CN102108098A

CN102108098A - 一种鳄鱼胶原蛋白及其制备方法和用途

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Publication number: CN102108098A
Application number: CN2010102508617A
Authority: CN
Inventors: 张博
Original assignee: BEIJING HONGYUAN AODA BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: BEIJING HONGYUAN AODA BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2010-08-11
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2011-06-29
Anticipated expiration: 2030-08-11
Also published as: CN102108098B

Abstract

本发明公开了一种鳄鱼胶原蛋白的制备方法，不仅可提高鳄鱼生产加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的经济效益与社会效益。药效学实验表明，本发明鳄鱼胶原蛋白在抗衰老、组织修复、伤口促愈和增强免疫方面具有显著效果。

Description

一种鳄鱼胶原蛋白及其制备方法和用途

发明领域

本发明涉及一种鳄鱼胶原蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质，分子含糖及大量甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，主要存在于动物肌腱、韧带、软骨、皮肤及其他结缔组织中，占人体或者其它动物体内总蛋白含量的25～33％。它具有支撑器官和保护肌体的功能，从动物中提取不同组织中不同类型的胶原蛋白，其功能和作用也不同。随着生物化学的发展，人们对胶原蛋白的认识逐渐提高，现在已经肯定胶原蛋白和免疫球蛋白一样，富有多样性和组织分布的特异性，是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白闭。鳄鱼皮、鳞甲、骨骼、掌及尾部含有大量的胶原蛋白，但现在对其开发尚不完全。

发明内容

本发明目的在于公开一种鳄鱼胶原蛋白，本发明的目的还在于公开该胶原蛋白的制备方法，本发明的目的还在于公开该胶原蛋白在抗衰老、组织修复和伤口促愈方面的用途。

本发明目的是通过如下方案实现的。

本发明鳄鱼胶原蛋白是由如下方法制备而成：

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至5-15％的Na₂CO₃中，浸泡2-6小时后，水洗至中性；再浸没至2-6％的HCl中，浸泡2-6小时后，水洗至中性；经过上述酸碱脱脂处理后，加入固液比1∶2-4的2-6％乙酸-醋酸溶液，密闭，于40-60℃恒温水浴中，20-40min后，加入酶底比为1-3％的胃蛋白酶，充分搅拌，35-40℃水浴，酶解4-8小时后，粗滤，3000-5000r/min离心20-40min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶2-4的2-6％乙酸-醋酸溶液，密闭，于40-60℃恒温水浴中，20-40min后，加入酶底比为1-3％的胃蛋白酶，充分搅拌，35-40℃水浴，酶解4-8小时后，粗滤，3000-5000r/min离心20-40min，取上清液；合并上清液，加入2-3moL/LNaCl进行沉淀后，于5-15℃，8000-12000r/min离心10-20min，弃上清液，取沉淀以0.3-0.8mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得本发明鳄鱼胶原蛋白粉。

本发明鳄鱼胶原蛋白优选由如下方法制备而成：

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；经过上述酸碱脱脂处理后，加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，37℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，37℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液；合并上清液，加入2.6moL/LNaCl进行沉淀后，于10℃，10000r/min离心15min，弃上清液，取沉淀以0.5mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得本发明鳄鱼胶原蛋白粉。

附图说明

图1：胃蛋白酶酶解温度单因素考察；

图2：胃蛋白酶酶解固液比单因素考察；

鳄鱼皮、鳞甲、骨骼、掌及尾部含有大量的胶原蛋白，通过物理、化学、生物技术等适当的方法处理后，能获得优质胶原蛋白，本发明公开了一种鳄鱼胶原蛋白的制备方法，不仅可提高鳄鱼生产加工的附加值，同时可减少环境污染，获得良好的经济效益与社会效益。药效学实验表明，本发明鳄鱼胶原蛋白在抗衰老、组织修复、伤口促愈和增强免疫方面具有显著效果。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1本发明鳄鱼胶原蛋白提取方法中酶解工艺的单因素考察实验

一、热水提与乙酸+酶水解对胶原蛋白组成的影响

1、仪器与试剂

日立L-8800型氨基酸自动分析仪，乙酸，胃蛋白酶(Sigma)，茚三酮(国药集团化学试剂有限公司)

2、氨基酸含量测定

采用离子交换色谱法(GB/T 5009.124-2003)，氨基酸自动分析仪工作条件：分离柱为4.6mm×600mm，进样量为每次20μl，离子交换柱缓冲液泵流速0.40ml/min，茚三酮泵流速为0.3ml/min。

3、操作过程：

A、本发明实施例1所述工艺制备得到的本发明鳄鱼胶原蛋白。

B、热水提工艺：取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；取经过上述酸碱处理过的样品，热水提24小时，粗滤，离心，取上清液，盐析，冻干，得到热水提胶原蛋白。

利用氨基酸自动分析仪，A和B两种胶原蛋白进行比较。

其中，色氨酸以4.2molNaOH水解，过甲酸氧化法处理测定胱氨酸，其余氨基酸以6molHCL水解测定；上机浓度为：10.45μg/50μL。结果见表1

表1 氨基酸含量检测表

结果显示：本发明工艺得到的胶原蛋白中氨基酸的含量明显高于热水提组，酸酶组合能获得更多的氨基酸。两种方法所得提取液均具有较好的色泽和胶凝性。但热水提组与本发明工艺相比，本发明工艺组具有反应条件温和、所得滤渣残留量低、蛋白质提取率和原料利用率高、能耗低等特点，因此更适于鳄鱼胶原蛋白的提取。

二、酶解温度的选择：

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；取经过上述酸碱处理过的混合物20g，于100mL具塞圆底烧瓶中，加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，37℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，分别于30℃、37℃、45℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液；合并上清液，加入2.6moL/LNaCl进行沉淀后，于10℃，10000r/min离心15min，弃上清液，取沉淀以0.5mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，得到供试样品。以羟脯氨酸含量为指标，筛选适宜酶解温度，各样品平行测试一份。

用茚三酮染色法测定羟脯氨酸的含量，具体方法如下：精密量取各供试品溶液0.5ml，各加2％茚三酮溶液和pH6.8缓冲液1ml，摇匀；量取蒸馏水0.5ml，加茚三酮溶液和磷酸盐缓冲液各1ml，摇匀，作为试剂空白液。100℃水浴加热15min，取出冷却，用蒸馏水定容至100ml。15min后，在569nm处测定吸光度值。结果见表2和附图1。

表2胃蛋白酶酶解温度单因素考察

实验结果表明：37℃时，鳄鱼肉酶解液羟脯氨酸含量较高。故确定胃蛋白酶酶解温度为37℃。

三、酶底比的选择：

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；取经过上述酸碱处理过的混合物20g，于50mL具塞圆底烧瓶中，加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于恒温水浴50℃，30min后，分别加入酶底比为1％、2％、3％、4％的胃蛋白酶，37℃水浴，酶解6小时，将酶解液置85℃恒温水浴灭活15分钟，冷却至室温后，以4200r/min离心15分钟，取上清液，盐析，得各供试品溶液。

以羟脯氨酸含量为指标。见表3

表3 胃蛋白酶酶解酶底比考察

结果显示，酶底比为2％时所得到的羟脯氨酸含量高，考虑到生产成本最终确定酶底比为2％很合理。

四、固液比的选择

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；取经过上述酸碱处理过的混合物20g，于100ml具塞圆底烧瓶中，分别加入不同体积的4％乙酸-醋酸溶液，使其固液比为1∶1、1∶3、1∶5，pH为1.6，密闭，于50℃恒温水浴作用30min，加入2％(酶底比)胃蛋白酶，37℃水浴，酶解6h后将酶解液置85℃恒温水浴灭活15min，冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，盐析，得供试样品。以羟脯氨酸含量为指标，筛选适宜固液比，各样品平行测试一份。结果见表4，附图2

表4 胃蛋白酶酶解固液比单因素考察

实验结果表明：固液比为1∶3时，羟脯氨酸含量较高。故确定胃蛋白酶酶解的乙酸固液比为1∶3。

五、酶解液的选择

(1)取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；取经过上述酸碱处理过的混合物20g，平均分为五份放于100ml具塞圆底烧瓶中，分别加入4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴作用30min，在各烧瓶中分别加入酶底比为2％的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜酶、中性蛋白酶、木瓜酶加中性蛋白酶，具体酶解条件按表5操作。6h后，将酶解液置85℃恒温水浴，灭活15min，冷却至室温后，以4200r/min离心15min，取上清液，透析后得到各供试品溶液。以羟脯氨酸含量为指标，用羟脯氨酸--茚三酮染色法测定羟脯氨酸的含量。结果见表6

表5 酶种类条件

表6 羟脯氨酸-茚三酮染色法考察酶种类结果表

结果显示：单一酶解液中羟脯氨酸的含量胃蛋白酶组＞胰蛋白酶组＞中性蛋白酶组＞木瓜酶+中性酶＞木瓜酶组，由此可以发现胃蛋白酶酶解羟脯氨酸得率最高。本法采用胃蛋白酶酶解。

六、酶解工艺优化

为了优化酶解工艺，对酶解温度(℃)、酶底比、固液比和酶解时间(h)为考察因素，按正交设计L₉(3⁴)表安排实验，筛选酶解工艺参数，以羟脯氨酸含量为指标，见表7～9：

表7 L₉(3⁴)因素水平表

表8 正交试验与结果

将上述结果进行方差分析，见表9：

表9 正交试验方差分析表

注：F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00

方差分析结果表明：酶解温度对结果有显著性影响(P＜0.01)，酶底比、固液比和酶解时间对。考虑到生产成本，最终确定鳄鱼胶原蛋白酶解的最佳参数为：酶解温度37℃，酶底比为2％，固液比为1∶3，酶解6小时，即A₂B₂C₂D₃。

实验例2本发明鳄鱼胶原蛋白促3T3细胞体外增殖作用

通过对小鼠成纤维细胞的增殖促进试验可以测定样品是否具有表皮生长因子样作用，是表皮组织修复药物的体外常用筛选方法。

1、材料及试剂

3T3系美国NIH研究所原株引进，选择DMEM培养基添加10％小牛血清培养，北京中医药大学生物系提供；噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)均为Amresco公司产品；鳄鱼胶原蛋白液，由本发明实施例1制备得到。

2、实验方法

将3T3细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基接种于96孔培养板，每孔加入200μl，37℃，5％CO₂孵箱中预培养。24小时后将含10％胎牛血清的DMEM培养基弃掉，分组加入经含2％胎牛血清的DMEM培养基稀释的含不同浓度的鳄鱼胶原蛋白液(起始浓度为20mg/ml)。每个浓度做四个平行孔。以培养基做为阴性对照。继续培养48小时作用后，每孔加入MTT(5mg/ml)20ul，37℃孵箱中培养4小时，弃掉培养液，每孔加入200ul二甲基亚枫。振荡混匀，酶标仪560nm波长检测。

3、实验结果

结果显示，本发明鳄鱼胶原蛋白能够促进3T3细胞的体外增殖作用，具有表皮组织修复功能。结果见表10

表10 鳄鱼胶原蛋白促进3T3细胞的生长作用

实验例3本发明鳄鱼胶原蛋白对机体免疫功能的调节作用

通过小鼠脾淋巴细胞转化试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响试验，探讨本品对机体免疫功能的调节作用

1、材料及试剂

动物ICR小鼠，雌性，体重20±2g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0011。试剂：新鲜羊血(SRBC)，北京生物制品研究所动物室提供；RPMI.Medlum1640培养液，GIBCO公司提供，批号1071044；阿氏液及补体均由本实验室配制；Con A SIGMA公司生产，配成100μg/ml过滤除菌备用；LPS SIGMA公司，批号122H4025，配成150μg/ml，过滤除菌备用；MTT SIGMA公司，配成5mg/ml备用；盐酸左旋咪唑(LMS)湖南洞庭制药厂生产；二甲基亚砜(DMSO)北京亚太精细化工公司，批号950612；鳄鱼胶原蛋白，由本发明实施例1制备得到。

仪器：UV-754分光光度计，上海第三仪器厂；台式高速冷冻离心机，索福ST21；玻片小室76×26，日本生产；电热恒温培养箱HHB11420湖北黄石医疗器械厂；尼康光学显微镜。

2、实验方法

(1)本发明鳄鱼胶原蛋白对小鼠脾淋巴细胞转化的影响

采用MTT比色法，用ICR小鼠，雌性，按体重均匀分为4组，每组10只：鳄鱼胶原蛋白500，250mg/kg口服；空白对照组口服蒸馏水，强的松5mg/kg肌肉注射为阳性对照。除强的松组于实验第7-9天给予外，其余各组均连续给药9天。第10天开始淋转试验：放血处死小鼠，取脾、研碎，过200目钢丝网，制成脾细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液调成2×106/ml脾细胞悬液，每份细胞悬液分3孔加入24孔培养板中，2ml/孔，1孔加Con A液100μl(相当于5μg/ml)，1孔加LPS液100μl(相当于7.5μg/ml)，1孔为对照，摇匀，置含5％CO2的培养箱培养72小时，在结束培养前4小时，取出培养板，离心2000rpm，10分钟，每孔弃去培养液1.6ml，加入不含小牛血清的1640培养液1.6ml，同时加入MTT液100μl/孔(相当于250μg/ml)，继续培养。结束培养后，离心2000rpm，10分钟，弃上清，每孔加入2ml DMSO，混匀，待紫色结晶完全溶解后，在721分光光度计比色，结果以波长570nm处的光密度值表示，用加Con A及LPS孔的光密度值分别减去不加刺激剂孔的光密度值代表T和B淋巴细胞的增殖能力。

(2)本发明鳄鱼胶原蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

用ICR小鼠，雌性，按体重均匀分为4组，每组10只：鳄鱼胶原蛋白500，250mg/kg口服；空白对照组口服蒸馏水，强的松5mg/kg肌肉注射为阳性对照。均每日灌服1次，连续9天。除空白组外，其余各组均在试验第8，9天肌注强的松5mg/kg造模。第7天全部小鼠腹腔注射0.2％肝糖元2ml/只，作为巨噬细胞诱导剂。第10天处死小鼠，冲洗并取出腹腔液，加入一定量鸡RBC悬液，用体外爬片法测定巨噬细胞吞噬鸡RBC的吞噬百分率和吞噬指数。

3、实验结果

见表11和12，本发明鳄鱼胶原蛋白可通过提高机体的细胞免疫功能和巨噬细胞吞噬功能来提高机休的免疫水平。

表11鳄鱼胶原蛋白对小鼠淋巴细胞增殖的影响(X±SD)

与空白对照比，*p＜0.05

表12鳄鱼胶原蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(X±SD)

与强的松组比*p＜0.05与空白对照比**p＜0.01

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

具体实施方

实施例1：本发明鳄鱼胶原蛋白

实施例2：本发明鳄鱼胶原蛋白

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至12％的Na₂CO₃中，浸泡3小时后，水洗至中性；再浸没至5％的HCl中，浸泡3小时后，水洗至中性；经过上述酸碱脱脂处理后，加入固液比1∶4的3％乙酸-醋酸溶液，密闭，于55℃恒温水浴中，25min后，加入酶底比为3％的胃蛋白酶，充分搅拌，36℃水浴，酶解7小时后，粗滤，3200r/min离心35min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶2的5％乙酸-醋酸溶液，密闭，于45℃恒温水浴中，35min后，加入酶底比为1％的胃蛋白酶，充分搅拌，40℃水浴，酶解5小时后，粗滤，4800r/min离心25min，取上清液；合并上清液，加入3moL/LNaCl进行沉淀后，于8℃，11000r/min离心10min，弃上清液，取沉淀以0.7mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得本发明鳄鱼胶原蛋白粉。实施例3：本发明鳄鱼胶原蛋白

取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至6％的Na₂CO₃中，浸泡5小时后，水洗至中性；再浸没至3％的HCl中，浸泡5小时后，水洗至中性；经过上述酸碱脱脂处理后，加入固液比1∶2的5％乙酸-醋酸溶液，密闭，于45℃恒温水浴中，35min后，加入酶底比为1％的胃蛋白酶，充分搅拌，39℃水浴，酶解5小时后，粗滤，4800r/min离心25min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶4的3％乙酸-醋酸溶液，密闭，于55℃恒温水浴中，25min后，加入酶底比为3％的胃蛋白酶，充分搅拌，35℃水浴，酶解7小时后，粗滤，3200r/min离心35min，取上清液；合并上清液，加入2moL/LNaCl进行沉淀后，于12℃，9000r/min离心20min，弃上清液，取沉淀以0.4mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得本发明鳄鱼胶原蛋白粉。

Claims

1.一种鳄鱼胶原蛋白，其特征在于该胶原蛋白由如下方法制备而成：

2.如权利要求1所述的鳄鱼胶原蛋白，其特征在于该胶原蛋白由如下方法制备而成：

3.如权利要求1-2任一所述的鳄鱼胶原蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的鳄鱼胶原蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：取鲜鳄鱼皮，刮去脂肪，清洗，切成小块，取鳄鱼鳞清洗除去杂物，刮去脂肪，切成丝，取鳄鱼骨除去肌肉，打碎；将上述物质浸没至10％的Na₂CO₃中，浸泡4小时后，水洗至中性；再浸没至4％的HCl中，浸泡4小时后，水洗至中性；经过上述酸碱脱脂处理后，加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，37℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液，备用；沉淀再加入固液比1∶3的4％乙酸-醋酸溶液，密闭，于50℃恒温水浴中，30min后，加入酶底比为2％的胃蛋白酶，充分搅拌，37℃水浴，酶解6小时后，粗滤，4000r/min离心30min，取上清液；合并上清液，加入2.6moL/LNaCl进行沉淀后，于10℃，10000r/min离心15min，弃上清液，取沉淀以0.5mol/L醋酸溶解后，转入透析袋透析，至无氯离子检出；倒出透析袋中的胶原蛋白溶液，冷冻干燥，得本发明鳄鱼胶原蛋白粉。

5.如权利要求1-2任一所述的鳄鱼胶原蛋白在制备具有抗衰老、组织修复和伤口促愈作用的药物中的应用。

6.如权利要求1-2任一所述的鳄鱼胶原蛋白在制备具有调节机体免疫作用的药物中的应用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于其中所述的抗衰老、组织修复和伤口促愈是指促3T3细胞体外增殖。