CN100558242C - 一种从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法，属于牛初乳中乳铁蛋白的工业化分离纯化技术领域。本发明是以牛初乳脱脂乳清为原料，采用酶法去除酪蛋白，膜分离技术和工业色谱技术相结合，从牛初乳中工业化分离纯度为90%以上的乳铁蛋白，涉及膜分离技术和工业色谱技术等现代生物集成技术在农产品深加工中的应用，本发明方法适合工业化规模应用，其优点是快速有效、成本适中、高纯度、高回收率。本发明对于促进乳制品的深加工及初乳资源的综合利用，提高我国人民特别是婴幼儿的健康水平，研究和开发功能性食品配料都具有重要的意义。
Description
技术领域
一种从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法，涉及膜分离技术和工业色谱技术等现代生物集成技术在农产品深加工中的应用，属于牛初乳中乳铁蛋白的工业化分离纯化技术领域。
背景技术
乳业界一般认为，乳牛分娩后7天内的乳汁称为牛初乳。初乳是一种非常特殊的乳，其化学组成和加工特性与普通乳汁有很大的差别。初乳色泽黄而浓稠，甚至带有少量血红色，具有特殊的乳腥味。初乳的乳固体含量高于常乳，其中球蛋白、白蛋白和无机盐含量特别高。初乳的酸度很高，热稳定性差。初乳中还可能含有大量的抗生素、农药及合成生长激素。由于这些特殊性质，初乳属于“异常乳”，美国食品及药物管理局(FDA)明确规定初乳不得掺入常乳加工，各国乳制品质量标准一般规定严禁使用初乳作为原料乳，绝大多数牧场均将初乳作为犊牛饲料或者废弃。
然而初乳含有多种具有生物活性功能的物质，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、活性肽、乳过氧化物酶、生长因子等，都具有特殊的生物活性功能。虽然，牛初乳中这些活性物质的含量略低于人初乳，但远高于其它食品。
近年来，初乳中的乳铁蛋白受到国内外学者的广泛关注。它是一种具有生物活性功能的糖蛋白，具有多种生物活性功能，如广谱抗菌活性、增强铁的传递和吸收、免疫调节作用、调节发炎反应、抗病毒作用和抑制脂肪氧化作用，可广泛应用于食品、医药和化妆品领域。
分离乳铁蛋白的方法主要有离子交换色谱法、金属螯合色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、免疫色谱法和超滤法。离子交换色谱法、金属螯合色谱法、疏水色谱法分离获得的乳铁蛋白纯度较高；但吸附容量小、效率低。亲和色谱法可实现一步分离，电泳分析表明其纯度极高，分离效果好，生物活性没有损失；但成本较高，工业化难度较大。免疫色谱法分离效果好，纯度高，抗体被固定后可重复使用；但柱的制备工艺复杂，抗体成本昂贵，难以实现工业化。超滤法处理量大，但产品的纯度较低。国内外普遍认为亲和色谱法是生产医药级乳铁蛋白最有效的方法之一，超滤法被用来生产食品级乳铁蛋白的潜力最大。
由此可见，虽然一些分离技术在实验室规模可以制得高纯度的乳铁蛋白，但处理量小，成本高昂，难以实现工业化；而超滤法产量大，但纯度低，因而阻碍了乳铁蛋白的推广应用。在工业化规模寻求一种成本适中、快速有效的方法，从牛初乳中分离出纯度较高的乳铁蛋白，是目前国内外乳品业亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速有效、成本适中、高纯度、高回收率，从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法。
本发明的技术方案：以牛初乳脱脂乳清为原料，采用酶法去除酪蛋白，膜分离技术和工业色谱技术相结合，从牛初乳中工业化分离纯度为90％以上的乳铁蛋白。工艺路线如图1所示。
1.酶法去除酪蛋白：以72h内分泌的牛初乳为原料，离心脱脂，采用皱胃酶酶法沉淀酪蛋白，乳清的澄清度好，减轻了蛋白质的共沉淀现象，有效地提高了乳清中乳铁蛋白的保留率，此法优于传统的盐酸沉淀法，不会造成环境污染。
在牛初乳脱脂乳清中，加入皱胃酶液，皱胃酶的活力为2000U/mL，添加量为100kg牛初乳脱脂乳清中加入该酶液50mL，加酶量控制在使初乳10-15min凝固为宜，将反应体系的pH调节至6.0，酶反应温度为40℃，初乳凝固后保温30min，离心去除酪蛋白后所得上清液即为酶法乳清。
2.预过滤：将所得酶法乳清通过囊式微滤器澄清，去除残留的酪蛋白胶粒。经过三足式离心机去除酪蛋白沉淀后得到的酶法乳清中还残留大量的酪蛋白胶粒，因此很有必要对酶法乳清进行预过滤，这样可以减轻终端超滤堵塞，提高生产效率，延长后续分离(终端分离)中超滤膜的使用寿命。采用Pore公司苏州分公司生产的囊式微滤器，孔径为0.2μm。这种囊式微滤器是一种新型的滤芯与其塑料外壳合为一体的即开即用型的过滤器。不仅容污能力和截留效率强、开孔率高，而且可以随时更换滤芯，非常方便，死体积小，因此在长期的使用过程中，能够保持高流速和高通量。为了平衡截留效率和生产能力之间的关系，最大限度地降低预过滤成本，采用囊式过滤是最适宜的。
3.分步超滤：采用板式膜组件和醋酸纤维素膜材料、以错流方式操作的超滤系统，首先选用截留相对分子质量为150kDa的超滤膜进行第一步超滤，收集透过液，再选用截留相对分子质量为10kDa的超滤膜进行第二步超滤，超滤工艺参数为：切向流速3-4L/min，临界操作压力0.10-0.15MPa，操作温度45-55℃，截留浓缩液即为乳铁蛋白粗制品，乳铁蛋白的纯度约为30％。
4.工业色谱纯化：选用SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换剂，装柱，柱尺寸为φ7.0×20cm，以pH值为7.7～8.0、10mmol/L的磷酸盐为起始平衡缓冲液，截留浓缩液上样，洗脱速度2L/h，先采用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱其它组分，至洗脱吸收值回复至基线水平，再采用1mol/L的NaCl溶液洗脱乳铁蛋白组分，至洗脱吸收值再次回复至基线水平作为洗脱结束，收集该乳铁蛋白组分的洗脱液，经超滤脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到乳铁蛋白精制品。经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定，所得乳铁蛋白组分显示为单一区带，相对分子质量为80,400Da。生产的乳铁蛋白精制品中乳铁蛋白的纯度和回收率分别为94.20％和75.45％。
本发明的有益效果：随着我国人民生活水平的提高和健康意识的增强，特别是对牛乳营养价值的认识，乳制品工业得到了迅猛的发展，同时也造成了初乳产量的增加。我国每年废弃的初乳资源超过18万吨。国内外对母乳喂养的益处已达成共识。但母乳毕竟有限，人类自然要寻找其它的初乳资源。综合考虑伦理、宗教、消费习惯以及工业基础等因素，人们转而开发牛初乳中的功能性成分是一个必然趋势，因为它是迄今为止最为现实的初乳资源。
乳铁蛋白是一种存在于外分泌液(如乳)中的具有生物活性功能的糖蛋白。乳铁蛋白的含量在初乳中最为丰富。它具有多种生物活性功能，如广谱抗菌活性、增强铁的传递和吸收、免疫调节作用、调节发炎反应、抗病毒作用和抑制脂肪氧化作用，被公认为一种重要的功能性成分或营养功能因子。乳铁蛋白主要可应用于以下三个方面：1.食品领域，开发为天然的防腐剂和抗菌剂；作为功能性成分添加到各类食品中，例如乳制品、运动营养产品、速溶饮料、免疫制品及口香糖等。2.医药领域，制成天然抗菌药物或高效补铁药剂。3.其它领域，作为饲料添加剂和生长促进因子来提高初生动物的身体机能，用于化妆品中增强抗衰老的功效。
规模化生产乳铁蛋白是乳铁蛋白研究中迫切需要解决的问题。目前，虽然一些分离技术在实验室规模可以制得高纯度的乳铁蛋白，但处理量小，成本高昂，难以实现工业化，因而阻碍了乳铁蛋白的推广应用。本发明正是针对以上技术难点，在工业化规模发明了一种成本适中、快速有效的方法，从牛初乳中分离出纯度较高的乳铁蛋白的方法。
本发明对于促进乳制品的深加工及废弃资源的综合利用，提高我国人民特别是婴幼儿的健康水平，研究和开发功能性食品配料都具有重要的意义。
附图说明
图1从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的工艺流程示意图。
具体实施方式
实施例1
按说明书上述工艺方法分离纯化乳铁蛋白。脱脂初乳量：100L，乳铁蛋白含量1.50g/L，酶法去除酪蛋白后得到酶法乳清90L，两步膜分离后得到浓缩液18L，乳铁蛋白浓度6.91g/L，乳铁蛋白回收率(以初乳中乳铁蛋白含量计)82.92％，浓缩液中乳铁蛋白相对于浓缩液中总蛋白的纯度为31.40％。浓缩液经色谱分离、脱盐浓缩及冷冻干燥后得到乳铁蛋白精制品113.18g，纯度为94.20％，乳铁蛋白回收率(以初乳中乳铁蛋白含量计)为71.08％。
实施例2
操作同实施例1，脱脂初乳量：300L，乳铁蛋白含量1.48g/L，酶法去除酪蛋白后得到酶法乳清272L，两步膜分离后得到浓缩液53L，乳铁蛋白浓度7.05g/L，乳铁蛋白回收率(以初乳中乳铁蛋白含量计)84.16％，浓缩液中乳铁蛋白相对于浓缩液中总蛋白的纯度为32.91％。浓缩液经色谱分离、脱盐浓缩及冷冻干燥后得到乳铁蛋白精制品350.35g，纯度为95.92％，乳铁蛋白回收率(以初乳中乳铁蛋白含量计)为75.72％。
Claims (1)
1.一种从牛初乳中工业化分离纯化乳铁蛋白的方法，其特征是以牛初乳脱脂乳清为原料，采用酶法去除酪蛋白，膜分离技术和工业色谱技术相结合，从牛初乳中工业化分离纯度为90％以上的乳铁蛋白；
(1)酶法去除酪蛋白：在牛初乳脱脂乳清中，加入皱胃酶液，皱胃酶的活力为2000U/mL，添加量为100kg牛初乳脱脂乳清中加入该酶液50mL，加酶量控制在使初乳10-15min凝固，将反应体系的pH调节至6.0，酶反应温度为40℃，初乳凝固后保温30min，离心去除酪蛋白后所得上清液即为酶法乳清；
(2)预过滤：将所得酶法乳清通过囊式微滤器澄清，去除残留的酪蛋白胶粒；
(3)分步超滤：采用板式膜组件和醋酸纤维素膜材料、以错流方式操作的超滤系统，首先选用截留相对分子质量为150kDa的超滤膜进行第一步超滤，收集透过液，再选用截留相对分子质量为10kDa的超滤膜进行第二步超滤，超滤工艺参数为：切向流速3-4L/min，临界操作压力0.10-0.15MPa，操作温度45-55℃，截留浓缩液即为乳铁蛋白粗制品；
(4)工业色谱纯化：选用SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换剂，装柱，柱尺寸为φ7.0×20cm，以pH值为7.7～8.0、10mmol/L的磷酸盐为起始平衡缓冲液，截留浓缩液上样，洗脱速度2L/h，先采用0.5mol/L的NaCl溶液洗脱其它组分，至洗脱吸收值回复至基线水平，再采用1mol/L的NaCl溶液洗脱乳铁蛋白组分，至洗脱吸收值再次回复至基线水平作为洗脱结束，收集该乳铁蛋白组分的洗脱液，经超滤脱盐、浓缩和冷冻干燥，得到乳铁蛋白精制品。
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