CN101113168A - 一种花生蛋白活性多肽及其制备方法 - Google Patents

一种花生蛋白活性多肽及其制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种花生蛋白活性多肽的连续发酵酶解合成工艺及其制备方法。所述的活性多肽占总蛋白质≥90，蛋白活性多肽占总蛋白质≥80％，脂肪≤1％，水份≤6％，灰份≤2％。本发明以花生蛋白为原料，通过连续发酵酶解合成工艺，制备出花生蛋白活性多肽，其与粉状蛋白相比具有良好的溶解性、流动性和稳定性，因此花生蛋白活性多肽可广泛应用到医药、日化、食品等领域。

Description

一种花生蛋白活性多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物活性多肽及其制备方法，尤其是涉及一种花生蛋白活性多肽的连续发酵酶解合成工艺及制备方法。
技术背景：
花生在我国是主要的油料作物之一，而榨油后的花生饼粕大部分用于加工饲料。随着科学技术的不断发展和花生蛋白开发利用技术的成熟，具有良好功能性质和生理活性的花生蛋白深加工产品正在蓬勃兴起，传统制备生物活性肽的方法有天然提取法、化学合成法、酸碱法及基因工程法，但这些方法的弊端是：肽得率低，生产成本高及产生副反应。
发明内容：
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种采用连续发酵酶解合成法制备花生蛋白活性多肽及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种花生蛋白活性多肽，所述的活性多肽占总蛋白质≥90，蛋白活性多肽占总蛋白质≥80％，脂肪≤1％，水份≤6％，灰份≤2％。
所述的花生蛋白活性多肽，按如下步骤制备：
(1)、原料处理：将花生蛋白粉水溶解，以碱调节PH值至碱性，离心取上清；以酸沉淀上清，离心收集沉淀。
(2)、酶解：将沉淀物加水溶解，再加入复合蛋白酶进行酶解，温度控制在30～40℃，反应时间为3～4h，PH值掌握在8～9，复合蛋白酶用量为1～3‰/g蛋白。
(3)、酶灭活分离：将酶处理后的蛋白溶液快速升温80～85℃。保持3～5秒钟使酶灭活，用分离机分离得上清液。
(4)、发酵酶解：将分离后的蛋白物加不含氨的蒸馏水溶解，加入复合蛋白酶进行发酵酶解，温度控制在32～55℃，反应时间为8～12h，使PH值为7～8，复合蛋白酶用量为3～5‰/g蛋白。
(5)、分离脱盐脱苦：采用多功能膜分离机，在分离的过程中将盐和苦味脱掉并将滤渣除去。
(6)、浓缩、干燥：将分子量为500～3000Da的花生蛋白活性多肽溶液再继续通过H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，经浓缩、干燥得到花生蛋白活性多肽。
所述的制备方法，步骤(1)中，将花生饼粕超微粉碎至150～350目。
所述的制备方法，步骤(1)中，花生蛋白粉与水的比例为1∶5～15，以碱液调节上清液PH值至碱性时PH值为8～9，以酸液调节上清液PH值至酸性时PH值为5～6。
所述的制备方法，步骤(3)中，将灭酶后的蛋白上清溶液的PH值调至碱性进行搅拌分离花生蛋白；加酸沉淀蛋白，离心收集溶液。
所述的制备方法，步骤(4)中，将离心分离后的花生蛋白加水稀释调节PH值呈碱性，加入复合蛋白酶B进行酶解。
所述的制备方法，步骤(5、6)中，将花生蛋白活性多肽溶液通过多功能膜分离设备过滤、脱盐，脱盐后的多肽溶液经浓缩、干燥得到花生蛋白活性多肽产品。
本发明的有益效果是：本发明以花生蛋白为原料，通过连续发酵酶解合成工艺，制备出花生蛋白活性多肽，其与粉状蛋白相比具有良好的溶解性和稳定性，例如粉状花生蛋白随浓度的增加粘度迅速提高，而花生蛋白活性多肽在高浓度下仍保持一定的流动性；在溶解性方面，粉状花生蛋白随着温度升高及PH值的降低易形成沉淀，而花生蛋白活性多肽仍保持良好的溶解性。
本发明的发明人通过实验室证明，花生蛋白活性多肽具有多种生物活性。
具体实施方式：
实施例1：花生蛋白活性多肽的制备工艺过程：
花生→低温取油→毛油精炼→成品油
        ↓
      花生豆粕→超微粉碎→半脱脂蛋白粉→酶解→分离→发酵酶解→分离→超滤→脱盐→浓缩→干燥→花生蛋白活性多肽(成品)。具体制备过程是：
1、原料预处理：花生饼粕超级粉碎，加水稀释，过150～350目筛制成粉花生蛋白，用碱调节PH值至微碱性并调节溶液温度至酶反应最适温度，而后加入复合酶A进行反应，再对花生蛋白粉作进一步提纯：
(1)花生蛋白粉→水溶(1∶15为粉水重量比)→碱提(用碱调节使PH＝7.5～9，25℃，25min)，温度控制在30～40℃，反应时间为3。5h，复合酶A的用量为1～3‰/g蛋白→离心(3000g、5min)取上层清液→酸沉(以盐酸调节使PH＝4.5～5)→离心(5000g、10min)收集沉淀。
(2)酶灭活分离：将酶处理后的蛋白溶液快速升温83℃。保持1～2min酶灭活进行灭酶后冷却至室温，3000g离心5min，取上清，分离得上清液，将灭酶后的蛋白上清溶液的PH值调至碱性进行搅拌分离花生蛋白；加酸沉淀蛋白，离心收集溶液。
(3)发酵酶解：将分离后的蛋白物加不含氨的蒸馏水溶解，花生蛋白溶液浓度为4～8％，加入复合蛋白酶B进行发酵酶解，温度控制在45℃，反应时间为10h，使PH值为7～9，复合蛋白酶用量为3～5‰/g蛋白。
(4)超滤：将酶解反应液通过截留分子量为1000～5000Da的超滤膜超滤去除大分子蛋白，超滤液即为花生蛋白活性肽原液，取超滤液即得花生蛋白活性多肽原液。
(5)脱盐、浓缩、干燥：将花生蛋白活性多肽原液通过纳滤膜分离设备进行脱盐处理、经浓缩、干燥即得花生蛋白活性多肽产品。
所得到的花生蛋白活性多肽是一种白色或微黄色精粉面，肽含量为≥80％，脂肪≤1％，水份≤6％，灰份≤2％，三氯乙酸氨溶解脂指数为99.88％，其溶解性实验表明，所有PH值都能溶于水，其热稳定性实验表明，体系温度达100℃也不会产生沉淀。
实施例2：花生蛋白活性多肽的功能实验
(1)搞高血压活性的测定
将100ul样品加入100ul 0.05M硼酸盐缓冲液中，缓冲液PH为8.5，其中包括0.3M Nacl、25mU血管紧张素转化酶(ACE)，37℃预热9min；加入150ul马尿酰组氨酰亮酸(HHL)启动反应，37℃反应0。8h，加入1M盐酸250ul终止反应；之后加入1.5ml乙酸乙酯萃酸马尿酸，漩涡混合后进行离心(2000g，15min)；吸取1ml乙酸乙酯层移入另一试管中，烘干，冷却后重新溶于3ml去离子水中，228nm下测定其吸光值，
ACE抑制活性(％)＝(Aa-Ab)/(Aa-Ac)*100％
其中Aa：不存在抑制剂时的光密度
Ab：存在抑制剂与酶时的光密度
Ac：抑制剂与酶都不存在时的光密度
(2)清除超氧阴离子自由基
在一系列的试管中加入8～10ml 0.05M，PH＝8.5的Tris-Hcl缓冲液，加入样品溶液100ul，空白组加入同体积的蒸馏水，再加入100ul的0.045M邻苯三酚(以0.01MHCL配制)，漩涡分散器震荡4minutes，加入100ul 10％抗坏血酸中止反应，在325nm处测吸光值。
清除自由基的能力(SA)＝(A0-AS)/AO*100％
其中A0为空白样测定值，AS为样品测定值
(3)清除羟自由基
在试管中依次加入0.6ml 9.1mM水杨酸一乙醇溶液，0.5ml的样品，0。6ml9mlM Fe2+溶液，3～4ml蒸馏水，最后加入5ml 88Mm H2O2，显色摇匀后，在510nm下测定清除活性。
清除能力＝(A0-AS)/A0*100％
其中A0(以样品溶剂代替样品)为空白样测定值，AS为样品测定值。
(4)抗氧化
10ml具塞玻璃试管中加入1.5ml 0.15M(PH7.0)的磷酸盐缓冲液，分别加入100ul样品，100ul 50mM亚油酸一乙醇溶液和50ul 50mM的Fecl2-EDTA溶液，采用漩涡分散器震荡4minutes，于50℃暗处水浴保温一段时间。
3ml75％乙醇，100ul上述混合液，100ul 1M的Fecl2的1MHCL溶液，100ul30％KSCN，采用漩涡分散器震荡4minutes后，立即在480nm测定溶液的吸光度。
AA＝(A0-AS)/A0*100％
其中抗氧化空白的吸光度为A0，加抗氧化剂是吸光度为AS。
所得花生蛋白活性多肽的功能活性检测结果如下：
(1)抗高血压活性：0.4mg/ml样品ACE抑制活性为51％；
(2)清除超氧阴离子自由基：25mg/ml样品清除率为35.6％；
(3)清除羟自由基：15mg/ml样品清除率为66.2％；
(4)抗氧化：25mg/ml样品抗氧化活性为42.1％。
因此花生蛋白活性多肽可广泛应用到医药、日化、食品等领域。

Claims (7)

1.一种花生蛋白活性多肽，其特征在于：所述的活性多肽占总蛋白质≥90，蛋白活性多肽占总蛋白质≥80％，脂肪≤1％，水份≤6％，灰份≤2％。
2.根据权利要求1所述的花生蛋白活性多肽，按如下步骤制备：
(1)、原料处理：将花生蛋白粉水溶解，以碱调节PH值至碱性，离心取上清；以酸沉淀上清，离心收集沉淀。
(2)、酶解：将沉淀物加水溶解，再加入复合蛋白酶进行酶解，温度控制在30～40℃，反应时间为3～4h，PH值掌握在8～9，复合蛋白酶用量为1～3‰/g蛋白。
(3)、酶灭活分离：将酶处理后的蛋白溶液快速升温80～85℃。保持3～5秒钟使酶灭活，用分离机分离得上清液。
(4)、发酵酶解：将分离后的蛋白物加不含氨的蒸馏水溶解，加入复合蛋白酶进行发酵酶解，温度控制在32～55℃，反应时间为8～12h，使PH值为7～8，复合蛋白酶用量为3～5‰/g蛋白。
(5)、分离脱盐脱苦：采用多功能膜分离机，在分离的过程中将盐和苦味脱掉并将滤渣除去。
(6)、浓缩、干燥：将分子量为500～3000Da的花生蛋白活性多肽溶液再继续通过H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，经浓缩、干燥得到花生蛋白活性多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将花生饼粕超微粉碎至150～350目。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，花生蛋白粉与水的比例为1∶5～15，以碱液调节上清液PH值至碱性时PH值为8～9，以酸液调节上清液PH值至酸性时PH值为5～6。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将灭酶后的蛋白上清溶液的PH值调至碱性进行搅拌分离花生蛋白；加酸沉淀蛋白，离心收集溶液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，将离心分离后的花生蛋白加水稀释调节PH值呈碱性，加入复合蛋白酶B进行酶解。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5、6)中，将花生蛋白活性多肽溶液通过多功能膜分离设备过滤、脱盐，脱盐后的多肽溶液经浓缩、干燥得到花生蛋白活性多肽产品。
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