CN102660525B - 一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法。所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法为：吸附剂吸附尿液中的尿蛋白一定时间后，收集吸附尿蛋白后的吸附剂，集中洗脱，将洗脱出的尿蛋白溶液通过金属螯合亲和层析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制剂不吸附，而人尿激肽原酶则结合到该金属螯合亲和层析柱上，从而实现二者的分离，收集洗脱峰，制备人尿激肽原酶粗制品。采用该技术方案可以实现尿液中的人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的高效分离，便于人尿激肽原酶和人尿胰蛋白酶抑制剂后续纯化处理，提高纯化收率；实现了两种蛋白粗制品的联产，生产成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及一种尿蛋白提取方法，尤其涉及一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法。
背景技术
人尿中含有三百多种蛋白质，目前已开发提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等，这些组分在临床上具有重要的治疗价值。
人尿激肽原酶（Urinary Kallidinogenase，以下简称为KN），是从人尿中分离提取的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右，分子量约54000D，属于丝氨酸蛋白酶。它能够激活人血浆激肽原转化为激肽。目前，已经被开发成用于治疗急性脑梗死的药物。
人尿胰蛋白酶抑制剂（Urinary trypsin inhibitor，以下简称为UTI）是一种从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2左右，分子量65000D，具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；从而抑制炎症介质的过度释放；改善微循环和组织灌注。而在机体受到严重损伤时起抑制全身性炎症反应（SIRS）的发生发展、继而阻断多脏器功能障碍（MODS），保护脏器功能等作用。
尿蛋白产品目前主要的生产过程是：首先，在各地经过尿蛋白的吸附、洗脱、沉淀等步骤制备尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品经过下游的分离纯化和精制，制备尿蛋白原料药；最后灌装成品制剂，用于临床。
中国人尿资源非常丰富，依赖于这一有利条件，尿蛋白产业从上世纪七十年代末就已经开始发展起来，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的规模化生产方式主要有两种，方法一：收集尿液，运输到加工点，用吸附剂吸附尿蛋白，由于尿液来源分散，收集成本高，加上城市卫生改造，收集已经越来越困难；方法二：直接将吸附尿蛋白的树脂放置在厕所进行连续在线吸附，然后收集吸附后的树脂运回加工点进行分离纯化。这种方法对环境无污染，可以在大中城市进行收集，尿源集中，运输成本较低，极大地扩大了尿蛋白的收集区域。
目前，KN粗品主要按照第一种方法制备，需要首先收集尿液，再用吸附KN的吸附剂单独对尿液进行吸附处理。尿液中的KN含量低、不稳定、容易降解，导致生产的收率很低、成本很高，后续纯化难度大。
在采用第二种方法制备KN粗品时，采用高效阴离子吸附剂，放置尿斗或尿池中，其可以在人尿流经吸附剂的同时，把其中KN和UTI等蛋白有效吸附，从而实现这些尿蛋白的高度富集，再经过集中洗脱、沉淀等步骤得到粗品。该方法中，KN迅速被固定化，大大提高了其稳定性，由于避免了尿液的大规模运输，也明显降低了成本。但是，该方法中，由于吸附剂较强的吸附性能，同时吸附了较多蛋白，给下游的纯化带来较大的难度。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均为酸性蛋白，常规的纯化方法对其较难分离，影响了KN的后续纯化。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效分离出尿液中的KN和UTI，便于KN和UTI后续纯化的制备人尿激肽原酶粗制品的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法：吸附剂吸附尿液中的尿蛋白一定时间后，收集吸附尿蛋白后的吸附剂，集中洗脱，将洗脱出的尿蛋白溶液通过金属螯合亲和层析柱，其中的人尿胰蛋白酶抑制剂不吸附，而人尿激肽原酶则结合到该金属螯合亲和层析柱上，从而实现二者的分离，收集洗脱峰，制备人尿激肽原酶粗制品。
所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，包含以下步骤：
1)将阴离子交换树脂作为吸附剂放置在公共厕所的尿池和尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白；
2)收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗、解吸处理；
3)用0.5－1.0M的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱峰；
4)超滤浓缩；
5)超滤浓缩液调节pH和电导，上样已经用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱，再用平衡液冲洗；
6)继续用洗脱溶液洗脱，收集洗脱峰；
7)在收集的洗脱峰中加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。可采用离心或者板框过滤收集沉淀。
步骤5的金属螯合亲和层析柱，其螯合的金属离子可以是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。优选Cu2+。
步骤5中，金属螯合亲和层析柱平衡液为0.01－0.2M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0－2M。优选0.02M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0.2M。
步骤5中，超滤浓缩液调节pH和电导，pH6－9，电导0.5－10mS/cm。优选pH8.0，电导2.2mS/cm。
在步骤5和步骤6之间，增加一个冲洗步骤，使用pH5－8，NaCl浓度≤0.2M的冲洗金属螯合亲和层析柱，所述的冲洗液缓冲介质为0.01－0.2M磷酸盐或者醋酸盐。加入低pH冲洗步骤，以提高人尿激肽原酶粗制品粗制品的比活，优选配方为：0.1M醋酸－醋酸钠（PH5.0），0.1M氯化钠。
步骤6中，金属螯合亲和层析柱洗脱溶液为0.01－0.2M醋酸—醋酸钠溶液，pH4.5－2.8。优选洗脱液配方为：20mM醋酸—醋酸钠（pH3.8）。
在步骤5中，收集上样和平衡液冲洗穿透，加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，制备人尿激肽原酶含量极低的人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。可采用离心或者板框过滤收集沉淀。
有益效果：本发明与现有技术相比，其有益效果是：
1、由于使用了对KN和UTI有高效分离效果的金属螯合亲和层析工艺，实现了两种蛋白的有效分离，大大降低了两种产品后续纯化的难度；
2、实现了两种蛋白粗制品的联产，生产成本较低；
3、步骤5与步骤6之间增加一个冲洗步骤，能够提高KN粗制品的比活；
4、利用本发明方法得到的UTI和KN具有以下特性：KN粗制品活性大于1.0PNA单位/g粗制品，比活（单位/A280）应≥0.02PNA单位/A280，UTI粗制品活性大于3万单位/g粗制品，比活（单位/A280）应≥200单位/A280。
附图说明
图1为本发明实施步骤示意图；
图2为金属螯合亲和层析图谱，纵坐标为280nm的光吸收，横坐标为流出溶液体积。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
如图1所示，一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法步骤为：将大孔阴离子交换树脂作为吸附剂，装入透水性较好的滤布袋内，直接放在公共厕所的尿池和尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白，一定时间后，收集吸附尿蛋白后的树脂，集中解析，将洗脱出的尿蛋白溶液通过Cu2+金属螯合亲和层析柱，其中的UTI不吸附，而KN蛋白则结合到该金属螯合亲和层析柱上，从而实现二者的分离，这样可以得到UTI粗制品和KN蛋白粗制品。
实施例1
大孔型阴离子交换树脂100公斤作为吸附剂，经过再生处理后，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在人流量较多的厕所的便斗或便池中，使尿液或被水稀释后的尿液流过树脂，24小时后，收集吸附尿蛋白的树脂，将吸附后树脂用饮用水冲洗干净，最后装柱；用0.1M的NaCl进行冲洗，用0.8M的NaCl进行洗脱，收集洗脱峰。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节pH至8.0和电导至2.2mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合亲和层析柱（Chelating sepharose FF）；再用平衡液（平衡液配方：0.02M磷酸盐缓冲，0.2MNaCl，pH8.0）冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液（U液），用20mM的醋酸－醋酸钠缓冲液（pH3.8）洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰（K液）。
U液与K液分别加入硫酸铵粉末，边加边搅，至饱和，静置4小时，U液加入硅藻土80g，K液加入硅藻土40g，分别用板框过滤收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品190克。KN粗制品95克，详见表1。从表1中可见，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98％的KN活性集中在KN粗制品中，二者实现了很好的分离。
表1：
| 重量（g） | UTI含量（U） | KN含量（PNA） | |
| UTI粗制品 | 190 | 1.21×107 | 3.16 |
| KN粗制品 | 95 | 1.03×104 | 175 |
UTI粗制品每克含UTI63000U，比活为250U/A280。KN粗制品每克含KN1.85PNA，比活0.016PNA U/A280。
实施例2
大孔型阴离子交换树脂200公斤作为吸附剂，经过再生处理后，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在人流量较多的厕所的便斗或便池中，使尿液或被水稀释后的尿液流过树脂，24小时后，收集吸附尿蛋白的树脂，将吸附后树脂用饮用水冲洗干净，最后装柱；用0.1M的NaCl进行冲洗；用0.8M的NaCl进行洗脱，收集洗脱峰。
用截留分子量30K的超滤膜超滤浓缩，将超滤浓缩液调节pH至8.0和电导至2.2mS/cm，上已经平衡好的Cu2+金属螯合亲和层析柱；再用平衡液（平衡液配方：0.02M磷酸盐缓冲，0.2M NaCl，pH8.0）冲洗该金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液（U液），用0.2M醋酸－醋酸钠（0.1M氯化钠，PH5.0）溶液冲洗金属螯合亲和层析柱后，用20m M的醋酸－醋酸钠缓冲溶液（pH3.8）进行洗脱，收集洗脱峰（K液），图2为其层析图谱。
U液与K液分别加入硫酸铵粉末，边加边搅，至饱和，静置4小时，U液加入硅藻土160g，K液加入硅藻土60g，分别用板框过滤收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品412克。KN粗制品135克，详见表2。从表2中可见，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而98％的KN活性集中在KN粗制品中，二者实现了很好的分离。
表2：
| 重量（g） | UTI含量（U） | KN含量（PNA） | |
| UTI粗制品 | 412 | 2.35×107 | 5.76 |
| KN粗制品 | 135 | 1.81×104 | 303 |
UTI粗制品每克含UTI57000U，比活为226U/A280。KN粗制品每克含KN2.24PNA，比活0.039PNA U/A280。由于本实施例中增加一个低pH冲洗步骤，明显提高了KN粗制品的比活。
实施例3
大孔型阴离子交换树脂100公斤作为吸附剂，经过再生处理后，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在人流量较多的厕所的便斗或便池中，使尿液或被水稀释后的尿液流过树脂，24小时后，收集吸附尿蛋白的树脂，将吸附后树脂用饮用水冲洗干净，最后装柱；用0.1M的NaCl进行冲洗，用0.5M的NaCl进行洗脱，收集洗脱峰。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节pH至6和电导至0.5mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Zn2+的金属螯合亲和层析柱；再用平衡液（平衡液配方：0.01M磷酸盐缓冲液，pH6.0）冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液（U液），用0.01M磷酸盐缓冲液（0.15M氯化钠，PH8.0）溶液冲洗金属螯合亲和层析柱后，用0.01M的醋酸溶液（pH2.8）洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰（K液）。
U液与K液分别加入硫酸铵粉末，边加边搅，至饱和，静置4小时，离心，在U液沉淀中加入硅藻土80g，K液沉淀中加入硅藻土40g，得到UTI粗制品192克。KN粗制品86克，详见表3。从表3中可见，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而约70％的KN活性集中在KN粗制品中。
表3：
| 重量（g） | UTI含量（U） | KN含量（PNA） | |
| UTI粗制品 | 192 | 9.8×106 | 53 |
| KN粗制品 | 86 | 6.4×103 | 116 |
UTI粗制品每克含UTI51200U，比活为272U/A280。KN粗制品每克含KN1.35PNA，比活0.015PNA U/A280。
实施例4
大孔型阴离子交换树脂100公斤作为吸附剂，经过再生处理后，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在人流量较多的厕所的便斗或便池中，使尿液或被水稀释后的尿液流过树脂，24小时后，收集吸附尿蛋白的树脂，将吸附后树脂用饮用水冲洗干净，最后装柱；用0.1M的NaCl进行冲洗，用1.0M的NaCl进行洗脱，收集洗脱峰。
用截留分子量30K的超滤膜进行超滤浓缩，将超滤浓缩液调节pH至9，电导至10mS/cm，上已经平衡好的金属离子为Ni2+的金属螯合亲和层析柱；再用平衡液（平衡液配方：0.2M磷酸盐缓冲，2M NaCl，pH9.0）冲洗金属螯合亲和层析柱，收集上样穿透液和冲洗穿透液（U液），用0.2M的醋酸钠溶液（pH4.5）洗脱金属螯合亲和层析柱，收集洗脱峰（K液）。
U液与K液分别加入硫酸铵粉末，边加边搅，至饱和，静置4小时，U液加入硅藻土80g，K液加入硅藻土40g，分别用板框过滤收集和吹干沉淀，得到UTI粗制品195克。KN粗制品81克，详见表4。从表4中可见，UTI基本上全部集中在UTI粗制品中，而45％的KN活性集中在KN粗制品中。
表4：
| 重量（g） | UTI含量（U） | KN含量（PNA） | |
| UTI粗制品 | 195 | 1.32×107 | 91 |
| KN粗制品 | 81 | 1.1×104 | 74 |
UTI粗制品每克含UTI67700U，比活为132U/A280。KN粗制品每克含KN0.91PNA，比活0.015PNA U/A280。
Claims (6)
1.一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于：吸附剂吸附尿液中的尿蛋白一定时间后，收集吸附尿蛋白后的吸附剂，集中洗脱，将洗脱出的尿蛋白溶液通过金属螯合亲和层析柱，上样已经用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱，所述的金属螯合亲和层析柱平衡液为0.01－0.2M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0－2M，pH6.0－9.0，金属螯合亲和层析柱的螯合的金属离子为Cu2+、 Zn2+、 Ni2+ 、Fe3+中的任意一种，再用平衡液冲洗，其中的人尿胰蛋白酶抑制剂不吸附，而人尿激肽原酶则结合到该金属螯合亲和层析柱上，从而实现二者的分离，收集洗脱峰，制备人尿激肽原酶粗制品。
2.根据权利要求1所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)将阴离子交换树脂作为吸附剂放置在公共厕所的尿池和尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白；
2)收集已吸附尿蛋白的树脂，进行清洗、解吸处理；
3)用0.5－1.0M的NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱峰；
4)超滤浓缩；
5)超滤浓缩液调节pH和电导，上样已经用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱，再用平衡液冲洗；
6)继续用洗脱溶液洗脱，收集洗脱峰；
7)在收集的洗脱峰中加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。
3.根据权利要求2所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于：步骤5中，超滤浓缩液调节pH和电导， pH6－9，电导0.5－10mS/cm。
4.根据权利要求2所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于：在步骤5和步骤6之间，增加一个冲洗步骤，使用pH5－8，NaCl浓度≤0.2M的冲洗液冲洗金属螯合亲和层析柱，所述的冲洗液缓冲介质为0.01－0.2M磷酸盐或者醋酸盐。
5.根据权利要求2所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于，步骤6中，金属螯合亲和层析柱洗脱溶液为0.01－0.2M醋酸－醋酸钠溶液，pH4.5－2.8。
6.根据权利要求2所述的制备人尿激肽原酶粗制品的方法，其特征在于：在步骤5中，收集上样穿透液和冲洗穿透液，加入硫酸铵粉末至饱和，静置2－10小时后，收集沉淀，制备人尿激肽原酶含量极低的人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品。
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