CN101525598B

CN101525598B - 一种尿抑肽酶的纯化方法

Info

Publication number: CN101525598B
Application number: CN 200810034221
Authority: CN
Inventors: 季晓铭; 高霄梁; 庞骏; 谢莽; 李勇; 洪云海; 李晓东
Original assignee: Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-03-05
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2028-03-05
Also published as: CN101525598A

Abstract

本发明公开了一种尿抑肽酶(Human urinary trypsin inhibitor，hUTI)的纯化方法，所述方法包括步骤：a、将含尿抑肽酶的溶液和阳离子交换树脂接触使尿抑肽酶吸附在阳离子交换树脂上；和b、用pH1-7缓冲液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的尿抑肽酶，得到纯化的尿抑肽酶。本发明的方法简单高效，获得的产品纯度高。

Description

一种尿抑肽酶的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的纯化方法，具体地涉及人尿抑肽酶的纯化方法。

背景技术

人尿抑肽酶(Human urinary trypsin inhibitor，又称尿胰蛋白酶抑制剂，以下简称hUTI)是一种存在于人尿中的蛋白酶抑制剂，具有广谱的酶抑制作用，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等均有抑制作用。同时hUTI可稳定溶酶体酶和抑制心肌抑制因子的产生。早在1909年，Bauer和Reich就首次报道了尿液中存在胰蛋白酶制剂，直到五、六十年代才先后报道了数种方法在酸性条件下分离纯化了几种小分子量的hUTI，直到1977年Sumi等才成功地分离纯化得到尿中完整的hUTI分子(分子量67K)。

hUTI是一个极性很强的蛋白质，PI为2.0。天然状态的UTI在-20℃条件下至少可以稳定1年，且反复冻融也不影响活力。hUTI是一种典型的Kuniz型的蛋白酶抑制剂，具有两个活性功能区。由于两个活性功能区均有很广的抑酶谱，且不完全重叠，所以能够同时抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等多种水解酶的活性；另外，hUTI分解形成的低分子量成分也具有很强的抑制水解酶的作用。hUTI是一个单链多肽糖蛋白，由143个氨基酸和2个糖链组成，其N端第10个氨基酸(丝氨酸)上连有一条低硫酸化的硫酸软骨素糖胺聚糖链，第45个氨基酸(天冬酰胺)上连有含唾液酸的二天线复合型低聚糖链。hUTI的氨基酸序列是：

N- AVLPQEEEGSGGGQLVTEVTKKEDSCQLGYSAGPCMGMTSRYFYNGTSMACETFQYGGCMGNGNNFVTEKECIQTCRTVAACNIPVTRGPCRAFIQLWA

hUTI的临床应用如下：

1.在治疗急性胰腺炎中的应用

hUTI的制剂商品名为乌司他丁(Ulinastatin)，最早应用于临床是在急性胰腺炎。日本在80年代中期进行的一系列有关急性胰腺炎的临床研究，确证了该药治疗胰腺炎的安全性和有效性。最新报道，医学家用含乌司他丁的造影液治疗慢性胰腺炎病人非常有效，不仅可以防治可能造成的并发症，而且也是一个新的诊断性治疗方法。

2.在治疗休克中的应用

休克时组织灌注的减少引起缺氧和体内产生内毒素，细胞内溶酶体膜被破坏，释放出各种水解酶使重要脏器发生大范围的损伤。在休克常规治疗基础上加用乌司他丁，可改善休克时的循环状况，抑制休克的恶性循环，减少器官功能衰竭的发生，对休克的治疗提供了有力的支持。

3.抗手术侵袭的应用

研究表明，手术开始前到手术早期注射乌司他丁有预防细胞功能障碍和改善细胞能量代谢的作用。另有报道，术前及术后给予消化系手术病人乌司他丁，可明显抑制术后粒细胞弹性蛋白酶升高和纤维连接蛋白的分解。表明乌司他丁有防御组织破坏的作用。另外研究发现，乌司他丁对术后肺和肾也有保护作用。

4.在体外循环中的应用

目前，日本在体外循环中已经广泛使用乌司他丁，以预防手术后器官功能衰竭(尤其是肾与肺)和再灌注损伤。国内第四军医大学西京医院也报道了乌司他丁在体外循环心脏直视手术中的应用，结论显示乌司他丁能有效地抑制病人围手术期促炎细胞因子的释放，减轻体外循环引起的急性炎症反应。

5.在产科方面的应用

早产仍然是目前产科中一个未解决的重要问题。目前已经证实乌司他丁在保护羊膜、抑制宫缩、防治早产和降低围产期死亡率等方面有十分重要的意义。

6.在肿瘤治疗中的应用

目前许多基础研究表明，乌司他丁可以降低肿瘤细胞的扩散能力和侵袭力，抑制肿瘤细胞的转移。另外日本临床研究表明，使用大剂量顺铂进行肿瘤化疗时，在传统化疗法基础上加用乌司他丁，对肾功能有明显的保护作用，可大大减少肾衰的发生率。

7.在其他方面的应用

乌司他丁在减轻肺损伤、缓解ARDS病人呼衰、治疗肺曲霉病及肝、肾移植手术中保护重要器官功能及辅助减轻排异作用的机制等方面都有基础和临床研究报道。

目前hUTI的制备工艺主要是使用阴离子交换色谱法、疏水层析色谱法、金属螯合色谱法、亲和层析色谱法这几种方法的组合从含人尿抑肽酶的溶液中纯化hUTI，步骤较多，工艺复杂，总得率偏低。因此，本领域的技术人员仍在不断摸索更合理、更简单的纯化方法。

发明内容

本发明旨在提供一种简便、有效的纯化hUTI的方法。

本发明的另一个目的是提供一种由简便、有效的纯化方法所得到的高纯度的hUTI。

本发明的再一个目的是提供一种含有高纯度hUTI的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种人尿抑肽酶(Human urinary trypsininhibitor，hUTI)的纯化方法，所述方法包括步骤：

a、将含人尿抑肽酶的水溶液和阳离子交换树脂接触使人尿抑肽酶吸附在阳离子交换树脂上；

b、用pH1-7缓冲液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的人尿抑肽酶，得到纯化的人尿抑肽酶。

在另一优选例中，所述人尿抑肽酶包括人尿来源的hUTI及其变体和重组的r-hUTI及其变体。

在另一优选例中，所述的阳离子交换树脂上的活性基团包括磺酸丙基(-SO₃H)，次甲基磺酸基(-CH₂SO₃H)，羧基(-COOH)，羧甲基(-OCH₂COOH)，苯酚基(-C₆H₅OH)；更佳地，为磺酸丙基(-SO₃H)和次甲基磺酸基(-CH₂SO₃H)。

在另一优选例中，所述的阳离子交换树脂的骨架介质包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素、苯乙烯、丙烯酸和/或其衍生物的交联物。较佳地，所述阳离子交换树脂的骨架介质包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素、和苯乙烯聚二苯乙烯的交联物。

在另一优选例中，所述的步骤a在pH1-7的条件下进行；更佳地，为pH2-5。

在另一优选例中，所述的步骤b中的缓冲液pH为2-5。

在另一优选例中，所述步骤b中的缓冲液的盐浓度为0-3M。

在另一优选例中，所述步骤b中的缓冲液中的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子为Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、或Mg²⁺。

在本发明的第二方面，提供了一种如上述的纯化方法得到的人尿抑肽酶，所述的人尿抑肽酶采用凯氏定氮法测定蛋白含量，它的比活≥4000IU/mg蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它包括如上述的人尿抑肽酶以及药学上可接受的载体，所述的人尿抑肽酶采用凯氏定氮法测定蛋白含量，它的比活≥4000IU/mg蛋白。

据此，本发明提供了一种合理、简便的人尿抑肽酶纯化方法。

具体实施方式

本发明可以通过如下步骤：a、将含人尿抑肽酶的水溶液和阳离子交换树脂接触使人尿抑肽酶吸附在阳离子交换树脂上；和b、用pH1-7缓冲液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的人尿抑肽酶，来获得高纯度的hUTI纯化产物，其比活≥4000IU/mg蛋白。

具体而言，如背景技术部分中所述，由于hUTI的等电点值很低，为2附近，按照常理是无法使用阳离子交换树脂的，因为若要使阳离子树脂能够吸附目标物，那么目标物的pH必须维持在等电点以下才能保证带正电荷从而能够被阳离子树脂吸附，而hUTI的等电点如此低，已超出阳离子树脂的工作范围，因此现有技术都使用阴离子交换树脂和其它层析树脂的组合方法来纯化hUTI。

在探索改进现有技术方法的过程中，本发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现，可以通过阳离子交换树脂在等电点附近甚至于高于等电点的情况下吸附hUTI，从而使大量杂蛋白流出或被洗涤掉，进而获得高纯度的hUTI纯化产物，其比活≥4000IU/mg蛋白，高于现有技术所获得产品的比活，而且工艺简单高效，适合工业化生产。

含人尿抑肽酶(hUTI)的水溶液

本发明的hUTI的溶液浓度优选在4-10万IU(国际单位)/mL，可以按本领域常规技术获得。例如由下述方法制得：1.将hUTI粗品经过超滤和乙醇沉淀制成hUTI原料；2.将hUTI原料配成水溶液。含有hUTI的水溶液接着进行本发明提供的纯化步骤。

所述hUTI粗品可以按本领域常规技术制得。例如，收集健康成年男性尿，验收合格后，以每1000L尿液用5-8kg阴离子树脂吸附，然后用约15％的氯化钠溶液洗脱，洗脱液加硫酸铵至约55％，收集沉淀物，干燥，得hUTI粗品。其效价在40-60IU/mg左右。

所述hUTI原料可以按本领域常规技术制得。例如，上述hUTI粗品用水溶解，用30000MW超滤膜超滤浓缩，加乙醇至50-60％，收集上清，再加乙醇至约75％，收集沉淀物，真空干燥，得hUTI原料。

本发明的方法也可以用于从重组后得到的细胞培养基中纯化重组r-hUTI。本发明的纯化方法还可以纯化其它哺乳动物的抑肽酶，例如牛、马、猪、羊和猴。

纯化方法

本发明提供的hUTI纯化方法包括步骤：

(a)将含hUTI的水溶液和阳离子交换树脂接触使hUTI吸附在阳离子交换树脂上；

(b)用pH1-7缓冲液洗脱附，得到纯化的hUTI。

较佳地，步骤a中所使用的阳离子交换树脂是强酸型阳离子交换树脂，更佳地选自次甲基磺酸基(S)琼脂糖离子交换树脂或磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换树脂。

较佳地，本发明纯化方法步骤(a)中所述的含hUTI的溶液和阳离子交换树脂接触包括将阳离子交换树脂直接投入含hUTI的溶液中，然后搅拌5-120分钟；在另一优选例中，所述的接触是将阳离子交换树脂装在层析柱等层析装置中，使含hUTI的溶液流过层析柱，流速为每小时0.1-10个柱体积。

本发明通过一步阳离子交换色谱法纯化步骤可以获得高纯度的hUTI。

在本发明的优选实例中，用次甲基磺酸基(S)琼脂糖离子交换色谱法纯化时，包括：(i)次甲基磺酸基琼脂糖离子交换树脂平衡步骤；(ii)上样步骤；(iii)洗脱步骤。

次甲基磺酸基(S)琼脂糖离子交换色谱法的平衡液pH优选在1-7，更优选在2-5之间，特别优选在3-3.5之间。

上样液的pH、电导调整到与平衡液一致，上样浓度优选在4-10万IU(国际单位)/mL。上样结束后用平衡液洗涤，洗涤体积优选在5-15个柱体积，能使大量杂蛋白流出。

洗脱优选在0-3M盐浓度的缓冲液中进行。所述洗脱用含盐缓冲液的盐包括氯化物、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐或其组合，其中所述盐类的阳离子为Na⁺、K⁺、NH₄ ⁺、Mg²⁺。洗脱步骤可以用线性梯度法洗脱，也可以用逐步阶段法洗脱。用阶段法洗脱的盐浓度更优选在0.2-1M，特别优选在0.3-0.5M。

收集含有hUTI的馏分，加乙醇沉淀。收集沉淀，真空干燥。

本发明的阳离子交换色谱法纯化步骤中，脱附的条件除了使用含高浓度盐的缓冲液进行脱附外，还可以使用提高pH的缓冲液来进行脱附。

在另一优选例中，用磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法进行纯化的条件如下：磺酸丙基(SP)琼脂糖离子交换色谱法的平衡液pH优选在3-3.5之间；上样浓度优选在4-10万IU(国际单位)/mL。

洗脱优选在pH1-7的缓冲液中进行，更优选在pH3-5的缓冲液，特别优选在pH4-4.5的缓冲液。所述的缓冲液选择柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液。

本发明制得的hUTI，比活不低于4000IU/mg。

本发明提供一种药物组合物，它含有上述纯化方法得到的hUTI以及药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明的药物组合物可用于本领域所了解的hUTI能使用的各个方面，例如但不限于，治疗急性胰腺炎、休克的辅助治疗、抗手术侵袭、用于体外循环、用于产科、或用于肿瘤治疗。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、提供了一种简便的纯化hUTI的方法(仅通过一步阳离子交换色谱法)，适于工业化生产；

2、本发明提供的纯化方法所得到的hUTI比活高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

取hUTI原料(效价690IU/mg)20克，总效价1380万IU，用水溶解至260mL，调pH约3.2，离心收集上清，调电导3-4ms，以约10cm/h的流速通过直径为5cm、高度为10cm的次甲基磺酸基琼脂糖树脂S-Sepharose F.F.(200mL，Amersham提供)，此树脂事先已用0.1M柠檬酸，pH3.2的缓冲液平衡好。上样结束后，用2升平衡液洗涤，流速10cm/h。然后用洗脱液(0.1M柠檬酸+0.4MNaCl，pH3.2)进行洗脱，流速10cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集馏出峰，合并有效成份约0.25L，加入3倍-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到3.3克纯化的hUTI干品，测得比活4201IU/mg蛋白(采用凯氏定氮法测定蛋白含量)。

实施例2

取hUTI原料(效价690IU/mg)30克，总效价2070万IU，用水溶解至390mL，调pH约3.5，离心收集上清，调电导3-4ms，以约15cm/h的流速通过直径为5cm、高度为15cm的磺酸丙基琼脂糖树脂SP-Sepharose F.F.(300mL，Amersham提供)，此树脂事先已用0.1M柠檬酸，pH3.5的缓冲液平衡好。上样结束后，用3升平衡液洗涤，流速15cm/h。然后用洗脱液(0.06M NaAc，pH4.2)进行洗脱，流速15cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集馏出峰，合并有效成份约0.35L，加入3倍-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到4.8克干品，测得比活4320IU/mg蛋白(采用凯氏定氮法测定蛋白含量)。

对比例：

取hUTI原料(效价690IU/mg)20克，总效价1380万IU，用1.0M NaCL溶液溶解至1L，调pH约6.0，离心收集上清，上疏水柱Butyl-Sepharose 4F.F.(Amersham提供)吸附，然后用含0.5M NaCl及0.1M醋酸钠的缓冲液进行梯度洗脱，用紫外检测器监测280nm处，收集馏出峰，合并有效成份；

上述收集液调整pH至6.0，上阴离子交换柱Q-Sepharose F.F.(Amersham提供)，用含0.5M NaCl及0.1M磷酸盐的缓冲液进行洗脱，洗脱液用分子量1万的超滤膜超滤浓缩；

上述超滤浓缩液调pH8.0，上凝胶柱Superdex200 prep grade吸附，用含5％NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，加入3倍-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到2.4克纯化的hUTI干品，测得比活2930IU/mg蛋白(采用凯氏定氮法测定蛋白含量)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种人尿抑肽酶的纯化方法，所述方法包括如下步骤：

取hUTI原料20克，效价690IU/mg，总效价1380万IU，用水溶解至260mL，调pH约3.2，离心收集上清，调电导3-4ms，以10cm/h的流速通过200mL，Amersham提供的直径为5cm、高度为10cm的次甲基磺酸基琼脂糖树脂S-Sepharose F.F.，此树脂事先已用0.1M柠檬酸，pH3.2的缓冲液平衡好；上样结束后，用2升平衡液洗涤，流速10cm/h；然后用0.1M柠檬酸+0.4M NaCl，pH3.2的洗脱液进行洗脱，流速10cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集馏出峰，合并有效成份约0.25L，加入3倍-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到3.3克纯化的hUTI干品，采用凯氏定氮法测定蛋白含量，测得比活4201IU/mg蛋白。

2.一种人尿抑肽酶的纯化方法，所述方法包括如下步骤：

取hUTI原料30克，效价690IU/mg，总效价2070万IU，用水溶解至390mL，调pH约3.5，离心收集上清，调电导3-4ms，以约15cm/h的流速通过300mL，Amersham提供的直径为5cm、高度为15cm的磺酸丙基琼脂糖树脂SP-Sepharose F.F.，此树脂事先已用0.1M柠檬酸，pH3.5的缓冲液平衡好；上样结束后，用3升平衡液洗涤，流速15cm/h，然后用0.06M NaAc，pH4.2的洗脱液进行洗脱，流速15cm/h，用紫外检测器监测280nm处，收集馏出峰，合并有效成份约0.35L，加入3倍-10℃的无水乙醇沉淀过夜，次日离心收集沉淀，用无水乙醇脱水，真空干燥得到4.8克干品，采用凯氏定氮法测定蛋白含量，测得比活4320IU/mg蛋白。