CN105859874A

CN105859874A - 一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法

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Publication number: CN105859874A
Application number: CN201610355698.8A
Authority: CN
Inventors: 陈石良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-05-26
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2016-08-17

Abstract

本发明涉及一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，主要步骤包括采集经抗凝处理的新鲜猪血，离心分离得到血球液，经溶血、酶解、离心得到酶解液，酶解液经超滤膜过滤、纳滤膜浓缩后喷雾干燥得猪血球活性小肽粉。本发明的方法选用高效内切蛋白酶，采用一步酶解法并结合超滤膜与纳滤膜分离技术，工艺流程简单，生产周期短，生产效率高，成本低，适合规模化的工业生产。本发明所制备的产品中活性小分子肽（相对分子量介于180～1000Da之间）含量高达75%以上，有机卟啉铁（血红素铁）含量达到0.2%以上，灰份含量低于5.0%，游离氨基酸含量低于11%。产品能促进动物生长，增强动物免疫力和抗病能力，是一种新型的功能性蛋白质饲料原料。

Description

一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法

技术领域

本发明涉及动物血液蛋白深加工技术领域，尤其涉及一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法。

背景技术

根据含氨基酸残基数的不同，肽可以分为多肽、寡肽、小肽。一般来讲，含氨基酸残基数超过50个的通常称为蛋白质，低于50个大于10个氨基酸残基的称为多肽，低于10个氨基酸残基的称为寡肽。小肽是指相对分子量介于180～1000Da之间的二肽、三肽和四肽。大量研究表明，在动物体内存在小肽吸收机制，小肽能完整地通过肠黏膜细胞进入体内循环。动物67％的氨基酸是以小肽的形式吸收的，剩余的33％才以游离氨基酸(FAA)的形式吸收。小肽不仅为蛋白质合成提高氮架，而且具有重要的生理调节功能。小肽的生理功能主要体现在以下几个方面：（1）促进氨基酸吸收，提高蛋白质合成速度。小肽不仅能被小肠粘膜吸收利用，其合成蛋白质的速度也远远高于氨基酸。（2）提高矿物质的吸收利用率。在动物体内，大多数的矿物元素吸收都要以蛋白质为载体，小肽可以与金属离子形成螯合物，保证其可溶状态，从而可以促进矿物元素的被动转运过程及其储存。（3）提高动物机体免疫力。小肽能够通过诱导小肠绒毛刷状缘膜酶活性上升和刺激消化酶分泌，抑制大肠杆菌的繁殖，来提高机体的免疫力。（4）促进消化道的发育，减少腹泻的发生。幼龄动物因消化道中的酶活较低，消化能力差，当日粮中蛋白质和游离氨基酸浓度过高时，容易引起动物的腹泻。小肽通过诱导小肠中一些酶活性的提高，使小肠消化功能发育提前，从而促进幼小动物的健康生长，提高其生产性能。因此，近年来功能性小肽产品的开发制备已成为保健食品和动物营养领域的研究热点。

猪血球是从猪血全血中离心分离得到的一种富含血红蛋白（Hemoglobin）的血细胞，也称红细胞或红血球，其血红蛋白的含量达到36%以上，约占全血蛋白质总量80%，是一种品质优良的动物源性蛋白质资源。尤其值得一提的是，猪血球中还含有丰富的有机卟啉铁（也称血红素铁），每100g血球蛋白粉中有机卟啉铁（血红素铁）的含量高达0.3克以上。有机卟啉铁亦即血红素型铁在肠道可以不受食物其他因素的影响进入肠黏膜，较其他植物性铁或动物性非血红素型铁以及无机铁吸收率高，因此添加富含有机卟啉铁（血红素铁）的血粉是幼龄动物补铁和预防母猪贫血极为有效的方法。

多年来，国内猪血加工企业基本上都是将从全血中分离得到的血球液直接喷雾干燥加工成血球蛋白粉。这种血球蛋白粉因蛋白质含量高，有机卟啉铁含量丰富，目前在部分畜禽和水产饲料中得到一定程度的应用。但是，由于血红蛋白分子量大（分子量分布范围主要集中在10000-60000Da之间），没有经过降解的血球蛋白粉不易被动物消化吸收，特别是幼畜由于消化功能尚未健全、酶系统发育不完善，对血红蛋白的消化能力差，利用率低，并造成环境污染，市场接受度不高，这是制约目前血球蛋白粉在养殖生产特别是在断奶仔猪日粮中大量推广应用的一个重要因素。另一方面，目前市场上生产销售的血球蛋白粉基本上都不含有活性肽类物质或者活性小分子肽含量很低，仅仅只能作为普通的蛋白质饲料原料销售，导致其经济附加值不高，难以满足当前养殖业对功能性饲料原料的迫切需求。

为了解决血球中血红蛋白大分子难以被消化吸收的问题，提升血球蛋白粉的营养价值和利用效果，近年来国内一些科研工作者在改进血球液加工工艺技术方面做了许多尝试，并取得了一些进步，其中不少已申请了发明专利。例如，CN200610034691.2公开了一种猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法，该方法以猪血血红细胞为原料，通过高压均质或超声波处理并结合复合蛋白酶酶解技术，制备出低分子肽和氨基酸，蛋白质回收率高，产物无不良风味。但是，该方法所得的产品中主要成分是分子量为10000Da以下的猪血红蛋白酶解产物，其中肽的分子量分布和含量特别是功能性的小分子肽含量并不清楚。CN201210191699.5公开了一种二步酶解法生产高品质血球蛋白肽的制备方法。该方法以猪血红血球为原料，利用酸性蛋白酶和中性蛋白酶进行分步酶解处理，并结合离心沉淀和化学氧化脱色方法，去除血红素，最终得到脱色的血球蛋白肽，产品具有良好的外观色泽，无臭味，产品中分子量小于5000Da的多肽类物质占80%以上。但是，该技术方法需要进行两步酶解处理，特别是在酸性蛋白酶水解过程中，在酸性条件下（PH2-3）部分血红蛋白易发生变性，并与血红素一起沉淀，被离心分离去除，因而蛋白质回收率较低，尤其是作为动物重要补铁来源的有机卟啉铁（血红素铁）流失，同时因多次调节PH值，带入较多的盐份，从而造成制备产物中灰分含量较高，产品中活性小分子肽（相对分子量介于180～1000Da之间）的含量也没有报道。CN201410547593.3公开了一种猪血球蛋白粉的制备方法，以猪血全血为原料，通过离心分离和超声波处理制备猪血血红蛋白液，再依次对血红蛋白液进行物理脱氧、超声处理、复合酶分段酶解、活性碳脱色、膜超滤浓缩、喷雾干燥等复杂的工艺流程处理，最后得到乳白色的猪血球蛋白多肽粉和血红素肽，该方法虽然彻底脱除了血球蛋白多肽粉的颜色和血腥味，产品感官性状大幅提升，蛋白消化吸收率有所提高，但是需要多次超声波处理，分段酶解，反复离心以及脱色浓缩，工艺繁琐，成本高，所得产品是分子量在6000Da以上的蛋白多肽粉，不含活性小分子肽，经济附加值不高。因此，现有技术方案无论是在制备工艺的简易性与可操作性方面还是在产品的营养价值和功能性方面都存在不足之处。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，该方法以丰富的猪血为原料，工艺简单，成本低，易于实施，所得产品中活性小分子肽含量高，易于消化吸收利用，能明显提高动物的生产性能，改善动物免疫机能，以满足市场对功能性蛋白饲料原料的需求。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现的：一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，包括以下步骤：

（1）猪血球液制备：采集经抗凝处理的新鲜猪血，离心分离，收集血红细胞，即得到血球液；

（2）溶血：往血球液中加入其体积1-2倍的去离子水，不断搅拌溶血30-90min，搅拌速度为30-60r/min，得到溶血液；

（3）酶解：调节溶血液PH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，在40-60℃温度下酶解4-16h，将酶解液升温至85℃灭酶5-10分钟，即得到酶解液；

（4）离心：将酶解液进行高速离心，收集上清夜，去除沉淀；

（5）超滤：将收集的离心上清液经截留分子量为1000-3000Da的超滤膜装置进行超滤，收集透过液；

（6）纳滤：将收集的超滤透过液，用截留分子量为150-300Da的纳滤膜进行纳滤浓缩，收集浓缩液；

（7）喷雾干燥：将所得到的纳滤浓缩液进行喷雾干燥，即得到猪血球活性小肽粉。

上述步骤（1）中所述的抗凝处理是添加食品级柠檬酸钠，添加量为新鲜猪血重量的0.3-0.6%，先将称量好的柠檬酸钠配制成10-15%柠檬酸钠溶液，然后在采集新鲜猪血过程中边搅拌边缓慢加入柠檬酸钠溶液。

上述步骤（1）中所述的离心分离是采用管式离心机连续分离，离心转速大于10000r/min。

上述步骤（3）所述的蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，酶活力为180000-200000U/ml，蛋白酶的添加量为血球液重量的0.1-1.0%。

上述步骤（4）所述的高速离心是采用管式离心机分离，离心转速大于10000r/min。

上述步骤（7）所述的喷雾干燥的进风口温度为200-250℃，出风口温度为70-100℃。

通过实施上述技术方案，本发明具有如下的有益效果：

（1）本发明的方法采用从枯草杆菌中提取的内切蛋白酶，将血红蛋白水解成最理想的小分子肽段，水解效率高。

（2）本发明的方法采用一步酶解法并结合利用超滤与纳滤膜分离技术，工艺流程非常简单，生产周期短，生产效率高，成本低，适合规模化的工业生产。

（3）本发明所制备的猪血球活性小肽粉产品营养价值高，其中活性小分子肽（相对分子量介于180～1000Da之间）含量高达75%以上，有机卟啉铁（血红素铁）含量达到0.2%以上，灰份含量低于5.0%，游离氨基酸含量低于11%；产品中的活性小肽、有机卟啉铁与氨基酸共存，协同增效，易于吸收利用。

（4）本发明所制备的猪血球活性小肽粉产品具有良好的促进动物生长、提高动物免疫力和抗病能力的功效，可作为一种新型的功能性蛋白质饲料原料，广泛应用于饲料工业特别是幼畜和弱畜饲料中。

附图说明

图1为本发明一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明，但是本发明的实施方式并不局限于此实施例表示的范围。

实施例1

（1）猪血球液制备：采集经抗凝处理的新鲜猪血1000L，用管式离心机连续离心分离得到440L血球液和560L血浆液，收集血球液，血浆液经喷雾干燥制成血浆蛋白粉；抗凝处理时添加食品级柠檬酸钠，添加量为新鲜猪血重量的0.4%，先将称量好的柠檬酸钠配制成10%柠檬酸钠溶液，然后在采集新鲜猪血过程中边搅拌边缓慢加入柠檬酸钠溶液；

（2）溶血：将血球液泵入反应罐中，加入440L的去离子水，不断搅60min，使血球破碎，搅拌速度为30r/min，制得溶血液880L；

（3）酶解：继续搅拌下将溶血液加热升温至50℃，用NaOH溶液调节其PH值至8.5，随后添加血球液重量0.4%的蛋白酶（酶活力200000U/ml），不断搅拌，每间隔一小时检测酶解液的PH值，当PH值下降至8.0以下时，补碱液调PH值至8.0，保温酶解4h后，将酶解液升温至85℃灭酶10分钟，即得到酶解液；

（4）离心：将酶解液采用管式离心机连续分离，离心转速为16300r/min，收集离心上清夜636L，去除沉淀；

（5）超滤：将收集的离心上清液经截留分子量为1000Da的中空纤维超滤膜装置，得到超滤透过液510L；

（6）纳滤：将收集的超滤透过液，再用截留分子量为200Da的纳滤膜过滤浓缩，收集浓缩液336L；

（7）喷雾干燥：将所得到的纳滤浓缩液进行喷雾干燥，即得到猪血球活性小肽粉121Kg；喷雾干燥的进风口温度为220℃，出风口温度为80℃。

实施例2

（1）猪血球液制备：采集经抗凝处理的新鲜猪血2000L，用管式离心机连续离心分离得到850L血球液和1150L血浆液，收集血球液，血浆液经喷雾干燥制成血浆蛋白粉；抗凝处理时添加食品级柠檬酸钠，添加量为新鲜猪血重量的0.5%，先将称量好的柠檬酸钠配制成10%柠檬酸钠溶液，然后在采集新鲜猪血过程中边搅拌边缓慢加入柠檬酸钠溶液；

（2）溶血：将血球液泵入反应罐中，加入850L的去离子水，不断搅60min，使血球破碎，搅拌速度为50r/min，制得溶血液1700L；

（3）酶解：继续搅拌下将溶血液加热升温至55℃，用NaOH溶液调节其PH值至8.5，随后添加血球液重量0.3%的蛋白酶（酶活力200000U/ml），不断搅拌，每间隔一小时检测酶解液的PH值，当PH值下降至8.0以下时，补碱液调PH值至8.0，保温酶解6h后，将酶解液升温至85℃灭酶10分钟，即得到酶解液；

（4）离心：将酶解液采用管式离心机连续分离，离心转速为16300r/min，收集离心上清夜1210L，去除沉淀；

（5）超滤：将收集的离心上清液经截留分子量为2000Da的中空纤维超滤膜装置，得到超滤透过液1045L；

（6）纳滤：将收集的超滤透过液，再用截留分子量为200Da的纳滤膜过滤浓缩，收集浓缩液744L；

（7）喷雾干燥：将所得到的纳滤浓缩液进行喷雾干燥，即得到猪血球活性小肽粉243Kg；喷雾干燥的进风口温度为230℃，出风口温度为90℃。

实施例3

（1）猪血球液制备：采集经抗凝处理的新鲜猪血5000L，用管式离心机连续离心分离得到2160L血球液和2840L血浆液，收集血球液，血浆液经喷雾干燥制成血浆蛋白粉；抗凝处理时添加食品级柠檬酸钠，添加量为新鲜猪血重量的0.5%，先将称量好的柠檬酸钠配制成10%柠檬酸钠溶液，然后在采集新鲜猪血过程中边搅拌边缓慢加入柠檬酸钠溶液；

（2）溶血：将血球液泵入反应罐中，加入2200L的去离子水，不断搅60min，使血球破碎，搅拌速度为50r/min，制得溶血液4360L；

（3）酶解：继续搅拌下将溶血液加热升温至55℃，用NaOH溶液调节其PH值至8.5，随后添加血球液重量0.2%的蛋白酶（酶活力200000U/ml），不断搅拌，每间隔一小时检测酶解液的PH值，当PH值下降至8.0以下时，补碱液调PH值至8.0，保温酶解8h后，将酶解液升温至85℃灭酶10分钟，即得到酶解液；

（4）离心：将酶解液采用管式离心机连续分离，离心转速为16300r/min，收集离心上清夜2850L，去除沉淀；

（5）超滤：将收集的离心上清液经截留分子量为3000Da的中空纤维超滤膜装置，得到超滤透过液2470L；

（6）纳滤：将收集的超滤透过液，再用截留分子量为200Da的纳滤膜过滤浓缩，收集浓缩液1620L；

（7）喷雾干燥：将所得到的纳滤浓缩液进行喷雾干燥，即得到猪血球活性小肽粉631Kg；喷雾干燥的进风口温度为230℃，出风口温度为90℃。

对上述实施例得到的产品主要成分以及蛋白质（肽）分子量分布与产品功效进行检测。

产品主要成分检测：按照常规方法对产品粗蛋白、小分子肽（相对分子量在180-1000Da）、粗灰分、水分、铁等主要成分进行检测。

结果如表1：

从表1中可以看出，实施例所得的产品中蛋白质含量均在87%以上，小分子肽含量达到75%以上，灰分含量小于5%，铁含量在0.2%以上。

蛋白质（肽）分子量分布检测：对上述实施例得到的产品取样送江南大学分析测试中心，采用高效凝胶过滤色谱（HPLC）法测定，以已知分子量蛋白质做参照。

结果如表2：

从表2中可以看出，产品中相对分子量在180-1000Da的小肽组分占蛋白质（肽）的比例在85%以上，分子量小于180Da的游离氨基酸所占比例在11%以下。

功效检测：选择35日龄的杜×长×大三元杂交仔猪120头，按体重相近、遗传基础相似的原则，随机分为3个处理组，分别为基础日粮组、基础日粮+0.5%小肽组、基础日粮+1.0%小肽组，每个处理组设四个重复，每个重复10头猪，试验期30天。

结果见表3：

从表3中可以看出，与对照组相比，添加血球活性小肽组平均日增重提高了10.6-14.0%，腹泻率降低34.9-40.8%；血液总蛋白、球蛋白、IgG含量分别提高了11.5-19.9%、9.4-23.0%、34.4-56.3%，这说明猪血球活性小肽粉能明显促进仔猪生长发育，提高仔猪生产性能，增强仔猪的免疫机能。

Claims

1.一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，包括以下步骤：

（1）猪血球液制备：在新鲜的猪血中加入柠檬酸钠做抗凝处理，然后离心分离，收集血红细胞，即得到血球液；

（3）酶解：调节溶血液PH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，在40-60℃温度下酶解4-16h，将酶解液升温至85℃灭酶5-10分钟，得到酶解液；

（5）超滤：将收集的离心上清液经截留分子量为1000-3000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液；

2.根据权利要求1所述的一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述柠檬酸钠为食品级柠檬酸钠，添加量为新鲜猪血重量的0.3-0.6%，先将称量好的柠檬酸钠配制成10-15%柠檬酸钠溶液，然后向新鲜猪血中边搅拌边缓慢加入柠檬酸钠溶液。

3.根据权利要求1所述的一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述离心分离是采用管式离心机连续分离，离心转速大于10000r/min。

4.根据权利要求1所述的一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶，酶活力为180000-200000U/ml，蛋白酶的添加量为血球液重量的0.1-1.0%。

5.根据权利要求1所述的一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述高速离心是采用管式离心机分离，离心转速大于10000r/min。

6.根据权利要求1所述的一种一步酶解法生产猪血球活性小肽粉的制备方法，其特征在于：步骤（7）所述喷雾干燥的进风口温度为200-250℃，出风口温度为70-100℃。