CN102676484A - 高纯度牛胰蛋白酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括加入提取剂提取、离心、加入盐析沉淀剂沉淀、溶解、超滤、离子交换层析柱、调pH至碱性加氯化钙活化、调pH值至酸性终止活化，检测胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力、测A₂₈₀值、超滤膜浓缩、监测透过液直至A₂₈₀值小于0.5、合并浓缩液和冲洗液即为高纯度胰蛋白酶；本发明的工艺制备方法得到的胰蛋白酶纯度高，催化作用专一性强。

Description

高纯度牛胰蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明涉及高纯度牛胰蛋白酶的制备方法。

背景技术

胰蛋白酶(trypsin，EC3.4.21.4)为蛋白酶的一种。在脊椎动物体内作为消化酶而起作用。该酶在胰脏是作为酶的前体-胰蛋白酶原而被合成的。随胰液分泌到小肠中，受肠激酶，或胰蛋白酶的作用成为活化胰蛋白酶。胰蛋白酶是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）残基中的羧基侧切断，酶切作用专一性强。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起到活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。

一、胰蛋白酶有广泛的用途

1.作为药物应用于临床

由于胰蛋白酶能消化溶解变性蛋白，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管所造成的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。注射用也可用于治疗毒蛇咬伤。

2.作为降解酶应用于药品、食品工业

胰蛋白酶因为其对蛋白质具有很强的降解能力而在蛋白类药品、食品的加工中有着很广泛的用途。如在透明质酸制备过程中去除蛋白质，在酒类和饮料的澄清、畜血蛋白的水解、胰蛋白胨制备、大豆肽的制备等方面也具有广泛的应用价值。

3.作为生物试剂应用于研究开发

胰蛋白酶不仅在医药领域有着重要的应用价值，而且在实验室研究开发中也被广泛使用。例如在原代细胞培养中胰蛋白酶消化法是获得单个细胞最经典的方法。该方法利用胰蛋白酶能够破坏基质和粘附蛋白的能力而将细胞与基质、细胞与细胞相互剥离，从而最大限度地去除原有组织的特性。再有就是利用胰蛋白酶蛋白的能力用于分析与蛋白结合的药物研究。

4.作为工具酶应用于基因工程

胰蛋白酶具有专一性裂解赖氨酸和精氨酸羧基形成的肽键的功能，因此在基因工程蛋白活化中具有重要应用。如在基因工程人胰岛素制备过程中胰蛋白酶可作用于胰岛素原B链和A链之间的Arg残基，得到Arg（B31）-人胰岛素。

二、现有胰蛋白酶的制备工艺现状

胰蛋白酶的来源大多为牛、猪、羊等动物的胰脏，早期也有采用提取完胰岛素后的猪或者是牛的胰液的，经过无菌处理后使用，然后进行提取、纯化后制备胰蛋白酶。分离纯化方法一般为溶剂浸提后采用沉淀法制备粗酶原，活化后采用离子交换层析、沉淀等方法纯化（中国专利从胰渣中提取及纯化胰蛋白酶的方法，申请号：200510030396.5；重庆医科大学学报，1995，：305-307；青海医药杂志，2000，4：56-57）。因为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶很难分开，这样的方法一般在产品中会混有胰凝乳蛋白酶，导致产品纯度不够，使酶切作用专一性降低，难以用于高纯度医药产品的制备和生产。因此制备高纯度胰蛋白酶越来越引起生物化学家和生物制药企业的重视。

三、本发明希望解决的技术问题

本发明希望在现有技术的基础上，经过科学的、扎实的研发工作，从大量的详实的科研数据中精选并提供一种简单的工艺方法，得到高纯度的胰蛋白酶。

发明内容

本发明的目的是制备高纯度的胰蛋白酶。并为促进其在医药卫生、药品食品加工领域中更广泛的应用奠定基础。本发明从牛胰脏中采用溶剂提取、盐析沉淀和离子交换层析法制备牛胰蛋白酶，其纯度高于一般方法制备的产品。

本发明的技术方案是首先采用溶剂牛胰脏匀浆进行提取，离心制备粗酶液，然后采用分级沉淀法制备胰蛋白酶原粗品，再采用超滤法对粗酶原进行纯化，继续采用层析法制备得到胰蛋白酶原，最后对胰蛋白酶原进行活化后超滤浓缩，即得到高纯度胰蛋白酶。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：

（1）、取动物胰脏，先进行组织破碎，加入至少2倍体积的提取剂，该提取剂是pH 3以上的无机或有机酸，提取至少12小时；

（2）、提取后的样品进行离心，收集上清液体；

（3）、将上清液加入盐析沉淀剂进行沉淀，至沉淀不再析出，得到的沉淀即为粗酶原I；

（4）、用磷酸缓冲液溶解粗酶原I，用超滤膜超滤，从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值，至A₂₈₀<0.5时停止超滤，浓缩样品至提取剂体积的1/10左右，得到粗酶原II；

（5）、将粗酶原II上到已平衡好的离子交换层析柱上，上样过程随时监测流出液A₂₈₀值，用Buffer A平衡3-5倍柱体积，再用等比例的Buffer A和Buffer B，加0.1-0.4mol氯化钠，进行线性洗脱，流速2-5ml/min，随时监测流出液A₂₈₀值；收集样品，于容器中测量体积和A₂₈₀值，得到样品III，于2-8℃保存备用；该Buffer A为10m mol柠檬酸与0.1mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；Buffer B为10m mol柠檬酸与0.4mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；Buffer A和Buffer B优选为5倍柱体积的Buffer A和5倍柱体积Buffer B；

（6）、样品III调pH至碱性后，加氯化钙进行活化，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高时，调pH值至酸性，终止活化，检测Typsin（即，胰蛋白酶）活力及Chymotrypsin（即，胰凝乳蛋白酶）活力；测A₂₈₀值，此为样品IV，于2-8℃保存备用；

（7）、将样品IV用准备好的3-10K超滤膜浓缩，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液即为成品；该Buffer L为10m mol柠檬酸。

上述步骤中，所述的监测A₂₈₀的目的是为了检测溶液中的杂质蛋白是否已除尽，若A₂₈₀值小于0.5，就可以判断杂蛋白已基本除尽。

本发明所涉及的Buffer A、Buffer B、Buffer L的具体配制和组成如下：

BufferA配制：10m mol柠檬酸+0.1mol氯化钠   pH：4.00±0.02

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

所需4mol氯化钠的体积(ml)=0.1×V_配制体积（ml）÷4。

BufferB的配制：10m mol柠檬酸+0.4mol氯化钠   pH：4.00±0.02

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

所需4mol氯化钠的体积(ml)=0.4×V_配制体积（ml）÷4。

Buffer L：10m mol柠檬酸；计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1。

用适当容器装3/4配制体积的纯化水，用量筒量取所需体积的1mol柠檬酸加到容器中，搅拌均匀后定容到配制体积，搅拌均匀后备用。

用适当容器取3/4配制体积的纯化水，量取计算量的1mol柠檬酸母液和4mol氯化钠母液于容器中，搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，定容到配制体积，重新测pH值并调至4.00±0.02，随时监测pH值为4.00±0.02直至稳定，搅拌均匀备用。

本发明人经研究发现，在采用溶剂提取和沉淀法制备粗酶后，先不活化，而是采用层析法可以先将胰蛋白酶原与胰凝乳蛋白酶原分离，再进行活化，得到胰蛋白酶。该工艺制备方法得到的胰蛋白酶纯度高，催化作用专一性强，适合作为药物使用或用于药品、食品加工等。

上述步骤5中，所述的于容器中测量体积的目的是为了便于计算收率。

本发明的上述方法中，所述提取剂体积优选为胰脏体积的2-6倍；该提取剂优选为0.1-0.15mol/l的硫酸或盐酸或2-4%的三氯乙酸；该提取剂的提取时间优选为12-36小时。

本发明所述的制备胰蛋白酶的方法中，所述步骤（3）中采用的盐析沉淀剂为溶解度超过200g/L的无机盐，或pH 3以下的酸；优选为硫酸。

本发明所述的制备胰蛋白酶的方法中，所述是步骤（3）优选为采用盐析沉淀剂沉淀进行分级沉淀处理；即，在上清液中依序加入20%、40%浓度的盐析沉淀剂进行分级沉淀。该分级沉淀的优点在于，可使产物纯度更高。

本发明所述的制备胰蛋白酶的方法中，所述步骤（4）中采用的超滤膜为3k-10k的超滤膜，优选10k的超滤膜。所述步骤（7）所采用超滤膜为3K超滤膜。

本发明所述的制备胰蛋白酶的方法中，所述步骤（5）为酶原在活化之前上阳离子交换层析，离子交换介质为SP树脂。SP的英文Saturated polyester plastic，可译为饱和聚酯塑料，在本发明中指树脂材料，即SP树脂；平衡缓冲液为Buffer A，洗脱液为Buffer A（5倍柱体积）和Buffer B（5倍柱体积），加0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，上样过程中监测流出液A₂₈₀值＜0.5以下开始梯度洗脱，洗脱后监测A₂₈₀，收集A₂₈₀＞1至胰凝乳蛋白酶活力＜0.2之间的样品。

本发明所述的制备胰蛋白酶的方法中，所述步骤（6）中，粗酶原样品III在SP层析后，用氢氧化钠调节至碱性，再加氯化钙进行活化，该活化的过程为用氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加0.1mol二水氯化钙活化，然后用盐酸调pH至2.5-3.0终止活化。

本发明所用的动物胰脏可以是猪、牛、羊等动物胰脏，优选实施例中采用牛胰脏。

本发明优选实施例中，提供一种从猪、牛或羊胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括：

1、取称量好的新鲜、剥去脂肪及结缔组织的动物胰脏用绞肉机绞碎，将绞过的动物胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量提取剂，捣碎后倒进提取容器中，再加至适量提取剂用搅拌器开始搅拌，提取一定时间，优选提取12~36小时；

2、搅拌提取后的样品离心后过滤（用多层医用纱布过滤），滤液再离心，收集上清液；

3、将上述步骤2中手机的上清液进行分级沉淀处理，得到粗酶原I；

4、用磷酸缓冲液溶解粗酶原I，用超滤膜超滤，重复此操作步骤，并从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值，至A₂₈₀<0.5时停止超滤，浓缩样品至一定体积，优选浓缩样品至提取剂体积的1/10左右，得粗酶原样品II；

5、将粗酶原II上到已平衡好的SP树脂层析柱上，上样过程随时监测流出液A₂₈₀值，用Buffer A平衡3-5倍柱体积，再用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），加0.1-0.4mol氯化钠进行线性洗脱，流速2-5ml/min，随时监测流出液A₂₈₀值；收集样品，于容器中测量体积（用于计算收率）和A₂₈₀值，得到样品III，于2-8℃保存备用；

6、样品III用氢氧化钠调pH至碱性后，加氯化钙进行活化，测A₂₈₀值，随时检测活力至活力升至最高时，用盐酸调pH值至酸性，终止活化，检测Typsin活力及Chymotrypsin活力；测A₂₈₀值，此为样品IV，于2-8℃保存备用；

7、将样品IV用准备好的3-10K超滤膜浓缩至一定体积，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液，即得到本发明所述的高纯度胰蛋白酶。

A₂₈₀值小于0.5是用来判断杂蛋白已基本除尽。

本发明另一实施例中，上述的胰蛋白酶制备方法是以牛胰脏为原料，制备步骤如下：

（1）、取称量好的新鲜、剥去脂肪及结缔组织的猪、牛、羊等动物胰脏用绞肉机绞碎，将绞过的胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量提取剂，捣碎后倒进提取容器中，再加适量提取剂用搅拌器开始搅拌，提取一定时间；

（2）、搅拌提取后的样品冷库放置一定时间后离心。离心后将上清用四层纱布过滤，滤液再离心收集上清；

（3）、离心后的样品，进行分级沉淀处理，得到粗酶原I；

（4）、样品用超滤膜超滤，重复此操作步骤（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品至一定体积得粗酶原样品II；

（5）、将样品II上到已平衡好的SP树脂层析柱上，上样过程随时监测流出液A₂₈₀值，平衡好后用Buffer进行线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值；收集A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜0.2之间的样品，于适当容器中准确测量体积和A₂₈₀值，得样品III，于2-8℃保存备用；

（6）、样品III调pH 8.10，加氯化钙活化一定时间，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力。测A₂₈₀值，此为样品IV，于2-8℃保存备用；

（7）、将样品IV用准备好的超滤膜浓缩至一定体积，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，再用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液，即为成品。

其中步骤（1）提取剂为硫酸或三氯乙酸，优选采用三氯乙酸。

优选地，本发明采用新鲜、剥去脂肪及结缔组织的牛胰脏5.0kg（按4台离心机计算，随离心机增多相应增加），用绞肉机绞碎，将绞过的牛胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量配制好的0.1-0.15mol硫酸或2-4%的三氯乙酸，捣碎后倒进提取容器中，再加至4倍体积0.1-0.15mol硫酸溶液或2-4%的三氯乙酸用搅拌器开始搅拌、计时提取24小时。

步骤（3）离心后上清液采用硫酸铵盐析或酸沉淀，其中优选的为硫酸铵盐析。离心后的样品，按242g/L加硫酸铵达到35-45%饱和度。搅拌溶解后，继续搅拌30分钟，放置24小时后，（离心9500转，10min，4℃），离心后将上清用四层纱布过滤至不锈钢桶中，再次离心收集上清，沉淀弃去。离心后的盐析上清，按205g/L加硫酸铵达到70%饱和度。搅拌溶解后，继续搅拌30分钟，放置24小时后，（离心9500转，10min，4℃），收集沉淀，上清弃去，沉淀即为胰蛋白酶原粗制品。

步骤（4）对第（3）步制备的酶原采用10K超滤膜超滤，浓缩样品体积至1-2L，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，继续超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中。样品搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，准确测定体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅱ。

步骤（5）将样品II上阳离子交换层析，离子交换介质为SP树脂。平衡缓冲液为BufferA，洗脱液为Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），加0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，上样过程中监测流出液A₂₈₀值＜0.5以下开始梯度洗脱，洗脱后监测A₂₈₀，收集A₂₈₀＞1至胰凝乳蛋白酶活力＜0.2之间的样品。

步骤（6）粗酶原样品III在SP层析后活化。活化过程为用氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加0.1M二水氯化钙活化，然后用盐酸调pH至2.5-3.0终止活化。

步骤（7）所用超滤膜为3K超滤膜。

本发明的有益效果是：原料易得，成本低廉，方法简单易操作，得到的胰蛋白酶活力相对于杂质胰凝乳蛋白酶活力高。经本申请人按常规测定方法检测，检测例为本发明实施例得到的胰蛋白酶，对比例为现有方法制得或市售的胰蛋白酶，相比之下，按照传统方法制得的胰蛋白酶活力与胰凝乳蛋白酶活力比值一般低于20，而按照本发明改进的方法得到的胰蛋白酶活力与胰凝乳蛋白酶活力比值均高于50，最高的达到1000，篇幅所限，对比实验所采用方法参见公知方法，过程和数据也可参见实施例后所附方法，必要时可提供实验记录进行佐证。该对比数据和结果显示：本发明带来的有益效果是令人惊喜的。本发明的工艺方法得到的产品在医药卫生、药品食品工业中有广阔的应用前景。

附图说明

图1~图3均为本发明的层析图，其中，横坐标是流出液的体积，单位为ml，纵坐标是吸收度，单位mAu相当于毫Au。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。

实施例1

以下步骤均在2-8℃环境进行

溶液的配制:

A.0.125mol硫酸的配制

取一定量2-8℃的纯化水，用10mol浓硫酸配制，搅匀后2-8℃放置备用。

计算：所需10mol浓硫酸的体积(ml)=0.125×V_配制体积（ml）÷10

B.Buffer L配制：10m mol柠檬酸

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

用适当容器装3/4配制体积的纯化水，用量筒量取所需体积的1mol柠檬酸加到容器中，搅拌均匀后定容到配制体积，搅拌均匀后备用。

C.Buffer A配制：10m mol柠檬酸+0.1mol氯化钠   pH：4.00±0.02

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

所需4mol氯化钠的体积(ml)=0.1×V_配制体积（ml）÷4

用适当容器取3/4配制体积的纯化水，量取计算量的1mol柠檬酸母液和4mol氯化钠母液于容器中，搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，定容到配制体积，重新测pH值并调至4.00±0.02，随时监测pH值为4.00±0.02直至稳定，搅拌均匀备用。

D.BufferB的配制：10m mol柠檬酸+0.4mol氯化钠     pH：4.00±0.02

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

所需4mol氯化钠的体积(ml)=0.4×V_配制体积（ml）÷4

用适当容器取3/4配制体积的纯化水，量取计算量的1mol柠檬酸母液和4mol氯化钠母液于容器中，搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，定容到配制体积，重新测pH值并调至4.00±0.02，随时监测pH值为4.00±0.02直至稳定，搅拌均匀备用。

1.1提取:取新鲜、剥去脂肪及结缔组织的牛胰脏5.0kg（按4台离心机计算，随离心机增多相应增加），用绞肉机绞碎，将绞过的牛胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量配制好的0.125mol硫酸，捣碎后倒进提取容器中，再加至4倍体积0.125mol硫酸溶液用搅拌器开始搅拌、计时提取24小时。

1.2离心:搅拌提取后的样品冷库放置24小时后离心。将搅拌均匀的溶液加入500ml离心瓶中，用架盘天平平衡好后对称装进Beckman离心机中，（离心4500转，10min，4℃，JA—10转子）离心后将上清用四层纱布过滤至20升不锈钢桶中，累计离心收集上清，沉淀弃去。

1.340%盐析:离心后的样品，按242g/L加硫酸铵达到40%饱和度。搅拌溶解后，继续搅拌30分钟，放置24小时后，（离心9500转，10min，4℃，JA—10转子），离心后将上清用四层纱布过滤至20升不锈钢桶中，累计离心收集上清，沉淀弃去。

1.470%盐析:离心后的40%盐析上清，按205g/L加硫酸铵达到70%饱和度。搅拌溶解后，继续搅拌30分钟，放置24小时后，（离心9500转，10min，4℃，JA—10转子），收集沉淀，上清弃去，沉淀即为胰蛋白酶原粗制品，即为样品Ⅰ。

1.5样品超滤：

A.超滤膜的准备：安装好10K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲至中性并用10mM柠檬酸buffer润膜后备用。

B.样品的准备：样品I按10ml/g加10mM柠檬酸buffer溶解，用Beckman离心机离心（9500转，15min），上清用300目筛网过滤，收集于适当容器中，于2-8℃保存备用。

C.超滤：用10K超滤膜浓缩样品体积至1-2L，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，继续超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中。

D.样品调pH值：将超滤后的样品搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，准确测定体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅱ，于2-8℃保存备用。(取一半的样品直接活化后进行10K超滤，此为样品Ⅲ，其余直接进行SP树脂层析纯化，此为按照传统方法制备得到的样品Ⅳ。)

E.超滤后样品活化：样品Ⅱ调pH8.10，加称量好的二水氯化钙，搅拌溶解后，用2mol氯氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高，速度缓慢时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力。（trypsin酶及chymotrypsin酶的活性检测方法见附件1）

F.超滤：活化后样品用10K超滤膜超滤，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中，此为样品Ⅲ。

1.6SP层析A:

A.层析柱的准备：用三次以上者需要重新装柱，装柱高度视需要而定。

B.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

C.上样：将样品Ⅲ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

D.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

E.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜1.0之间的样品，此为样品Ⅳ，检测发现无合格样品。层析图暂欠奉。

SP层析B:

A.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

B.上样：将样品Ⅱ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

C.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

D.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜0.2之间的样品，于适当容器中准确测量体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅴ，于2-8℃保存备用。层析图见图1。

1.7酶原的活化：以下trypsin酶的活性检测方法见附录1

样品Ⅴ调pH 8.10，加氯化钙进行活化，缓慢将称量好的二水氯化钙加入样品内，搅拌溶解后，用2mol氢氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高，速度缓慢时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力.测A₂₈₀值，此为样品Ⅵ，于2-8℃保存备用。

1.8.3K超滤：

A.超滤膜的准备：安装好10K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲至中性并用10mM柠檬酸buffer润膜后备用。

B.超滤：将样品Ⅵ用准备好的超滤膜浓缩至2L左右，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液即为成品样品VII。检测trypsin活力及chymotrypsin活力并测A₂₈₀值。

1.9超滤膜的再生及贮存：

A：用0.1mol NaOH洗膜：取2mol NaOH的母液500ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升，搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱洗膜。当用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30~60分钟。

B：用纯化水冲洗膜至回流液和透过液pH试纸检测pH值为中性。

C：用0.01mol NaOH存膜：取2mol NaOH的母液50ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱存膜。当用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30分钟，即可。存完后盖好上下封口平放于包装盒中，放2-8℃环境贮存，备用。

1.10实验结果：

经测定先活化后层析的样品IV酶活力结果为trypsin活力：72.7U/mg，chymotrypsin活力：20.01U/mg。先层析后活化的样品VII酶活力结果为trypsin活力：141.6U/mg，chymotrypsin活力：15.5U/mg。后者纯度远远高于前者。

实施例2

溶液的配制:

A.3%三氯乙酸的配制：

校正天平，用4L烧杯称取固体三氯乙酸M_{三氯乙酸（g）}=3%×V_体积L×1000，将三氯乙酸放入盛有约为2/3配制体积的2-8℃纯化水的90L桶中，搅拌溶解，然后定容到所配制的体积，搅匀后2-8℃放置。

B.Buffer L配制：参考实施例1中配制方法。

C.Buffer A的配制：参考实施例1中配制方法。

D.Buffer B的配制：参考实施例1中配制方法。

E.透析液配制：0.05mol HCL的配制

取12mol HCL体积(L)：0.05×配制体积(L)÷12，放入90L塑料桶中加入2-8℃的纯化水，定容到配制体积，搅拌均匀后2-8℃放置。

2.1提取：取新鲜、剥去脂肪及结缔组织的猪胰脏5.0kg（按4台离心机计算，随离心机增多相应增加），用绞肉机绞碎，将绞过的猪胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量配制好的3%三氯乙酸溶液，捣碎后倒进提取容器中，再加至4倍体积的3%三氯乙酸溶液用搅拌器开始搅拌、计时提取20min。

2.2离心：将搅拌均匀的溶液加入500ml离心瓶中，用架盘天平平衡好后对称装进Beckman离心机中，（离心4500转，10min，4℃，JA-10转子）离心后将上清用四层纱布过滤至20升不锈钢桶中，累计离心收集上清，上清在2-8℃放置≥20h，沉淀弃去。

注意：从计时提取到离心结束不得超过90分钟。

2.3沉降：静止20小时后的上清观察混浊度，如果上清为白色的混悬液开始离心（9500转，15min，4℃），收集离心所得沉淀即为酸沉淀，如上清不是白色的混悬液继续沉降直至变为白色的混悬液方可离心。

2.3酶原的制备：

2.3.1透析袋的清洗：

将透析袋从1m mol EDTA（pH：8.00）的贮存液中取出，用纯化水冲洗干净后即可使用。

2.3.2离心：对放置20小时的粗制备液进行离心（9500转，15min，4℃）弃去上清，沉淀称重。

2.3.3透析：将沉淀按10ml/g的比例加入0.05M HCL，搅拌使其成均匀的混悬液，然后装进透析袋扎紧封口放进0.05M HCL的塑料桶中透析除盐，不断更换塑料桶中透析液至透析袋中的样品溶解(使总透析液体积至少为样品体积的100倍)，直到透析袋中样品由乳白色变为澄清。透析完全已溶解的酶原移到10L不锈钢桶中，此为样品Ⅰ，装样品的透析袋先用纯化水冲洗干净，然后放入1mmol EDTA(pH：8.00)中2-8℃保存备用。

2.4样品超滤：

2.4.1超滤膜的准备：安装好10K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲至中性并用10mM柠檬酸buffer润膜后备用。

2.4.2样品的准备：将透析好的样品Ⅰ收集于10L不锈钢桶中，用2mol氢氧化钠调pH值为5.60±0.02，用Beckman离心机离心（4500转，15min），上清用300目筛网过滤，收集于适当容器中，于2-8℃保存备用。

2.4.3超滤：用10K超滤膜浓缩样品体积至1-2L，加Buffer L至样品体积3倍左右，继续超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中。

2.4.4样品调pH值：将超滤后的样品搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，准确测定体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅱ，于2-8℃保存备用。(取一半的样品直接活化后进行10K超滤，此为样品Ⅲ，其余直接进行SP树脂层析纯化，此为按照传统方法制备得到的样品Ⅳ。)

2.4.5超滤后样品活化：样品Ⅱ调pH8.10，加氯化钙进行活化，缓慢将称量好的二水氯化钙加入样品内，搅拌溶解后，用2mol氯氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力。（trypsin酶及chymotrypsin酶的活性检测方法见附录1）

2.4.6超滤：活化后样品用10K超滤膜超滤，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中，此为样品Ⅲ。

2.5纯化

SP层析A:

A.层析柱的准备：用三次以上者需要重新装柱，装柱高度视需要而定。

B.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

C.上样：将样品Ⅲ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

D.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

E.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜1.0之间的样品，检测结果无合格。

SP层析B:

A.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

B.上样：将样品Ⅱ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

C.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

D.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜0.2之间的样品，于适当容器中准确测量体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅴ，于2-8℃保存备用。层析图见图2。

2.6酶原的活化：以下trypsin酶的活性检测方法见附录1

2.6.1样品Ⅴ按0.1mol加二水氯化钙：

计算：需固体二水氯化钙的量（g）=147.02×0.1×V_{样品Ⅲ的体积}

按计算好的量称出固体二水氯化钙备用。

2.6.2样品的活化：缓慢将称量好的二水氯化钙加入样品Ⅴ内，搅拌溶解后，用2mol氯氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高，速度缓慢时（一般150U/mg左右），用4mol盐酸调pH值2.80，终止活化，测A₂₈₀值，此为样品Ⅵ，于2-8℃保存备用。

2.7 3K超滤：

2.7.1超滤膜的准备：安装好3K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲洗至中性，并用Buffer L润膜后备用。

2.7.2超滤：将样品Ⅵ用准备好的超滤膜浓缩至2L左右，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液即为成品。

2.7.3超滤膜的再生及贮存：

A：用0.1mol NaOH洗膜：取2mol NaOH的母液500ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升，搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱洗膜。当用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30~60分钟。

B：用纯化水冲洗膜至回流液和透过液pH试纸检测pH值为中性。

C：用0.01mol NaOH存膜：取2mol NaOH的母液50ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱存膜。当用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30分钟，即可。存完后盖好上下封口平放于包装盒中，放2-8℃环境贮存，备用。

2.8实验结果：

经测定先活化后层析的样品IV酶活力结果为trypsin活力：166.1U/mg，chymotrypsin活力：10.3U/mg。先层析后活化的样品VII酶活力结果为trypsin活力：268.0U/mg，chymotrypsin活力：0.36U/mg。后者纯度远远高于前者，可达前者的几倍。

实施例3

A.3%三氯乙酸的配制：参考实施例1中配制方法。

B.Buffer L配制：参考实施例1中配制方法。

C.Buffer A的配制：参考实施例1中配制方法。

D.Buffer B的配制：参考实施例1中配制方法。

计算：所需1mol柠檬酸的体积(ml)=0.01×V_配制体积（ml）÷1

所需4mol氯化钠的体积(ml)=0.4×V_配制体积（ml）÷4

用适当容器取3/4配制体积的纯化水，量取计算量的1mol柠檬酸母液和4mol氯化钠母液于容器中，搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，定容到配制体积，重新测pH值并调至4.00±0.02，随时监测pH值为4.00±0.02直至稳定，搅拌均匀备用。

3.1提取：取新鲜、剥去脂肪及结缔组织的羊胰脏5.0kg（按4台离心机计算，随离心机增多相应增加），用绞肉机绞碎，将绞过的羊胰脏放入高速组织捣碎机中，加入适量配制好的3%三氯乙酸溶液，捣碎后倒进提取容器中，再加至4倍体积的3%三氯乙酸溶液用搅拌器开始搅拌、计时提取20min。

3.2离心：将搅拌均匀的溶液加入500ml离心瓶中，用架盘天平平衡好后对称装进Beckman离心机中，（离心4500转，10min，4℃，JA—10转子）离心后将上清用四层纱布过滤至20升不锈钢桶中，累计离心收集上清，上清在2-8℃放置≥20h，沉淀弃去。

3.375%盐析:离心后的样品，按492g/L加硫酸铵达到75%饱和度。搅拌溶解后，继续搅拌30分钟，放置2小时后，（离心9500转，10min，4℃，JA—10转子），收集沉淀上清弃去，盐析沉淀即为胰蛋白酶原粗制品，即为样品Ⅰ。

3.4样品超滤：

A.超滤膜的准备：安装好10K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲至中性并用10mM柠檬酸buffer润膜后备用。

B.样品的准备：盐析沉淀按10ml/g加10mM柠檬酸buffer溶解，用Beckman离心机离心（4500转，15min），上清用300目筛网过滤，收集于适当容器中，于2-8℃保存备用。

C.超滤：用10K超滤膜浓缩样品体积至1-2L，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，继续超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中。

D.样品调pH值：将超滤后的样品搅拌均匀，用2mol氢氧化钠调pH值4.00±0.02，准确测定体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅱ，于2-8℃保存备用。(取一半的样品直接活化后进行10K超滤，此为样品Ⅲ，其余直接进行SP树脂层析纯化，此为按照传统方法制备得到的样品Ⅳ。)

E.超滤后样品活化：样品Ⅱ调pH8.10，加氯化钙进行活化，缓慢将称量好的二水氯化钙加入样品内，搅拌溶解后，用2mol氯氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高，速度缓慢时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力。（trypsin酶及chymotrypsin酶的活性检测方法见附录1）

F.超滤：活化后样品用10K超滤膜超滤，加10mM柠檬酸buffer至样品体积3倍左右，超滤重复此操作步骤三次（从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值），最后浓缩样品体积至1L左右，除去进口压力用10mM柠檬酸buffer将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液至适当容器中，此为样品Ⅲ。

3.5SP层析A:

A.层析柱的准备：用三次以上者需要重新装柱，装柱高度视需要而定。

B.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

C.上样：将样品Ⅲ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

D.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

E.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜1.0之间的样品，检测无合格样品。层析图暂欠奉。

SP层析B:

A.层析柱的平衡：用Buffer A平衡3-5倍柱体积，线性流速40-50cm/h。

B.上样：将样品Ⅱ上到已平衡好的SP层析柱上，上样量按40OD/L计算，上样过程中随时监测流出液A₂₈₀值，上样结束后用Buffer A平衡至流出液A₂₈₀值降至0.5以下。

C.梯度：平衡好后用Buffer A（5倍柱体积）+Buffer B（5倍柱体积），进行0.1-0.4mol氯化钠线性梯度洗脱，随时监测流出液A₂₈₀值。

D.样品收集：收集样品A₂₈₀＞1至chymotrypsin活力＜0.2之间的样品，于适当容器中准确测量体积和A₂₈₀值，此为样品Ⅴ，于2-8℃保存备用。层析图见图3。

3.6酶原的活化：以下trypsin酶的活性检测方法见附录1

活化：样品Ⅴ调pH 8.10，加氯化钙进行活化，缓慢将称量好的二水氯化钙加入样品内，搅拌溶解后，用2mol氯氧化钠调pH值8.10±0.02，然后计时，测A₂₈₀值随时检测活力至活力升至最高，速度缓慢时，用盐酸调pH值2.80，终止活化，检测trypsin活力及chymotrypsin活力。测A₂₈₀值，此为样品Ⅵ，2-8℃保存备用。

3.7 3K超滤：

A.超滤膜的准备：安装好10K超滤膜，用纯化水把超滤膜冲至中性并用10mM柠檬酸buffer润膜后备用。

B.超滤：将样品Ⅵ用准备好的超滤膜浓缩至2L左右，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液即为成品。检测trypsin活力及chymotrypsin活力并测A₂₈₀值。

3.8超滤膜的再生及贮存：

A：用0.1mol NaOH洗膜：取2mol NaOH的母液500ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升，搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱洗膜。当用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30~60分钟。

B：用纯化水冲洗膜至回流液和透过液pH试纸检测pH值为中性。

C：用0.01mol NaOH存膜：取2mol NaOH的母液50ml加到20L不锈钢桶中用纯化水定容到10升搅拌均匀，加热到35-45℃，开始用碱存膜。用pH试纸检测透过液和回流液pH值为碱性后再循环30分钟即可。存完后盖好上下封口平放于包装盒中，2-8℃环境贮存，备用。

3.9实验结果：

经测定先活化后层析的样品IV酶活力结果为trypsin活力：212.5U/mg，chymotrypsin活力：20.4U/mg。先层析后活化的样品VII酶活力结果为trypsin活力：240.4U/mg，chymotrypsin活力：0.14U/mg。后者纯度远远高于前者，是前者的数倍。

trypsin酶浓度及活性的检测：

1.trypsin底物的配制：

1.1 trypsin底物缓冲液的配制：0.0115mol CaCl₂+0.046mol Tris     pH：8.10±0.02

计算：需1MTris的体积为体积(ml)=V(ml)×0.046÷2

需1mol CaCl₂体积(ml)=V(ml)×0.0115

将取出的1M Tris和1M CaCl₂分别加入1000ml的烧杯中，再加入3/4配制体积的纯化水（2-8℃），校正pH计，用4M HCl调pH值为8.10±0.02，定容到所配制的体积，装于三角烧瓶中，并用石蜡膜封好后备用。

1.2配制0.01mol TAME：

用天平称取固体TAME量（g）：378.9×0.01×V_{所配的体积}（L），加入2-8℃的约2/3配制体积的纯化水，搅拌溶解，然后定容到所配制的体积，搅匀后2-8℃放置。

2.Chymotrypsin底物的配制：

2.1底物缓冲液的配制：0.08mol Tris+0.1mol CaCl₂     pH：7.80±0.02

计算：需1mol Tris的体积(ml)=V(ml)×0.08

需1mol CaCl₂的体积(ml)=V(ml)×0.1

将取出的1mol Tris和1mol CaCl₂分别加入1L烧杯中，再加入3/4配制体积的纯化水，搅拌均匀，校正pH计，用4mol盐酸调pH值为7.80±0.02，定容到所配制的体积，装于三角烧瓶中，并用石蜡膜封好备用。

2.2配制0.00107mol BTEE：

计算：需固体BTEE的量(g)=313.36×0.00107×V(ml)/1000

50%甲醇溶液的配制：取甲醇的量(ml)=1/2×配制体积V，将取好的甲醇加纯化水定容至配制体积，即得50%甲醇溶液，混匀后备用。

称取所需固体BTEE的量，加入50%甲醇溶液中，搅拌溶解后于2-8℃保存备用。

3.浓度及活性的检测

3.1打开分光光度计，预热30分钟左右，于280nm下用纯化水作空白调“0”再调“100”。

3.2 trypsin酶浓度的测定：

用pipette吸出一定量的trypsin放入比色皿中，按稀释倍数加入一定量的纯化水混合摇匀，用分光光度计测定其A₂₈₀值。根据公式计算出trypsin酶浓度。

trypsin酶浓度（mg/ml）=A₂₈₀×0.7

3.3trypsin酶活性的测定：

将分光光度计的波长调为247nm，用吸球吸取配好的底物缓冲液2.6ml，放入4ml的比色皿中，再加入0.01M TAME 0.3ml混合均匀作空白设置0点，然后加入稀释好的酶0.1ml混匀，立即放入分光光度计中，记时3分钟内的变化值。

trypsin酶的活力单位计算公式如下：

3.4chymotrypsin酶浓度的检测：

chymotrypsin酶浓度（mg/ml）=A₂₈₀值×0.49

3.5chymotrypsin酶活性的测定：

将分光光度计的波长调为256nm，用吸球吸取配好的底物缓冲液1.5ml，放入4ml比色皿中，再加入1.4ml配好的BTEE，混合均匀作空白，设置0点，然后加入稀释好的酶0.1ml混匀，立即放入分光光度计中，记时3分钟内的变化值。

chymotrypsin酶的活力单位，计算公式如下：

以上为本发明的技术方案尤其是实施例所采用的检测方法。

Claims (10)

1.一种从动物胰脏中制备高纯度胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：

（1）取动物胰脏，先进行组织破碎，加入至少2倍体积的提取剂，该提取剂是pH 3以上的无机或有机酸，提取至少12小时；

（2）提取后的样品进行离心，收集上清液体；

（3）将上清液加入盐析沉淀剂进行沉淀，至沉淀不再析出，得到的沉淀即为粗酶原I；

（4）用磷酸缓冲液溶解粗酶原I，用超滤膜超滤，从超滤开始随时监测透过液A₂₈₀值，至A₂₈₀<0.5时停止超滤，浓缩样品至提取剂体积的1/10左右，得到粗酶原II；

（5）将粗酶原II上到已平衡好的离子交换层析柱上，上样过程随时监测流出液A₂₈₀值，用Buffer A平衡3-5倍柱体积，再用Buffer A和Buffer B加0.1-0.4mol氯化钠，进行线性洗脱，流速2-5ml/min，随时监测流出液A₂₈₀值；收集样品，于容器中测量体积和A₂₈₀值，得到样品III，于2-8℃保存备用；该Buffer A为10m mol柠檬酸与0.1mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；Buffer B为10m mol柠檬酸与0.4mol氯化钠混合得到的pH为4.00±0.02的缓冲液；

（6）样品III调pH至碱性后，加氯化钙进行活化，测A₂₈₀值，随时检测活力至活力升至最高时，调pH值至酸性，终止活化，检测胰蛋白酶活力及胰凝乳蛋白酶活力；测A₂₈₀值，此为样品IV，于2-8℃保存备用；

（7）将样品IV用准备好的3-10K超滤膜浓缩，此过程随时监测透过液A₂₈₀值，然后用Buffer L将膜中样品冲出，直至回流液A₂₈₀值小于0.5，合并浓缩液和冲洗液，即得；该Buffer L为10m mol柠檬酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的提取剂为0.1-0.15mol/l的硫酸或盐酸或2-4%的三氯乙酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）中采用的盐析沉淀剂为溶解度超过200g/L的无机盐，或pH 3以下的酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的盐析沉淀剂为硫酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）为采用盐析沉淀剂沉淀进行分级沉淀处理，该分级沉淀处理为在上清液中依序加入20%、40%浓度的盐析沉淀剂进行分级沉淀。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（4）采用的超滤膜为3k-10k的超滤膜。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）为酶原在活化之前上阳离子交换层析，离子交换介质为SP树脂，平衡缓冲液为Buffer A，洗脱液为5倍柱体积的Buffer A和5倍柱体积的Buffer B，加0.1-0.4mol氯化钠进行线性梯度洗脱，上样过程中监测流出液A₂₈₀值＜0.5以下开始梯度洗脱，洗脱后监测A₂₈₀，收集A₂₈₀＞1至胰凝乳蛋白酶活力＜0.2之间的样品。

8.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤（6）粗酶原样品III在离子交换层析后，用氢氧化钠调节至碱性，再加氯化钙进行活化，该活化的过程为用氢氧化钠调pH至8.0-8.5，加0.1mol二水氯化钙活化，然后用盐酸调pH至2.5-3.0终止活化。

9.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤（7）所用超滤膜为3K超滤膜。

10.根据权利要求1所述的制备胰蛋白酶的方法，其特征在于：所述动物胰脏包括猪、牛、羊的动物的胰脏。

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