JP5887407B2 - 複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、バイオ医学材料分野に属しており、複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法に関する。前記複合コラーゲンスポンジは、人体や動物体における創傷面の止血、細胞成長及び増殖の促進、並びに血管及び臓器組織の修復に用いられる。

医療分野において、創傷の修復は臨床手術後の体の成長及び再生と関連性がある病態生理学的過程であり、体の一連の生化学的、生理的および形態的変化を含む。そのため、体に損傷を受けた場合、皮膚および臓器表面の欠損がよく見られる。細胞が回復不可能の状況において、体に転位皮弁及び植皮片の感染、ただれ、壊死などの現象が現れてくる。一般的に、臨床上においてそれらの現象の発生率を低減するために、抗生物質を注射したり、外部に漢方薬や西洋薬を使用したりするなどの抗感染的処理法を採用している。しかし、創傷面における体組織細胞の生存率が極めて低いので、筋肉の欠損、傷跡の残存、創傷治癒周期が長いなどの不良状況が発生してしまい、さらに再手術する必要がある場合も存在するという特徴がある。

傷口に不良状況の発生を避け、また再手術の比率を低減するという技術問題を解決するために、八十年代以来、増殖因子を用いることで身体創傷および医療手術後の体組織修復に対する作用に関する研究や臨床応用は、大量的に行われてきており、体組織修復の内包的な意味も、単なる体表治癒から細胞組織の修復過程までに進めており、増殖因子で創傷面の自然治癒に人為的干渉し、組織細胞の生存効果を促進させ、または回復させる。

コラーゲンは、細胞外マトリックスを構成する構造タンパク質であり、複数の糖タンパク質分子で構成された白く、透明的かつ非分岐性の原繊維であって、四次構造を備える。コラーゲンの単量体はトロポコラーゲンであり、トロポコラーゲン分子は、電子顕微鏡によって検出された直径が１．５ｎｍで、長さが約３００ｎｍで、相対分子量が２．８５×１０^５である細長い三重螺旋チェーンであって、特殊なアミノ酸組成によって安定な三重螺旋空間構造を具備しており、止血の作用、低抗原性、可分解性および生体適合性を有するので、バイオ医学材料を製造し、臨床上の止血および細胞成長を促進するために用いられている。

線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、創傷治癒の過程におけるすべての関連細胞の有糸分裂促進因子、化学走性及び調節タンパク質であって、中胚葉および外胚葉由来の細胞（たとえば、上皮細胞、真皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など）に対して修復促進および再生の作用を有する。

ＵＳ２００６／０２３６８９１、ＵＳ１９７８／４，０６６，０８３、ＵＳ２００８０２６８０５２及びＵＳ２０１０／７，７５４，２５８ に、動物のアキレス腱または皮から抽出されたコラーゲンを用いてコラーゲン膜を製造するための方法が開示されたが、いずれもウイルスを不活性化する対策が言及されていない。臨床応用の過程には、人獣共通病原性微生物の交差感染が存在する可能性があるのも必然的であり、たとえば、脳炎Ｂ型ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ＥＢＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ ＨＥＶ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ＰＲＶ）、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ＶＳＶ）及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などのウイルスは、かつて大規模の人獣交差感染にかかる病気を引き起こし、大災害を引き起こしたことがある。このため、そのような製造技術によって製造された製品は、臨床応用においてある程度のセキュリティリスク｛きけん せい｝がある。

ＣＮ１２２８３３９とＣＮ１５１１５９２に、生物因子が加えられた複合コラーゲンスポンジが開示されたが、製造過程において、放射線照射の方式で滅菌処理が採用されたのである。生体活性材料に対し、放射線照射過程において、製品の温度を高めて生体活性物質を変性させる可能性がある。このため、生体活性材料の活性を低減させるだけではなく、新しい免疫活性物質が生成する可能性もある。それにより、臨床応用に必要とされないトラブルが生じてしまう。

また、製品は、長期にわたる保存過程において活性が低減しつつあり、臨床応用の効果と有効期限に影響を与える。しかし、上述した特許文献には、いずれも入れられた生体活性物質の安定性に対する保護対策や考察を明確的に実施せず、ウイルスを不活性化する効果を確認することもない。

米国特許出願公開第２００６／０２３６８９１号公報 米国特許第４，０６６，０８３号明細書 米国特許出願公開第２００８／０２６８０５２号公報 米国特許第７，７５４，２５８号明細書 中国出願公開第１２２８３３９号明細書 中国出願公開第１５１１５９２号明細書

上記の技術課題を解決するために、本発明は、複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法を提案する。具体的には、本発明は、下記の技術内容が含まれる。

１、本発明は、コラーゲンと細胞増殖因子を含み、吸水量が５２倍よりも大きい複合コラーゲンスポンジを提供する。
２、弾性率が７０．０Ｎ／ｃｍ ^２ よりも大きい、上記１に記載の複合コラーゲンスポンジである。
３、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニンおよびセリンから選ばれた少なくとも１種であるアミノ酸と、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロースおよびマンニトールから選ばれた少なくとも１種である糖と、アルブミンとを（１〜１１）：（１．２５〜１７．５）：（１〜７．５）の重量比で含む保護剤をさらに含み、複合コラーゲンスポンジに対して保護剤の含有量が１０重量％〜５０重量％である、上記２に記載の複合コラーゲンスポンジである。
４、上記保護剤は、コラーゲン溶液に添加されたアミノ酸の終濃度が２．０ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．５ ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌであり、コラーゲン溶液に添加された糖の終濃度が２．５ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３．０ ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌであり、コラーゲン溶液に添加されたヒト血清アルブミンの終濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌであるように添加されている、上記３に記載の複合コラーゲンスポンジである。
５、上記保護剤はグリセリンをさらに含み、コラーゲン溶液に添加されたグリセリンの終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである上記４に記載の複合コラーゲンスポンジである。そのため、上記コラーゲンスポンジにグリセリンが含まれた場合、それと保護剤における糖との重量比が（０．５〜７．５）：（１．２５〜１７．５）である。
６、コラーゲン、細胞増殖因子及び上記３〜５のいずれか１項に記載の保護剤を含む複合コラーゲンスポンジである。
７、本発明は、上記１〜６のいずれか１項に記載の複合コラーゲンスポンジの製造方法であって、該方法におけるコラーゲンの精製工程は、ＣＭ５２陽イオン交換樹脂の分取クロマトグラフィーであるイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する工程を含み、溶離液は、濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ〜０．８ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムと、濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌである酢酸ナトリウムとを含むｐＨ４．５の水溶液である、複合コラーゲンスポンジの製造方法である。
８、該方法における、ウイルス不活性化の工程は、
有機溶剤／洗浄剤による、ウイルスを不活性化する過程である第１のウイルス不活性化の過程と、
複合コラーゲンスポンジ溶液を９０℃〜１００℃で３０〜１２０分間水浴処理する第２のウイルス不活性化の過程という二段ウイルス不活性化の過程を含む、上記７に記載の複合コラーゲンスポンジの製造方法である。
９、上記有機溶剤／洗浄剤は、ポリソルベート８０とリン酸トリブチルの混合物であり、コラーゲン溶液における上記ポリソルベート８０とリン酸トリブチルの添加量は、ポリソルベート８０の終濃度が１％、リン酸トリブチルの終濃度が０．３％であり、好ましくは、コラーゲンの濃度が３０ ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌで、ｐＨ値が６．０〜８．０であるように制御された条件下で、コラーゲン溶液にポリソルベート８０とリン酸トリブチルを含む混合滅菌水溶液を徐々に添加し、ポリソルベート８０の終濃度が１％、リン酸トリブチルの終濃度が０．３％となるようにするとともに、２４℃〜２６℃でウイルスを６〜８時間不活性化する、上記８に記載の複合コラーゲンスポンジの製造方法である。
１０、保護剤の存在下で、上記第２のウイルス不活性化の過程を実施し、コラーゲン溶液に添加される保護剤の量は、保護剤を構成するアミノ酸の終濃度が２．０ ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌ、糖の終濃度が２．５ ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌ、アルブミンの終濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌとなる量であり、好ましい状況において、上記保護剤はグリセリンをさらに含み、コラーゲン溶液に添加されるグリセリンの終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである、上記６〜９のいずれか１項に記載の複合コラーゲンスポンジの製造方法である。

本発明の複合コラーゲンスポンジは、毛細血管の再生を促進し、局部の血液循環を改善し、創傷面の治癒を加速することができ、火傷創傷面（浅達性ＩＩ度、深達性ＩＩ度、肉芽創傷面を含む）、慢性創傷面（体表慢性潰瘍などを含む）及び新鮮創傷面（外傷、皮膚提供区における創傷面、手術創傷などを含む）に用いられる。本発明の複合コラーゲンスポンジ製品は、長期にわたる保存過程においても生体活性物質の安定性を保持することができ、高吸水性、高弾性率及び優れている柔軟性を具備しており、臨床応用にも優れた効果が生じる。

図１は、本発明のコラーゲンの電気泳動像である。図１は、ａが標準相対分子量Ｍａｒｋｅｒを示し、ｂがコラーゲンの標準品を示し、ｃが本発明のコラーゲンのサンプルを示す。 図２は、本発明のサンプルと対照サンプルとの吸水量の比較を示す。 図３は、本発明のサンプルと対照サンプルとの弾性率の比較を示す。

本発明のコラーゲンは、新鮮な哺乳動物の結合組織または豚皮を原料としてもよい。本発明の具体的な１つの実施態様において、上記コラーゲンは豚皮から抽出されたＩ型コラーゲンである。抽出過程には、塩析とクロマトグラフィー精製とを組み合わせる方式を採用して精製する。それにより、得られたコラーゲンは、純度が高く、非免疫原性であり、かつ、吸水性と弾性率も大幅に向上された。そして、得られたコラーゲンに対して二段ウイルス不活性化工程を実施することで、得られたコラーゲンスポンジの病原微生物による汚染リスクを低減するとともに、生体活性物質に与える影響も低減することができる。また、有効な保護剤を添加することにより、得られた複合コラーゲンスポンジ製品は高い安定性を有する。

本発明が提供する複合コラーゲンスポンジは、コラーゲンをマトリックスにし、増殖因子が均一的に分布されたものである。たとえば、１平方センチメートルあたりの複合コラーゲンスポンジに、２００Ｕ〜１５００Ｕの塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が含まれる。

本発明によって製造された複合コラーゲンスポンジを、長さが２．５ｃｍ〜１０ｃｍで、幅が２．５ｃｍ〜５．０ｃｍで、厚さが０．３ｃｍ〜２．０ｃｍである製品として製造可能である。

本発明が提供するコラーゲンスポンジは、コラーゲンの純度が９９．０％よりも大きく、吸水量が５２倍よりも大きく、灰分が１．０％よりも少ないという特徴を有する。

本発明が提供するコラーゲンは、弾性率が７０．０Ｎ／ｃｍ ^２ よりも大きく、形成された孔径が大体５０ｕｍ〜１００ｕｍであり、０〜１００時間（ｈ）内に、ＦＧＦを連続して放出することができ、創傷に対する治療効果を向上させる。

コラーゲンスポンジ製品にウイルスが載せられるリスクを低減して、製品の安全性を確保するために、原料に対するスクリーニングとコントロールを強化するだけではなく、本発明のコラーゲンスポンジの製造方法には、下記の二段ウイルス不活性化の過程も採用される。

第１のＳ／Ｄによるウイルス不活性化の過程：抽出して得られたコラーゲン溶液にウイルス不活性化剤、たとえば、有機溶剤／洗浄剤（Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を添加して、脂質エンベロープウイルスを不活性化する。具体的な方法というと、５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで連続して撹拌する状態において、コラーゲン溶液にポリソルベート８０とリン酸トリブチルを含む水溶液を徐々に添加し、均一的に撹拌することにより、ポリソルベート８０の終濃度が１％、リン酸トリブチルの終濃度が０．３％となるようにするとともに、２４℃〜２６℃でウイルスを６〜８時間不活性化する。

流行性脳炎Ｂ型ウイルスと仮性狂犬病ウイルスを指示ウイルスとして使用する。上記の方法により、指示ウイルスの不活性化量が４ｌｏｇｓよりも大きく、安全性の要求に合致している。

上記のウイルス不活性化の方法には、コラーゲンの濃度が高すぎるとウイルス不活性化の効果に影響を与えたので、コラーゲンの濃度が３０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌで、ｐＨ値が６．０〜８．０であるように制御された条件下で、上記Ｓ／Ｄによるウイルス不活性化の過程を行うのは一般的である。

第２のウイルス不活性化の過程：９０℃〜１００℃で製品のウイルス不活性化を３０ｍｉｎ〜１２０ｍｉｎ行う。たとえば、製品をアルミニウムプラスチックで包装した後、水浴滅菌器に入れて、９０℃〜１００℃で製品の水浴処理を３０ｍｉｎ〜１２０ｍｉｎ実行する。放射線照射の代わりに該水浴滅菌方法でウイルスを不活性化処理することで、ＤＮＡやＲＮＡ非脂質エンベロープウイルスを有効的に不活性化するという効果を達成できる。

第２のウイルス不活性化の過程において、９０℃〜１００℃でウイルス不活性化を３０ｍｉｎ〜１２０ｍｉｎ実行する条件が、コラーゲンと増殖因子の生体活性に影響を与える可能性がある。その問題を解決するために、本発明は、第２のウイルス不活性化の過程に、コラーゲン溶液に、アミノ酸、糖及びアルブミンを含む保護剤を添加する。得られた複合コラーゲンスポンジをより柔らかくし、弾性力がより大きくするために、上記保護剤に適量のグリセリンを添加してもよい。

上記保護剤に使われたアミノ酸またはアミノ酸塩は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニンおよびセリンから選ばれた１つまたは２つのものである。コラーゲン溶液に添加されたアミノ酸またはアミノ酸塩は終濃度が２．０ ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌであることが一般的であり、好ましくは、２．５ ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである。

上記保護剤に使われた糖は、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロースおよびマンニトールから選ばれた少なくとも１つのものである。コラーゲン溶液に添加された糖は終濃度が２．５ ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌであることが一般的であり、好ましくは、３．０ ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである。

上記保護剤にグリセリンが含まれる場合に、コラーゲン溶液に添加されたグリセリンは、終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌであることが一般的である。

製品を臨床に応用するとき、上記保護剤に使われるアルブミンは、ヒト血清アルブミンであることが望ましい。コラーゲン溶液に添加されたヒト血清アルブミンは終濃度が２ｍｇ／ｍｌ以上であり、１５ｍｇ／ｍｌが上限となる。

本発明のコラーゲンは、動物の皮から抽出されたものであり、製品を臨床に応用するとき、豚皮から抽出されたＩ型コラーゲンを採用することが望ましい。調製された複合コラーゲンスポンジの溶液には、コラーゲンの含有量が３０ｍｇ／ｍｌ以上であり、線維芽細胞増殖因子の濃度が４００ Ｕ／ｍｌ〜３０００Ｕ／ｍｌであることが一般的である。

Ｓ／Ｄによるウイルス不活性化の方法は、血液製品に適用できるのが一般的である。血液製品に有機溶剤／洗浄剤（Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を添加することで脂質エンベロープウイルスを不活性化することは、一般的な方法であり、使用された有機溶剤／洗浄剤は、ポリソルベート８０とリン酸トリブチルである。しかし、ポリソルベート８０とリン酸トリブチルは、一定の副作用があるので、ポリソルベート８０の残留量が１００ｕｇ／ｍｌ未満、リン酸トリブチルの残留量が１０ｕｇ／ｍｌ未満であるように、後続のコラーゲンの精製過程において、両方の残留量をコントロールする必要がある。

本発明には、２回の塩析及びクロマトグラフィー精製を通じて、ポリソルベート８０とリン酸トリブチルを有効に除去することができ、それにより、ポリソルベート８０の残留量は、１０ｕｇ／ｍｌ未満、リン酸トリブチルの残留量は２ｕｇ／ｍｌ未満である。

コラーゲンの抗原性は、主にコラーゲン分子鎖末端にある非螺旋領域、すなわち、Ｃ末端ペプチドとＮ末端ペプチド由来である。本発明は、ペプシンを介して分子鎖端末にある非螺旋領域を分解して、抽出や精製過程を通じて端末ペプチドを除去することで、純度が高いコラーゲンを取得し、コラーゲンスポンジを製造するために用いられる。塩析精製を行うとき、使われる塩化ナトリウム水溶液は濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ〜３．５ｍｏｌ／Ｌであり、好ましい濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍｏｌ／Ｌであり、０℃〜４℃の条件下、４ｈ〜１２ｈを維持する。ＣＭ５２陽イオン交換クロマトグラフィー精製のとき、ｐＨ＝３．５〜４．５で、濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ〜０．８ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウム水溶液を用いて勾配溶離を行うが、濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ４．５である酢酸ナトリウム水溶液を用いて勾配溶離を行うことが望ましい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動検査によって、本発明のコラーゲンは、完全な三重螺旋構造を具備するので、完全な生体活性を保持している。しかも、検査や計算を行った結果、コラーゲンの純度が９６％（Ｗ／Ｗ）以上で、さらに、９９．０％以上である。それにより、従来の精製方法で抽出された純度が低いコラーゲンによる免疫原性の反応問題を避けることができる。

生物因子の活性を保証するために、製品を凍結乾燥するとき、まず、−４０℃〜−４５℃で凍結を３ｈ〜５ｈ実行して、そして、真空乾燥を行い、真空度が２０Ｐａを超えないようにコントロールし、１０ｈ〜１５ｈにおいて製品の温度を２０℃までに上昇させるように製品温度の上昇レートをコントロールし、さらに２０℃〜２５℃で２ｈ〜５ｈ維持し、凍結乾燥された製品の水分を５％以内になるようにコントロールする。

具体的にいうと、本発明の複合コラーゲンスポンジの製造工程は、以下の通りである。

工程１ 原料を選択し、脱脂処理を行う。
検疫検査に合格した新鮮な哺乳動物の結合組織または豚皮を原料とし、処理を行う。プロセスは以下の通りである。豚皮をナイフで毛と内側の油脂を除去し、処理後の豚皮を秤量してからステンレス容器に入れる。原料である豚皮と１０％〜３５％（Ｗ／Ｗ）（好ましくは２５％）の炭酸ナトリウム溶液とが１：１〜１０の重量比（好ましくは１：５）で、炭酸ナトリウム溶液を添加し、２０ｍｉｎ〜６０ｍｉｎ（好ましくは２０ｍｉｎ）浸漬し、５分につき１回撹拌する。浸漬後取り出して、精製水で１０回洗い流し、水を切り、ステンレス製のナイフで原料における油脂または毛包などの不純物を除去する。

工程２ 粉砕工程：工程１で処理された豚皮を秤量し、カッターで短冊状に切ってから、低温粉砕機を利用して０．２〜０．５cm^２の塊状に切ってから、ステンレス製容器に入れる。そして、７５％のエタノール溶液を入れて２０ｍｉｎ浸漬してから取り出し、精製水で１０回繰り返して洗い流し、そして、冷却後の注射用水で５回繰り返して洗い流して、水を切る。

工程３ 酵素の分解工程：工程２で処理された豚皮原料に０℃〜４℃の注射用水を１：５〜３０の重量比で添加し（たとえば、豚皮と水の比率は１ｋｇ：１０ｋｇである）、均一的に混合させ、蠕動ポンプで、事前に冷却循環システムが起動されているコロイドミルに入れて、温度が０℃〜４℃であるようにコントロールし、ホモジネートとなる。そのホモジネートを酵素分解タンクに入れ、１．０Ｍの酢酸水溶液を徐々に滴下し、ｐＨ値を２．５〜３．５、好ましくは２．５に調整する。ペプシン（工程２の原料１ｋｇに５ｇ〜１０ｇのペプシンを添加するように）を添加し、酵素分解温度が１０℃〜２０℃の間にコントロールし、２０ｈ〜２４ｈ酵素分解し、そのとき、酵素分解液は、粘稠的かつ均一的なのり状流体となる。

工程４ ペプシンを不活性化する：工程３で処理された酵素分解液に重量比が２０％である水酸化ナトリウム溶液を徐々に添加し、ｐＨ値を９．０に調整して、０℃〜４℃で１０ｈ維持する。そして、１．０Ｍの酢酸水溶液を用いてｐＨ値を６．５に調整する。

工程５ 濾過：工程４で処理された酵素分解液に注射用水を添加し（酵素分解液と注射用水との重量比が１：１〜１０であるように希釈する）、均一的に混合して、コラーゲンの濃度が３０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは３０ｍｇ／ｍｌとなるようにする。孔径が４０μｍであるフィルタエレメントを用いて荒濾過を行ってから、孔径が１．０μｍであるフィルタエレメントを用いて精濾過を行い、ウイルス不活性化の専用タンクに入れる。

工程６ Ｓ／Ｄによるウイルス不活性化工程：５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍで連続して撹拌している状態において、工程５で処理された溶液にポリソルベート８０とリン酸トリブチルを含む水溶液を徐々に添加し、均一的に撹拌することにより、ポリソルベート８０の終濃度が１％（重量％）、リン酸トリブチルの終濃度が０．３％（重量％）となるようにし、２４℃〜２６℃でウイルスを６〜８ｈ、好ましくは６ｈ不活性化する。

工程７ 塩析工程：工程６で処理された溶液に塩化ナトリウムを添加するとともに、攪拌機で攪拌する。回転速度が１００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍで、塩化ナトリウムの終濃度が２．０ｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２．５ｍｏｌ／Ｌであるようにし、０℃〜４℃で４ｈ維持する。連続フロー冷却遠心機で、１４０００ｒｐｍ〜１６０００ｒｐｍ、０℃〜４℃の条件下、６０ｍｉｎ〜３０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てる。沈澱物：０．３Ｍの酢酸水溶液の質量比＝１：１０〜１５となるように、沈澱物を取って０．３Ｍの酢酸水溶液に添加して、均一的に撹拌し、沈澱物を完全に溶解させる。塩化ナトリウムを添加して、塩化ナトリウムの終濃度が２．０５ｍｏｌ／Ｌ〜２．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは ２．５ｍｏｌ／Ｌとなるようにし、遠心によって、コラーゲンの沈殿物を取得する。

工程８ 脱塩工程：コラーゲンの沈澱物と９５％の冷エタノールの重量比＝１：３〜８であるように、工程７で得られたコラーゲンの沈殿物に９５％の冷エタノールを添加して、均一的に撹拌し、８０００ｒｐｍ、０℃〜４℃の条件下、３０ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、沈殿物を収集してから、１回繰り返す。コラーゲンの沈殿物：酢酸ナトリウム溶液の重量比＝１：８〜２０であるように、コラーゲンの沈殿物に０．１ｍｏｌ／Ｌ、 ｐＨ４．５である酢酸ナトリウム溶液を添加して、均一的に撹拌し、フィルタエレメントの孔径が０．４５ｕｍであるフィルターで濾過し、ＣＭ陽イオンクロマトグラフィー精製工程に移行する。

工程９ ＣＭ５２陽イオン交換クロマトグラフィー精製工程：ＣＭ５２陽イオン交換樹脂を充填した分取クロマトグラフィーカラム（１０×１００ＣＭ）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム緩衝液によって１０個のカラム床体積でバランス処理して、サンプルローディングする。サンプルローディングの速度は、２０．０ ｍｌ／ｍｉｎ〜３０．０ｍｌ／ｍｉｎであり、好ましくは２３．０ｍｌ／ｍｉｎである。そして、それぞれ、濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．５である酢酸ナトリウム水溶液を用いて５個のカラム床体積で溶離し、さらに、０．４ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．５である酢酸ナトリウム水溶液を用いて溶離し、ピークが現れたとき、タンパク質溶離液を収集し、そして、０．６ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．５である酢酸ナトリウム水溶液を用いて５個のカラム床体積で溶離し、検出波長が２１５ｎｍである。

工程１０ 限外濾過工程：収集されたコラーゲン溶離液を、孔径が１０ｋＤで、膜面積が４Ｍ^２であるタンジェンシャルフロー限外濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で限外濾過して、濃縮脱塩処理を行う。まず、原容積の１／３までに濃縮し、２／３の注射用水を補充してから、さらに、原容積の１／３までに濃縮し、２／３の注射用水を補充し、そして、原容積の１／３までに濃縮する。濃縮過程において、限外濾過機の入口圧力が０．１５Ｍｐａ未満で、コラーゲンの分画液を収集する。

工程１１ 調製工程：工程１０で得られたコラーゲン溶液を濃度が４０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、表１に示された配合によって１０００ミリリットルの複合コラーゲンスポンジ溶液を調製する。

工程１２ 濾過滅菌工程：調製された溶液を、材質がポリエーテルスルホンであり、孔径が０．４５μｍと０．２２μｍであるフィルタエレメント（ＰＡＬＬ）を装着したフィルターで順に濾過する。

工程１３ 凍結乾燥工程：工程１２で処理された溶液をステンレス製金型に添加し、金型の仕様が１５ｃｍ×５ｃｍであり、分注液体が３７ｍｌである。そして、凍結乾燥機に入れて凍結乾燥を行う。低温凍結乾燥の方法で、溶液における水分を除去する。まず、−４０℃で４ｈ凍結し、そして、真空乾燥を行い、真空度が２０Ｐａを超えないようにコントロールし、１５ｈ以内に製品の温度を２０℃まで上昇させるように製品温度の上昇レートをコントロールし、さらに２５℃で４ｈ維持する。

工程１４ 第２のウイルス不活性化工程：凍結乾燥後の製品をアルミニウムプラスチック包装機でアルミニウムプラスチック包装し、そして、水浴滅菌器に入れ、水浴によるウイルス不活性化を行う。ウイルス不活性化の完了後、製品を２℃〜８℃の条件下で、暗所保存して予備する。

実施例１−３
表１に示される条件に従って、上記複合コラーゲンスポンジの製造工程を実行し、サンプル１−３を取得した。

実施例１における保護剤は、使われるアミノ酸がグリシンであり、糖がスクロースであり、実施例２における保護剤は、使われるアミノ酸が重量比が１：１であるロイシンとイソロイシンであり、糖が重量比が１：２であるグルコースとトレハロースであり、実施例３における保護剤は、使われるアミノ酸が重量比が１：１であるアラニンとセリンであり、糖が重量比が１：２であるラクトースとマンニトールであった。

５、検出結果
（１） Ｓ／Ｄによるウイルス不活性化効果に対する検証
Ｓ／Ｄによるウイルス不活性化効果に対して検証を行った。流行性脳炎Ｂ型ウイルスと仮性狂犬病ウイルスを指示ウイルスとして使用し、培養細胞がＢＨＫ２１細胞であり、９６ウェルの細胞病変法を採用して、Ｋａｒｂｅｒ法に従って計算した。結果は、表２と表３に示す。

結果：実施例１のウイルス減少量≧５．５６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例２のウイルス減少量≧５．８１３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例３のウイルス減少量≧５．５６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ

結果：実施例１≧５．０６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例２≧４．８１３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例３≧４．３７５ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ

検証結果により、コラーゲン溶液は、Ｓ／Ｄ処理を経て、指示ウイルスの不活性化量が４ｌｏｇｓよりも大きく、安全要求に合致することが示された。すなわち、コラーゲン濃度が３０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌで、ｐＨ値が６．５〜７．５であるように制御された条件下で、ポリソルベート８０の終濃度が１％、リン酸トリブチルの終濃度が０．３％となるようにして、２４℃〜２６℃でウイルスを６ｈ〜８ｈ不活性化するのは、有効的である。

（２） 水浴でウイルスを不活性化してから、サンプルを取って不活性化の効果検証を行った。流行性脳炎Ｂ型ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及び豚パルボウイルスを指示ウイルスとして使用し、培養細胞がＢＨＫ２１細胞であり、９６ウェルの細胞病変法を採用して、Ｋａｒｂｅｒ法に従って計算した。結果は、表４、表５及び表６に示す。

結果：実施例１≧４．９３８ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例２≧５．１８８ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例３≧５．０６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ

結果：実施例１≧４．５６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例２≧５．０６３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例３≧５．１８８ｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ

結果：実施例１≧４．８１３ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例２≧４．７５０ＬｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ
実施例３≧５．１２５ｇＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌ

検証結果により、サンプルは、水浴不活性化処理を経て、指示ウイルスの不活性化量が４ｌｏｇｓよりも大きく、安全要求に合致することが示された。

（３） コラーゲンの純度検査
コラーゲンがクロマトグラフィー精製された後、コラーゲンの純度検査を行った。同じ質量濃度を有する、コラーゲン対照品、クロマトグラフィー精製されたサンプル及びクロマトグラフィー精製されていないサンプルを調製し、サンプル処理液と混合して、沸騰水浴で５ｍｉｎ加熱し、濃縮ゲルが５％、分離ゲルが１０％で、電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、７．５％酢酸と５％メタノールで脱色した。サンプルローディング量は１０ｕｌであった。Ｉ型コラーゲン対照品は、Ｓｉｇｍａ社から購入されたものである。 コラーゲンは、クロマトグラフィー精製された後、電気泳動分析を経て、対照品と比べて、バンドが一致しており、典型的なＩ型コラーゲンであり、且つその他の不純的なバンドが存在しないことが示された。それにより、抽出されたサンプルは純度が高いものであることが分かった。電気泳動像が図１に示す。図１は、ａが標準相対分子量Ｍａｒｋｅｒを示し、ｂがコラーゲンの標準品を示し、ｃが本発明の実施例２で取得されたコラーゲンのサンプルを示す。

（４） コラーゲンの含有量検査
ケルダール法によってタンパク質の総量を検査し、そして、Ｗｏｅｓｓｅｎｅｒ法を利用して水分解液におけるヒドロキシプロリンの含有量を測定した。式Ｍ_１＝Ｍ_０／１４％に従ってコラーゲンの含有量を算出し、タンパク質の総量と比較して、コラーゲンの純度を計算した。本発明の実施例２におけるコラーゲンの含有量は、対照品の含有量以上であるため、純度が高いことが分かった。結果は、表７に示す。

（５） ポリソルベート８０とリン酸トリブチルの残留量
クロマトグラフィー精製された後、サンプリングしてポリソルベート８０とリン酸トリブチルの残留量を検査し、除去効果の有効性を確認した。

ポリソルベート８０におけるポリエトキシル（Ｐｏｌｙｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）とアンモニウムコバルトチオシアネートと反応して生成された青色の複合物がジクロロメタンに溶解可能であることを利用して、比色分析方法で６２０ｎｍでポリソルベート８０を測定した。ポリソルベート８０対照品はＣＡＳＲｅｓｔｒｙＮｕｍｂｅｒ：９００５−６５−６（アメリカＵＳＰ薬局方基準）である。ガスクロマトグラフィーでサンプルにおけるリン酸トリブチルの残留量を測定した。リン酸トリブチル対照品はＣＡＳＲｅｓｔｒｙＮｕｍｂｅｒ：１２６−７３−８ （ヨーロッパＥＰ薬局方基準）であり、クロマトグラフ：島津ＧＣ−１４Ｃであり、酸変性ポリエチレングリコールキャピラリーカラムと、フレームイオン化検出器とを使用し、注入量が０．１ｕｌであった。その結果により、クロマトグラフィー精製された後、製品におけるポリソルベート８０とリン酸トリブチルの残留量は、極めて低く、安全要求に合致することが分かった。結果は、表８に示す。

（６） 水浴不活性化前後のＦＧＦ活性変化
複合コラーゲンスポンジの組成が表９に示されること以外、実施例１と同じ方法を採用し、サンプル４、５および６を取得した。

細胞増殖法／ＭＴＴ比色分析を用いて線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を検査した。細胞がＮＩＨ３Ｔ３であり、線維芽細胞増殖因子は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長に対して刺激的な作用を持っている。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長状況は、線維芽細胞増殖因子の生体活性によって異なることによって、線維芽細胞増殖因子の活性を検査した。ＦＧＦ標準品は、中国薬品生物製品鑑定所から購入され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、中国科学院典型培養物委員会細胞庫から購入されたものである。検査結果は、表１０、表１１に示す。

検査結果により、１０ｋＧのＣｏ６０による照射でＦＧＦの活性が大きく損害され、１０ｋＧのＣｏ６０による照射は１００℃、３０ｍｉｎと比べて、データはＳＰＳＳソフトウェアの処理を経て、 Ｐ＜０．０１ となり、比較可能性があることが明らかになった。

線維芽細胞増殖因子の添加量が異なる以外に、実施例１と同じ方法でコラーゲンスポンジを製造し、サンプル７、８を取得し、サンプル４と長期にわたる安定的な考察実験を行った。結果により、配合に保護剤としてアミノ酸、アルブミン、糖及びグリセリンを添加することは、製品が有効期限内における生体活性を有効的に保証できることが分かった。

（７） 吸水性の比較
実施例１、２、３によって取得されたサンプル１、２及び３の吸水性を検査して、対照サンプルと比較した。スポンジを取って、精密に計量し（０．１ｍｇまで精確し）、２０℃の精製水に浸漬して、破損させないように柔らかにこする。水分が十分に吸収された後、ピンセットで一角を軽く挟んで、水面からあげて、そのまま２分間保持した後計量し、コラーゲンスポンジの質量と比較した。検査及び比較の結果は図２に示す。

図２には、Ｙ軸は吸水量（質量／質量）であり、対照１は『アメリカ薬局方』（ＵＳＰ３２−ＮＦ２７）における吸収性ゼラチンスポンジの吸水量標準であり、対照２は中国特許文献ＣＮ１０１２７９１０４ における実施例１に従って製造されたコラーゲンスポンジであり、対照３は中国特許文献ＣＮ１９１５４３７における実施例に従って製造されたコラーゲンスポンジである。図２から、本発明の複合コラーゲンスポンジの吸水量はいずれも５２倍以上であり、しかも、従来技術により製造されたコラーゲンスポンジと既存のコラーゲンスポンジは、本発明のような吸水量に達することができないことが分かった。

（８） 弾性率の比較
サンプルの両端をそれぞれ、引張試験機の冶具に固定し、試験機を起動して一定の速度でサンプルを引き張り、サンプルが破壊されるまでに、サンプルの応力変化を測定した。検査及び比較の結果は図３に示す。図３には、Ｙ軸は弾性率（Ｎ／ｃｍ ^２ ）であり、対照４はＣＮ１４８７９６７Ａに開示された方法によって製造されたコラーゲンスポンジである。図３から、本発明のサンプルは７０．０Ｎ／ｃｍ ^２ よりも大きい弾性率を有し、従来技術により製造されたコラーゲンスポンジは５０．０Ｎ／ｃｍ ^２ 未満であることが分かった。

Claims (9)

1. コラーゲンと細胞増殖因子を含み、
   吸水量が質量基準で５２倍よりも大きく、
   弾性率が７０．０Ｎ／ｃｍ ^２ よりも大きく、
   ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニンおよびセリンから選ばれた少なくとも１種であるアミノ酸と、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロースおよびマンニトールから選ばれた少なくとも１種である糖と、アルブミンとを（１〜１１）：（１．２５〜１７．５）：（１〜７．５）の重量比で含む保護剤をさらに含み、複合コラーゲンスポンジに対して保護剤の含有量が１０重量％〜５０重量％である
   ことを特徴とする複合コラーゲンスポンジ。
2. 前記保護剤はグリセリンをさらに含む、請求項１に記載の複合コラーゲンスポンジ。
3. コラーゲン、細胞増殖因子及び前記保護剤を含むことを特徴とする請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の複合コラーゲンスポンジ。
4. ＣＭ５２陽イオン交換樹脂の分取クロマトグラフィーであり且つ使用される溶離液が濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌ〜０．８ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウムと、濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌである酢酸ナトリウムと、を含むｐＨ４．５の水溶液であるイオン交換クロマトグラフィーを用いた精製過程を含むコラーゲン精製工程を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の複合コラーゲンスポンジを製造する方法。
5. コラーゲン溶液において有機溶剤／洗浄剤によりウイルスを不活性化する過程である第１のウイルス不活性化の過程、及び
   複合コラーゲンスポンジを９０℃〜１００℃で３０分間〜１２０分間水浴処理する第２のウイルス不活性化の過程、
   という二段ウイルス不活性化の過程を含むウイルス不活性工程を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記有機溶剤／洗浄剤は、ポリソルベート８０とリン酸トリブチルの混合物であり、前記コラーゲン溶液における前記ポリソルベート８０と前記リン酸トリブチルの添加量は、前記ポリソルベート８０の終濃度が１％、前記リン酸トリブチルの終濃度が０．３％である請求項５に記載の方法。
7. コラーゲンの濃度が３０ｍｇ／ｍｌ〜７０ｍｇ／ｍｌであるように制御された条件下で、前記コラーゲン溶液に前記ポリソルベート８０と前記リン酸トリブチルを含む混合滅菌水溶液を徐々に添加し、前記ポリソルベート８０の終濃度が１％、前記リン酸トリブチルの終濃度が０．３％となるようにするとともに、２４℃〜２６℃でウイルスを６〜８時間不活性化することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニンおよびセリンから選ばれた少なくとも１種であるアミノ酸と、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロースおよびマンニトールから選ばれた少なくとも１種である糖と、アルブミンとを（１〜１１）：（１．２５〜１７．５）：（１〜７．５）の重量比で含む保護剤の存在下で前記第２のウイルス不活性化の過程を実施し、前記コラーゲン溶液に添加される前記保護剤の量は、前記保護剤を構成する前記アミノ酸の終濃度が２．０ｍｇ／ｍｌ〜２２ｍｇ／ｍｌ、前記糖の終濃度が２．５ ｍｇ／ｍｌ〜３５ｍｇ／ｍｌ、前記アルブミンの終濃度が２ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌとなる量である請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記保護剤はグリセリンをさらに含み、前記コラーゲン溶液に添加される前記グリセリンの終濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌである請求項８に記載の方法。