CN102731683A

CN102731683A - 一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法

Info

Publication number: CN102731683A
Application number: CN2012102459592A
Authority: CN
Inventors: 郭维; 雷晓刚; 周霞; 郭恩中
Original assignee: HUBEI YINUORUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HUBEI YINUORUI BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明公开了一种从肝素废液中分离低分子肝素的方法；本发明方法在对肝素废液进行酶水解、碱氧纯化、滤膜过滤除杂等预处理的基础上，采用多膜分级切向超滤法，使用2000~10000Da多种规格超滤膜，从预处理过的肝素废液中分离天然低分子肝素组分；所得到的天然低分子肝素分子量分布范围为3000~8000Da，平均分子量为3500~5500Da，其中＜3000Da的低分子肝素比例≤5.0%，＞8000Da的低分子肝素比例≤10.0%；抗FXa/FIIa为6~9，其中抗FXa效价为145-180IU/mg，抗FIIa效价为20~30IU/mg，有望成为抗血栓的候选药物；本发明方法分离成本低，分离效率高，所制备的低分子肝素是纯天然的产物，保留了天然构象，无有机试剂残留。

Description

一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法。

技术背景

肝素（普通肝素即未分级肝素），是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用，其分子量范围为3000~30000 Da。在临床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环等。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类。其最大的副作用是引起出血，有时甚至会导致出血性死亡，因此，为了解决其出血的问题，人们研制了新型的抗凝血药物——低分子肝素。这类药物是普通肝素的一种升级产品，具有链短、结合部位少、生物利用度高、半衰期长等优点。在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量标准用抗FXa／FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。当皮下注射低分子肝素时，其在体内的抗FXa作用要比普通肝素强得多，而抗FIIa活性较弱，还具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，目前已逐渐取代肝素成为主流的抗血栓类的药物。

由于低分子肝素在未分级肝素中的含量较低，目前市场上低分子肝素都是由未分级肝素经化学降解或酶降解方法制备的钠盐或钙盐。其平均分子量约为5000 Da分子量分布为3000~8000 Da。在降解的过程中，部分戊糖抗凝血活性中心被破坏，只有约20％的组分具有戊糖活性中心。低分子量肝素与肝素相比，抗栓活性降低了约30％，抗凝活性则更低。降解后所制备的低分子肝素与天然低分子肝素相比，除了效价偏低以外，还会有杂质过多、质量难以控制以及结构不稳定等缺点。目前还无法人工合成在效果和结构上能与天然低分子肝素想媲美的产品。另外，在肝素制备的过程中，为了获得更高的效价，往往采取低倍乙醇分级沉淀的方式除去天然低分子肝素，因此会有大量的天然低分子肝素溶解于乙醇中。平均每生产1 kg普通肝素所消耗的医用乙醇约为100 kg，而这些醇沉液最终被排放至乙醇回收塔中，再乙醇回收完毕以后最终被作为废液排放到自然界中。这种处理方法不仅会导致对环境造成极大的污染，而且会导致天然低分子肝素资源的极大的浪费。目前还缺少对这类废液最合适的处理方法。

随着技术的进步和加工工艺的发展，各种膜材料逐渐用于生物分离工艺，从而使原本复杂的分离工艺变得简单易行。与传统分离方法相比，膜分离方法具有效率高、工作条件温和、可连续操作等优点，因此在工业上得到了越来越广泛的应用。超滤技术是利用膜的选择性透过原理，将大分子截留于膜上而允许小分子物质透过。在传统的超滤过程中随着超滤的进行，由于浓差极化现象而使大分子物质在膜介质表面不断堆积，造成超滤膜的通量大大降低，影响分离效率，因此在实际应用中常采用错流过滤或切向流过滤来提高超滤效率。在切向流超滤技术中，原料液的流向平行于超滤膜，从而可以及时将沉积在超滤膜表面的大分子溶质随着料液的流动而转移，有效缓解膜通量下降过快的问题。通过滤液回流和重复超滤，可对滤液中溶质进行快速浓缩和分离。

发明内容

本发明的目的就是根据上述现有技术的状况而提供一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法；该方法通过对肝素废液进行酶水解、碱氧纯化、滤膜过滤除杂后，再采用多膜分级切向超滤法，使用2000~10000 Da多种规格超滤膜作为手段，从预处理过的肝素废液中分离得到分子范围为3000~8000 Da的天然低分子肝素组分；分离成本低，分离效率高，所制备的低分子肝素是纯天然的产物，保持着天然的构象，无有机试剂残留。

本发明的一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，包括以下步骤：

1）酶水解，除去小分子蛋白：取肝素废液，用NaOH溶液调整pH为9~11之间，在40~50℃加入胰蛋白水解酶搅拌15~24小时，然后将温度升至90~95℃保温2~3个小时，离心，弃去沉淀，向上清液中加入NaCl和乙醇，沉淀12~18小时，得沉淀物；其中胰蛋白水解酶及NaCl的用量按kg/L计，分别为肝素废液体积的0.1%和1%，乙醇的用量为上清液体积的2-3倍；

2）碱氧纯化，脱色：在步骤1）所得的沉淀物中加入其重量30~60倍的纯化水，搅拌溶解，得溶解液；控制溶解液温度为40℃~50℃，调整溶解液pH为9~11之间，加入溶解液体积0.1~0.5%的过氧化氢，室温搅拌反应6-8小时，得纯化液；

3）滤膜过滤除杂：将步骤2）所得的纯化液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，以除去溶液中悬浮的颗粒，得滤液；

4）切向流超滤：将步骤3）所得到的滤液进行切向流超滤，先选择截留分子量为8,000-10,000 Da的超滤膜超滤，除去大分子肝素，收集透过液；再选择截留分子量为2000~3000的超滤膜对所收集的透过液超滤，除去小分子肝素，收集截留液；

5）分段醇沉除杂，除去截留液中的硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素等杂质：向4）所得的截留液中加入0.7~0.8倍体积的甲醇，10℃以下沉淀12~18小时，分离得沉淀物；在沉淀物加入其重量3~6倍的纯化水，待沉淀完全溶解后，向溶液中加入0.7~0.8倍体积的甲醇，10℃以下沉淀12~18小时，分离得沉淀物；将沉淀物真空干燥后，在干燥的沉淀物中加入其重量2~4倍的纯化水溶解，得待检测液；

6）检测：对5）中待检测液的效价、平均分子量及分子量分布进行测定，若平均分子量和分子量分布不符合低分子肝素的标准，则继续按步骤4）的操作对待检测液进行循环超滤，至达到或高于低分子肝素标准为止；将超滤后的溶液，经0.22 μm的滤膜过滤，得滤液；再用HCl溶液调节滤液pH值至6.5~7.4之间；

7）冻干：将滤液冻干，即得到天然低分子肝素；其平均分子量为3500~5500 Da，其中＜3000 Da的低分子肝素比例≤5.0%，＞8000 Da的低分子肝素比例≤10.0%；抗FXa/FIIa为6~9，其中抗FXa效价为145-180 IU/mg，抗FIIa效价为20~30 IU/mg。

所述的肝素废液，是指在普通肝素制备过程中的所产生的废液。

所述的切向流超滤，其进料液流速控制为1-2 L/min、料液进口压力为0.9-1.2 bar、回流排放压力为0.5-0.7 bar，超滤温度为室温。

以下是本发明产品的检测结果与低分子肝素标准（EP）对照表：

从上表中可以看出，本发明所制备的天然低分子肝素与未分级肝素降解所制得的低分子肝素相比，从产品的效果上，本发明抗FXa效价提升20%~30%，抗FIIa效价提升了10%，抗FXa/抗FIIa比值提升了2~3倍，大幅降低了出血危险；从安全性上，本发明所制备的低分子肝素是纯天然的产物，保持着天然的构象，由于主要采用的物理分离法，不会有机试剂残留的问题；从成本上，本发明仅仅是利用肝素生产过程中的所产生的废液作为原料进行制备，成本极低。本发明生产的天然低分子肝素可作为肝素类抗血栓药物的补充药物。

具体实施方式

实施例1

1、取肝素废液300 L，在搅拌的情况下，控制废液温度为40℃，用1M NaOH溶液调整pH值为9.5，随后加入300 g胰蛋白水解酶，搅拌20小时，得酶解液；

2、将酶解液升温至90℃，保温2小时，然后溶液冷却，离心去沉淀。在搅拌的情况下，向上清液中加入3 kg的NaCl，随后加入800 L的95%的乙醇，2小时后停止搅拌，控制料液温度在10℃以下，沉淀12小时，分离得沉淀物9.45 kg；

3、向沉淀物中加入300 L纯化水，搅拌溶解，得溶解液，控制溶解液温度为40℃，调整pH为9，加入30%的过氧化氢900 ml，搅拌6小时，得碱氧纯化液；

4、将碱氧纯化液，经过0.45 μm的微孔滤膜过滤，以除去悬浮颗粒，得滤液；

5、选择截留量为8000 Da的超滤膜，将滤膜过滤液在蠕动泵的驱动下进行切向流超滤。调节进料液流速为2 L/min、料液进口压力为1.2bar、回流排放压力为0.7 bar (即跨膜压力为0.9 bar)，在室温下超滤，当浓缩液体积为为50~70 L时，补加20 L纯化水，继续循环超滤5小时得210 L透过液；

6、选择截留量为2000 Da的超滤膜，将步骤5中所得的透过液在蠕动泵的驱动下进行切向流超滤。调节进料液流速为1 L/min、料液进口压力为0.9 bar、回流排放压力为0.5 bar (即跨膜压力为0.7 bar)，在室温下超滤，当截留液体积为50~70 L时，补加20 L纯化水，继续循环超滤5小时，收集截留液，体积为40 L；

7、在搅拌的情况下，向截留液中添加28 L甲醇，1小时后停止搅拌，控制料液温度在10℃以下，沉淀12小时，分离得沉淀物2.15 kg；将沉淀物溶于4 L纯化水中，在搅拌的情况下，加入2.8 L甲醇，控制温度10℃以下，沉淀12小时，分离得到沉淀物0.56 kg，真空干燥后溶于2 L纯化水。将溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液，再用1M 的HCl调节滤液pH值至6.8，取样检测；

8、参照美国药典方法采用HPLC检测样品相对平均分子量和分子量分布。HPLC设备为戴安U3000附带GPC模块。色谱柱为东曹 TSK-G2000SWXL，流动相为28.40 g/L的Na₂SO₄（pH为5.0），流速为0.2 ml/min。检测器为戴安UltiMate3000紫外检测器和Shodex的RI101示差折光检测器。结果显示，样品平均分子量为4500 Da，其中<2000 的比例为15%，2000~8000 Da的比例为80%，＞8000的比例为5%，符合低分子肝素标准。产品效价检测结果（参照美国药典方法），其中抗FXa效价：168 IU/mg，抗FIIa效价：22 IU/mg，抗FXa/抗FIIa=7.6；

9、将步骤7调节pH值后的滤液放入冻干机中于-60℃干燥，即得天然低分子肝素432 g。

实施例2

1、取肝素废液600 L，在搅拌的情况下，控制废液温度为50℃，用1M的NaOH溶液，调整pH值为10.5之间，随后加入600 g胰蛋白水解酶，搅拌24小时，得酶解液；

2、将酶解液升温至95℃，保温3小时，然后溶液冷却，离心去沉淀。在搅拌的情况下，向上清液中加入6 kg的NaCl，随后加入1500 L的95%的乙醇，2小时后停止搅拌，控制溶液温度在10℃以下，沉淀18小时，分离得沉淀物18.23 kg；

3、向沉淀物中加入600 L纯化水，搅拌溶解，得溶解液，控制溶解液温度为50℃，调整pH为11，加入30%的过氧化氢3000 ml，搅拌8小时，得碱氧纯化液；

6、选择截留量为2000 Da的超滤膜，将步骤5中所得的透过液在蠕动泵的驱动下进行切向流超滤。调节进料液流速为1 L/min、料液进口压力为0.9 bar、回流排放压力为0.5 bar (即跨膜压力为0.7 bar)，在室温下超滤，当截留液体积为10~30 L时，补加20 L纯化水，继续循环超滤5小时，收集截留液，体积为40 L；

7、在搅拌的情况下，向截留液中添加28 L甲醇，1小时后停止搅拌，控制料液温度在10℃以下，沉淀12小时，分离得沉淀物4.97 kg；将沉淀物溶于4 L纯化水中，在搅拌的情况下，加入28 L甲醇，控制温度10℃以下，沉淀12小时，分离得到沉淀物0.93 kg，真空干燥后溶于2 L纯化水。将截留液经0.22 μm微孔滤膜过滤，得滤液，再用1 M的HCl溶液，调节滤液pH值至7.2，取样检测；

8、参照美国药典方法采用HPLC检测样品相对平均分子量和分子量分布。HPLC设备为戴安U3000附带GPC模块。色谱柱为东曹 TSK-G2000SWXL，流动相为28.40 g/L的Na₂SO₄（pH为5.0），流速为0.2 ml/min。检测器为戴安UltiMate3000紫外检测器和Shodex的RI101示差折光检测器。结果显示，样品平均分子量为4700 Da，其中<2000 的比例为12%，2000~8000 Da的比例为80%，＞8000的比例为8%，符合低分子肝素标准。抗FXa效价：153 IU/mg，抗FIIa效价：25 IU/mg，抗FXa/抗FIIa=6.1；

9、将步骤7调节pH值后的滤液放入冻干机中于-60℃干燥，即得天然低分子肝素892 g。

Claims

1.一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，其特征在于包括以下步骤：

4）切向流超滤：将步骤3）所得到的滤液进行切向流超滤，先选择截留分子量为8,000-10,000 Da的超滤膜超滤，收集透过液；再选择截留分子量为2000~3000的超滤膜对所收集的透过液超滤，收集截留液；

2. 根据权利要求1所述的一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，其特征在于：所述的肝素废液，是指在普通肝素制备过程中的所产生的废液。

3.根据权利要求1或2所述的一种从肝素废液中分离天然低分子肝素的方法，其特征在于：所述的切向流超滤，其进料液流速控制为1-2 L/min、料液进口压力为0.9-1.2 bar、回流排放压力为0.5-0.7 bar，超滤温度为室温。