CN111303454A - 一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用，属于医学和生物医学工程领域。该方法包括以下步骤：提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，制备胶原冻干样品；将所得胶原冻干样品剪碎后采用酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品‑酸溶液；将所得鳄鱼皮胶原冻干品‑酸溶液置于4℃以下的环境溶解，并在4℃以下采用碱溶液将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。本发明提供了一种爬行类动物无免疫原性的胶原水凝胶的制备方法，所得水凝胶可以用于关节软骨缺损的修复以及治疗，可以降低朊病毒和病毒疾病的传播，避免应用过程中引起自身免疫反应，提高了软骨缺损修复的有效性和安全性。
Description
技术领域
本发明涉及涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有血供，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复。传统的治疗如关节内清理和灌洗术等难以获得满意的临床效果。组织工程技术通过种子细胞复合支架材料构建组织工程化软骨，植入到缺损部位而实现治疗目的。
胶原水凝胶作为软骨主要成分之一，具备理想的生物相容性及成软骨性能。目前应用于软骨组织工程的胶原水凝胶主要来源于哺乳动物，包括牛皮、猪皮及鼠尾胶原。然而，哺乳动物源性基质可能传播朊病毒和病毒疾病(C.R.Trevitt,P.N.Singh,VariantCreutzfeldt-Jakob disease:pathology,epidemiology,and public healthimplications,American Journal of Clinical Nutrition,2003；78(3Suppl):651S-656S)。此外，哺乳动物源性胶原可能引起自身免疫反应(E.K.Choi,P.A.Gatenby,N.W.Mcgill,J.F.Bateman,W.G.Cole,J.R.York,Autoantibodies to type II collagen:occurrence in rheumatoid arthritis,other arthritides,autoimmune connectivetissue diseases,and chronic inflammatory syndromes,Annals of the RheumaticDiseases,1988；47(4):313-22)。Courtenay等(J.S.Courtenay,M.J.Dallman,A.D.Dayan,A.Martin,.,B.Mosedale,.Immunisation against heterologous type II collageninduces arthritis in mice,Nature,1980；283(5748):666-8)使用牛皮胶原诱导小鼠关节炎(CIA)模型，已经用于研究自身免疫疾病模型构建超过30年。
发明内容
本发明提供了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用，能够解决上述现有技术问题中的一种或几种。
根据本发明的一个方面，提供了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，并制备胶原冻干样品；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎；
(3)将经步骤(2)处理后所得到的胶原材料采用醋酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液置于4℃以下的环境中进行溶解，充分溶解后在4℃以下的环境中采用碱溶液将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。
由此，通过本方法可以制备鳄鱼皮的无免疫原性的胶原水凝胶，可以用于关节软骨缺损的修复以及治疗，所得胶原水凝胶来源于两栖爬行类动物，一方面可以降低朊病毒和病毒疾病的传播，另一方面还可以避免应用过程中引起自身免疫反应，提高了软骨缺损修复的有效性和安全性。
在一些实施方式中，步骤(1)中提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，以及制备胶原冻干样品包括以下步骤：
①取新鲜的鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪碎，一般可剪为细丝条状，将剪碎的鳄鱼皮装入锥形瓶中；
②将脱脂液(乙醇:氯仿＝1:1)按5～8:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢充分后用NaCl溶液进行彻底清洗；
④将步骤③中所得的鳄鱼皮用醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用HCl溶液溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，在低温震荡摇床上进行酶消化4～7天，在消化期间可隔天加入适量醋酸促使消化完全；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行离心去除沉淀物，收集上层溶液并用NaOH溶液调至pH＝8～8.5，酶失活后，再用HCl溶液将上述溶液的pH值调至2～2.5；
⑦称取适量的NaCl粉末研细后边搅拌边加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，通过低温高速离心机进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
由此，提供了一种鳄鱼皮胶原的提取方法，按照上述方法提取鳄鱼皮中的胶原可以提高所得胶原样品的纯度。并且，此提取方法简单，对设备的要求不高，易于操作。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原提取的方法中，步骤③中所述EDTA-NaOH溶液的浓度为10％，所述NaCl溶液的浓度为10％；步骤④中醋酸溶液pH＝2；步骤⑤和步骤⑨中所述HCl溶液pH＝2；步骤⑥中所述NaOH溶液的浓度为2mol/L，所述HCl溶液的浓度为2mol/L；步骤
中所述透析袋的分子量为8000～14000。由此，可以保证鳄鱼皮胶原有较高的提取率，并且提高所得胶原样品的纯度。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(2)还包括采用紫外线照射进行杀菌的操作；步骤(3)中所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液的浓度为10～15mg/mL。步骤(2)中紫外线照射杀菌可以保证胶原冻干样品的卫生情况，提高所得水凝胶的安全性。步骤(3)中鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液的浓度为10～15mg/mL可以保证胶原材料的溶解效果。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中采用浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；步骤(4)中采用0.5～1.5mol/L的NaOH溶液调节pH值。采用低浓度的弱酸溶解胶原材料，可以保证胶原材料的溶解效果，并且不会影响胶原品质。低浓度的NaOH溶液调节pH值，可以避免整个体系pH波动过大，从而保证胶原品质。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中采用浓度为0.45～0.55mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；步骤(4)中采用0.6～1.2mol/L的NaOH溶液调节pH值。由此，可以缩短溶解时间，并进一步提高鳄鱼皮胶原水凝胶的产量，保证水凝胶的品质。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(4)中还包括将所得的pH＝6.8～7.2的溶液置于37℃恒温条件下静置的操作。由此，可以促进鳄鱼皮胶原水凝胶成品的成型。
在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中所用醋酸溶液与步骤(4)所用NaOH溶液的体积比大约为5:3。由此，可以获得凝胶性能稳定的胶原水凝胶。
根据本发明的一个方面，还提供了鳄鱼皮胶原水凝胶的一种应用，将制备的鳄鱼皮胶原水凝胶用于诱导干细胞成骨分化。提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)，进行培养得到第三代骨髓间充质干细胞，并将BMSCs包裹于调制好的鳄鱼皮胶原水凝胶中，置于37℃恒温环境下15分钟，形成负载细胞的凝胶，可以使BMSCs的保持良好的活性，促进BMSCs成软骨分化。由此，可以用于软骨缺损的修复。
附图说明
图1为本发明实施例4的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2为本发明实施例4的红外光谱图；
图3为本发明实施例4的紫外光谱图；
图4为本发明实施例4的溶胀曲线图；
图5为本发明实施例4的机械力学图表；
图6为本发明实施例8的活死细胞染色图；
图7为本发明实施例8的肌动蛋白微丝荧光染色图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
实施例1鳄鱼皮胶原的提取
①取新鲜的鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪为2mm*5mm的细丝条状，将剪碎的鳄鱼皮装入锥形瓶中；
②配制乙醇:氯仿＝1:1(V/V)的脱脂液，将脱脂液按5:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用10％EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢充分后用10％NaCl溶液进行彻底清洗；
④将步骤③中所得的鳄鱼皮用pH＝2的醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用pH＝2的HCl溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，在低温震荡摇床上进行酶消化4天，在消化期间隔天加入适量pH＝2的醋酸促使消化完全；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行低温高速离心机离心去除沉淀物，收集上层溶液并用2mol/L的NaOH溶液调至pH＝8，酶失活6小时后，再用2mol/L的HCl溶液将上述溶液的pH值调至2；
⑦称取适量的NaCl粉末研细后边搅拌边加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，通过低温高速离心机离心处理，设置转速为9000rpm，离心40分钟，离心完成后收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
实施例2鳄鱼皮胶原的提取
①取新鲜的鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪为2mm*5mm的细丝条状，将剪碎的鳄鱼皮装入锥形瓶中；
②配制乙醇:氯仿＝1:1(V/V)的脱脂液，将脱脂液按6:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用10％EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢充分后用10％NaCl溶液进行彻底清洗；
④将步骤③中所得的鳄鱼皮用pH＝2的醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用pH＝2的HCl溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，在低温震荡摇床上进行酶消化6天，在消化期间隔天加入适量pH＝2的醋酸促使消化完全；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行低温高速离心机离心去除沉淀物，收集上层溶液并用2mol/L的NaOH溶液调至pH＝8.2，酶失活5小时后，再用2mol/L的HCl溶液将上述溶液的pH值调至2.2；
⑦称取适量的NaCl粉末研细后边搅拌边加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，通过低温高速离心机离心处理，设置转速为9000rpm，离心40分钟，离心完成后收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
实施例3鳄鱼皮胶原的提取
①取新鲜的鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪为2mm*5mm的细丝条状，将剪碎的鳄鱼皮装入锥形瓶中；
②配制乙醇:氯仿＝1:1(V/V)的脱脂液，将脱脂液按8:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用10％EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢充分后用10％NaCl溶液进行彻底清洗；
④将步骤③中所得的鳄鱼皮用pH＝2的醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用pH＝2的HCl溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，在低温震荡摇床上进行酶消化7天，在消化期间隔天加入适量pH＝2的醋酸促使消化完全；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行低温高速离心机离心去除沉淀物，收集上层溶液并用2mol/L的NaOH溶液调至pH＝8.5，酶失活6小时后，再用2mol/L的HCl溶液将上述溶液的pH值调至2.5；
⑦称取适量的NaCl粉末研细后边搅拌边加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，通过低温高速离心机离心处理，设置转速为9000rpm，离心40分钟，离心完成后收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
实施例4鳄鱼皮胶原水凝胶的制备
(1)称取实施例1中所得鳄鱼皮胶原冻干样品1g，备用；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎，并采用紫外线照射进行杀菌处理；
(3)将浓度为0.4mol/L的醋酸溶液100mL加入步骤(2)中所得无菌鳄鱼皮胶原冻干样品中进行溶解，得浓度为10mg/mL的鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液置于4℃以下的环境溶解，溶解过程中置于冰上并不断搅拌，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后仍置于冰上，并采用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液调节pH值，NaOH溶液用量大约为60mL时，其pH值为6.8。将所得溶液置于37℃恒温条件下静置15min，得到液态的水凝胶。
以牛皮胶原为对照，对本实施例所得的鳄鱼皮胶原水凝胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、红外光谱检测、紫外光谱检测确定其关键化学键和鉴定胶原类型；检测溶胀率、降解率、机械力学等分析所得鳄鱼皮胶原水凝胶的材料学特性。
图1中可以看出鳄鱼皮胶原水凝胶样品和牛皮胶原水凝胶样品纯度较高，几乎没有多余条带的出现。二者都至少由两种α肽链组成，并且含有它们的交联链(β和γ链)，符合I型胶原蛋白的特征，可以初步鉴定所提取的胶原为I型胶原。
图2中可以看到牛皮和鳄鱼皮均一一对应出现酰胺A、酰胺B以及酰胺I、酰胺II和酰胺III键，其中酰胺A带是由N-H伸缩振动产生的特征吸收峰，N-H伸缩振动的吸收峰出现在3400-3450cm-1，如果它以氢键和其它官能团形成缔合体后，其峰将偏向低波数一侧，由此证明试样中存在氢键，说明提取的胶原中三股螺旋结构的存在；酰胺B带出现在2941cm-1，是由C-N伸缩振动引起的特征吸收峰；1654cm-1处峰是酰胺Ⅰ带的特征吸收峰，主要与C＝O键的伸缩振动有关，或由氢键和羧基(-COO-)共同产生，并且，这是蛋白质二级结构(也就是α螺旋结构)特有的标志区域；1552cm-1处峰是酰胺Ⅱ带的特征吸收峰，是由N-H弯曲振动引起的；1242cm-1处是酰胺Ⅲ带的特征吸收峰，就表明胶原中存在螺旋结构，以上的特征吸收峰可证明所提取的胶原中三股螺旋结构保存相对完整。
对牛皮胶原以及鳄鱼皮胶原两种胶原蛋白在190～400nm的近紫外光区进行扫描测试，获得的紫外扫描曲线如图3所示。胶原蛋白是一种较为特殊的蛋白，它的氨基酸组成中几乎不含有色氨酸等存在共轭双键的氨基酸，在280nm波长处无吸收峰，反而是在220～230nm波长处有显著吸收峰，符合胶原蛋白的特征吸收。
图4显示牛皮胶原和鳄鱼皮胶原在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的溶胀性能，可看出鳄鱼皮胶原提前达到溶胀平衡，溶胀性能较牛皮胶原低。
对牛皮胶原和鳄鱼皮胶原进行机械力学分析，分析结果如图5所示，发现鳄鱼皮胶原的杨氏模量高于牛皮胶原，有文献报道随着力学强度增加，材料对软骨诱导性能会增加，因此鳄鱼皮胶原在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨上更具优势。
实施例5鳄鱼皮胶原水凝胶的制备
(1)称取实施例1中所得鳄鱼皮胶原冻干样品1.5g，备用；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎，并采用紫外线照射进行杀菌处理；
(3)将浓度为0.6mol/L的醋酸溶液100mL加入步骤(2)中所得无菌鳄鱼皮胶原冻干样品中进行溶解，得浓度为15mg/mL的鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液置于2℃以下的环境溶解，溶解过程中置于冰上并不断搅拌，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后仍置于冰上，并采用浓度为1.5mol/L的NaOH溶液调节pH值，NaOH溶液用量大约为50mL时，其pH值为7.2。将所得溶液置于35℃恒温条件下静置18min，得到半固态的水凝胶。
以牛皮胶原为对照，对本实施例所得的鳄鱼皮胶原水凝胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、红外光谱检测、紫外光谱检测确定其关键化学键和鉴定胶原类型；检测溶胀率、降解率、机械力学等分析所得鳄鱼皮胶原水凝胶的材料学特性。检测结果与实施例4相同，检测图谱与图1～图5基本相同。
实施例6鳄鱼皮胶原水凝胶的制备
(1)称取实施例1中所得鳄鱼皮胶原冻干样品1g，备用；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎，并采用紫外线照射进行杀菌处理；
(3)将浓度为0.45mol/L的醋酸溶液100mL加入步骤(2)中所得无菌鳄鱼皮胶原冻干样品中进行溶解，得浓度为10mg/mL的鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液置于4℃以下的环境溶解，溶解过程中置于冰上并不断搅拌，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后仍置于冰上，并采用浓度为0.6mol/L的NaOH溶液调节pH值，NaOH溶液用量大约为65mL时，其pH值为7.0。将所得溶液置于40℃恒温条件下静置18min，得到液态的水凝胶。
以牛皮胶原为对照，对本实施例所得的鳄鱼皮胶原水凝胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、红外光谱检测、紫外光谱检测确定其关键化学键和鉴定胶原类型；检测溶胀率、降解率、机械力学等分析所得鳄鱼皮胶原水凝胶的材料学特性。检测结果与实施例4相同，检测图谱与图1～图5基本相同。
实施例7鳄鱼皮胶原水凝胶的制备
(1)称取实施例1中所得鳄鱼皮胶原冻干样品1.2g，备用；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎，并采用紫外线照射进行杀菌处理；
(3)将浓度为0.55mol/L的醋酸溶液100mL加入步骤(2)中所得无菌鳄鱼皮胶原冻干样品中进行溶解，得浓度为12mg/mL的鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-醋酸溶液置于4℃以下的环境溶解，溶解过程中置于冰上并不断搅拌，待无菌牛皮胶原冻干品充分溶胀后仍置于冰上，并采用浓度为1.2mol/L的NaOH溶液调节pH值，NaOH溶液用量大约为50mL时，其pH值为7.0。将所得溶液置于37℃恒温条件下静置16min，得到半固态的水凝胶。
以牛皮胶原为对照，对本实施例所得的鳄鱼皮胶原水凝胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、红外光谱检测、紫外光谱检测确定其关键化学键和鉴定胶原类型；检测溶胀率、降解率、机械力学等分析所得鳄鱼皮胶原水凝胶的材料学特性。检测结果与实施例4相同，检测图谱与图1～图5基本相同。
实施例8鳄鱼皮胶原水凝胶在有道干细胞成骨分化中的应用
从SD大鼠的骨髓腔中提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)，进行培养得到第三代骨髓间充质干细胞，并将BMSCs包裹于实施例4中调制好的鳄鱼皮胶原水凝胶中，置于37℃恒温环境下15分钟，形成负载细胞的凝胶。
将所得负载细胞的凝胶随机分为鳄鱼皮胶原组(CRO组)，另设牛皮胶原组(COW组)，分别培养14天后，通过激光共聚焦来检测细胞的增殖、存活和细胞骨架情况，。
图6为活死细胞染色试验结果图，表明BMSCs增殖稳定并且能保持良好活性；图7为鬼笔环肽/Hoechst33258染色试验结果图，经鬼笔环肽/Hoechst33258染色，培养14天后细胞的肌动蛋白由长丝状(BMSCs表型)转变为圆环状(软骨细胞表型)，促进软骨再生修复。说明鳄鱼皮胶原水凝胶具有极大促进BMSCs成软骨分化的作用，是治疗临床关节软骨缺损的一种非常有潜质的生物材料。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取鳄鱼皮胶原，并制备胶原冻干样品；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎；
(3)将经步骤(2)处理后所得到的胶原材料采用醋酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液置于4℃以下的环境进行溶解，溶解后将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原冻干样品的制备方法包括以下步骤：
①取鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪碎，并装入锥形瓶中；
②将脱脂液按5～8:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢后使用NaCl溶液清洗；
④将步骤③所得中的鳄鱼皮用醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用HCl溶液溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，进行酶消化4～7天；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行离心去除沉淀物，收集上层溶液并用NaOH溶液调至pH＝8～8.5，酶失活后，再用HCl溶液将pH值调至2～2.5；
⑦称取适量NaCl加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，将步骤⑦中所得混合物进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧中所得的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
⑩0再次称取适量NaCl加入到步骤⑨中所得的粗提胶原溶液中进行盐析处理；
3.根据权利要求2所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤③中所述EDTA-NaOH溶液的浓度为10％，所述NaCl溶液的浓度为10％；
步骤④所述醋酸溶液的pH＝2；
步骤⑤和步骤⑨中所述HCl溶液pH＝2；
步骤⑥中所述NaOH溶液的浓度为2mol/L，所述HCl溶液的浓度为2mol/L；
步骤
中所述透析袋的分子量为8000～14000。
4.根据权利要求1所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中还包括采用紫外线照射进行杀菌的操作；步骤(3)中所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液的浓度为10～15mg/mL。
5.根据权利要求4所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中采用浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；
步骤(4)中采用0.5～1.5mol/L的NaOH溶液调节pH值。
6.根据权利要求5所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，
步骤(3)中采用浓度为0.45～0.55mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；
步骤(4)中采用0.6～1.2mol/L的NaOH溶液调节pH值。
7.根据权利要求6所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中还包括将所得的pH＝6.8～7.2的溶液置于35～40℃恒温条件下静置的操作。
8.一种如权利要求1～7中任一项所述方法制备的鳄鱼皮胶原水凝胶在诱导干细胞成软骨分化中的应用。
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