CN103275943B - 从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶的方法，步骤包括新鲜猪脾脏冷冻处理后，再经切碎、磨浆浸提、过滤、硫酸铵分级沉淀、IDA琼脂糖介质吸附、清洗杂蛋白、洗脱、脱盐、浓缩、冷冻干燥获得SOD纯品。本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从猪脾脏中高效回收超氧化物歧化酶的目的。
Description
技术领域
本发明涉及从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase，SOD)的方法，是一种从猪脾脏中制备超氧化物歧化酶的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称 SOD）别名肝蛋白、奥谷蛋白，是一种广泛存在于各种生物体内的金属酶。SOD 是活性氧清除反应过程中第一个发挥抗氧化作用的酶，能够特异性地清除生物体产生的超氧化物阴离子自由基它能催化超氧自由基 O2-转变为 H2O2和O2，对体内自由基引起的各种损伤具有清除和保护作用。临床上用于骨性关节炎、类风湿性关节炎、放射与化疗、烧伤、家族性肌萎缩性侧索硬化等方面的治疗。此外在抗辐射、抗肿瘤和预防衰老等多方面研究发现，SOD与多种疾病的预防与治疗有着密切关系。SOD的临床治疗价值正在不断地被人们所认识，已广泛应用于保健品、食品添加剂及化妆品等领域。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）自1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。自从 McCord 等人首先从牛的红细胞中提取SOD以来，我国学者已经从牛血、猪血、鸭血、猪肝、小白菜、人血红细胞及羊血等物质中纯化出Cu/Zn型SOD。其提取纯化的方法均是在McCord和 Fridovich法的基础上加以改进而来的。文献表明，由动物体中提取纯化的Cu/Zn-SOD，其酶比活明显高于从小白菜叶细胞溶质和叶绿体中纯化的Cu/Zn-SOD。
目前，SOD生产厂家最常用的提取SOD方法为使用有机溶剂萃取SOD，该方法处理量比较小，生产成本高，而且有机溶剂容易污染环境和极易对生产员工身体造成伤害，无法大规模生产。另外，用动物血液提取SOD，原料的前处理和保存受到很大的限制，不易规模化生产，致使SOD产品价格居高不下。到目前为止，国内外尚无从动物脾脏提取SOD的生产企业，也未见相关报道。为此，我们开发了从动物脾脏提取SOD的工艺方法，本工艺不使用有机溶剂，无加热过程，大大简化了生产工艺，防止了环境污染，而且脾脏原料易得，易于收购保藏，提取的SOD纯度高，收率可达98%以上。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本低廉，高效从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法。
本发明的从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下步骤 ：
①、屠宰猪立即采取新鲜脾脏，尽量剔除脂肪和结缔组织，进行-20℃冷冻保藏；
②、用切碎机和绞肉机粉碎冷冻猪脾脏，加入5-10倍体积的水，搅拌后，再用骨泥磨磨浆，搅拌浸提过夜(12-24小时)；
③、用卧式离心机，除去颗粒杂质，再用板框过滤机过滤，收集澄清液体；
④、加入30%饱和度的硫酸铵搅拌6小时，板框过滤，收集澄清液体，再补加硫酸铵到60%饱和度，搅拌6小时，板框过滤，收集沉淀。
⑤、沉淀加5-10倍体积的10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0），过滤去除絮状物，收集澄清液体。
⑥、金属琼脂糖介质用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡2个柱体积后，使步骤⑤所得澄清液缓慢通过金属琼脂糖介质柱或与金属琼脂糖介质混合，金属琼脂糖介质再用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）加150毫摩尔氯化钠洗涤3-5个介质体积，以便去除杂蛋白。
⑦、用150毫摩尔柠檬酸钠（pH4.5）洗脱10-20个介质体积，收集洗脱液（洗脱液中含有SOD）；金属琼脂糖介质再用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡2个介质体积后，进行下一轮纯化用（可重复使用10次左右，10次以后介质需要再生处理，以恢复介质吸附SOD的能力）。
⑧、用5摩尔氢氧化钠液调洗脱液pH值到7.5，加入铜盐溶液，至铜离子终浓度为 1-200毫摩尔，用板框过滤机过滤除沉淀，再用3000道尔顿的超滤膜和去离子水清洗SOD脱盐并浓缩到1/50体积，加1摩尔的DTT(二硫苏糖醇，为还原剂)至终浓度0.1摩尔，再用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
本发明中，吸附SOD用的金属琼脂糖介质，如Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin等都适用，由于IDA琼脂糖介质具有良好的吸附效果和再生效果，而且价格相对便宜，优选IDA介质为吸附剂。金属琼脂糖介质是指用二价金属盐溶液与Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin混合，使二价金属离子螯合于Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin上，再用去离子水清洗介质，除去未结合的多余金属离子。金属盐溶液可以是二价铜盐溶液、镍盐溶液、锌盐溶液、锰盐溶液、铁盐溶液、钙盐溶液等，包括硫酸铜溶液，氯化铜溶液、硝酸铜溶液、硫酸镍溶液，氯化镍溶液、硝酸镍溶液、硫酸锌溶液，氯化锌溶液、硝酸锌溶液、硫酸锰溶液，氯化锰溶液、硝酸锰溶液、硫酸亚铁溶液，氯化亚铁溶液、硝酸亚铁溶液、硫酸钙溶液，氯化钙溶液、硝酸钙溶液等。金属琼脂糖介质的作用是亲和吸附超氧化物歧化酶，除去杂蛋白，获得高纯度的SOD。由于用铜离子制备的介质柱具有良好的吸附效果和再生效果，而且价格相对便宜，优选铜离子介质作为吸附SOD的层析介质。
本发明中的铜-IDA琼脂糖介质制备是按下述方法制备的：购买的镍-IDA琼脂糖介质为生产厂家已经螯合了镍离子的介质，呈绿色，并含有20%乙醇，需要除去乙醇和更换铜离子。首先，用去离子水清洗镍-IDA琼脂糖介质除去乙醇，再加介质二倍体积的0.5摩尔的EDTA二钠溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质不含镍离子，色泽为白色。然后，加入介质二倍体积的0.2摩尔的氯化铜溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质便会螯合有铜离子，色泽为蓝色。
本发明平衡铜-IDA琼脂糖介质是向铜-IDA琼脂糖介质中加入10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）溶液，用量为介质体积的2倍，浸泡1小时，用200目筛过滤去除液体沥干即可。
本发明中，柠檬酸钠盐能够夺取结合于介质上的二价金属离子，以便洗脱与二价离子结合的超氧化物歧化酶，柠檬酸钠盐亦可以用醋酸钠或EDTA二钠盐等替代。
本发明中铜-IDA琼脂糖介质连续使用10次以上，结合SOD的量会明显下降，铜-IDA琼脂糖介质纯化效率降低，需要再生处理，以便恢复铜-IDA琼脂糖介质的的纯化效率和性能。本发明中的铜-IDA琼脂糖介质再生处理是按下述方法实现的：首先，加入介质二倍体积的0.5摩尔的EDTA二钠溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质由于不含铜离子，色泽变为白色。然后，再加入介质二倍体积的0.2摩尔的氯化铜溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体沥干，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质便会重新螯合铜离子，色泽恢复蓝色。
本发明中，步骤⑧所述的铜盐溶液可以是硫酸铜溶液，氯化铜溶液或硝酸铜溶液等。
本发明中，步骤⑧所述的超滤过程包括浓缩和脱盐，步骤如下：先用超滤膜浓缩从介质上洗脱下来的SOD溶液到1/10的体积；然后加水稀释到原体积，再进行超滤膜浓缩，重复5次便可达到脱盐的目的；脱盐后的浓缩液加入还原剂DTT，至DTT终浓度为0.01-1mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩，至SOD浓度达到50-200毫克/毫升；上述的超滤膜为截留分子量在1000-10000之间的超滤膜。
所述还原剂可为DTT、还原型谷胱甘肽、维生素C或beta-巯基乙醇等。
本发明中的金属琼脂糖介质吸附处理方法有两种，一种就是常用的柱层析方法，该方法需要把金属琼脂糖介质预先装柱，才能使用，而且使用几次后需要重新装柱才能恢复通量，操作复杂，对操作人员技术要求较高；另一种方法不装柱，直接把铜-IDA琼脂糖介质倒入 SOD 粗品溶液中吸附SOD蛋白，然后回收介质，该方法通量大，生产周期短，重复性高，操作简单方便，便于掌握。
本发明调节超氧化物歧化酶(SOD)粗品溶液pH到8.0，即为金属琼脂糖介质吸附最佳pH值和Tris-Cl缓冲液最适宜缓冲能力，使SOD在铜-IDA琼脂糖介质上吸附力较强，最大化吸附SOD，这样使得铜-IDA琼脂糖介质吸附的通量大大增加，操作更简单，使SOD产量达日产公斤级规模。
本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从猪脾脏中高效回收SOD蛋白资源。离心和过滤所得到的残渣由于不含有任何有害物质，高温干燥后可作为动物蛋白饲料。所得硫酸铵的液体经脱水后可回收利用，作为化肥使用，可达到综合利用的效果，无浪费。
附图说明
图1是本发明产品制备工艺流程图。
图2是本发明SDS-PAGE电泳图。图中的M为蛋白质标准分子量Marker；S为纯化的SOD产品SDS-PAGE电泳，其中的Mn/Fe型SOD分子量为24.5KD，Cu/Zn型SOD单体分子量为15.8KD。
具体实施方式
结合附图1，对本发明的从猪脾脏中提取超氧化物歧化酶，实现了工业生产的目的，为提取超氧化物歧化酶技术方案作进一步说明：
实施例 1
取屠宰场新鲜猪脾脏10kg，切碎，加50升去离子水，用胶体磨磨浆，5000转离心10分钟，再用滤纸过滤，得清液60升，加入固体硫酸铵10.5公斤（达30%饱和度），25℃以下搅拌6小时，过滤除净沉淀，上清液再补加硫酸铵11.88公斤（达60%饱和度），过滤得沉淀。沉淀加20升去离子水溶解，再加2摩尔的Tris-Cl（pH8.0）10毫升，使溶液含10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0），用滤纸过滤，得透明液体。透明液体加入5升用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡好的铜-IDA琼脂糖介质，缓慢搅拌（50转/分钟）2小时，停止搅拌，静置1小时后，200目筛过滤，得吸附有SOD的介质，用10升含150毫摩尔氯化钠的10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0）缓冲液洗涤介质3次，除净杂蛋白，得吸附了SOD的铜-IDA琼脂糖介质。向吸附了SOD的介质加入20升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5），搅拌1小时，200目筛过滤，收集液体，该介质再用10升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5）洗脱SOD蛋白一次，合并两次洗脱液，共得30升含SOD溶液，加入氯化铜使溶液使铜离子浓度为200毫摩尔，调pH7.5，用滤纸过滤，去除杂质，收集滤液。滤液用截留分子量3000的超滤膜超滤浓缩，浓缩到5升，再加入30升去离子水，稀释浓缩液，反复4次，最后浓缩到2升SOD浓缩液，加1摩尔的DTT至DTT终浓度0.1豪摩尔，冷冻干燥得SOD纯品20.1克，经SDS-PAGE胶电泳确定为15.8KD的一条电泳带（附图2），酶比活为5000U/毫克。
实施例 2
取冷冻猪脾脏100kg，切碎，加500升去离子水，用胶体磨磨浆，用卧式离心机离心除去粗杂质，再用小型板框过滤机澄清过滤，得清液约600升，加入固体硫酸铵105公斤（达30%饱和度），25℃以下搅拌6小时，用小型板框过滤机过滤除净沉淀，上清液再补加硫酸铵118.8公斤（达60%饱和度），用小型板框过滤机过滤得沉淀。沉淀加200升去离子水溶解，再加2摩尔的Tris-Cl（pH8.0）100毫升，使溶液含10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0），用小型板框过滤机过滤，得透明液体。透明液体加入25升用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡好的铜-IDA琼脂糖介质，缓慢搅拌（30转/分钟）2小时，停止搅拌，静置1小时后，用200目筛过滤，得吸附了SOD铜-IDA琼脂糖介质，用50升含150毫摩尔氯化钠的10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0）缓冲液洗涤介质3次，除净杂蛋白。除杂蛋白的吸附SOD介质再加入100升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5），搅拌1小时，200目筛过滤，收集液体。介质再用50升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5）洗脱SOD蛋白一次，两次洗脱液合并共得150升含SOD溶液，加入氯化铜使溶液使铜离子浓度为200毫摩尔，调pH7.5，用小型板框过滤机过滤，收集滤液。滤液用截留分子量 3000 的超滤膜超滤浓缩，浓缩到15升，再加入100升去离子水，稀释浓缩液，反复4次，最后浓缩到10升，加1摩尔的DTT至终浓度0.1摩尔， 冷冻干燥得SOD纯品203克，经SDS-PAGE胶电泳确定为15.8KD的一条电泳带（附图2），酶比活为5060U/毫克。
实施例 3
取冷冻猪脾脏500kg，切碎，加2.5吨去离子水，用胶体磨磨浆，5000转离心10分钟，用4㎡板框过滤机过滤，得清液约3000升，加入固体硫酸铵528公斤（达30%饱和度），25℃以下搅拌6小时，用4㎡板框过滤机过滤除净沉淀，上清液在补加硫酸铵594公斤（达60%饱和度），用4㎡板框过滤机过滤得沉淀。沉淀加500升去离子水溶解，再加2摩尔的Tris-Cl（pH8.0）500毫升，使溶液含10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0），用小型板框过滤机过滤，得透明液体。透明液体加入50升用10毫摩尔的Tris-Cl（pH8.0）平衡好的铜-IDA琼脂糖介质，缓慢搅拌（30转/分钟）2小时，停止搅拌，静置1小时后，用200目筛过滤，得吸附了SOD铜-IDA琼脂糖介质，用100升含150毫摩尔氯化钠的10豪摩尔的Tris-Cl（pH8.0）缓冲液洗涤介质3次，除净杂蛋白。除杂蛋白的吸附SOD介质再加入200升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5），搅拌1小时，200目筛过滤，收集液体。介质再用200升150摩尔柠檬酸钠（pH4.5）洗脱SOD蛋白一次，两次洗脱液合并共得400升含SOD溶液，加入氯化铜使溶液铜离子浓度为200毫摩尔，调pH7.5，用小型板框过滤机过滤，收集滤液。滤液用截留分子量 3000 的超滤膜超滤浓缩，浓缩到50升，再加入300升去离子水，稀释浓缩液，反复4次，最后浓缩到25升，加1摩尔的DTT至终浓度0.1摩尔，冷冻干燥得SOD纯品2.13公斤，经SDS-PAGE胶电泳确定为15.8KD的一条电泳带（附图2），酶比活为5040U/毫克。
Claims (10)
1.一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、新鲜冷冻猪脾脏，切碎后加入5-10倍体积的去离子水，搅拌混匀后，磨浆，过滤得含超氧化物歧化酶的澄清液；
2)、含超氧化物歧化酶的澄清液用30％和60％饱和度的硫酸铵分级沉淀，制备超氧化物歧化酶的粗制品；
3)、在超氧化物歧化酶粗提品中加入2摩尔pH8.0的Tris-Cl溶液，至溶液中含10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl，再经过铜-IDA琼脂糖介质吸附超氧化物歧化酶，经洗杂、洗脱、脱盐、浓缩、冷冻干燥过程制备超氧化物歧化酶冻干粉；
上述的脱盐、浓缩步骤如下：先进行超滤膜浓缩从介质上洗脱下来的SOD溶液到1/10的体积；然后加水稀释到原体积，再进行超滤膜浓缩，重复4-5次便达到脱盐的目的；脱盐后的浓缩液加入还原剂DTT，至DTT终浓度为0.01-1mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩；上述的超滤膜为截留分子量在1000-10000之间的超滤膜。
2.根据权利要求1所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：
①、屠宰猪立即采取新鲜脾脏，尽量剔除脂肪和结缔组织，进行-20℃冷冻保藏；
②、用切碎机和绞肉机粉碎冷冻猪脾脏，加入5-10倍体积的水，搅拌后，再用骨泥磨磨浆，搅拌浸提过夜12-24小时；
③、用卧式离心机，除去颗粒杂质，再用板框过滤机过滤，收集澄清液体；
④、加入30％饱和度的硫酸铵搅拌6小时，板框过滤，收集澄清液体，再补加硫酸铵到60％饱和度，搅拌6小时，板框过滤，收集沉淀；
⑤、沉淀加5-10倍体积的10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl，过滤去除絮状物，收集澄清液体；
⑥、铜-IDA琼脂糖介质用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl平衡2个柱体积后，使步骤⑤所得澄清液缓慢通过铜-IDA琼脂糖介质柱或与铜-IDA琼脂糖介质混合，再用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl加150毫摩尔氯化钠洗涤3-5个介质体积，以便去除杂蛋白；
⑦、用150毫摩尔pH4.5的柠檬酸钠洗脱10-20个介质体积，收集洗脱液；铜-IDA琼脂糖介质再用10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl平衡2个介质体积后，进行下一轮纯化用，可重复使用10次左右，10次以后介质需要再生处理，以恢复介质吸附SOD的能力；
⑧、用5摩尔氢氧化钠液调洗脱液pH值到7.5，加入铜盐溶液，至铜离子终浓度为1-200毫摩尔，用板框过滤机过滤除沉淀，再用3000道尔顿的超滤膜和去离子水清洗SOD脱盐并浓缩到1/10体积，加1摩尔的DTT至终浓度0.1摩尔，所述DTT是还原剂二硫苏糖醇，再用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
3.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述吸附SOD用的铜-IDA琼脂糖介质是指用二价铜盐溶液与Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTA Resin混合，使二价铜离子螯合于Chelating Genarose FF、IDA琼脂糖介质、NTAResin上，再用去离子水清洗介质，除去未结合的多余铜离子。
4.根据权利要求1所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述铜-IDA琼脂糖介质制备是按下述方法制备的：购买的镍-IDA琼脂糖介质为生产厂家已经螯合了镍离子的介质，呈绿色，并含有20％乙醇，需要除去乙醇和更换铜离子，首先，用去离子水清洗镍-IDA琼脂糖介质除去乙醇，再加介质二倍体积的0.5摩尔的EDTA二钠溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质不含镍离子，色泽为白色。然后，加入介质二倍体积的0.2摩尔的氯化铜溶液浸泡介质2小时，用200目筛过滤除去液体，再用去离子水清洗介质5次，这时的介质便会螯合有铜离子，色泽为蓝色。
5.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述⑦步骤中平衡铜-IDA琼脂糖介质是向铜-IDA琼脂糖介质中加入10毫摩尔pH8.0的Tris-Cl溶液，用量为介质体积的2倍，浸泡1小时，用200目筛过滤去除液体沥干即可。
6.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述柠檬酸钠盐能够夺取结合于介质上的二价金属离子，以便洗脱与二价离子结合的超氧化物歧化酶，柠檬酸钠盐亦可以用醋酸钠或EDTA二钠盐替代。
7.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述步骤⑧所述的铜盐溶液是硫酸铜溶液，氯化铜溶液或硝酸铜溶液。
8.根据权利要求2所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述步骤⑧所述的超滤过程包括浓缩和脱盐，步骤如下：先用超滤膜浓缩从介质上洗脱下来的SOD溶液到1/10的体积；然后加水稀释到原体积，再进行超滤膜浓缩，重复5次便可达到脱盐的目的；脱盐后的浓缩液加入还原剂DTT，至DTT终浓度为0.01-1mM，不断加水稀释同时继续超滤膜浓缩，至SOD浓度达到50-200毫克/毫升；上述的超滤膜为截留分子量在1000-10000之间的超滤膜。
9.根据权利要求1所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述还原剂是DTT、还原型谷胱甘肽、维生素C或beta-巯基乙醇。
10.根据权利要求1所述的一种从猪脾脏提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述铜-IDA琼脂糖介质吸附处理方法有两种，一种是柱层析方法，该方法需要把铜-IDA琼脂糖介质预先装柱才能使用，而且使用几次后需要重新装柱才能恢复通量；另一种方法不装柱，直接把铜-IDA琼脂糖介质倒入SOD粗品溶液中吸附SOD蛋白，然后回收介质。
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