CN102618523B - 一种糜蛋白酶的纯化工艺 - Google Patents

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本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域一种糜蛋白酶的纯化工艺：碎浆；盐析，过滤；加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；过滤，用50kDa的超滤膜进行超滤；用5-10kDa的超滤膜进行超滤；滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；过滤，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超滤膜进行超滤；SP离子交换柱纯化；用10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，大于1500U/mg，可以减少用药量，减少患者医疗支出，也提高了该酶的用药安全性。

Description

一种糜蛋白酶的纯化工艺
技术领域    
本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域，特别涉及一种糜蛋白酶的纯化工艺。
背景技术   
糜蛋白酶是从牛胰脏或猪胰脏中提取分离纯化得到的一种蛋白酶。它能切断蛋白质肽链中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽链，故能有效酶解蛋白质，因而具有清创消脓，消化脓汁和去除坏死组织，助长新生肉芽生长的功能。在临床上主要用于抗炎消肿，有报道称其在辅助抗癌方面也具有不错效果。此外，在皮革工业上，糜蛋白酶常用于脱去动物皮上的毛等。
目前国内已对该酶做了大量的研究，提取纯化工艺多采用盐析多重结晶结合透析的方法。盐析多重结晶纯化能力弱，耗费时间长；低温激活耗费时间长，激活效率低；透析工艺耗时长，不便于工业化生产；且得到的产品纯度低，杂蛋白多，增加了用药的不良反应；传统工艺所得产品的酶活性一般在1000-1200单位/毫克左右，产品纯度为80-85%。酶活性低，产品中的杂蛋白增加了过敏反应风险。因此，提高糜蛋白酶的纯度，提高其活性可以提高该酶的用药安全性，是研究人员需关注的问题。
发明内容   
为了解决以上糜蛋白酶活性含量低，纯度低的问题，本发明提供了一种制得的糜蛋白酶活性含量高、纯度高的糜蛋白酶的纯化工艺。
本发明是通过以下方式实现的：
一种糜蛋白酶的纯化工艺，包括以下步骤：
（1）取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；
（2）向胰浆中加入硫酸溶液进行盐析，过滤；
（3）滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；
（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；
（5）滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；
（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；
（7）过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，调pH至5.0，25℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；
（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH 7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；
（9）调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
（10）沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；
（12）将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。
所述的纯化工艺，步骤（3）中滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤。
所述的纯化工艺，步骤（7）中用5N NaOH调节pH至5.0，加入的硫酸为5N的硫酸。
所述的纯化工艺，步骤（8）中胰蛋白酶加入量为5mg/100g晶体，加入晶体重量1倍的体积的pH 7.6、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6。
所述的纯化工艺，步骤（10）中超滤时添加pH 3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止。
冷纯化水是指10℃以下的纯化水。
本发明的有益效果：本发明的糜蛋白酶的纯化工艺，使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高,降低了以往因产品中的杂蛋白而导致的过敏反应风险；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，效价大于1500 U/mg，提高了该酶的用药安全性。
附图说明   
图1为实施例1所得产品HPLC检测纯度图。
具体实施方式
实施例1
（1）取新鲜牛胰10 kg，去除脂肪、结缔组织等，用绞肉机绞碎成胰浆；
（2）加入20L（胰浆体积量的2倍）0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼用10 L冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
（3）滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中低温放置过夜；
（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤,收集滤出液，
（5）用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；
（7）过滤收集滤饼390g，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的5倍，滴加5 N 硫酸使pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，用5 N NaOH调节pH至5.0，于25℃，孵育2-5 h，即有针状晶体析出，过滤收集晶体；
（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加适量5 N硫酸使溶解，加入晶体重量1倍体积量的pH 7.6 、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，以5 N NaOH调节pH 7.6，加入少量胰蛋白酶（2mg/100g晶体），于室温活化2-4 h ；
（9）激活结束后，用5 N硫酸调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
（10）沉淀用冷纯化水加5 N硫酸溶解，于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0 左右的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止；
（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱的洗脱液；
（12）将上述洗脱液于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0 左右的冷纯化水，至HPLC检测母液中蛋白纯度大于95%，HPLC检测结果见附图1。将上述超滤液通过0.22μm的滤膜除菌，冻干得产品65g，所得成品的效价为1536 U/mg。
实施例2
（1）取5kg冷冻的牛胰，将脂肪、结缔组织等去除，绞碎成胰浆；
（2）加入15 L（胰浆体积量的3倍） 0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼再用胰浆体积量1倍的冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
（3）滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤，冷室中低温放置过夜；
（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；
（5）滤出液用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
（6）滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜，次日过滤；
（7）过滤收集滤饼186g，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3倍，滴加5 N 硫酸使pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，用5N NaOH调节pH至5.0，于25℃，孵育2-5 h，即有针状晶体析出，过滤收集晶体；
（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加入晶体重量1倍体积量的pH 7.6 、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6，加入少量胰蛋白酶（5mg/100g晶体），于室温20℃活化2-4 h ；
（9）激活结束后，用5 N硫酸调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
（10）上述沉淀用冷纯化水加5 N硫酸溶解，于冷室中用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0 左右的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止；
（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；
（12）将上述洗脱液于冷室中用截留分子量30kDa的超滤膜进行超滤，不断添加pH 3.0 左右的冷纯化水，至HPLC检测母液中蛋白纯度大于95%为止，将上述超滤液通过0.22μm的滤膜除菌，冻干得产品32g，所得成品的效价为1525U/mg。
对比实施例
 (1）取5kg冷冻的牛胰，去除脂肪、结缔组织，绞碎成胰浆；
（2）加入10L 0.25 N硫酸溶液，于冷室中搅拌提取24h，过滤，滤饼再用胰浆体积量1倍的冷的0. 25 N硫酸同法搅拌提取1h，过滤，合并两次滤液；
（3）滤液搅拌并逐渐加入硫酸铵至0.4饱和度，加入少量硅藻土助滤，冷室中低温放置过夜；
（4）过滤收集滤液，滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜，次日过滤收集滤饼；
（5）将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3倍，滴加5 N 硫酸使pH达2.0，搅拌使溶解，缓慢加饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，用5N NaOH调节pH至5.0，于25℃，孵育48 h，过滤收集晶体；
（6）再按上述步骤重复结晶五次，过滤收集糜蛋白酶糜原结晶。
（7）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3倍，加入晶体重量1倍体积量的pH 7.6 、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6，加入少量胰蛋白酶（5mg/100g晶体），于室温5℃活化48 h ；
（9）激活结束后，用5 N硫酸调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集盐析品；
（10）加入上述滤饼重量1.3倍量的纯化水溶解，装入透析袋中，置于5℃冷水中透析48-72h，过滤取清液，冻干的成品45g， 效价为1250 U/mg，产品纯度84.1%。

Claims (5)

1.一种糜蛋白酶的纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：
（1）取牛胰，将脂肪、结缔组织除去，绞碎成胰浆；
（2）向胰浆中加入硫酸溶液进行提取，过滤；
（3）滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；
（4）过滤，滤液用截留分子量50kDa的超滤膜进行超滤；
（5）滤出液用截留分子量5-10kDa的超滤膜进行超滤；
（6）截留液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；
（7）过滤，将滤饼溶于冷纯化水中，冷纯化水的体积数为滤饼质量数的3-5倍，加硫酸调pH为2.0，搅拌使溶解，加入饱和硫酸铵溶液，饱和硫酸铵溶液的体积数为滤饼质量数的2倍，调pH至5.0，25℃，孵育2-5 h，有晶体析出，过滤收集晶体；
（8）晶体用冷纯化水加硫酸溶解，冷纯化水的体积数为晶体质量数的3-5倍，调节pH 7.6，加入胰蛋白酶，20℃活化2-4 h ；
（9）调节pH 至4.0，加入固体硫酸铵使达0.7饱和度，过滤收集沉淀；
（10）沉淀用冷纯化水加硫酸溶解，用截留分子量10kDa的超滤膜进行超滤；
（11）将上述超滤脱盐的料液加至已用0.05mol/L NaAC 缓冲液平衡好的SP离子交换柱上，用3倍柱体积的含0.2 mol/L NaCl 的缓冲液洗柱，用3倍柱体积的含0.4 mol/L NaCl 的缓冲液洗脱得洗脱液；
（12）将上述洗脱液用截留分子量10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。
2.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（3）中滤液中加入硫酸铵至0.4饱和度，加入硅藻土助滤。
3.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（7）中用5N NaOH调节pH至5.0，加入的硫酸为5N的硫酸。
4.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（8）中调节pH7.6的操作为加入晶体重量1倍的体积的pH 7.6、0.5 mol/L的磷酸盐缓冲液，以5N NaOH调节pH 7.6；胰蛋白酶加入量为5mg/100g晶体。
5.根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于步骤（10）中超滤时添加pH 3.0的冷纯化水，至母液电导与0.05mol/L NaAC 缓冲液电导相同为止。
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