CN106589103A - 一种蛋白琥珀酸铁的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，包括如下步骤：(1)溶解、酰化；(2)膜过滤；(3)膜分离；(4)载铁：(5)膜过滤；(6)膜分离；(7)精滤、沉淀、干燥。本发明通过对制备工艺中关键的杂质分离工艺步骤进行改进，与现有技术相比能够有效简化重复且繁琐的制备工艺步骤，大大减小制备过程中微生物污染的风险，有效去除酰化过程的副产物丁二酸和载铁过程中未参与反应的三价铁离子，并且生产过程可连续、工艺时间短，能大大提高生产效率。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及一种蛋白琥珀酸铁的制备方法。
背景技术
目前伴随着人民生活水平的提高，广大人民群众对身体健康日益重视。为了预防和控制缺铁性贫血，采取了多种途径，如膳食途径、食物强化等，也取得了很好的效果。然而对孕妇、儿童以及其他严重缺铁性贫血等病人，药物治疗就显得尤为必需。
早期治疗方法多以口服无机铁盐为治疗手段，最常见的为硫酸亚铁。无机金属铁盐被人体摄入后，在酸性胃液介质中易被电离成为金属阳离子，然后进入小肠被人体吸收利用。而小肠壁对带有正电荷的金属离子有一定的排斥作用，导致部分金属离子不仅不易被吸收，还会刺激胃肠，引起腹泻。不同金属元素之间的拮抗作用也会使吸收进入体内的金属元素利用率和沉积效率受到限制，导致其生物有效性降低。另有文献报道亚铁离子还能催化自由基，具有细胞毒性。
由于无机铁盐的种种弊端，人们开始寻找新的补铁药物。Saltman等研究人员通过一系列研究，提出了铁的吸收转运机制。他们认为在动物腔肠内，不论是三价还是二价的铁，都必须与内源或外源配位体结合形成络合物，再以此形式吸收并进一步转运。考虑到药品安全性，合成补铁药物的配位体最好是内源性配位体。研究人员继而把目光投向了铁的螯合物。随后产生了大量的小分子有机铁配合物，但是时至至今，这类物质还是以保健食品或添加剂在使用，国内仍然未见物质为主药的真正意义上的药品。
70年代后期，国外开始研究开发大分子的补铁药物，至今，大分子的补铁药物研制成功并上市的并不多见，以多糖铁配合物和蛋白铁配合物为主。
现有蛋白琥珀酸铁(即，IPS)专利(申请公布号CN 102838667、申请公布号CN104402984)中提供了的制备方法均包括如下步骤为：溶解酪蛋白、酰化(酸沉、离心、碱溶)、载铁(离心过滤、酸沉、离心、碱溶、酸沉、离心、碱溶、离心、精滤、酸沉、洗涤沉淀)、干燥。现有专利在制备蛋白琥珀酸铁过程中出现多次酸沉、离心、碱溶过程，酰化步骤中酸沉、离心、碱溶为除去酰化步骤中副产物丁二酸，载铁步骤中酸沉、离心、碱溶为除去游离铁。酸沉、离心、碱溶几步操作将蛋白琥珀酸铁从溶液状态变成悬浊液，通过离心的方式收集沉淀物，然后将沉淀物转移并再次溶解，过程耗时较长，且会多次出现。因此，现有技术在除去反应液中杂质过程中效率低、生产周期长；并且沉淀物转移过程中会暴露在外界环境中、与生产人员接触频繁，药品生产过程中微生物风险较高，给药品质量带来隐患；生产过程不连续，杂质不易监测。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其中通过对制备工艺中关键的杂质分离工艺步骤进行改进，与现有技术相比能够有效简化重复且繁琐的制备工艺步骤，大大减小制备过程中微生物污染的风险，有效去除酰化过程的副产物丁二酸和载铁过程中未参与反应的三价铁离子，并且生产过程可连续、工艺时间短，能大大提高生产效率。
为实现上述目的，按照本发明，提供了一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向酪蛋白溶液中加入丁二酸酐，并调节该酪蛋白溶液的pH值，使该酪蛋白溶液的pH值满足6.0～9.0，从而得到酰化液；
(2)调节所述步骤(1)得到的所述酰化液的pH值，使该酰化液的pH值满足5～12；接着，利用截留分子量为500kDa～1000kDa的超滤膜对该酰化液进行过滤，得到酰化液滤液；
(3)调节所述步骤(2)得到的所述酰化液滤液的pH值，使该酰化液滤液的pH值满足5.0～12.0；然后，利用截留分子量为100kDa～300kDa的超滤膜对所述酰化液滤液进行膜分离，弃去透过液，即得到酰化酪蛋白溶液；
(4)向所述步骤(3)得到的所述酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，调节pH值至6.0～9.0，接着离心过滤，保留滤液，即得到蛋白琥珀酸铁粗品溶液；
(5)调节所述步骤(4)得到的所述蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值，使该蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值满足5～12；接着，利用截留分子量为500kDa～1000kDa的超滤膜进行过滤，即得到蛋白琥珀酸铁粗品滤液；
(6)调节所述步骤(5)得到的所述蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值，使该蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值满足5.0～12.0；接着，使用截留分子量为100kDa～300kDa的超滤膜进行膜分离，弃去透过液，即得到蛋白琥珀酸铁溶液；
(7)对所述步骤(6)得到的所述蛋白琥珀酸铁溶液进行加酸反应，生成的沉淀即蛋白琥珀酸铁。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述酪蛋白溶液中酪蛋白的浓度为5％～20％；加入的所述丁二酸酐与酪蛋白的质量比为1:1～5；
所述步骤(4)中，向所述酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，是使酰化酪蛋白与FeCl3两者的质量比满足1:0.1～1；所述FeCl3溶液的浓度为1％～4％。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，调节所述酪蛋白溶液的pH值，具体是向所述酪蛋白溶液中加入氢氧化钠溶液，从而使该酪蛋白溶 液的pH值满足6.0～9.0。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，调节所述酰化液的pH值，具体是向该酰化液中加入氢氧化钠溶液；
所述步骤(2)中，利用所述超滤膜对该酰化液进行过滤时，所述超滤膜的膜内压力为0.2Mpa～0.4Mpa，优选为0.3Mpa；
优选的，所述酰化液的pH值为5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为800kDa。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，调节所述酰化液滤液的pH值，具体是向该酰化液滤液中加入氢氧化钠溶液；
利用所述超滤膜对所述酰化液滤液进行膜分离时，所述超滤膜的膜内压力不超过0.2Mpa；
优选的，所述酰化液滤液的pH值为8～10。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)中，所述调节pH值至6.0～9.0，是利用氢氧化钠溶液调节的。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(5)中，利用所述超滤膜进行过滤时，所述超滤膜的膜内压力为0.2Mpa～0.4Mpa，优选为0.3Mpa；
优选的，所述蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值为5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为800kDa。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(6)中，使用所述超滤膜进行膜分离时，所述超滤膜的膜内压力不超过0.2Mpa；
优选的，所述蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为200kDa。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，所述酰化酪蛋白溶液中丁二酸的浓度不超过0.1％；所述步骤(6)中，所述蛋白琥珀酸铁溶液中游离铁离子的浓度不超过0.1％。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(7)中，在对所述蛋白琥珀酸铁 溶液进行加酸反应之前，所述蛋白琥珀酸铁溶液还经过精滤处理；得到的所述蛋白琥珀酸铁，还经过水洗、以及干燥处理。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于该制备方法是在溶液状态高效率将杂质除去，从而制备得到蛋白琥珀酸铁，一方面能避免过多产生的微生物风险，提高生产效率，另一方面由于蛋白琥珀酸铁生产过程中的杂质为溶解状态，能够实现杂质的在线监测。通过监测中间反应产物中杂质含量，如酰化酪蛋白溶液中丁二酸的浓度(允许的最大浓度值可根据目标蛋白琥珀酸铁产品的纯度要求灵活调整，例如可优选为不超过0.1％)、以及蛋白琥珀酸铁溶液中游离铁离子的浓度(允许的最大浓度值可根据目标蛋白琥珀酸铁产品的纯度要求灵活调整，例如可优选为不超过0.1％)，能有效确保最终制得的蛋白琥珀酸铁其杂质含量低，更利于发挥蛋白琥珀酸铁的药用价值。
本发明的蛋白琥珀酸铁制备方法使用等容膜分离的方式去除酰化过程的副产物丁二酸和载铁过程中未参与反应的三价铁离子。在研发过程中，发现超滤膜截留分子量对蛋白琥珀酸铁制备有着重要影响，通过使用不同截留分子量的超滤膜对蛋白琥珀酸铁制备过程中的酰化蛋白溶液和蛋白琥珀酸铁粗品溶液进行超滤，结果发现膜通量下降很快，至无透过液。另一方面，酰化蛋白溶液和蛋白琥珀酸铁粗品溶液经过精滤或高速离心后膜通量下降速度变慢，但仍然不能满足实验要求，因此本发明采用膜过滤的方式对酰化蛋白溶液和蛋白琥珀酸铁粗品溶液进行处理，并对超滤膜孔径进行筛选，对溶液pH、膜内压力进行研究，找到一种在溶液状态高效率将杂质除去的蛋白琥珀酸铁制备方法。
本发明提供的蛋白琥珀酸铁酸铁的制备方法具有如下优点：
1、本发明的蛋白琥珀酸铁的制备方法生产过程连续、工艺时间短。
2、本发明的蛋白琥珀酸铁的制备方法生产过程中物料与生产人员、外界环境接触少，降低了药品生产过程中微生物风险。
此外，本发明通过控制各种反应原料的浓度及配比，将酪蛋白溶液中酪蛋白的浓度控制为5％～20％，丁二酸酐与酪蛋白质量比控制为1:1～5，酰化酪蛋白与FeCl3的质量比控制为1:0.1～1，FeCl3溶液的浓度控制为1％～4％，能有效控制蛋白琥珀酸铁制备反应的产率，进一步确保制得的蛋白琥珀酸铁的性能。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中蛋白琥珀酸铁膜法制备，具体包括如下步骤：
A、溶解、酰化：向酪蛋白溶液中加入丁二酸酐，使用氢氧化钠溶液保持pH在6.0～9.0，丁二酸酐添加完毕后，得酰化液。酪蛋白溶液中酪蛋白的浓度可以为5％～20％，加入的所述丁二酸酐与酪蛋白的质量比可以为1:1～5。
B、膜过滤：使用氢氧化钠溶液调节酰化液pH在5～12，再通过截留分子量在500KDa～1000KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.2～0.4Mpa，得酰化液滤液。
C、膜分离：使用氢氧化钠溶液调节酰化液滤液pH在5.0～12.0，使用截留分子量100KDa～300KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力不超过0.2Mpa，透过液弃去，监测酰化液中丁二酸的浓度，得酰化酪蛋白溶液。
D、载铁：向酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，氢氧化钠溶液调节pH至6.0～9.0，离心过滤，得蛋白琥珀酸铁粗品溶液。向酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，是使使酰化酪蛋白与FeCl3两者的质量比满足1:0.1～1，加入的FeCl3溶液的浓度可以为1％～4％。
E、膜过滤：使用氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品溶液pH在5～12，再通过截留分子量在500KDa～1000KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.2～0.4Mpa，得蛋白琥珀酸铁粗品滤液。
F、膜分离：使用氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品滤液pH在5.0～12.0，使用截留分子量100KDa～300KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力不超过0.2Mpa，透过液弃去，监测蛋白琥珀酸铁粗品滤液中铁离子的浓度，得蛋白琥珀酸铁溶液。
G、精滤、干燥：精滤，加酸沉淀，过滤出沉淀，水洗沉淀，干燥得蛋白琥珀酸铁。
其中，步骤B中使用氢氧化钠溶液调节pH在5～12，优选pH为5.5～7.5。
步骤B中使用的超滤膜的截留分子量在500KDa～1000KDa，优选为800KDa。
步骤B过程控制膜内压力不超过0.2～0.4Mpa，优选为0.3Mpa。
步骤C使用氢氧化钠溶液调节pH在5～12，优选pH为8～10。
步骤E中使用氢氧化钠溶液调节pH在5～12，优选pH为5.5～7.5。
步骤E中使用的超滤膜的截留分子量在500KDa～1000KDa，优选为800KDa。
步骤E过程控制膜内压力不超过0.2～0.4Mpa，优选为0.3Mpa。
步骤F使用氢氧化钠溶液调节pH在5～12，优选pH为5.5～7.5。
步骤F使用截留分子量100KDa～300KDa的超滤膜，超滤膜的截留分子量优选为200KDa。
具体实施例如下：
实施例1
溶解酰化：于500L反应釜中，加105L水及7.0kg酪蛋白，加入2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，加入丁二酸酐3.5kg，2mol/L 氢氧化钠溶液使溶液保持pH在6.0～9.0，丁二酸酐添加完毕后，得酰化液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液pH在6.3，再通过截留分子量在800KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.2Mpa，得酰化液滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液滤液pH在10.2，使用截留分子量200KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力0.2Mpa，透过液弃去，监测酰化液中丁二酸的浓度0.1％，得酰化酪蛋白溶液。
载铁：向酰化酪蛋白溶液中缓慢加入2％FeCl3溶液335L，反应中检测反应液pH，并使用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH在6.0～9.0，得蛋白琥珀酸铁粗品溶液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品溶液pH在6.5，再通过截留分子量在800KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.2Mpa，得蛋白琥珀酸铁粗品滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品滤液pH在9.5，使用截留分子量200KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力不超过0.2Mpa，透过液弃去，监测蛋白琥珀酸铁粗品滤液中铁离子的浓度为0.01％，得蛋白琥珀酸铁溶液。
精制：蛋白琥珀酸铁溶液过1.2um微孔滤膜，滤液中加入3mol/L盐酸溶液约2.3L，pH值至2.66，继续搅拌半小时，然后过滤，每次用水洗沉淀，收集沉淀，真空干燥，得干燥品6.6632kg，收率为95.12％，铁含量5.3wt％，游离铁含量0.05％。微生物检查，蛋白琥珀酸铁需氧菌总数小于100cfu/g、霉菌和酵母菌总数小于10cfu/g。
实施例2
溶解酰化：于500L反应釜中，加105L水及7.0kg酪蛋白，加入2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，加入丁二酸酐3.5kg，2mol/L氢氧化钠溶液使溶液保持pH在6.0～9.0，丁二酸酐添加完毕后，得酰化液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液pH在11.3，通过截留分子1000KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.4Mpa，得酰化液滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液滤液pH在5.5，使用截留分子量10W的超滤膜膜分离，控 制膜内压力0.1Mpa，透过液弃去，监测酰化液中丁二酸的浓度0.09％，得酰化酪蛋白溶液。
载铁：向酰化酪蛋白溶液中缓慢加入2％FeCl3溶液335L，反应中检测反应液pH，并使用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH在6.0～9.0，得蛋白琥珀酸铁粗品溶液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品溶液pH在10.9，通过截留分子量1000KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.4Mpa，得蛋白琥珀酸铁粗品滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品滤液pH在5.8，使用截留分子量100KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力不超过0.2Mpa，透过液弃去，监测蛋白琥珀酸铁粗品滤液中铁离子的浓度0.009％，得蛋白琥珀酸铁溶液。
精制：蛋白琥珀酸铁溶液过1.2um微孔滤膜，滤液中加入3mol/L盐酸溶液约2.0L，pH值至2.89，继续搅拌半小时，然后过滤，每次用水洗沉淀，收集沉淀，真空干燥，得干燥品6.8633kg，收率为98.05％，铁含量5.0wt％，游离铁含量0.06％。微生物检查，蛋白琥珀酸铁需氧菌总数小于100cfu/g、霉菌和酵母菌总数小于10cfu/g。
实施例3
溶解酰化：于500L反应釜中，加105L水及7.0kg酪蛋白，加入2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，加入丁二酸酐3.5kg，2mol/L氢氧化钠溶液使溶液保持pH在6.0～9.0，丁二酸酐添加完毕后，得酰化液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液pH在8.1，再通过截留分子量在500KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.3Mpa，得酰化液滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节酰化液滤液pH在8.8，使用截留分子量300KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力0.2Mpa，透过液弃去，监测酰化液中丁二酸的浓度0.11％，得酰化酪蛋白溶液。
载铁：向酰化酪蛋白溶液中缓慢加入2％FeCl3溶液335L，反应中检测反应液pH，并使用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH在6.0～9.0，得蛋白琥珀 酸铁粗品溶液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品溶液pH在7.5，再通过截留分子量在500KDa超滤膜过滤，控制膜内压力0.3Mpa，得蛋白琥珀酸铁粗品滤液。使用2mol/L氢氧化钠溶液调节蛋白琥珀酸铁粗品滤液pH在6.8，使用截留分子量300KDa的超滤膜膜分离，控制膜内压力不超过0.2Mpa，透过液弃去，监测蛋白琥珀酸铁粗品滤液中铁离子的浓度0.013％，得蛋白琥珀酸铁溶液。
精制：蛋白琥珀酸铁溶液过1.2um微孔滤膜，滤液中加入3mol/L盐酸溶液约2.6L，pH值至2.26，继续搅拌半小时，然后过滤，每次用水洗沉淀，收集沉淀，真空干燥，得干燥品6.5803kg，收率为94.04％，铁含量5.5wt％，游离铁含量0.09％。微生物检查，蛋白琥珀酸铁需氧菌总数小于100cfu/g、霉菌和酵母菌总数小于10cfu/g。
对比例1
对比例1是参照中国专利文献CN104402984A制备蛋白琥珀酸铁，具体步骤如下：
溶解酰化：向反应釜中加入纯化水105L，加酪蛋白7kg，搅拌，不断加入2mol/L氢氧化钠溶液约3.5L，溶解完后pH值约8，反应温度室温，然后加入丁二酸酐3.5kg，2mol/L氢氧化钠溶液使反应液的pH值保持在7.0～8.5，三小时加完，然后继续搅拌半小时，向溶液中加入3mol/L盐酸溶液约18.55L，约45min内加完，使pH值2.5～3.0，继续搅拌半小时，离心取沉淀；将沉淀转移至反应釜中，加水157.5L，搅拌分散，加入2mol/L氢氧化钠溶液约5.6L使溶解，溶解完后pH值8.6，继续搅拌1小时，离心。
载铁：取滤液测固含量算出其中琥珀酸酰化蛋白为6.1951g，按三氯化铁:琥珀酸酰化蛋白＝0.71:1的比例称取三氯化铁配制三氯化铁溶液(三氯化铁4.4451kg，加水89.9L，搅拌溶解，然后边搅拌边加0.2mol/L碳酸氢钠溶液154L)，两小时内向琥珀酸酰化蛋白溶液中加入三氯化铁溶液154L，并同时加2mol/L氢氧化钠溶液使pH值保持在7.0一8.5，三氯化铁溶液加完 后继续搅拌半小时，离心。
精制：半小时内向滤液中加入3mol/L盐酸溶液约10.5L，pH值至2.5，然后过滤，取沉淀，加水约105L，强力搅拌分散，30分钟内加2mol/L氢氧化钠溶液约7L，搅拌使溶解，最后溶液的pH值约8，共搅拌约3小时，溶解完全后过滤，滤液加酸沉淀，半小时加入3mol/L盐酸溶液约4.55L,pH值至2.5，然后过滤，取沉淀，加水约175L，强力搅拌分散，30分钟内加2mol/L氢氧化钠溶液约5.6L，搅拌使溶解，最后溶液的pH值约8，继续搅拌约4小时，过滤，滤液1.2um微孔滤膜过滤，滤液加酸沉淀，加入3mol/L盐酸溶液约2.1L，pH值至2.51，继续搅拌半小时，然后过滤，每次用水洗沉淀，收集沉淀，真空干燥，得干燥品6.9791kg，收率为99.7％，铁含量4.9wt％，游离铁含量0.08％。微生物检查，蛋白琥珀酸铁需氧菌总数在100～1000cfu/g、霉菌和酵母菌总数在10～100cfu/g。
对比例2
对比例2是参照中国专利文献CN102838667A制备蛋白琥珀酸铁，具体步骤如下：
溶解酰化：于500L反应釜中，加105L水及7.0kg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分三次缓慢加入1.4kg丁二酸酐，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10.0，丁二酸配加完后继续搅拌0.5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，使琥珀酸酰化蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸酰化蛋白溶液约105L。取琥珀酸酰化蛋白溶液适量，测定琥珀酸酰化蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸酰化蛋白的总重(6.70kg)。
载铁反应：根据琥珀酸酰化蛋白:三氯化铁按重量比1:1，称取6.70kg三氯化铁，并配制1.85％三氯化铁溶液362L。将琥珀酸酰化蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤。
精制：滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4.0，离心，用水洗沉淀，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4.0，离心，用水洗沉淀，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0,使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2um陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。
冷冻干燥：将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在30Pa，以每小时升高4℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高5℃升温至30℃，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6.0223kg，收率89.9％，铁含量8.2wt％，游离铁含量0.10％。微生物检查，蛋白琥珀酸铁需氧菌总数在100～1000cfu/g、霉菌和酵母菌总数在10～100cfu/g。
表1所示为本发明的蛋白琥珀酸铁制备时间与现有技术蛋白琥珀酸铁制备时间比较；表2所示为本发明制备的蛋白琥珀酸铁与现有技术制备的蛋白琥珀酸铁微生物结果比较。
表1：本发明的蛋白琥珀酸铁制备时间与现有技术蛋白琥珀酸铁制备时间比较(不含干燥工艺)
从上表1可知，现有技术的制备周期为83h，非常有必要一种大幅度降低蛋白琥珀酸铁的生产周期的制备方法，本发明的蛋白琥珀酸铁制备方法与现有技术相比，在生产周期上有明显优势，本发明的蛋白琥珀酸铁制备周期为42.5h。
表2：本发明制备的蛋白琥珀酸铁与现有技术制备的蛋白琥珀酸铁微生物结果比较
由上表2可知，本发明的蛋白琥珀酸铁制备方法与现有技术相比，其制备的成品在微生物含量方面有显著优势。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向酪蛋白溶液中加入丁二酸酐，并调节该酪蛋白溶液的pH值，使该酪蛋白溶液的pH值满足6.0～9.0，从而得到酰化液；
(2)调节所述步骤(1)得到的所述酰化液的pH值，使该酰化液的pH值满足5～12；接着，利用截留分子量为500kDa～1000kDa的超滤膜对该酰化液进行过滤，得到酰化液滤液；
(3)调节所述步骤(2)得到的所述酰化液滤液的pH值，使该酰化液滤液的pH值满足5.0～12.0；然后，利用截留分子量为100kDa～300kDa的超滤膜对所述酰化液滤液进行膜分离，弃去透过液，即得到酰化酪蛋白溶液；
(4)向所述步骤(3)得到的所述酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，调节pH值至6.0～9.0，接着离心过滤，保留滤液，即得到蛋白琥珀酸铁粗品溶液；
(5)调节所述步骤(4)得到的所述蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值，使该蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值满足5～12；接着，利用截留分子量为500kDa～1000kDa的超滤膜进行过滤，即得到蛋白琥珀酸铁粗品滤液；
(6)调节所述步骤(5)得到的所述蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值，使该蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值满足5.0～12.0；接着，使用截留分子量为100kDa～300kDa的超滤膜进行膜分离，弃去透过液，即得到蛋白琥珀酸铁溶液；
(7)对所述步骤(6)得到的所述蛋白琥珀酸铁溶液进行加酸反应，生成的沉淀即蛋白琥珀酸铁。
2.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述酪蛋白溶液中酪蛋白的浓度为5％～20％；加入的所述丁二酸酐与酪蛋白的质量比为1:1～5；
所述步骤(4)中，向所述酰化酪蛋白溶液中加入FeCl3溶液，是使酰化酪蛋白与FeCl3两者的质量比满足1:0.1～1；所述FeCl3溶液的浓度为1％～4％。
3.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，调节所述酪蛋白溶液的pH值，具体是向所述酪蛋白溶液中加入氢氧化钠溶液，从而使该酪蛋白溶液的pH值满足6.0～9.0。
4.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，调节所述酰化液的pH值，具体是向该酰化液中加入氢氧化钠溶液；
所述步骤(2)中，利用所述超滤膜对该酰化液进行过滤时，所述超滤膜的膜内压力为0.2Mpa～0.4Mpa，优选为0.3Mpa；
优选的，所述酰化液的pH值为5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为800kDa。
5.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，调节所述酰化液滤液的pH值，具体是向该酰化液滤液中加入氢氧化钠溶液；
利用所述超滤膜对所述酰化液滤液进行膜分离时，所述超滤膜的膜内压力不超过0.2Mpa；
优选的，所述酰化液滤液的pH值为8～10。
6.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述调节pH值至6.0～9.0，是利用氢氧化钠溶液调节的。
7.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，利用所述超滤膜进行过滤时，所述超滤膜的膜内压力为0.2Mpa～0.4Mpa，优选为0.3Mpa；
优选的，所述蛋白琥珀酸铁粗品溶液的pH值为5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为800kDa。
8.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，使用所述超滤膜进行膜分离时，所述超滤膜的膜内压力不超过0.2Mpa；
优选的，所述蛋白琥珀酸铁粗品滤液的pH值5.5～7.5；所述超滤膜的截留分子量为200kDa。
9.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述酰化酪蛋白溶液中丁二酸的浓度不超过0.1％；所述步骤(6)中，所述蛋白琥珀酸铁溶液中游离铁离子的浓度不超过0.1％。
10.如权利要求1所述蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，在对所述蛋白琥珀酸铁溶液进行加酸反应之前，所述蛋白琥珀酸铁溶液还经过精滤处理；得到的所述蛋白琥珀酸铁，还经过水洗、以及干燥处理。
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