CN102174628A - 一种花生生物活性肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花生生物活性肽的制备方法，它是以花生饼为原料，经粉碎、浸提后得到脱脂花生饼粉末，再经碱溶、酸沉后得花生蛋白，将所得的花生蛋白进行酶解、离心和超滤获得小分子物质超滤液和大分子物质浓缩液，将小分子物质超滤液经交换树脂脱盐、浓缩、干燥得到花生肽干粉，将大分子物质浓缩液回收进行二次酶解、超滤、脱盐、浓缩、干燥获得花生肽干粉。本发明的花生肽有较好的增强免疫力的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物蛋白质组合物的制备方法，尤其涉及一种花生生物活性肽的制备方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物，我国生产的花生除少部分作为干果食用之外，大部分是作为油料资源用于榨取食用油脂。榨油后所得占花生总重量56％～61％的花生饼粕中蛋白质含量为55％左右，其氨基酸组成较完全，含有大量人体必需氨基酸，营养价值可与FAO推荐的模式蛋白质相媲美。且资源丰富，价格低廉，是酶解制备生物活性肽的良好植物蛋白资源。花生饼粕多被用作饲料或肥料，尚未充分深加工利用，因而造成花生蛋白资源的极大浪费。如果对花生蛋白进行有限的酶解，可生产出高营养、高附加值且易于吸收的具有生物活性功能的生物制品。
肽是由氨基酸通过肽键连接而成的化合物，它是机体组织细胞的基本组成成分。科学家已在人体中发现了100多种生物活性肽，这些肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要，所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与多肽有关系。
花生肽是指花生蛋白经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程得到的蛋白质水解产物。花生肽具有较好的功能特性，如花生肽溶液在高浓度下黏度依然较低，能在较宽的pH值范围内保持溶解状态；具有较高的吸湿性和保湿性；渗透压比氨基酸低得多；能抑制蛋白质形成凝胶，减少了由于花生蛋白大分子引起的过敏原性，增加了产品的稳定性等。此外，花生肽还具有抗氧化、抗疲劳、降血压、提高机体免疫力等多种生理活性，可广泛用于医药、保健食品、食品添加剂、调味品等多个领域，具有良好的应用前景。
花生饼中除了含有50～55％左右的花生蛋白外，还含有糖分、粗纤维、粗脂肪、水分、矿物质等其它成分。由于含有这些杂质成分，目前制备花生肽的工艺中，很少将花生饼直接作为原料来使用，不仅浪费了生产原料，还增加了生产成本。另外，在纯化花生蛋白及制备花生肽的过程中，均有加酸碱调节pH的工序，因此，不可避免的代入大量盐分，影响了最终产品的品质。第三，现有技术由于水解条件不同，花生肽的分子量也不同，而不同分子量的花生肽具有不同的生理功能，怎样得到特定分子量的产品，并且提高该分子量产品的纯度，从而使产品具有特定的生理功能，也是目前需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生生物活性肽的制备方法。
本发明的花生生物活性肽的制备方法如下：
(A)将花生饼粉碎，过60～80目筛，用95％正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，为脱脂花生饼粉末，待用；
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉按1∶5～1∶10溶解至水中，加热至45～55℃，用碱试剂调节pH至8.0～10.0，搅拌15min，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，取上清液；
(C)将步骤(B)的上清液加热至70～90℃，用柠檬酸试剂调节pH至3.0～5.0，搅拌15min，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，收集沉淀，为花生蛋白；
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀与水的质量比为1∶10～1∶20的比例溶解至水中，加热至90～100℃，保持15～30min，然后冷却至40～50℃，用NaOH试剂调节并保持pH在7.5～9.0，按照花生蛋白质量的2％～10％的质量，添加碱性蛋白酶Alcalase，酶解2～4h；
(E)待步骤(D)酶解结束后，迅速用HCl溶液调节pH至5.0～3.0，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，取上清液，为花生肽粗制液；
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为花生肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解；
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸和10％NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7.0左右，待用
将步骤(F)中所得的超滤液，以5～10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7.0时停止加样，收集为花生肽精制液；
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液，减压浓缩至固型物含量30％～40％；
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述步骤(A)的目的是用正己烷溶解花生饼中的残留脂质，以去除花生饼中的脂质，使最终产品的脂肪含量降低，所谓“浸提”，就是用正己烷溶解花生饼粉中的脂溶性物质，然后过滤或者离心去除液体，留下花生饼固体。
上述步骤(B)碱溶的目的是：利用蛋白质在碱性条件下溶解的特性，将花生蛋白和碱不溶性物质分离开，以提高花生蛋白的含量。
上述步骤(C)酸沉的目的是：利用蛋白质在酸性等电点条件下沉淀的特性，将花生蛋白和酸溶性物质分开，以提高花生蛋白的含量。
上述步骤(B)、(C)的目的是为了去除花生饼中的杂质，提高花生蛋白的含量，为酶解提供原料。一般花生饼中蛋白的含量在50％左右，经过上述方法处理后，花生蛋白含量可达90％以上。
上述步骤(D)中酶解过程需要不断搅拌，同时加入NaOH溶液以保持pH值在7.5～9.0，酶解的目的是：将花生饼中的大分子蛋白质酶解为小分子蛋白质和肽。
上述步骤(E)调酸的目的是为了使酶失活，停止酶解反应；离心的目的是为了固液分离，收集酶解液。
上述步骤(F)中超滤的目的是为了截取需要分子量的产品；二次酶解的目的是为了将分子量1000Da以上的大分子蛋白水解成小分子，提高利用原料利用。
上述步骤(G)中脱盐的目的是为了去除酶解液中因酶解过程中不断调节pH而带入的盐离子。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果：
(1)直接以花生饼为原料，提高了原料利用率；
(2)用浸提法除去花生饼中的残留油脂，使最终产品脂肪含量在1％以下；
(3)利用碱溶酸沉法纯化花生蛋白，提高水解原料的品质，使最终产品的总氮量在90％以上；
(4)采用超滤法对花生肽进行分级处理，保证100％的花生肽分子量在1000Da以下，并对于分子量1000Da以上的花生肽进行二次酶解，使最终产品的分子量分布均在1000Da以下；
(5)利用阴阳交换树脂对花生肽粗品进行脱盐，没有脱盐处理的产品盐分含量在8％左右，采用本方法中的脱盐工艺处理的产品盐分含量在2％以下；
(6)由本发明制备并精制的花生肽具有良好的提高动物免疫力的功能。
本发明的方法制备的花生肽有较好的增强动物免疫力的效果，实验证明如下：
实验动物小鼠预饲3d后，按体重随机分组，将小鼠分成对照组，花生200mg/kg.d剂量组，每组各30只。对照组给予一定剂量的生理盐水。喂养中，观察小鼠活动的能力，并且每三天称量体重一次。各组给药5周(35天)后，处死小鼠后实验。处死小鼠后，立即取出脏器，用吸水纸吸去污血，置于电子分析天平上称量脏器的重量，脏器指数以脏器重量(mg)与体重(10g)之比表示。处死小鼠后立即取出脾脏及胸腺，用吸水纸吸去污血，置于电子分析天平上称重，免疫器官指数以免疫器官重量(mg)与体重(10g)之比表示。
表1花生肽对小鼠体重的影响
| 组别 | 第一周(g) | 第二周(g) | 第三周(g) | 第四周(g) | 第五周(g) |
| 对照组 | 15.29 | 24.45 | 30.56 | 33.35 | 36.49 |
| 剂量组 | 16.08 | 25.08 | 33.07 | 37.88 | 39.00 |
表2花生肽对小鼠脏器指数的影响
表3花生肽对小鼠免疫器官及其指数的影响
从上述结果来看：花生多肽剂量组小鼠的体重与对照组相比有不同程度的提高，剂量组小鼠体重明显高于对照组小鼠，随着喂养时间的延长，这种趋势更加明显，并且体重的增加与剂量呈剂量对应关系；花生多肽各剂量组小鼠的脏器重量均有一定程度的增加；花生多肽对小鼠的免疫器官有一定的影响。剂量组200mg/Kg.d花生多肽具有较高的胸腺指数(27.02mg/10g)、脾脏重量(0.1501g)及指数(38.49mg/10g)，且剂量组花生多肽的脾脏指数与对照组相比具有显著性。这表明剂量的花生多肽有较强的增加动物免疫功能的作用。
本方法制备的花生肽，其产品在于包括如下特点：
(1)本方法制备的菜籽肽为白色或淡黄色粉末，无肉眼可见外来物质；
(2)本方法制备的花生肽产总氮含量(以干基计)≥90.0％，肽含量(以干基计)≥85.0％，所得的相对分子质量均在1000Da以下，水分含量≤5.0％，灰分含量(以干基计)≤2.0％，粗脂肪含量(以干基计)≤1.0％；
(3)由本发明制备并精制的花生肽具有良好的提高动物免疫力的功能。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
图1为本发明的花生生物活性肽的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
一种花生生物活性肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
(A)取花生饼500g，将花生饼粉碎，过80目筛，用95％正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，为脱脂花生饼粉末，待用；
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉倒入3L水中，加热至45～55℃，用碱试剂调节pH至10.0，搅拌15min，在3000r/min的转速下，离心15min，取上清液；
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃，用柠檬酸试剂调节pH至3.0，搅拌15min，在3000r/min的转速下，离心15min，收集沉淀，为花生蛋白，称重为312g；
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入3.5L水中，加热至90～100℃，保持15min，然后冷却至40℃，用NaOH试剂调节并保持pH在9.0，添加碱性蛋白酶Alcalase 16g，酶解3h；
(E)待步骤(D)酶解结束后，迅速用HCl溶液调节pH至3.0，在3000r/min的转速下，离心15min，取上清液，为花生肽粗制液；
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为花生肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解；
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸和10％NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7.0左右，待用
将步骤(F)中所得的超滤液，以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7.0时停止加样，收集为花生肽精制液；
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液，减压浓缩至固型物含量40％；
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为216g，经检测本产品总氮含量(以干基计)93.4％，肽含量(以干基计)≥90.6％，所得的相对分子质量均在1000Da以下，水分含量4.5％，灰分含量(以干基计)≤1.5％，粗脂肪含量(以干基计)≤0.6％。
实施例2
一种花生生物活性肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
(A)取花生饼1000g，将花生饼粉碎，过80目筛，用95％正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，为脱脂花生饼粉末，待用；
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉8L水中，加热至55℃，用碱试剂调节pH至9.0，搅拌15min，在3000r/min的转速下，离心15min，取上清液；
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃，用柠檬酸试剂调节pH至4.0，搅拌15min，在3000r/min的转速下，离心15min，收集沉淀，为花生蛋白，称重为523g；
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入10L水中，加热至90℃，保持20min，然后冷却至45℃，用NaOH试剂调节并保持pH在8.5，添加碱性蛋白酶Alcalase 50g，酶解4h；
(E)待步骤(D)酶解结束后，迅速用HCl溶液调节pH至3.0，在3000r/min的转速下，离心15min，取上清液，为花生肽粗制液；
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为花生肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解；
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸和10％NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7.0左右，待用
将步骤(F)中所得的超滤液，以8倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7.0时停止加样，收集为花生肽精制液；
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液，减压浓缩至固型物含量40％；
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为403g，经检测本产品总氮含量(以干基计)90.2％，肽含量(以干基计)≥86.5％，所得的相对分子质量均在1000Da以下，水分含量7.0％，灰分含量(以干基计)≤1.9％，粗脂肪含量(以干基计)≤0.9％。
实施例3
一种花生生物活性肽的制备方法，该方法包括如下步骤：
(A)取花生饼100g，将花生饼粉碎，过60目筛，用95％正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，为脱脂花生饼粉末，待用；
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼倒入800mL水中，加热至50℃，用碱试剂调节pH至9.5，搅拌15min，在3500r/min的转速下，离心15min，取上清液；
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃，用柠檬酸试剂调节pH至4.5，搅拌15min，在3500r/min的转速下，离心15min，收集沉淀，为花生蛋白，称重为61g；
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入1L水中，加热至90℃，保持30min，然后冷却至45℃，用NaOH试剂调节并保持pH在8.0，添加碱性蛋白酶Alcalase 2.5g，酶解2h；
(E)待步骤(D)酶解结束后，迅速用HCl溶液调节pH至5.0，在3000r/min的转速下，离心15min，取上清液，为花生肽粗制液；
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为花生肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解；
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸和10％NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7.0左右，待用
将步骤(F)中所得的超滤液，以5倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7.0时停止加样，收集为花生肽精制液；
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液，减压浓缩至固型物含量35％；
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为52g，经检测本产品总氮含量(以干基计)94.1％，肽含量(以干基计)≥92.6％，所得的相对分子质量均在1000Da以下，水分含量4.0％，灰分含量(以干基计)≤1.0％，粗脂肪含量(以干基计)≤0.9％。
Claims (1)
1.一种花生生物活性肽的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(A)将花生饼粉碎，过60～80目筛，用95％正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h，浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发，为脱脂花生饼粉末，待用；
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉按1∶5～1∶10溶解至水中，加热至45～55℃，用碱试剂调节pH至8.0～10.0，搅拌15min，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，取上清液；
(C)将步骤(B)的上清液加热至70～90℃，用柠檬酸试剂调节pH至3.0～5.0，搅拌15min，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，收集沉淀，为花生蛋白；
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀与水的质量比为1∶10～1∶20的比例溶解至水中，加热至90～100℃，保持15～30min，然后冷却至40～50℃，用NaOH试剂调节并保持pH在7.5～9.0，按照花生蛋白质量的2％～10％的质量，添加碱性蛋白酶Alcalase，酶解2～4h；
(E)待步骤(D)酶解结束后，迅速用HCl溶液调节pH至5.0～3.0，在3000～4000r/min的转速下，离心15min，取上清液，为花生肽粗制液；
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中，溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜，溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液，收集超滤液，为花生肽超滤液；溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩，将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解；
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱，然后分别用7.5％盐酸和10％NaOH对其进行浸泡，转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂，再用去离子水清洗至pH为7.0左右，待用；
将步骤(F)中所得的花生肽超滤液，以5～10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子，待流出液pH＝4.0左右时停止加样，之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子，至流出液呈pH为7.0时停止加样，收集为花生肽精制液；
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液，减压浓缩至固型物含量30％～40％；
(I)步骤(H)中的花生肽精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
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