альбумин человека. Конечная концентрация сывороточного альбумина человека, добавленного в раствор коллагена, обычно составляет 2 мг/мл или более, но не более чем 15 мг/мл.
Коллаген по настоящему изобретению выделяют из кожи животных. Когда продукт применяют в клинической практике, предпочтительно применяют коллаген I типа, выделенный из кожи свиней. В приготовленном растворе композиционной коллагеновой губки содержание коллагена обычно составляет 30 мг/мл или более, и концентрация факторов роста фибробластов обычно составляет 400-3000 ед./мл.
S/D-способ вирусной инактивации обычно является подходящим для препаратов крови. Добавление органических растворителей/детергентов в препараты крови для инактивации вирусов, покрытых липидной оболочкой, является общепринятым способом, и применяемые органические растворители/детергенты представляют собой полисорбат 80 и трибутилфосфат. Однако полисорбат 80 и трибутилфосфат обладают определенными неблагоприятными эффектами, и поэтому необходимо контролировать их остаточные количества во время последующей очистки коллагена, так чтобы остаточная концентрация полисорбата 80 была меньше чем 100 мкг/мл, и остаточная концентрация трибутилфосфата была меньше чем 10 мкг/мл.
В настоящем изобретении полисорбат 80 и трибутилфосфат могут быть эффективно удалены путем проведения двухкратного высаливания и проведения хроматографической очистки, так чтобы остаточная концентрация полисорбата 80 была меньше чем 10 мкг/мл и остаточная концентрация трибутилфосфата была меньше чем 2 мкг/мл.
Антигенность коллагена, главным образом, характеризуется неспиральными областями на концах молекулы коллагена, то есть С-концевым пептидом и N-концевым пептидом. В настоящем изобретении неспиральные области на концах молекулы отщепляют пепсином и эти концевые пептиды удаляют экстракцией и очисткой для получения высокоочищенного коллагена для применения в изготовлении коллагеновых губок. Во время очистки высаливанием применяют водный раствор NaCl с концентрацей 2,0-3,5 моль/л, предпочтительно 2,0-2,5 моль/л, и поддерживают температуру от 0°C до 4°C в течение 4-12 ч. Во время очистки СМ52-катионообменной хроматографией водный раствор NaCl с концентрацией от 0,2 до 0,8 моль/л и рН 3,5-4,5 применяют для градиентной элюции; и предпочтительно водные растворы с рН 4,5, каждый из которых содержит 0,1 моль/л ацетата натрия и 0,2 моль/л, 0,4 моль/л или 0,6 моль/л NaCl применяют для градиентной элюции. При исследовании электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) обнаружили, что коллаген по настоящему изобретению имеет полную трехспиральную структуру и полностью сохраняет биоактивность, а чистота коллагена достигает 96% (масс/масс.) или более, даже 99,0% или более, как проверено и рассчитано, что предупреждает иммунногенные реакции, вызываемые коллагенами низкой чистоты, выделенными традиционными способами очистки.
Для лиофилизации продукта, продукт, во-первых, подвергают замораживанию при температуре от -40 до -45°C в течение 3-5 ч и затем вакуумной сушке при степени вакуума, поддерживаемой на уровне не выше чем 20 Па; температуру продукта поднимают до 20°C за 10-15 ч при контролируемой скорости подъема температуры и продукт оставляют при 20-25°C на 2-5 ч; и поддерживают содержание воды в лиофилизированном продукте 5% или меньше для обеспечения активности биологических факторов.
Конкретнее, этапы получения композиционной коллагеновой губки по настоящему изобретению представляют собой следующие.
Этап 1. Выбор исходного материала и обезжиривающая обработка
Свежую соединительную ткань млекопитающих или кожу свиней, прошедших карантин и обследование, брали в качестве исходных материалов и обрабатывали в ходе следующего процесса: щетину и внутренний жир кожи свиньи удаляли при помощи лезвия; обработанную кожу свиньи взвешивали и помещали в контейнер из нержавеющей стали, в который добавляли водный раствор карбоната натрия в массовом отношении исходного материала кожи свиньи к водному раствору 10%-35% (масс/масс.) (предпочтительно 25%) карбоната натрия 1 : от 1 до 10 (предпочтительно 1:5) для вымачивания кожи свиньи в течение 20-60 мин (предпочтительно 20 мин), в то же время выполняя перемешивания один раз каждые 5 минут; после вымачивания кожу свиньи вынимали из контейнера и промывали 10 раз чистой водой; воду сливали и загрязнения в исходном материале, такие как жир или волосяные фолликулы, соскабливали режущим инструментом из нержавеющей стали.
Этап 2. Процедура измельчения
Кожу свиньи, обработанную на этапе 1, взвешивали, нарезали полосами в резальной машине, затем разрезали на куски 0,2-0,5 см2 с помощью криогенной мельницы и помещали в контейнер из нержавеющей стали, в который добавляли раствор 75% этанола для вымачивания кусков в течение 20 минут; и после этого куски вынимали, 10 раз повторно промывали чистой водой, затем 5 раз повторно промывали охлажденной водой для инъекций и высушивали.
Этап 3. Процедура энзимолиза
Воду для инъекций при 0-4°C добавляли к исходному материалу кожи свиньи, обработанной на этапе 2 в массовом отношении 1 : от 5 до 30 (например, отношение кожи свиньи к воде 1 кг : 10 кг) и тщательно перемешивали; смесь накачивали в коллоидную мельницу с помощью перистальтического насоса, в котором предварительно была запущена циркуляционная система охлаждения для поддержания температуры от 0°С до 4°C, и затем гомогенизировали; жидкость-гомогенат переносили в резервуар для энзимолиза, в который медленно по каплям добавляли водный раствор 1,0 М уксусной кислоты для доведения рН до 2,5-3,5, предпочтительно 2,5; добавляли пепсин (5-10 г пепсина на 1 кг исходного материала, полученного на этапе 2); температуру энзимолиза поддерживали между 10°C и 20°C и проводили энзимолиз в течение 20-24 ч; и на этом этапе ферментативный лизат представлял собой вязкую и однородную коллоидную жидкость.
Этап 4. Процедура инактивации пепсина
Водный раствор гидроксида натрия, 20% по массе, медленно добавляли к ферментативному лизату, полученному на этапе 3, для доведения рН до 9,0; лизат выдерживали при 0-4°C в течение 10 ч; затем доводили рН до 6,5 водным раствором 1,0 М уксусной кислоты.
Этап 5. Процедура фильтрования
Воду для инъекций добавляли к ферментативному лизату, полученному на этапе 4, (ферментативный лизат разводили в массовом отношении лизата к воде 1 : от 1 до 10 и тщательно перемешивали, так что концентрация коллагена составляла 30-70 мг/мл, предпочтительно 30 мг/мл; смесь подвергали грубому фильтрованию через фильтрующий элемент с размером пор 40 мкм и затем подвергали тонкому фильтрованию через фильтрующий элемент с размером пор 1,0 мкм в специальный резервуар для вирусной инактивации.
Этап 6. S/D процедура вирусной инактивации
При непрерывном перемешивании при 50-200 об/мин водный раствор, содержащий полисорбат 80 и трибутилфосфат, медленно добавляли к раствору, полученному на этапе 5, смесь перемешивали до однородного состояния, так что конечная концентрация полисорбата 80 составляла 1% (по массе) и конечная концентрация трибутилфосфата составляла 0,3% (по массе), и вирусную инактивацию проводили при 24-26°C в течение 6-8 ч, предпочтительно 6 ч.
Этап 7. Процедура высаливания
NaCl добавляли к раствору, полученному на этапе 6, при перемешивании на мешалке со скоростью вращения 100-500 об/мин, так что конечная концентрация NaCl составляла 2,0-2,5 моль/л, предпочтительно 2,5 моль/л, и смесь выдерживали при 0-4°C в течение 4 ч. Смесь центрифугировали при 0-4°C в центрифуге с постоянным охлаждением при 14000-16000 об/мин в течение 60-30 мин и супернатант отбрасывали; осадок собирали, добавляли к водному раствору 0,3 М уксусной кислоты при массовом отношении осадка к 0,3 М раствору уксусной кислоты 1 : от 10 до 15 и затем перемешивали до полного растворения осадка; добавляли NaCl до конечной концентрации NaCl 2,05-2,5 моль/л, предпочтительно 2,5 моль/л; затем смесь центрифугировали для получения осадка коллагена.
Этап 8. Процедура обессоливания
Охлажденный раствор 95% этанола добавляли к осадку коллагена, полученному на этапе 7, в массовом отношении осадка коллагена к охлажденному 95% этанолу 1 : от 3 до 8, и перемешивали до однородного состояния; смесь центрифугировали при 0-4°C, 8000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отбрасывали и осадок собирали; и вышеописанный процесс повторяли один раз. 0,1 моль/л раствор ацетата натрия с рН 4,5 добавляли к осадку коллагена в массовом отношении осадок коллагена : раствор ацетата натрия 1 : от 8 до 20 и перемешивали до однородного состояния; смесь фильтровали через фильтр, имеющий фильтрующий элемент с размером пор 0,45 мкм, и передавали на процедуру очистки СМ-катионообменной хроматографией.
Этап 9: Процедура очистки СМ52-катионообменной хроматографией Препаративную хроматографическую колонку, набитую СМ52-катионообменной смолой (10×100 см), уравновешивали 10 объемами слоя 0,1 моль/л буфера ацетата натрия при рН 4,5, затем вносили образец со скоростью внесения 20,0-30,0 мл/мин, предпочтительно 23,0 мл/мин; колонку элюировали 5 объемами слоя 0,1 моль/л водного раствора ацетата натрия с рН 4,5, содержащего 0,2 моль/л NaCl, затем 0,1 моль/л водного раствора ацетата натрия с рН 4,5, содержащего 0,4 моль/л NaCl, белковый элюат собирали, когда его пик начинал появляться, и затем колонку элюировали 5 объемами слоя 0,1 моль/л водного раствора ацетата натрия с рН 4,5, содержащего 0,6 моль/л NaCl, при этом длина волны детектирования составляла 215 нм.
Этап 10. Процедура ультрафильтрации
Для концентрирования и обессоливания собранный элюат коллагена подвергали ультрафильтрации через ультрафильтр с тангенциальным потоком (Millipore), с порогом отсечения 10 кДа и площадью мембраны 4 м2, в котором элюат сначала концентрировали до 1/3 первоначального объема и дополняли 2/3 водой для инъекций до первоначального объема, затем снова концентрировали до 1/3 первоначального объема и дополняли 2/3 водой для инъекций до первоначального объема, затем концентрировали до 1/3 первоначального объема; во время концентрирования давление на входе ультрафильтра составляло менее чем 0,15 МПа на всем протяжении концентрирования; и уловленный раствор коллагена собирали.
Этап 11. Процедура приготовления
Концентрацию раствора коллагена, полученного на этапе 10, доводили до 40-70 мг/мл и 1000 мл раствора композиционной коллагеновой губки готовили в соответствии с составом, показанным в Таблице 1.
Этап 12. Процедура стерилизации фильтрованием
Приготовленный раствор фильтровали последовательно через фильтры, оснащенные полиэфирсульфоновыми фильтровальными элементами с размером пор 0,45 мкм и размером пор 0,22 мкм (PALL).
Этап 13. Процедура лиофилизации
Раствор, обработанный на этапе 12, добавляли в форму из нержавеющей стали 15 см×5 см; объем налитой жидкости составлял 37 мл; затем форму помещали в лиофилизатор для лиофилизации и воду из раствора удаляли способом криогенной лиофилизации, при котором раствор сначала замораживали при -40°C в течение 4 ч и затем высушивали под вакуумом со степенью вакуума, поддерживаемой на уровне не выше 20 Па, температуру продукта повышали до 20°C за 15 ч при контролируемой скорости повышения температуры и поддерживали при 25°C в течение 4 ч.
Этап 14. Двухстадийная процедура вирусной инактивации
Лиофилизированный продукт упаковывали в материал из алюмопластика в упаковочной машине для материала из алюмопластика и затем помещали в стерильную камеру на водяной бане для проведения вирусной инактивации на водяной бане. После завершения вирусной инактивации продукт хранили при 2-8°C в защищенном от света месте до применения.
Примеры 1-3
Вышеописанные этапы изготовления композиционной коллагеновой губки проводили в условиях, перечисленных ниже в Таблице 1, и были получены образцы 1-3.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
В защитном агенте примера 1 в качестве аминокислоты применяли глицин и в качестве сахарида применяли сахарозу; в защитном агенте примера 2 в качестве аминокислот применяли лейцин и изолейцин в массовом отношении 1:1 и в качестве сахаридов применяли глюкозу и трегалозу в массовом отношении 1:2; в защитном агенте примера 3 в качестве аминокислот применяли аланин и серии в массовом отношении 1:1 и в качестве сахаридов применяли лактозу и маннит в массовом отношении 1:2.
5. Результаты исследования
(1) Проверка эффективности S/D вирусной инактивации
Проверяли эффективность S/D вирусной инактивации. Вирус эпидемического энцефалита В и вирус ложного бешенства применяли в качестве индикаторных вирусов; культивируемые клетки представляли собой клетки ВНК21 (фибробласты почек сирийского хомячка); вычисления проводили на 96-луночных микропланшетах с помощью метода цитопатического эффекта и в соответствии с методом Карбера. Результаты показаны в таблицах 2 и 3.
Figure 00000004
Результаты:
Уменьшение вируса в примере 1 более чем на 5,563 LgTCID50/0,1 мл.
Уменьшение вируса в примере 2 более чем на 5,813 LgTCID50/0,1 мл.
Уменьшение вируса в примере 3 более чем на 5,563 LgTCID50/0,1 мл.
Figure 00000005
Figure 00000006
Результаты:
Пример 1 более чем на 5,063 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 2 более чем на 4,813 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 3 более чем на 4,375 LgTCID50/0,1 мл.
Результаты проверки демонстрируют инактивацию индикаторных вирусов более чем на 4 логарифма после S/D-обработки раствора коллагена, что соответствует требованиям безопасности. То есть она эффективна для выполнения вирусной инактивации при 24-26°C в течение 6-8 ч с полисорбатом 80 в конечной концентрации 1% и трибутилфосфатом в конечной концентрации 0,3%, в условиях, при которых концентрацию коллагена поддерживают при 30-70 мг/мл и рН 6,5-7,5.
(2) После вирусной инактивации на водяной бане образцы брали для проверки эффективности инактивации. Вирус эпидемического энцефалита В, вирус ложного бешенства и свиной парвовирус использовали в качестве индикаторных вирусов; культивируемые клетки представляли собой клетки ВНК21; вычисления проводили на 96-луночных микропланшетах с помощью метода цитопатического эффекта и в соответствии с методом Карбера. Результаты показаны в таблицах 4, 5 и 6.
Figure 00000007
Figure 00000008
Результаты:
Пример 1 более чем на 4,938 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 2 более чем на 5,188 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 3 более чем на 5,063 LgTCID50/0,1 мл.
Figure 00000009
Результаты:
Пример 1 более чем на 4,563 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 2 более чем на 5,063 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 3 более чем на 5,188 LgTCID50/0,1 мл.
Figure 00000010
Результаты:
Пример 1 более чем на 4,813 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 2 более чем на 4,750 LgTCID50/0,1 мл.
Пример 3 более чем на 5,125 LgTCID50/0,1 мл.
Результаты проверки демонстрируют инактивацию индикаторных вирусов более чем на 4 логарифма после инактивации образцов на водяной бане, что соответствует требованиям безопасности.
(3) Исследование чистоты коллагена
После хроматографической очистки образцы коллагена брали для исследования чистоты коллагена. Были приготовлены контрольные образцы коллагена с одинаковой массовой концентрацией. Хроматографически очищенные образцы и образцы, не прошедшие хроматографическую очистку, перемешивали с раствором для обработки образцов и нагревали в течение 5 мин на кипящей водяной бане, затем подвергали электрофорезу в геле из 5% концентрирующего геля и 10% разделяющего геля, окрашивали Кумасси Бриллиантовым Голубым R250 и отмывали в 7,5% уксусной кислоте и 5% метаноле. Объем загрузки составлял 10 мкл. Контрольный образец коллагена I типа приобретали у Sigma. Электрофоретический анализ показал, что коллаген, обработанный путем хроматографической очистки, демонстрировал такие же зоны, как и контрольный образец, и представлял собой типичный коллаген I типа; никаких других примесных зон не наблюдали, что указывает на то, что выделенный образец был высокоочищенным. Электрофоретические изображения показаны на Фиг. 1. На Фиг. 1, а обозначает стандартный маркер относительных молекулярных масс; б обозначает стандартный образец коллагена; в обозначает образец коллагена, полученный в примере 2 настоящего изобретения.
(4) Измерение содержания коллагена
Суммарные белки определяли методом Кьельдаля и содержание гидроксильных групп пролина в гидролизате измеряли методом Woessener. Содержание коллагена рассчитывали по формуле M1=M0/14% и затем сравнивали с суммарным содержанием белка для расчета чистоты коллагена.
Содержание коллагена в примере 2 настоящего изобретения составляло не меньше чем таковое в контроле, что предполагает очень высокую чистоту. Результаты показаны в таблице 7.
Figure 00000011
(5) Остаточные количества полисорбата 80 и трибутилфосфата После хроматографической очистки образцы брали для измерения остаточных количеств полисорбата 80 и трибутилфосфата с целью подтвердить эффективность их удаления.
На основании того факта, что синий комплекс, образованный в результате реакции полиоксиэтилена в полисорбате 80 с кобальто-тиоцианатом аммония, растворим в дихлорметане, полисорбат 80 измеряли колориметрией при 620 нм. Контрольный образец полисорбата 80 имеет регистрационный номер CAS: 9005-65-6 (Стандарт Фармакопеи США (USP)). Остаточное количество трибутилфосфата в образце, который тестируют, измеряли газовой хроматографией. Контрольный образец трибутилфосфата имеет регистрационный номер CAS: 126-73-8 (Стандарт Европейской Фармакопеи (ЕР)). Оборудование для хроматографии: Shimadzu GC-14C с капиллярной колонкой кислотно-модифицированного полиэтиленгликоля и пламенно-ионизационным детектором; объем загрузки: 0,1 мкл. Результаты показали, что количества остаточных полисорбата 80 и трибутилфосфата в продукте после хроматографической очистки были очень низкими, что соответствует требованиям безопасности. Результаты детекции показаны в таблице 8.
Figure 00000012
(6) Различие между активностями FGF до и после инактивации на водяной бане
Образцы 4, 5 и 6 готовили таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что применяли состав композиционной коллагеновой губки, показанный в Таблице 9.
Фактор роста фибробластов (FGF) измеряли на клетках NIH3T3 (клетки фибробластов мыши линии NIH3T3) способом клеточной пролиферации/МТТ колориметрии (МТТ: 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-бромид тетразолия). FGF является стимулятором роста клеток NIH3T3, и скорость роста клеток NIH3T3 изменяется в зависимости от биоактивности FGF, что применяют для измерения активности FGF. Стандартный образец FGF приобретали в Институте Медицины и Идентификации биологических продуктов Китая (Institute of Medicines and Biological Products Identification of China); и клетки NIH3T3 приобретали в Клеточной Библиотеке Комитета Типичных Культур Академии Наук Китая (Cell Library of Typical Culture Committee of the Chinese Academy of Sciences). Результаты измерений показаны в таблицах 10 и 11.
Результаты измерений показывают, что излучение 10 кг СобО в значительной степени губительно для активности FGF. Когда излучение 10 кг Со60 сравнивают с условиями 100°C/30 мин, данные показывают Р менее 0,01 после обработки программным обеспечением SPSS (статистический пакет для социальных наук, от англ. Statistical package for social sciences), что означает, что их можно сравнивать.
Образцы 7 и 8 были получены посредством изготовления коллагеновых губок тем же способом, как и в примере 1, за исключением того, что количества добавленного FGF отличались, и образцы 7 и 8 подвергали исследованию на долговременную стабильность вместе с образцом 4. Результаты показывают, что добавление аминокислот, альбумина, сахаридов и глицерина к композиции в качестве защитных агентов может эффективно обеспечивать биоактивность продукта на протяжении его срока годности.
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
(7) Сравнение водопоглощающих способностей
Водопоглощающие способности образцов 1, 2 и 3, полученных в примерах 1, 2 и 3, изучали и сравнивали с таковой контрольного образца. Брали кусок губки и точно взвешивали (с точностью до 0,1 мг), погружали в чистую воду при 20°C и осторожно перемешивали, не вызывая каких-либо разрывов; когда он полностью пропитывался водой, губку доставали из воды путем осторожного захватывания угла маленькими щипцами и подвешивали над водной поверхностью на 2 минуты перед взвешиванием. Массу сравнивали с массой коллагеновой губки. Результаты исследования и сравнения показаны на Фиг. 2.
На Фиг. 2 ось Y обозначает абсорбцию воды (масс/масс); контроль 1 представляет собой стандарт абсорбции воды для абсорбирующей желатиновой губки в «Фармакопее США» (USP32-NF27); контроль 2 представляет собой коллагеновую губку, полученную в соответствии с примером 1 патента Китая CN 101279104; контроль 3 представляет собой коллагеновую губку, полученную в соответствии с примерами патента Китая CN 1915437. Как показано на Фиг.2, все композиционные коллагеновые губки по настоящему изобретению имеют водопоглощающую способность 52 раза или более, в то время как все коллагеновые губки, полученные в соответствии с уровнем техники или существующие коллагеновые губки имеют водопоглощающую способность ниже, чем таковая по настоящему изобретению.
(8) Сравнение модулей упругости
Образец фиксировали за оба конца на зажимах динамометра; прибор начинал разделять и натягивать образец с определенной скоростью; изменение в напряжении образца измеряли до тех пор, пока образец не рвался. Результаты исследования и сравнения показаны на Фиг. 3. На Фиг. 3 ось Y представляет собой модуль упругости (Н/см); контроль 4 представляет собой коллагеновую губку, полученную способами, раскрытыми в CN 1487967А. На Фиг. 3 показано, что образцы по настоящему изобретению имеют модуль упругости больше чем 70,0 Н/см, в то время как модуль упругости коллагеновой губки, полученной в соответствии с уровнем техники, составляет менее чем 50,0 Н/см.

Claims (7)

1. Композиционная коллагеновая губка для остановки кровотечения и стимулирования роста и пролиферации клеток, содержащая коллаген и факторы роста клеток, где композиционная коллагеновая губка имеет водопоглощающую способность более чем 52 раза на основании массы композиционной коллагеновой губки, имеет модуль упругости более чем 70,0 Н/см2 и дополнительно содержит защитный агент в количестве 10%-50% по массе относительно массы композиционной коллагеновой губки, где указанный защитный агент содержит аминокислоты, сахариды и альбумин в массовом отношении 1-11:1,25-17,5:1-7,5, где аминокислоты представляют собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из лейцина, изолейцина, глицина, аланина и серина; и сахариды представляют собой по меньшей мере один сахарид, выбранный из глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы и маннита,
где способ изготовления композиционной коллагеновой губки включает этап вирусной инактивации, который включает двухстадийную процедуру вирусной инактивации:
первая стадия вирусной инактивации представляет собой вирусную инактивацию органическим растворителем/детергентом;
вторая стадия вирусной инактивации представляет собой 30-120-минутную обработку раствора композиционной коллагеновой губки на водяной бане при 90-100°C, и ее проводят в присутствии защитного агента.
2. Композиционная коллагеновая губка по п. 1, где защитный агент дополнительно содержит глицерин.
3. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 1 или 2, где способ включает следующие этапы: (1) выбор исходного материала и обезжиривающая обработка; (2) процедура измельчения; (3) процедура энзимолиза; (4) процедура инактивации пепсина; (5) процедура фильтрования; (6) S/D процедура вирусной инактивации; (7) процедура высаливания; (8) процедура обессоливания; (9) процедура очистки СМ52-катионообменной хроматографией; (10) процедура ультрафильтрации; (11) процедура приготовления раствора композиционной коллагеновой губки; (12) процедура стерилизации фильтрованием; (13) процедура лиофилизации; (14) процедура вирусной инактивации второй стадии,
где этап (9) представляет собой этап очистки коллагена, который включает процесс очистки с использованием ионообменной хроматографии, которая представляет собой препаративную хроматографию на катионообменной смоле СМ52, и элюенты, используемые в ионообменной хроматографии, представляют собой растворы с pH 4,5, содержащие хлорид натрия в концентрациях от 0,2 моль/л до 0,8 моль/л и ацетат натрия в концентрации 0,1 моль/л,
этап (6) представляет собой вирусную инактивацию органическим растворителем/детергентом;
этап (14) представляет собой 30-120-минутную обработку раствора композиционной коллагеновой губки на водяной бане при 90-100°C, и его проводят в присутствии защитного агента.
4. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 3, где органический растворитель/детергент представляет собой смесь полисорбата 80 и трибутилфосфата, и полисорбат 80 и трибутилфосфат добавляют в раствор коллагена в таких количествах, что конечная концентрация полисорбата 80 составляет 1% и конечная концентрация трибутилфосфата составляет 0,3%.
5. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 4, где в условиях, при которых концентрацию коллагена поддерживают при 30-70 мг/мл, смешанный стерильный водный раствор, содержащий полисорбат 80 и трибутилфосфат, медленно добавляют в раствор коллагена до тех пор, пока конечная концентрация полисорбата 80 не составит 1% и конечная концентрация трибутилфосфата не составит 0,3%, и вирусную инактивацию проводят при 24-26°C в течение 6-8 часов.
6. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по любому из пп. 3-5, где защитный агент добавляют в раствор коллагена в таком количестве, что конечная концентрация аминокислот, составляющих защитный агент, составляет 2,0-22 мг/мл, конечная концентрация сахаридов составляет 2,5-35 мг/мл и конечная концентрация раствора альбумина составляет 2-15 мг/мл, где указанный защитный агент содержит аминокислоты, сахариды и альбумин в массовом отношении 1-11:1,25-17,5:1-7,5, где аминокислоты представляют собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из лейцина, изолейцина, глицина, аланина и серина; и сахариды представляют собой по меньшей мере один сахарид, выбранный из глюкозы, лактозы, сахарозы, трегалозы и маннита.
7. Способ изготовления композиционной коллагеновой губки по п. 6, где защитный агент дополнительно содержит глицерин, так что конечная концентрация глицерина, добавленного в раствор коллагена, составляет 1,0-15 мг/мл.
RU2014103549/15A 2011-07-28 2012-06-07 Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления RU2584348C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2011102127130A CN102357259A (zh) 2011-07-28 2011-07-28 一种生物蛋白海绵及其制备方法
CN201110212713.0 2011-07-28
PCT/CN2012/076577 WO2013013537A1 (zh) 2011-07-28 2012-06-07 一种复合胶原蛋白海绵及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014103549A RU2014103549A (ru) 2015-09-10
RU2584348C2 true RU2584348C2 (ru) 2016-05-20

Family

ID=45582674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014103549/15A RU2584348C2 (ru) 2011-07-28 2012-06-07 Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9439999B2 (ru)
EP (1) EP2737910B1 (ru)
JP (1) JP5887407B2 (ru)
KR (2) KR101717266B1 (ru)
CN (1) CN102357259A (ru)
RU (1) RU2584348C2 (ru)
WO (1) WO2013013537A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018074951A1 (ru) * 2016-10-21 2018-04-26 Балабаньян, Вадим Юрьевич Антибактериальная белковая губка для химиотерапии инфицированных ран и способ ее получения

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102357259A (zh) * 2011-07-28 2012-02-22 王珊珊 一种生物蛋白海绵及其制备方法
KR101531479B1 (ko) * 2014-11-21 2015-06-26 세원셀론텍(주) 의료용 재료로 사용하기 위한 고농도 콜라겐 제조방법
CN105126084A (zh) * 2015-07-29 2015-12-09 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种胶原蛋白组合物及其制备方法
CN107349463A (zh) * 2017-06-16 2017-11-17 卓阮医疗科技（苏州）有限公司 一种生物源性止血微粒及其制备方法
CN111295094A (zh) 2017-10-09 2020-06-16 泰尔茂比司特生物技术有限公司 冻干容器及使用冻干容器的方法
WO2019072219A1 (zh) * 2017-10-11 2019-04-18 倪少伟 基于结缔组织的蛋白肽制备方法与所制备蛋白肽及其用途
CN107827974B (zh) * 2017-11-10 2021-01-01 中国科学院过程工程研究所 一种人纤维蛋白原的制备方法
CN111084788A (zh) * 2018-10-22 2020-05-01 上海蓝盎电子科技发展有限公司 人工细胞间质
CN109985271B (zh) * 2019-02-26 2021-10-22 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 一种用于难愈合创面修复的复合胶原敷料及其制备方法
JP2022525398A (ja) 2019-03-14 2022-05-13 テルモ ビーシーティー バイオテクノロジーズ，エルエルシー 凍結乾燥容器用充填治具、システム及び使用方法
CN114099761B (zh) * 2020-08-27 2022-06-21 厦门大学 一种浴海绵止血材料及其制备方法和应用
CN112999096A (zh) * 2021-03-31 2021-06-22 广州源肽生物科技有限公司 一种含活性多肽美容制品冻干海绵及其制备方法
CN114225020B (zh) * 2021-12-31 2023-05-02 暨南大学 一种ova淀粉样蛋白原纤维及其制备方法与应用
CN114632183B (zh) * 2022-03-30 2023-02-03 温州医科大学 一种创伤蛋白海绵及其制备方法和在制备皮肤修复中减少瘢痕形成的药物中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990013320A1 (en) * 1989-05-05 1990-11-15 Ferrosan A/S Haemostatic sponge
US5001169A (en) * 1984-10-24 1991-03-19 Collagen Corporation Inductive collagen-based bone repair preparations
DE4404625C1 (de) * 1994-02-14 1995-04-13 Ludwig Dr Baumgartner Verfahren zur Inaktivierung thermolabiler Viren in biologischem Material unter Beibehaltung der kollagenen Eigenschaften
WO2001037861A1 (en) * 1999-11-22 2001-05-31 Anamar Medical Ab A conjugate of a collagen ii-binding fragment and an arthritis-affecting pharmaceutical substance
RU2193897C2 (ru) * 1996-04-04 2002-12-10 Бакстер Акциенгезельшафт Гемостатическая губка, основанная на коллагене, способ ее получения, повязка для ран, включающая такую губку, и набор для приготовления повязки для ран
WO2004007707A1 (en) * 2002-07-10 2004-01-22 National Blood Authority Process for producing a virus-inactivated thrombin preparation
CN101612113A (zh) * 2009-06-23 2009-12-30 武汉海特生物制药股份有限公司 一种神经生长因子海绵剂及其制备方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4066083A (en) 1976-06-03 1978-01-03 Pentapharm A.G. Sterile surgical collagen product
JPH01303152A (ja) 1988-06-01 1989-12-07 Katakura Chitsukarin Kk 止血材およびその製造法
US5496559A (en) * 1991-04-08 1996-03-05 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Porous solid formulations containing proteinaceous physiologically active substances
US6180606B1 (en) 1994-09-28 2001-01-30 Gensci Orthobiologics, Inc. Compositions with enhanced osteogenic potential, methods for making the same and uses thereof
US6686191B1 (en) * 1995-09-22 2004-02-03 Bayer Healthcare Llc Preparation of virally inactivated intravenously injectable immune serum globulin
US5814328A (en) 1997-01-13 1998-09-29 Gunasekaran; Subramanian Preparation of collagen using papain and a reducing agent
WO1998031403A1 (en) 1997-01-16 1998-07-23 Cohesion Corporation Lyophilized collagen-based biomaterials, process of preparation and uses thereof
AT407117B (de) 1997-09-19 2000-12-27 Immuno Ag Fibrinschwamm
CN1141981C (zh) 1999-02-04 2004-03-17 李校坤 促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用
JP4334719B2 (ja) 1999-08-27 2009-09-30 学校法人 関西大学 凍結保護物質の調製方法
EE05587B1 (et) 2001-01-25 2012-10-15 Nycomed Pharma As Meetod kollageenk„sna valmistamiseks
CN1183941C (zh) * 2002-09-28 2005-01-12 陈武德 一种治疗心脑血管病的中药水丸
CN1197631C (zh) 2002-12-30 2005-04-20 中国皮革和制鞋工业研究院 一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法
GB0303999D0 (en) 2003-02-21 2003-03-26 Devro Plc Collagen film
CN100444901C (zh) 2003-08-07 2008-12-24 唐宝辉 生物膨胀性止血海绵及其生产工艺
US20090312524A1 (en) * 2003-11-28 2009-12-17 Alternative Sourced Collagen, Llc Compositions and methods comprising collagen
CA2571981C (en) * 2004-07-09 2014-12-30 Ferrosan A/S Haemostatic composition comprising hyaluronic acid
CN100444902C (zh) * 2005-08-15 2008-12-24 上海其胜生物制剂有限公司 胶原蛋白海绵的制备工艺
JP2009540936A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ユニバーシティー オブ サウス フロリダ コラーゲン足場、それを伴う医療用埋植物、およびその使用方法
AU2007297611B2 (en) 2006-09-21 2013-02-07 Purdue Research Foundation Collagen preparation and method of isolation
US8088323B2 (en) 2007-02-27 2012-01-03 Ppg Industries Ohio, Inc. Process of electrospinning organic-inorganic fibers
CN101279104B (zh) * 2007-04-05 2011-05-11 王珊珊 一种含有生长因子的胶原蛋白海绵的制备方法
DE102007037056A1 (de) 2007-07-24 2009-01-29 Aesculap Ag Hämostyptikum
CN101486748B (zh) * 2008-01-15 2011-11-02 浙江新和成股份有限公司 一种5，7-双烯胆固醇酯的制备方法
WO2009122902A1 (ja) 2008-04-02 2009-10-08 Hoya株式会社 アパタイト/コラーゲン複合体からなる膨張性多孔体、及びその製造方法
WO2010062049A2 (ko) * 2008-11-03 2010-06-03 Lee Jae In 형상기억합금을 이용한 동력발생장치
CN102357259A (zh) * 2011-07-28 2012-02-22 王珊珊 一种生物蛋白海绵及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5001169A (en) * 1984-10-24 1991-03-19 Collagen Corporation Inductive collagen-based bone repair preparations
WO1990013320A1 (en) * 1989-05-05 1990-11-15 Ferrosan A/S Haemostatic sponge
DE4404625C1 (de) * 1994-02-14 1995-04-13 Ludwig Dr Baumgartner Verfahren zur Inaktivierung thermolabiler Viren in biologischem Material unter Beibehaltung der kollagenen Eigenschaften
RU2193897C2 (ru) * 1996-04-04 2002-12-10 Бакстер Акциенгезельшафт Гемостатическая губка, основанная на коллагене, способ ее получения, повязка для ран, включающая такую губку, и набор для приготовления повязки для ран
WO2001037861A1 (en) * 1999-11-22 2001-05-31 Anamar Medical Ab A conjugate of a collagen ii-binding fragment and an arthritis-affecting pharmaceutical substance
WO2004007707A1 (en) * 2002-07-10 2004-01-22 National Blood Authority Process for producing a virus-inactivated thrombin preparation
CN101612113A (zh) * 2009-06-23 2009-12-30 武汉海特生物制药股份有限公司 一种神经生长因子海绵剂及其制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018074951A1 (ru) * 2016-10-21 2018-04-26 Балабаньян, Вадим Юрьевич Антибактериальная белковая губка для химиотерапии инфицированных ран и способ ее получения

Also Published As

Publication number Publication date
US9439999B2 (en) 2016-09-13
WO2013013537A1 (zh) 2013-01-31
EP2737910A4 (en) 2015-05-27
KR20160108599A (ko) 2016-09-19
RU2014103549A (ru) 2015-09-10
KR20140034938A (ko) 2014-03-20
US20140235539A1 (en) 2014-08-21
EP2737910B1 (en) 2018-12-19
CN102357259A (zh) 2012-02-22
KR101717266B1 (ko) 2017-03-16
JP2014521415A (ja) 2014-08-28
EP2737910A1 (en) 2014-06-04
JP5887407B2 (ja) 2016-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2584348C2 (ru) Композиционная коллагеновая губка и способ ее изготовления
JP6284987B2 (ja) ウイルス不活化血小板抽出物、その使用及び調製
Loo et al. Ultrashort peptide nanofibrous hydrogels for the acceleration of healing of burn wounds
JP4615223B2 (ja) コラーゲンバイオ繊維、ならびにその調製方法および使用
US10576037B2 (en) Compositions comprising placental collagen for use in wound healing
US20070031474A1 (en) Implantable preparations
AU2021202201A1 (en) Extracellular matrix compositions
CN101730540A (zh) 含有角蛋白生物材料的伤口愈合组合物
CN112717200A (zh) 一种重组人胶原蛋白可吸收水凝胶皮肤支架及其制备方法、使用方法
Navarro et al. In vivo evaluation of three-dimensional printed, keratin-based hydrogels in a porcine thermal burn model
KR20070113876A (ko) 혈장성분을 함유하는 창상 치료용 약학 조성물
KR20180028229A (ko) 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법
WO2013045689A1 (en) Therapeutic use of gelatin hydrogels with a gel-sol transition at body temperature
CN111420023B (zh) 含i型胶原和透明质酸的复合物及制备和用途
RU2715715C1 (ru) Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения
Woo et al. Preparation of UV-curable gelatin derivatives for drug immobilization on polyurethane foam: development of wound dressing foam
KR101095940B1 (ko) 주사가능한 불용성 글로빈 이식체
JP7309872B2 (ja) 傷痍治療用医薬組成物
CN115671366B (zh) 促进伤口愈合的复合敷料、其制备方法及应用
RU2462255C1 (ru) Органоспецифический регенерант gi
WO2023088415A1 (zh) 一种鲵皮肤分泌物水解液及其制备方法和应用
Siaghi et al. Luteolin-incorporated fish collagen hydrogel scaffold: An effective drug delivery strategy for wound healing
Esmaeili et al. Xenograft-based skin substitutes: A critical review
JPH02215730A (ja) 細胞増殖抑制剤

Legal Events

Date Code Title Description
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20170207