CN103880951B - 一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法 - Google Patents
一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法。此层析介质由乌司他丁亲和配体和普通层析介质连接而成。其亲和配体为聚赖氨酸3000，普通层析介质是sephadex，亲和配体和层析介质通过亲水间隔臂进行连接。然后利用上述的亲和层析介质对乌司他丁进行纯化生产。通过调整各种溶液的浓度、pH值，洗涤、洗脱的流速等工艺，从原料中快速分离纯化分子量为37-43kDa的乌司他丁。整个过程只需要经过一步亲和层析，纯化得到的乌司他丁纯品，其收率大于80%，比活大于5000IU/mg.pr。整个纯化步骤消耗时间短，活性回收率及比活较高，适于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备乌司他丁的方法，具体涉及一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法。
背景技术
乌司他丁是一种Kunitz型的广谱蛋白酶抑制剂，能够有效的抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、乳糖酶、脂肪酶、透明质酸酶和其他胰腺酶的活性。此外，其具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子（MDF）产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。
其在临床医疗中有广泛的应用，适用症包括急性胰腺炎（包括外伤性、术后及内窥镜逆行性胰胆管造影术后的急性胰腺炎）、慢性复发性胰腺炎的急性恶化期，急性循环衰竭（出血性休克、细菌性休克、外伤性休克、烧伤性休克）；也广泛用于胸外科手术、消化系统手术、肿瘤手术、器官移植、器官切除手术及CPB手术；还用于治疗与预防肿瘤化疗产生的肾功能障碍。
目前，日本的MochidaPharmaceutical(Tokyo,Japan)公司有较成熟的产品，分子量为67kDa，国内按中国药典2013版规定，分子量要求为37～43kDa。然而乌司他丁的分离纯化步骤通常包括了多步的硫酸铵沉淀，表面活化剂处理，热处理，离子交换层析，分子筛层析等。而过多的纯化步骤，导致了纯化时间较长，蛋白和活性回收率较低的结果。
为了大规模生产乌司他丁，必须减少分离纯化的步骤。因此，需要提供快速高效的乌司他丁分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可克服上述现有技术中的缺点的乌司他丁制备方法，该方法利用了乌司他丁亲和层析介质，使纯化乌司他丁可以大规模的快速制备。
本发明的技术方案为：
第一方面，一种乌司他丁亲和层析介质的合成方法，其合成方法如下：
（1）活化：取亲和层析介质sephadex,先用10-12倍纯水洗涤，过滤抽干。再加入活化缓冲液A，在40-45℃下搅拌2.5-3.5h，然后过滤，再用纯化水洗涤后过滤抽干；
（2）亲水间隔臂的连接：活化后的亲和层析介质sephadex加含5%-10%的1，3-二氨基-2-羟基丙烷的水溶液，而后在加热至60-70℃后搅拌，再用纯化水洗涤后过滤抽干；
（3）疏水间隔臂的连接：加三聚氯氰的水-丙酮溶液，通过氢氧化钠调pH值至7.5-8.5，冷却至4-8℃搅拌，再用纯化水洗涤，过滤抽干；
（4）连接上亲和配体：加聚赖氨酸水溶液，搅拌，调pH值至9-10，用纯化水洗涤，过滤抽干即可；
所述亲和层析介质sephadex为sephadexG75。
所述亲和配体聚赖氨酸的分子大小为聚赖氨酸3000。
所述缓冲液A为0.5MNaOH,10%二甲亚砜，6%环氧氯丙烷。
第二方面，制备纯化的乌司他丁，其制备方法如下：
（1）取乌司他丁亲和层析介质，装柱，用PH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液冲洗平衡亲和层析介质。
（2）将含有乌司他丁粗品，加入2-3倍的水溶液进行解析，然后过滤、将溶液浓缩至3.5-4.5L，取浓缩液；
（3）将上述（2）的浓缩液通过乌司他丁亲和介质进行吸附，然后采用pH值为7.0-8.0洗脱缓冲液B冲洗亲和介质，用以洗涤杂质；
（4）最后用PH值为7.5-9.5的洗脱缓冲液Ｃ洗脱亲和介质上吸附的乌司他丁，收集纯化后的乌司他丁溶液，浓缩、冷冻干燥即得。
所述缓冲液B为磷酸盐溶液。
所述缓冲液C为甘氨酸溶液。
本发明通过乌司他丁亲和层析介质生产纯品乌司他丁，可以大规模快速分离分子量为37-43的纯化乌司他丁，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到乌司他丁纯品，整个纯化步骤消耗时间短，活性回收率可大于80%，同时比活比活大于5000IU/mg.pr，符合中国药典要求，适于大规模推广应用。
附图说明
图1为聚赖氨酸3000的分子结构图。
具体实施方式
实施例1：
1乌司他丁亲和层析介质合成：
（1）取sephadexG752000g，用10倍体积的纯化水洗涤，过滤，然后抽干成湿饼状；加2000ml活化缓冲液（0.5MNaOH,10%二甲亚砜，6%环氧氯丙烷），40℃搅拌2.5h，然后倒入漏斗中，用10倍体积纯化水洗涤，过滤，然后抽干成湿饼状。
（2）活化的sephadexG75介质加2000ml含5%1，3-二氨基-2-羟基丙烷的水溶液,60℃搅拌20h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。
（3）加2000ml0.1M/L三聚氯氰的水-丙酮溶液，用0.1M氢氧化钠调体系PH为7.5，4℃冰浴搅拌1h，用10倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。
（4）加2000ml0.15mol聚赖氨酸3000水溶液，40℃搅拌12h，PH维持9-10，用纯化水清洗，抽干成饼状即可。
2乌司他丁亲和层析介质纯化乌司他丁：
（1）取乌司他丁亲和层析介质2000ml，装柱，用10L0.02MPH值为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗平衡亲和层析介质。
（2）取115.2百万单位乌司他丁粗品，经2倍水溶液溶解，然后过滤、将溶液浓缩至3.5L，取浓缩液；
（3）将上述（2）的浓缩液过上述（1）经过平衡的乌司他丁亲和层析介质吸附，然后用10L0.02MPH7.0磷酸盐洗脱缓冲液洗涤干净。
（4）再用0.05MGLY-NaOH甘氨酸溶液（PH9.0）洗脱，收集洗脱流出蛋白高峰段，检测效价为97.7百万单位，收率为84.8%，比活为5321.8IU/mg.pr，分子量为40，符合中国药典要求。
实施例2：
1乌司他丁亲和层析介质合成：
（1）取sephadexG753000g，用12倍体积的纯化水洗涤，过滤，然后抽干成湿饼状；加3000ml活化缓冲液（0.5MNaOH,10%二甲亚砜，6%环氧氯丙烷），45℃搅拌3.5h，然后倒入漏斗中，用12倍体积纯化水洗涤，过滤，然后抽干成湿饼状。
（2）活化的sephadexG75介质加2000ml含10%1，3-二氨基-2-羟基丙烷的水溶液,70℃搅拌20h，用12倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。
（3）加3000ml0.1M/L三聚氯氰的水-丙酮溶液，用0.1M氢氧化钠调体系PH为8.5，8℃冰浴搅拌1h，用12倍体积纯化水清洗，抽干成湿饼状。
（4）加3000ml0.15mol聚赖氨酸3000水溶液，40℃搅拌12h，PH维持9-10，用纯化水清洗，抽干成饼状即可。
2乌司他丁亲和层析介质纯化乌司他丁：
（1）取乌司他丁亲和层析介质3000ml，装柱，用10L0.02MPH值为8.0的磷酸盐缓冲液冲洗平衡亲和层析介质。
（2）取115.2百万单位乌司他丁粗品，经3倍水溶液溶解，然后过滤、将溶液浓缩至4.5L，取浓缩液；（3）将上述（2）的浓缩液过上述（1）经过平衡的乌司他丁亲和层析介质吸附，然后用15L0.02MPH8.0磷酸盐洗脱缓冲液洗涤干净。（4）再用0.05MGLY-NaOH甘氨酸溶液（PH9.5）洗脱，收集洗脱流出蛋白高峰段，检测效价为96.2单位，收率为82.8%，比活为5215.8IU/mg.pr，分子量为42，符合中国药典要求。
Claims (3)
1.一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
第一方面，一种乌司他丁亲和层析介质的合成方法，其合成方法如下：
（1）活化：取亲和层析介质sephadex,先用10-12倍纯水洗涤，过滤抽干；再加入活化缓冲液A，在40-45℃下搅拌2.5-3.5h，然后过滤，再用纯化水洗涤后过滤抽干；
（2）亲水间隔臂的连接：活化后的亲和层析介质sephadex加含5%-10%的1，3-二氨基-2-羟基丙烷的水溶液，而后在加热至60-70℃后搅拌，再用纯化水洗涤后过滤抽干；
（3）疏水间隔臂的连接：加三聚氯氰的水-丙酮溶液，通过氢氧化钠调pH值至7.5-8.5，冷却至4-8℃搅拌，再用纯化水洗涤，过滤抽干；
（4）连接上亲和配体：加聚赖氨酸水溶液，搅拌，调pH值至9-10，用纯化水洗涤，过滤抽干即可；
第二方面，制备纯化的乌司他丁，其制备方法如下：
（1）取乌司他丁亲和层析介质，装柱，用PH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液冲洗平衡亲和层析介质；
（2）将含有乌司他丁粗品，加入2-3倍的水溶液进行解析，然后过滤、将溶液浓缩至3.5-4.5L，取浓缩液；
（3）将上述（2）的浓缩液通过乌司他丁亲和介质进行吸附，然后采用pH值为7.0-8.0洗脱缓冲液B冲洗亲和介质，用以洗涤杂质；
（4）最后用PH值为7.5-9.5的洗脱缓冲液Ｃ洗脱亲和介质上吸附的乌司他丁，收集纯化后的乌司他丁溶液，浓缩、冷冻干燥即得；
所述缓冲液A为0.5MNaOH,10%二甲亚砜，6%环氧氯丙烷，所述缓冲液B为磷酸盐溶液，所述缓冲液C为甘氨酸溶液。
2.根据权利要求1所述的一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法，其特征在于：所述亲和层析介质sephadex为sephadexG75。
3.根据权利要求1所述的一种通过乌司他丁亲和层析介质制备纯品乌司他丁的方法，其特征在于：所述亲和配体聚赖氨酸的分子大小为聚赖氨酸3000。
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