CN103725665A - 一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法 - Google Patents

一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明阐述一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法。该制备方法包括以下工艺步骤：(1)原料绞碎，抽提蛋白；(2)分级盐析，糜元粗品；(3)粗品投料，多重结晶；(4)活化；(5)盐析；(6)透析；(7)冻干。本发明采用羊胰脏为原材料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道；并且已建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。

Description

一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，设计药用糜蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶。 
背景技术
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺等哺乳动物胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。 
目前中国市场上生产糜蛋白酶的厂家有十几家，但多采用传统工艺法生产，制备的糜蛋白酶效价低，而且不稳定。中国专利CN1944641A公开了一种糜蛋白酶的制备方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶，但是正如中国专利CN1013025B分析，也存在一些缺点，最主要的，亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足，也能获得高比活的糜蛋白酶，但同样，比较起传统工艺来，生产成本太高。在原料的选择上，中国的厂家亦局限于采用牛胰脏或猪胰脏制备糜蛋白酶。可是随着糜蛋白酶的应用广泛，使得国际市场对本产品的需求不断扩大，质量要求上更加严格，要求产品有更高的质量：《中国药典》(2010版)规定，糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对市场需求的扩大和效价提高的要求，本发明采用羊胰脏为原料，对传统工艺进行了改进和创新。 
发明内容
本发明的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，该方法包括如下步骤： 
1、糜蛋白酶粗制生产操作： 
(1)新鲜的羊胰脏，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重。 
(2)绞碎物置塑料桶中，按1～3ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸渍20～30小时，在浸渍期中每小时搅拌1次。 
(3)将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再按1～2ml/g的比例加入0.125mol/L硫酸溶液浸渍1～3小时，滤干后弃去滤渣。 
(4)将两次浸渍液合并置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固体硫酸铵242g，使达40％饱和度，静置12～16小时。 
(5)过滤，留取过滤液，固体弃去。 
(6)在每1000ml清液中加入固体硫酸铵205g，使达70％饱和度，放置12～16小时。 
(7)过滤，留取固体，弃滤液。 
(8)将沉淀物按2～4ml/g的比例加水溶解，再按(4)(5)(6)(7)操作法分次加固体硫酸铵近40％和70％饱和度沉淀。 
(9)取70％饱和度沉淀物，按1～3ml/g的比例加水溶解，再按0.2～ 1.5ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0。 
(10)将溶液静置20～28℃恒温箱中40～50小时，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品。 
2、糜蛋白酶精制生产操作： 
(1)结晶工序 
投料：取糜蛋白酶粗品，置不锈钢桶内，按5～9ml/g的比例加水溶解，调pH值至2.5～3.5，搅拌8～10小时后，静置12～16小时。 
结晶I 
静置结束后搅拌，并调pH值至2.0～3.0。按1～3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，搅拌10～30分钟，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温40～48小时，过滤，收集滤饼，滤液弃去。 
结晶II 
按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 
结晶III 
按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置 20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 
结晶IV 
按2～4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0～3.0，再按0.5～2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置20～28℃条件下，保温20～24小时，过滤，收集滤饼。 
(2)活化工序 
称量滤饼重量，按2～4ml/g的比例加入水溶解，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，调pH值至7.5～8.5。 
再按0.5～1.5ml/g滤饼的比例加入磷酸盐缓冲液，搅拌片刻，调节pH值至7.5～8.5。加入活化剂胰蛋白酶，比例为3～6mg/100ml料液，活化60～80小时。 
(3)盐析工序 
活化结束后调pH值至3.5～4.5，量取活化液体积，按400～600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析，放置12～16小时。 
过滤，弃滤液，收集滤饼。 
(4)透析工序 
滤饼按1～1.5ml/g的比例加入水，搅拌溶解，用透析纸扎包成袋，将透析袋吊放于透析池中，进行4～6天透析。 
(5)冻干工序 
收集、合并透析液，过滤，量取体积，调pH值至6.0～7.0，装盘、冻干。 
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是： 
本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的糜蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。 
本发明采用羊胰脏为原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道，扩大了市场销售。 
本发明已建立起一套规模化的生产工艺，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。 
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 
实施例1 
1、糜蛋白酶粗制生产操作： 
(1)称取新鲜冷冻的羊胰脏4kg，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重。 
(2)绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液4L浸渍22小时，在浸渍期中每小时搅拌1次。 
(3)将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液4L 浸渍1小时，滤干后弃去滤渣。 
(4)将两次浸渍液合并，量取体积7.5L，置塑料桶中，加入固体硫酸铵1.82kg，使达40％饱和度，静置12小时。 
(5)过滤，留取过滤液，量取体积7.4L，固体弃去。 
(6)在过滤液中加入固体硫酸铵1.52kg，使达70％饱和度，放置12小时。 
(7)过滤，留取固体，称重118g，弃滤液。 
(8)将沉淀物用236ml纯化水溶解，再按(4)(5)(6)(7)操作法分次加固体硫酸铵近40％和70％饱和度沉淀。 
(9)取70％饱和度沉淀物66g，用66ml纯化水溶解，加入饱和硫酸铵溶液13.2ml，并用5mol/L氢氧化钠溶液调pH4.1。 
(10)将溶液静置20℃恒温箱中42小时，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品，称重20.8g。 
2、糜蛋白酶精制生产操作： 
(1)结晶工序 
投料：取糜蛋白酶粗品20.8g，置不锈钢桶内，加104ml纯化水溶解，并加适量2.5mol/L H2SO4溶液调节pH2.6，搅拌8小时后，静置12小时。 
结晶I 
静置结束后搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH2.0。加入饱和硫酸铵溶液21ml，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调pH4.1，置20℃条件下，保温40小时，过滤，收集滤饼，称重38.1g，滤液弃去。 
结晶II 
滤饼加76.2ml纯化水溶解，用2.5mol/l硫酸调pH2.0，加饱和硫酸铵溶液19.0ml，用5mol/L NaOH调pH4.1，置20℃条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重33.2g。 
结晶III 
滤饼加66.4ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH2.0，加饱和硫酸铵溶液16.6ml，用5mol/L NaOH调pH4.1，置20℃条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重30.9g。 
结晶IV 
滤饼加61.8ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH2.0，加饱和硫酸铵溶液15.4ml，用5mol/L NaOH调pH4.1，置20℃条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重30.5g。 
(2)活化工序 
加61.0ml纯化水溶解滤饼，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，加5mol/L NaOH溶液调pH7.5。 
加入磷酸盐缓冲液15.2ml，搅拌片刻，调pH7.5。加入活化剂胰 蛋白酶2.4mg，活化60小时。 
(3)盐析工序 
用2.5mol/L硫酸调pH3.1，量取活化液体积70.6ml，加入固体硫酸铵28g进行盐析，放置12小时，过滤，弃滤液，收集滤饼，称重33g。 
(4)透析 
滤饼加入纯化水33ml，搅拌溶解，用透析纸扎包成袋，将透析袋吊放于透析池中，进行4天透析。 
(5)冻干工序 
收集、合并透析液，过滤，量取体积31ml，调节pH6.0，装盘1盘、冻干，称重7.8g。 
(6)根据《中国药典》(2010版)规定的糜蛋白酶效价检测法对本品进行检验，本品的效价为1428单位/毫克。 
实施例2 
1、糜蛋白酶粗制生产操作： 
(1)称取新鲜冷冻的羊胰脏4kg，立即用镊子和剪刀将脂肪结缔组织等除去，置绞碎机中绞碎，称重。 
(2)绞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液12L浸渍28小时，在浸渍期中每小时搅拌1次。 
(3)将浸渍物置滤袋过滤，滤渣再用0.125mol/L硫酸溶液8L浸渍3.0小时，滤干后弃去滤渣。 
(4)将两次浸渍液合并，量取体积15.6L，置塑料桶中，加入固体硫酸铵3.78kg，使达40％饱和度，静置16小时。 
(5)过滤，留取过滤液，量取体积14.7L，固体弃去。 
(6)在过滤液中加入固体硫酸铵3.0kg，使达70％饱和度，放置16小时。 
(7)过滤，留取固体，称重126g，弃滤液。 
(8)将沉淀物用504ml纯化水溶解，再按(4)(5)(6)(7)操作法分次加固体硫酸铵近40％和70％饱和度沉淀。 
(9)取70％饱和度沉淀物73g，用219ml纯化水溶解，加入饱和硫酸铵溶液103.5ml，并用5mol/L氢氧化钠溶液调pH5.0。 
(10)将溶液静置28℃恒温箱中48小时，即有针状结晶(糜蛋白酶粗品)析出。抽滤，即得糜蛋白酶粗品，称重20.9g。 
2、糜蛋白酶精制生产操作： 
(1)结晶工序 
投料：取糜蛋白酶粗品20.9g，置不锈钢桶内，加188ml纯化水溶解，并加适量2.5mol/L H2SO4溶液调节pH3.4，搅拌10小时后，静置16小时。 
结晶I 
静置结束后搅拌，并加2.5mol/L H2SO4溶液调pH2.8。加入饱和硫酸铵溶液62.7ml，搅拌30分钟，用5mol/L NaOH调pH5.0，置28℃条件下，保温48小时，过滤，收集滤饼，称重38.3g，滤液弃去。 
结晶II 
滤饼加153ml纯化水溶解，用2.5mol/l硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液76.6ml，用5mol/L NaOH调pH5.0，置28℃条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重33.9g。 
结晶III 
滤饼加135.6ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液67.8ml，用5mol/L NaOH调pH5.0，置28℃条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重31.3g。 
结晶IV 
滤饼加125.2ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液62.6ml，用5mol/L NaOH调pH5.0，置26℃条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重30.9g。 
(2)活化工序 
加123.6ml纯化水溶解滤饼，并滴加少量2.5mol/L H2SO4溶液助溶，待完全溶解后，加5mol/L NaOH溶液调pH8.4。 
加入磷酸盐缓冲液46.3ml，搅拌片刻，调pH8.4。加入活化剂胰蛋白酶9.8mg，活化80小时。 
(3)盐析工序 
用2.5mol/L硫酸调pH4.5，量取活化液体积164ml，加入固体硫酸铵98.4g进行盐析，放置16小时，过滤，弃滤液，收集滤饼，称重36g。 
(4)透析 
滤饼加入纯化水54ml，搅拌溶解，用透析纸扎包成袋，将透析袋吊放于透析池中，进行6天透析。 
(5)冻干工序 
收集、合并透析液，过滤，量取体积51ml，调节pH6.9，装盘1盘、冻干，称重8.1g。 
(6)根据《中国药典》(2010版)规定的糜蛋白酶效价检测法对本品进行检验，本品的效价为1361单位/毫克。 
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。 

Claims (10)

1.一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原料绞碎，抽提蛋白；(2)分级盐析，得糜元粗品；(3)粗品投料，多重结晶；(4)活化；(5)盐析；(6)透析；(7)冻干。
2.权利要求1所述制备方法，其特征在于，各步骤具体为：
(1)将羊胰脏绞碎，用硫酸溶液浸渍2次；取滤液，加固体硫酸铵，使达40％饱和度，过滤，取滤液；加固体硫酸铵，使达70％饱和度；过滤，取沉淀物；加水溶解，调pH值至4.0～5.0，抽滤，得糜蛋白酶粗品；
(2)结晶工序
用水溶解糜蛋白酶粗品，调pH值至2.5～3.5，静置8～12小时；结晶：将糜蛋白酶粗品溶解液再调pH值至2.0～3.0；加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0～5.0，置25±3℃条件下，保温20～48小时，过滤，收集滤饼；滤饼加水溶解，重复上述结晶操作3次，得滤饼；
(3)活化工序
用水溶解上步中所得滤饼，调pH值至7.5～8.5；加磷酸盐缓冲液，调节pH值至7.5～8.5；加入活化剂，活化60～80小时；
(4)盐析工序
活化液调pH值至3.5～4.5，加入固体硫酸铵进行盐析，过滤，收集滤饼；
(5)透析工序
滤饼加水溶解，放透析袋，透析4～6天。
(6)冻干工序
收集、合并透析液，过滤，调节pH值至6.0～7.0，装盘、冻干。
3.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述胰脏为羊胰脏，适应了向穆斯林国家的医药界供应药用原料的渠道。
4.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，饱和硫酸铵溶液与粗品溶液的体积比为1～3。
5.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中加入活化剂的比例为3～6mg/100ml料液，活化60～80小时。
6.根据权利要求5所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述活化剂为胰蛋白酶。
7.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(4)中按400～600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析。
8.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，滤饼加水溶解的比例为1～1.5ml/g。
9.根据权利要求2所述的一种从羊胰脏中提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(6)中冻干前pH调节为6.0～6.5。
10.一种糜蛋白酶，其特征在于，所述糜蛋白酶通过权利要求1-9任意之一的方法制备得到，其效价为1200～1500单位/毫克。
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