一种花生生物活性肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种植物蛋白质组合物的制备方法,尤其涉及一种花生生物活性肽的制备方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物,我国生产的花生除少部分作为干果食用之外,大部分是作为油料资源用于榨取食用油脂。榨油后所得占花生总重量56%~61%的花生饼粕中蛋白质含量为55%左右,其氨基酸组成较完全,含有大量人体必需氨基酸,营养价值可与FAO推荐的模式蛋白质相媲美。且资源丰富,价格低廉,是酶解制备生物活性肽的良好植物蛋白资源。花生饼粕多被用作饲料或肥料,尚未充分深加工利用,因而造成花生蛋白资源的极大浪费。如果对花生蛋白进行有限的酶解,可生产出高营养、高附加值且易于吸收的具有生物活性功能的生物制品。
肽是由氨基酸通过肽键连接而成的化合物,它是机体组织细胞的基本组成成分。科学家已在人体中发现了100多种生物活性肽,这些肽具有传递生理信息,调节生理功能的作用,对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要,所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与多肽有关系。
花生肽是指花生蛋白经蛋白酶作用后,再经分离、精制等过程得到的蛋白质水解产物。花生肽具有较好的功能特性,如花生肽溶液在高浓度下黏度依然较低,能在较宽的pH值范围内保持溶解状态;具有较高的吸湿性和保湿性;渗透压比氨基酸低得多;能抑制蛋白质形成凝胶,减少了由于花生蛋白大分子引起的过敏原性,增加了产品的稳定性等。此外,花生肽还具有抗氧化、抗疲劳、降血压、提高机体免疫力等多种生理活性,可广泛用于医药、保健食品、食品添加剂、调味品等多个领域,具有良好的应用前景。
花生饼中除了含有50~55%左右的花生蛋白外,还含有糖分、粗纤维、粗脂肪、水分、矿物质等其它成分。由于含有这些杂质成分,目前制备花生肽的工艺中,很少将花生饼直接作为原料来使用,不仅浪费了生产原料,还增加了生产成本。另外,在纯化花生蛋白及制备花生肽的过程中,均有加酸碱调节pH的工序,因此,不可避免的代入大量盐分,影响了最终产品的品质。第三,现有技术由于水解条件不同,花生肽的分子量也不同,而不同分子量的花生肽具有不同的生理功能,怎样得到特定分子量的产品,并且提高该分子量产品的纯度,从而使产品具有特定的生理功能,也是目前需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生生物活性肽的制备方法。
本发明的花生生物活性肽的制备方法如下:
(A)将花生饼粉碎,过60~80目筛,用95%正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h,浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发,为脱脂花生饼粉末,待用;
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉按1∶6~1∶8溶解至水中,加热至45~55℃,用碱试剂调节pH至9.0~10.0,搅拌15min,在3000~3500r/min的转速下,离心15min,取上清液;
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃,用柠檬酸试剂调节pH至3.0~4.5,搅拌15min,在3000~3500r/min的转速下,离心15min,收集沉淀,为花生蛋白;
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀与水的质量比为1∶10~1∶20的比例溶解至水中,加热至90~100℃,保持15~30min,然后冷却至40~45℃,用NaOH试剂调节并保持pH在8.0~9.0,按照花生蛋白质量的4%~10%的质量,添加碱性蛋白酶Alcalase,酶解3~4h;
(E)待步骤(D)酶解结束后,迅速用HCl溶液调节pH至5.0~3.0,在3000~4000r/min的转速下,离心15min,取上清液,为花生肽粗制液;
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中,溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜,溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液,收集超滤液,为花生肽超滤液;溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩,将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解;
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱,然后分别用7.5%盐酸和10%NaOH对其进行浸泡,转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂,再用去离子水清洗至pH为7.0左右,待用
将步骤(F)中所得的超滤液,以5~10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子,待流出液pH=4.0左右时停止加样,之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子,至流出液呈pH为7.0时停止加样,收集为花生肽精制液;
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液,减压浓缩至固型物含量35%~40%;
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述步骤(A)的目的是用正己烷溶解花生饼中的残留脂质,以去除花生饼中的脂质,使最终产品的脂肪含量降低,所谓“浸提”,就是用正己烷溶解花生饼粉中的脂溶性物质,然后过滤或者离心去除液体,留下花生饼固体。
上述步骤(B)碱溶的目的是:利用蛋白质在碱性条件下溶解的特性,将花生蛋白和碱不溶性物质分离开,以提高花生蛋白的含量。
上述步骤(C)酸沉的目的是:利用蛋白质在酸性等电点条件下沉淀的特性,将花生蛋白和酸溶性物质分开,以提高花生蛋白的含量。
上述步骤(B)、(C)的目的是为了去除花生饼中的杂质,提高花生蛋白的含量,为酶解提供原料。一般花生饼中蛋白的含量在50%左右,经过上述方法处理后,花生蛋白含量可达90%以上。
上述步骤(D)中酶解过程需要不断搅拌,同时加入NaOH溶液以保持pH值在7.5~9.0,酶解的目的是:将花生饼中的大分子蛋白质酶解为小分子蛋白质和肽。
上述步骤(E)调酸的目的是为了使酶失活,停止酶解反应;离心的目的是为了固液分离,收集酶解液。
上述步骤(F)中超滤的目的是为了截取需要分子量的产品;二次酶解的目的是为了将分子量1000Da以上的大分子蛋白水解成小分子,提高利用原料利用。
上述步骤(G)中脱盐的目的是为了去除酶解液中因酶解过程中不断调节pH而带入的盐离子。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和效果:
(1)直接以花生饼为原料,提高了原料利用率;
(2)用浸提法除去花生饼中的残留油脂,使最终产品脂肪含量在1%以下;
(3)利用碱溶酸沉法纯化花生蛋白,提高水解原料的品质,使最终产品的总氮量在90%以上;
(4)采用超滤法对花生肽进行分级处理,保证100%的花生肽分子量在1000Da以下,并对于分子量1000Da以上的花生肽进行二次酶解,使最终产品的分子量分布均在1000Da以下;
(5)利用阴阳交换树脂对花生肽粗品进行脱盐,没有脱盐处理的产品盐分含量在8%左右,采用本方法中的脱盐工艺处理的产品盐分含量在2%以下;
(6)由本发明制备并精制的花生肽具有良好的提高动物免疫力的功能。
本发明的方法制备的花生肽有较好的增强动物免疫力的效果,实验证明如下:
实验动物小鼠预饲3d后,按体重随机分组,将小鼠分成对照组,花生200mg/kg.d剂量组,每组各30只。对照组给予一定剂量的生理盐水。喂养中,观察小鼠活动的能力,并且每三天称量体重一次。各组给药5周(35天)后,处死小鼠后实验。处死小鼠后,立即取出脏器,用吸水纸吸去污血,置于电子分析天平上称量脏器的重量,脏器指数以脏器重量(mg)与体重(10g)之比表示。处死小鼠后立即取出脾脏及胸腺,用吸水纸吸去污血,置于电子分析天平上称重,免疫器官指数以免疫器官重量(mg)与体重(10g)之比表示。
表1花生肽对小鼠体重的影响
组别 |
第一周(g) |
第二周(g) |
第三周(g) |
第四周(g) |
第五周(g) |
对照组 |
15.29 |
24.45 |
30.56 |
33.35 |
36.49 |
剂量组 |
16.08 |
25.08 |
33.07 |
37.88 |
39.00 |
表2花生肽对小鼠脏器指数的影响
表3花生肽对小鼠免疫器官及其指数的影响
从上述结果来看:花生多肽剂量组小鼠的体重与对照组相比有不同程度的提高,剂量组小鼠体重明显高于对照组小鼠,随着喂养时间的延长,这种趋势更加明显,并且体重的增加与剂量呈剂量对应关系;花生多肽各剂量组小鼠的脏器重量均有一定程度的增加;花生多肽对小鼠的免疫器官有一定的影响。剂量组200mg/Kg.d花生多肽具有较高的胸腺指数(27.02mg/10g)、脾脏重量(0.1501g)及指数(38.49mg/10g),且剂量组花生多肽的脾脏指数与对照组相比具有显著性。这表明剂量的花生多肽有较强的增加动物免疫功能的作用。
本方法制备的花生肽,其产品在于包括如下特点:
(1)本方法制备的菜籽肽为白色或淡黄色粉末,无肉眼可见外来物质;
(2)本方法制备的花生肽产总氮含量(以干基计)≥90.0%,肽含量(以干基计)≥85.0%,所得的相对分子质量均在1000Da以下,水分含量≤5.0%,灰分含量(以干基计)≤2.0%,粗脂肪含量(以干基计)≤1.0%;
(3)由本发明制备并精制的花生肽具有良好的提高动物免疫力的功能。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
图1为本发明的花生生物活性肽的制备方法的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
一种花生生物活性肽的制备方法,该方法包括如下步骤:
(A)取花生饼500g,将花生饼粉碎,过80目筛,用95%正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h,浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发,为脱脂花生饼粉末,待用;
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉倒入3L水中,加热至45~55℃,用碱试剂调节pH至10.0,搅拌15min,在3000r/min的转速下,离心15min,取上清液;
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃,用柠檬酸试剂调节pH至3.0,搅拌15min,在3000r/min的转速下,离心15min,收集沉淀,为花生蛋白,称重为312g;
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入3.5L水中,加热至90~100℃,保持15min,然后冷却至40℃,用NaOH试剂调节并保持pH在9.0,添加碱性蛋白酶Alcalase 16g,酶解3h;
(E)待步骤(D)酶解结束后,迅速用HCl溶液调节pH至3.0,在3000r/min的转速下,离心15min,取上清液,为花生肽粗制液;
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中,溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜,溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液,收集超滤液,为花生肽超滤液;溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩,将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解;
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱,然后分别用7.5%盐酸和10%NaOH对其进行浸泡,转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂,再用去离子水清洗至pH为7.0左右,待用
将步骤(F)中所得的超滤液,以10倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子,待流出液pH=4.0左右时停止加样,之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子,至流出液呈pH为7.0时停止加样,收集为花生肽精制液;
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液,减压浓缩至固型物含量40%;
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为216g,经检测本产品总氮含量(以干基计)934%,肽含量(以干基计)≥90.6%,所得的相对分子质量均在1000Da以下,水分含量4.5%,灰分含量(以干基计)≤1.5%,粗脂肪含量(以干基计)≤0.6%。
实施例2
一种花生生物活性肽的制备方法,该方法包括如下步骤:
(A)取花生饼1000g,将花生饼粉碎,过80目筛,用95%正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h,浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发,为脱脂花生饼粉末,待用;
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼粉8L水中,加热至55℃,用碱试剂调节pH至9.0,搅拌15min,在3000r/min的转速下,离心15min,取上清液;
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃,用柠檬酸试剂调节pH至4.0,搅拌15min,在3000r/min的转速下,离心15min,收集沉淀,为花生蛋白,称重为523g;
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入10L水中,加热至90℃,保持20min,然后冷却至45℃,用NaOH试剂调节并保持pH在8.5,添加碱性蛋白酶Alcalase 50g,酶解4h;
(E)待步骤(D)酶解结束后,迅速用HCl溶液调节pH至3.0,在3000r/min的转速下,离心15min,取上清液,为花生肽粗制液;
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中,溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜,溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液,收集超滤液,为花生肽超滤液;溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩,将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解;
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱,然后分别用7.5%盐酸和10%NaOH对其进行浸泡,转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂,再用去离子水清洗至pH为7.0左右,待用
将步骤(F)中所得的超滤液,以8倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子,待流出液pH=4.0左右时停止加样,之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子,至流出液呈pH为7.0时停止加样,收集为花生肽精制液;
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液,减压浓缩至固型物含量40%;
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为403g,经检测本产品总氮含量(以干基计)90.2%,肽含量(以干基计)≥86.5%,所得的相对分子质量均在1000Da以下,水分含量7.0%,灰分含量(以干基计)≤1.9%,粗脂肪含量(以干基计)≤0.9%。
实施例3
一种花生生物活性肽的制备方法,该方法包括如下步骤:
(A)取花生饼100g,将花生饼粉碎,过60目筛,用95%正己烷溶剂在50℃条件下浸泡2h,浸提后晾晒至正己烷试剂完全挥发,为脱脂花生饼粉末,待用;
(B)将步骤(A)中正己烷浸提之后的花生饼倒入800mL水中,加热至50℃,用碱试剂调节pH至9.5,搅拌15min,在3500r/min的转速下,离心15min,取上清液;
(C)将步骤(B)的上清液加热至90℃,用柠檬酸试剂调节pH至4.5,搅拌15min,在3500r/min的转速下,离心15min,收集沉淀,为花生蛋白,称重为61g;
(D)将步骤(C)中收集的沉淀按沉淀倒入1L水中,加热至90℃,保持30min,然后冷却至45℃,用NaOH试剂调节并保持pH在8.0,添加碱性蛋白酶Alcalase 2.5g,酶解2h;
(E)待步骤(D)酶解结束后,迅速用HCl溶液调节pH至5.0,在3000r/min的转速下,离心15min,取上清液,为花生肽粗制液;
(F)将步骤(E)所得的花生肽粗制液注入储槽中,溶液经微滤后通过分子量截留量为1000Da超滤膜,溶液中的小分子物质经中空纤维膜的内壁渗透出来成为超滤液,收集超滤液,为花生肽超滤液;溶液中的蛋白等大分子物质得以保留并得到浓缩,将浓缩液回收至步骤(D)中再次酶解;
(G)交换树脂于去离子水中浸泡处理24小时后装柱,然后分别用7.5%盐酸和10%NaOH对其进行浸泡,转化为H+型阳离子交换树脂和OH-型阴离子交换树脂,再用去离子水清洗至pH为7.0左右,待用
将步骤(F)中所得的超滤液,以5倍柱体积/h的流速通过H+型阳离子交换树脂来脱除阳离子,待流出液pH=4.0左右时停止加样,之后将此流出液以同样流速通过OH-型阴离子交换树脂来脱除阴离子,至流出液呈pH为7.0时停止加样,收集为花生肽精制液;
(H)由步骤(G)中得到的花生肽精制液,减压浓缩至固型物含量35%;
(I)步骤(H)中的精制液经喷雾干燥或冷冻干燥制成花生肽干粉。
上述花生肽干粉称重为52g,经检测本产品总氮含量(以干基计)94.1%,肽含量(以干基计)≥92.6%,所得的相对分子质量均在1000Da以下,水分含量4.0%,灰分含量(以干基计)≤1.0%,粗脂肪含量(以干基计)≤0.9%。