CN101544965B - 从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺 - Google Patents

Abstract

一种从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺，是以猪胎盘(含产仔血)为原料，利用其中所富含的免疫球蛋白(Ig)、免疫活性肽、超氧化物歧化酶(SOD)、脂多糖、胎盘蛋白等成份，依据它们具有不同的结构、分子量、等电点、理化特性、生物活性等，应用盐溶、盐析、层析、超滤等现代生化技术和生物集成技术，制定出适合工业化生产的联产工艺，使得在同一生产工艺流程中，可生产出猪胎盘中具有市场开发价值的功效成份：免疫球蛋白、免疫活性肽、超氧化物歧化酶、脂多糖、胎盘蛋白5种产品。该工艺采用传统与现代工艺相结合，通过联产生产出多种产品，不仅使胎盘资源得到充分利用，变废为宝，且无废液排放，绿色环保，还可大大降低生产成本，提高经济效益。

Description

从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种猪胎盘(含产血)综合利用联产工艺，是以猪胎盘为主原料，应用现代生物过程集成化技术，在同一生产工艺流程中，可生产出免疫球蛋白(Ig)、免疫活性肽、超氧化物歧化酶(SOD)、脂多糖、胎盘蛋白共5种系列产品，可广泛应用于医药、保健、日化工业和畜牧业。

背景技术

人类使用胎盘的历史源远流长。约400多年前，李时珍在其集中国古今医学之大成的《本草纲目》中，认为人、羊、猪、牛等哺乳动物的胎盘可以入药，并将胎盘以“紫河车”之名。现代科学证明，胎盘中含有50多种生物活性物质及氨基酸、矿物质等营养成分，是一种理想的免疫调节剂和营养美容保健剂。迄今为止，已有多种细胞生长因子从胎盘中被分离出来，如人胎盘源细胞生长因子(HPGF)、血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。

目前，我国已经有企业成功研制人胎素活细胞胶囊、人胎素美之容胶囊、人胎素美之体胶囊、人胎素香之体胶囊、人胎素强之体胶囊、人胎素口服液、人胎素嫩白修复液、人胎素嫩白修复霜、人胎素注射液、人胎素脂多糖注射液(人胎素脂多糖针剂、胎盘脂多糖针剂、胎盘脂多糖注射液)等新一代人胎素系列产品。可以预见，随着生物技术的不断发展，更多更好的胎盘制品会不断涌现。

但由于人胎盘数量少价植高，使胎盘系列产品的开发及应用受到很大限制。动物胎盘中同样含有丰富的生物活性物质，从动物的胎盘中提取功能成分，制作成本将会大大降低，从而获得更大的效益。九十年代以来国内外大量开发了羊胎盘系列产品，主要用于营养保健品和化妆品行业；对鹿胎盘、牛胎盘的研究和开发已有少量报道，而对猪胎盘的研究和开发仅有零星报道，且工艺均为单产。我国每年屠宰生猪近5亿头，以此推算，每年至少有5000万头母猪产出1亿个胎盘(按每头母猪每胎产10头仔猪，每年至少怀胎两次计算)，每个猪胎盘平均约重3公斤，每年至少有30万吨猪胎盘资源待开发利用，但目前大部分被废弃。许多研究已证明，猪胎盘中同样含有免疫球蛋白，白蛋白、多种活性酶、细胞生长因子、多肽、核苷酸、脂多糖及多种维生素和微量元素等功效成份，总蛋白质含量在80％以上。但截至目前，关于猪胎盘的系列产品的应用开发尚未见到有较详细的研究报道，所以研究开发数量多、来源广、价格低的猪胎盘综合利用工艺具有重要意义。

据有关研究证明以及市场调查显示，本工艺提取的免疫球蛋白(Ig)、免疫活性肽、超氧化物歧化酶(SOD)、脂多糖等活性成分具有以下功能和市场开发价值：

1.免疫球蛋白(IG)：

免疫球蛋白是直接参与免疫反应的抗体蛋白的总称。猪胎盘和胎盘血含有大量免疫球蛋白，是体液免疫的主要物质，它能凝集细菌、中和细菌毒素，并能在体内其他因素的参与下彻底杀死细菌和病毒，增强机体的免疫功能，预防消化道等疾病，促进营养吸收。

据有关资料报导，免疫球蛋白可对抗人体24种常见致病菌和病毒。可作为婴幼儿食品添加剂，促进婴幼儿营养吸收、增强免疫力。同时，免疫球蛋白也可以作为幼畜饲料添加剂，特别是集约化养殖基地，将免疫球蛋白应用于早期断奶幼畜，可减少幼畜疾病，促进生长发育，目前在动物饲料添加剂市场供不应求。

2.SOD(超氧化物歧化酶)

SOD是英文“Superoxide Dismutase”的缩写，中文名叫“超氧化物歧化酶”。它是一种生物酶，主要应用范畴有：

(1)作为药用酶，治疗多种疾病

研究表明，SOD具有及时清除体内超氧阴离子自由基的作用，它使机体保持正常的生理状态。但是随着年龄的增长或处于疾病状态时，体内产生的自由基会越来越多，而SOD含量却越来越少，因此及时向体内补充SOD是保证人体健康和促进疾病痊愈的必要途径。

(2)作为日化工业产品添加剂

目前国内外已将SOD应用于化妆品，经使用验证，SOD不仅有抗皱、祛班、色素等作用，还有抗炎、防晒、延缓衰老等作用

(3)作为食品添加剂，其功能主要有两个作用，一是作为抗氧剂，与其它类型抗氧剂一样，SOD可作为罐头食品、啤酒、果汁等产品的天然抗氧剂，防止食品变质及腐败，还可作为水果、蔬菜的良好保鲜剂。二是作为食品营养强化剂，SOD的抗病、抗衰老特性可大大提高食品的利用度。目前，国内外已将SOD广泛应用于牛奶、咖啡、啤酒、口香糖、果汁、饮料、糖果等产品。

3.免疫活性肽

从胎盘组织、胎盘血和母猪产血中提取的免疫活性肽，是一种核酸肽类，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫等作用，且分子量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、无种属差异等优点。因而，作为一种新型而又安全的免疫制剂广泛应用于人类和动物疾病防治。是一种很有开发和应用前景的生物产品。

4、脂多糖

脂多糖能增强非特异性免疫防卫系统的体液因素使补体的含量增高，也可诱导干扰素的产生，使溶菌酶和吞噬细胞活性增强，提高嗜中性白细胞和巨噬细胞的杀菌作用。脂多糖本身就是一种抗原，也影响机体的特异性免疫反应，可促进抗体的产生。临床上对于病毒和细菌引起的许多疾病有很好的预防和治疗作用。

发明内容

本发明的目的正是基于上述状况而专门研究开发的一种从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺，该工艺以猪胎盘为原料，应用现代生物过程集成化技术，在同一生产工艺流程中，生产出猪胎盘中具有市场开发价值的功效成份：免疫球蛋白(Ig)、免疫活性肽、超氧化物歧化酶(SOD)、脂多糖、胎盘蛋白5种产品。

本发明的猪胎盘系列产品联产工艺包括以下工艺步骤：

A、取新鲜猪胎盘及产仔猪血，去除胎膜和脐带，加等重量的浓度为1-6％的氯化钠盐水浸渍，粉碎，过滤，分别收集滤液(I)和滤渣(I)；

B、将滤液离心，收集上清液(I)和红色沉淀，将红色沉淀加等体积去离子水，搅拌，使红血球充分溶血，然后按体积加硫酸铵至饱和度50-60％，搅拌、静置，离心，依次加入离心液体积0.15倍的乙醇、0.08倍的氯仿，搅拌，静置，离心，收集离心液，水浴加热至60-65度，保温10-15分钟，离心，收集离心液，经超滤脱盐即得SOD粗品溶液；

C、将上清液(I)按体积加硫酸铵至饱和度50-60％，待硫酸铵完全融解后，静置2小时，过滤或离心，收集沉淀透析脱盐即得免疫球蛋白粗品溶液，收集滤液(II)；

D、将滤液(II)通过截留分子量10000的超滤装置系统，分别收集截留液和透析液；

G、将D步骤中的透析液进一步超滤、纯化处理即得猪胎盘免疫活性肽，D步骤中的截留液为胎盘蛋白液，经加热变性脱盐处理即得胎盘蛋白粉；

H、将A步骤中的滤渣(I)加2-3倍的去离子水，调PH值8.0-8.5，按每公斤滤渣(I)加胰蛋白酶2克于反应液中，水浴加热至40-50度，保温，酶消化48小时，过滤或离心，收集滤液加入三氯醋酸沉淀杂蛋白，搅拌均匀，立即离心，分别收集上清液和沉淀物，将上清液用2倍体积的95％乙醇进行沉淀、透析、纯化即得脂多糖溶液，收集沉淀物加等重量水，加热煮沸使蛋白变性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盘蛋白粉。

在本发明中，所述新鲜猪胎盘为产后24-48小时内的猪胎盘和母猪产血。A步骤中所述过滤过程使用的滤网目数为20-60。

由上述工艺制备的免疫球蛋白、免疫活性肽、SOD等粗品均可根椐市场需求通过超滤、层析、冷冻干燥进一步纯化成精品。整个工艺中所用有机溶剂废液均可蒸馏回收。

在本发明中，所述离心时掌握的时间为10-20分钟，转速每分3000-4000转。

本发明所依据的技术原理和创新点：

1、猪胎盘(含产仔猪血)中富含免疫球蛋白、SOD、多肽、脂多糖等活性成份，依据它们具有不同的结构、分子量、等电点、理化特性、生物活性等，应用盐溶、盐析、层析、超滤、等现代生化技术和生物集成技术，制定出适合工业化生产的联产工艺。该联产工艺未见同类专利报导。

2、该工艺采用传统工艺与现代工艺相结合，通过联产生产出五种产品，不仅使胎盘资源得到充分利用，而且可以大大降低生产成本，提高经济效益。

3、本发明工艺对提取5种产品后的废液和废渣，采取加热变性、脱盐、干燥处理制成优质的动物蛋白，可以说变废为宝，有效解决了废料的排放问题。做到了绿色环保。

4、本发明工艺对猪胎盘原料处理采取常温下用浓盐水浸渍、粉碎的方法，可防止在采集和运输过程中原料腐败和有效成分失活等问题。与目前许多专利报导的低温细胞破壁技术处理法相比，使原料收集更方便，成本更低，可操作性更强。。

5、主要活性成分在提取、纯化过程中，本发明工艺采用分级盐析与层析相结合，超滤与透析相结合，简易设备与现代设备相结合，把细胞分离技术、沉淀技术、膜分离技术、凝胶过滤层析等技术进行科学合理的系统组合，形成一套独特的生产工艺流程。与目前许多专利报导的低温超声波高压蛋白裂解法、膜分离法、超临界二氧化碳提取法等相比，具有成本低，投料量大，更适合工业化、规模生产的特点。

附图说明

附图为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

本发明以下结合附图将具体操作步骤做进一步描述：

1、收集母猪产后24小时内的新鲜胎盘(含产仔猪血)，称重。剪开胎膜和脐带，加等重量体积的2％的氯化钠水浸渍约1小时，用绞肉机粉碎，再浸渍约1小时以上，粗滤(20目)，分别收集滤液(I)和滤渣(I)。

2、将滤液离心(3000转/分)20分钟，收集上清液(I)和红色沉淀。将红色沉淀加等体积去离子水，搅拌30分，使红血球充分溶血，然后按体积加硫酸铵至饱和度50％，搅拌30分，静置2小时，离心。量取离心上清液的体积，依次加入0.15倍体积的乙醇，0.08倍体积的氯仿，边加边搅拌，加完后再搅拌30分钟，静置2h，离心，收集离心液，水浴加热至60度，保温10分钟左右，离心，收集离心液，经超滤脱盐即得SOD粗品溶液；并测其活性。收集所有离心沉淀加热变性，水洗脱盐烘干即为动物蛋白粉。

3、将上清液(I)按体积加硫酸铵至50％饱和度，待硫酸铵完全溶解后，，静置2小时以上，过滤(300-400目)，分别收集沉淀和滤液(II)。沉淀装透析袋用水透析脱盐即得免疫球蛋白粗品溶液。

4、将滤液(II)通过截留分子量1万的超滤装置系统进行超滤脱盐、浓缩，分别收集截留液和透析液。透析液即为猪胎盘活性肽粗品。

5、将截留液经加热变性、脱盐、真空干燥处理即得胎盘蛋白粉。

6、将滤渣(I)加2倍的去离子水，用氢氧化钠调PH值8.0，按每公斤滤渣(I)加胰蛋白酶2克(1∶200的消化力)于反应液中，水浴加热至40度，保温、消化48小时，离心。收集离心液加入三氯醋酸，搅拌均匀，立即离心，分别收集上清液和沉淀物。将上清液用2倍体积的95％乙醇进行沉淀处理，透析纯化即得脂多糖溶液。收集沉淀物加等重量水，加热使蛋白变性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盘蛋白粉。

7、精制纯化：由上述工艺制备的免疫球蛋白、免疫活性肽、SOD等粗品均可根椐市场需求通过超滤浓缩、亲和层析和分子筛层析纯化、冷冻干燥进一步制成精品。整个工艺中所用有机溶剂废液均可蒸馏回收再利用。

Claims (3)

1.一种从猪胎盘中提取多种生物活性物质的联产工艺，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、以新鲜猪胎盘及产仔猪血为原料，去除胎膜和脐带，加等重量的浓度为1-6％的氯化钠盐水浸渍，粉碎，过滤，分别收集滤液和滤渣；

B、将滤液离心，收集上清液和红色沉淀，将红色沉淀加等体积去离子水，搅拌，使红血球充分溶血，然后按体积加硫酸铵至饱和度50-60％，搅拌、静置、离心，量取离心上清液的体积，依次加入0.15倍体积的乙醇、0.08倍体积的氯仿，搅拌、静置、离心，收集离心液，水浴加热至60-65度，保温10-15分钟，离心，收集离心液，经超滤脱盐即得SOD粗品溶液；

C、将步骤B所收集的上清液按体积加硫酸铵至饱和度50-60％，待硫酸铵完全溶解后，静置2小时，过滤，收集滤液和沉淀，将沉淀透析脱盐即得免疫球蛋白粗品溶液；

D、将步骤C所收集的滤液通过截留分子量10000的超滤装置系统，分别收集截留液和透析液；

E、将D步骤中的透析液进一步超滤、纯化处理即得猪胎盘免疫活性肽，D步骤中的截留液为胎盘蛋白液，经加热变性脱盐处理即得胎盘蛋白粉；

F、将A步骤中的滤渣加2-3倍的去离子水，调PH值8.0-8.5，按每公斤滤渣加胰蛋白酶2克于反应液中，水浴加热至40-50度，保温，酶消化48小时，过滤，收集滤液加入三氯醋酸沉淀杂蛋白，搅拌均匀，立即离心，分别收集上清液和沉淀物，将上清液用2倍体积的95％乙醇进行沉淀、透析、纯化即得脂多糖溶液，所收集的沉淀物加等重量水，加热煮沸使蛋白变性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盘蛋白粉。

2.根据权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：所述新鲜猪胎盘及产仔猪血为产后24-48小时内的猪胎盘和母猪产血。

3.根据权利要求1所述的联产工艺，其特征在于：A步骤中的过滤过程使用的滤网目数为20-60。

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