CN101863974A - 一种直接富集尿蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种直接在小便池或便斗中用吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的吸附剂运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。本方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括离子交换树脂等特定吸附剂，对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法对厕所的卫生状况无明显影响，并大幅度降低了尿液运输的成本以及带来的一系列环境问题。

Description

一种直接富集尿蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种直接在小便池或便斗中用吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的吸附剂运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。

背景技术

尿胰蛋白酶抑制剂，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Human Urinary Trypsin Inhibitor)。尿胰蛋白酶抑制剂是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，分子量经HPLC法测定为60～70KD，经SDS-PAGE测定为40～50KD，等电点为2.6，是一种对热稳定的酸性蛋白。该蛋白目前主要用于胰腺炎、休克等疾病的治疗。

尿激酶(Urokinase，简写为UK)，是由人肾小管上皮细胞产生并分泌到尿中的一种碱性蛋白酶，等电点值在pH8～9之间，人尿中平均含量为5～7iu/ml。在尿激酶的天然来源中，主要有两种形式的尿激酶分子，即高分子量尿激酶(54000道尔顿)和低分子量尿激酶(33000道尔顿)。

人尿激肽原酶(英文名：Urinary Kallidinogenase)是从人尿中分离提取的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右。目前，已经被开发成用于治疗急性脑梗死的药物。

这些蛋白具有重要的治疗价值，在疾病的治疗中发挥了重要的作用。目前，均主要来自人尿。生产方式基本上都是先收集尿液，再将尿液运至相应场所进行集中处理，尿激酶主要利用硅胶进行吸附，尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶主要利用壳聚糖进行吸附，再通过氨水或高盐等解吸条件，将蛋白从吸附剂上解吸，通过硫酸铵沉淀等方法得到含有相应蛋白的粗品。

随着经济的发展，人们生活水平日益改善，社会对环境重视程度不断提高，尿蛋白的收集越来越困难。按照目前男性尿蛋白制备通行的工艺：先收集尿液，再集中到加工点进行尿蛋白吸附和后续处理。该法收集男性尿液，气味较大，不符合城市卫生要求，生产尿蛋白粗品所需尿液，已从大中城市已经全面退出，目前，收集的尿液主要来自小城镇、乡村，收集的成本越来越高，而且收集时间间隔也越来越长，尿蛋白的降解、变性较为严重，给后续的纯化也带来更多的困难。本发明的目的就是在符合城市卫生化要求的基础上，利用离子交换吸附剂，对尿液或稀释尿液中尿激酶、尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等尿蛋白进行现场吸附，解决了上述难题。

发明内容

本发明首次利用树脂，通过处理后，直接在便池或便斗中吸附尿液或稀释尿液中的蛋白；

以前的尿蛋白吸附方法，必需收集尿液，然后将尿液运至加工点，统一处理。本专利方法的创新性在于不用收集尿液，可直接吸附流经树脂的尿液的尿蛋白。本发明的方法对厕所的卫生状况无明显影响，大幅度降低了尿液运输、加工成本以及带来的一系列环境问题。本发明的目的是提供一种直接在小便池或便斗中用吸附剂吸附尿液或者稀释尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的吸附剂运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

(1)将吸附剂再生处理，水冲至中性；

(2)将处理好的吸附剂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中；

(3)尿液流经吸附剂，尿蛋白被吸附；

(4)收集吸附尿蛋白的吸附剂，运至加工点进行后续处理。

所述的吸附剂再生处理，可采用常规的吸附剂再生处理方法，包括酸或/和碱再生、水冲至中性。

本发明所述的吸附剂包括树脂，凝胶等。

其中所述树脂包括普通树脂和大孔型树脂，优选为大孔型树脂，可包括阴离子交换树脂，阳离子交换树脂，阴阳离子混合树脂或者两性树脂；其中两性树脂是指树脂同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团。

所述的尿液可以是原尿液，也可以是经过稀释后的尿液。

装有吸附剂的滤布袋可在卫生间便斗或便池中放置一段时间，放置一定时间可以根据情况而定，如果放置时间短，吸附的蛋白量较小，如果放置时间较长，蛋白可能变性、降解等，一般可为24小时左右。

所述透气性较好的滤布是指该滤布既能保证尿液能透过，但又不致使吸附剂外漏。优选50目孔径的滤布。

所述的尿蛋白包括等电点低于5的蛋白，也包括等电点高于8的尿蛋白，或者同时包括等电点低于5和高于8的尿蛋白；其中，等电点低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶等，等电点高于8的尿蛋白包括尿激酶等。

本发明所述的后处理包括解吸，过滤、超滤浓缩、盐析等步骤得到含有尿蛋白的蛋白质粗制品以及进一步纯化得到高纯度的尿蛋白的过程。

优选的，本发明的技术方案如下：

(1)将树脂再生处理，水冲至中性；

(2)将阴离子交换树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点低于5的尿蛋白，和/或将阳离子交换树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点高于8的尿蛋白，和/或将阴阳离子混合树脂或两性树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点低于5和/或高于8的尿蛋白；

(3)放置一定时间后，尿液流经树脂，尿蛋白被吸附；

(4)收集吸附尿蛋白的树脂，运至加工点进行后续处理。

其中所述树脂包括普通树脂和大孔型树脂，优选为大孔型树脂，可包括阴离子交换树脂，阳离子交换树脂，阴阳离子混合树脂或者两性树脂；树脂骨架包括聚苯乙烯、丙烯酸、酚醛树脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素等任意一种或几种；配基为磺酸基、羧酸基、磷酸基等阳离子交换基团和伯胺、仲胺、叔胺和季胺基等阴离子基团。经过对大量各种类型吸附剂的筛选，基于对尿液和稀释尿液中目标蛋白吸附能力的比较，获得了对尿激酶、尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等尿蛋白有高吸附量的吸附剂，阳离子树脂优选配基为-SO₃ ^-的大孔型聚丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂，阴离子交换树脂优选配基为-N⁺(CH₃)₃的大孔型聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂，两性树脂优选聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂，配基为〔-N⁺(CH₃)₃〕和COO^-。应用这些树脂蛋白交换量大，流速高(吸附力强)。

所述的两性树脂是指树脂同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团。

所述的尿蛋白包括等电点低于5的蛋白，也包括等电点高于8的尿蛋白，或者同时包括等电点低于5和高于8的尿蛋白；其中，等电点低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶等，等电点高于8的尿蛋白包括尿激酶等。

本发明所述的后处理包括解吸，过滤、超滤浓缩、盐析等步骤得到含有尿蛋白的蛋白质粗制品以及进一步纯化得到高纯度的尿蛋白的过程。

在本发明尿蛋白粗品原料富集方法中，原尿直接流经树脂，能有效的吸附尿蛋白中尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等；经测定，其理化性质和生理活性不会发生改变。

本发明的方法，能有效吸附稀释尿液中的目标蛋白，研究者进行了各种吸附剂对尿液从原液至稀释100倍的吸附研究，在此范围内，本发明优选的吸附剂对目标蛋白均可以进行有效吸附。最佳的尿蛋白吸附范围是从尿原液到稀释10倍。

本发明利用树脂的离子交换性质，利用尿激酶、尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等尿蛋白等电点的区别，将有效成分吸附上树脂，从而达到有效吸附的目的。

利用本发明方法所述的阴离子交换树脂得到的尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶具有以下特性：尿胰蛋白酶抑制剂活性大于5万单位/kg树脂，人尿激肽原酶活性大于0.001PNA单位/kg树脂，所制备的粗制品尿胰蛋白酶抑制剂活性大于1万单位/g粗制品，比活(单位/E₂₈₀)应≥30单位/E₂₈₀，人尿激肽原酶活性大于0.01PNA单位/g粗制品，比活(单位/E₂₈₀)应≥0.1PNA单位/E₂₈₀。

利用本发明方法所述的阳离子交换树脂得到的尿激酶具有以下特性：尿激酶活性大于1000单位/kg树脂，所制备的粗制品尿激酶活性大于1万单位/g粗制品，比活(单位/E₂₈₀)应≥30单位/E₂₈₀。

利用本发明方法所述的两性离子交换树脂得到的尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶和尿激酶具有以下特性：尿胰蛋白酶抑制剂活性大于3万单位/kg树脂，人尿激肽原酶活性大于0.001PNA单位/kg树脂，尿激酶活性大于500单位/kg树脂。

本方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括离子交换树脂等特定吸附剂，对流经吸附剂的包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接进行有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法对厕所的卫生状况无明显影响，并大幅度降低了尿液运输的成本以及带来的一系列环境问题。

具体实施方式

以下用实例说明本发明的方法，但本发明并不限于以下应用。

实施例1：

大孔阴离子交换树脂10公斤(聚苯乙烯树脂，配基为〔-N⁺(CH₃)₃〕)，经过3％盐酸、3％NaOH再生处理，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在卫生间的便斗或便池中(每天可流过80L尿液的便池放1公斤树脂)，尿液或被水稀释后的尿液流过树脂；24小时后，将吸附尿蛋白的树脂集中到加工点，用10％硫酸铵溶液进行洗脱；将洗脱液加硫酸铵粉末至饱和，静置2小时，硅藻土过滤收集沉淀部分，沉淀吹干，得到尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶粗制品120克。每克粗制品含尿胰蛋白酶抑制剂31000U，含人尿激肽原酶0.3PNA。

实施例2：

将配基为-N⁺(CH₃)₃的聚苯乙烯树脂、丙烯酸树脂、酚醛树脂、葡聚糖、壳聚糖、纤维素吸附剂各1公斤，分别再生、平衡处理后，按实施例1的方法进行尿蛋白吸附和洗脱，结果：配基为-N⁺(CH₃)₃的聚苯乙烯树脂、丙烯酸树脂分别得到10克、9.5克粗制品，尿胰蛋白酶抑制剂总活性分别为325000U和287000U，含人尿激肽原酶3.2PNA，2.6PNA，其它吸附剂尿胰蛋白酶抑制剂总活性均低于200000U，人尿激肽原酶低于2PNA。

实施例3：

大孔阳离子交换树脂20公斤(丙烯酸树脂，配基为-SO₃ ^-)，经过3％盐酸、3％NaOH再生处理，水冲至中性，装入孔径为50目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在卫生间的便斗或便池中(每天可流过30L尿液的便池放1公斤树脂)，尿液或被水稀释后的尿液流过树脂；24小时后，将吸附尿蛋白的树脂集中到加工点，用10％硫酸铵溶液进行洗脱；将洗脱液加硫酸铵粉末至饱和，静置2小时，硅藻土过滤收集沉淀部分，沉淀吹干，得到尿激酶粗制品50克。每克粗制品含尿激酶36000U。

实施例4：

将配基为磷酸根、-COO^-、-SO₃ ^-的聚苯乙烯树脂、丙烯酸树脂、酚醛树脂、葡聚糖、壳聚糖、纤维素吸附剂各1公斤，分别再生、平衡处理后，按实施例3的方法进行尿蛋白吸附和洗脱，结果：配基为-SO₃ ^-的聚苯乙烯树脂、丙烯酸树脂得到6.2克、5.1克粗制品，尿激酶活性为210000U和185000U，其它吸附剂制备的尿激酶粗制品活性均低于150000U。

实施例5：

两性树脂5公斤(聚苯乙烯树脂，配基为〔-N⁺(CH₃)₃〕和COO^-)，经过3％NaOH再生处理，水冲至中性，装入孔径为60目的滤布袋中，将装好树脂的滤布袋放置在卫生间的便斗或便池中(每天可流过100L尿液的便池放1公斤树脂)，尿液或被水稀释后的尿液流过树脂；24小时后，将吸附尿蛋白的树脂集中到加工点，用10％硫酸铵溶液进行洗脱；将洗脱液加硫酸铵粉末至饱和，静置2小时，硅藻土过滤收集沉淀部分，沉淀吹干，得到尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶粗制品52克。每克粗制品含尿胰蛋白酶抑制剂27000U，含人尿激肽原酶0.15PNA，含尿激酶31000U。

尿胰蛋白酶抑制剂活性测定方法见国家食品药品监督管理局标准YBH09342008。

尿激酶活性测定方法见《中华人民共和国药典》。

人尿激肽原酶活性测定方法见国家食品药品监督管理局标准YBH30442005。

Claims (10)

1.一种直接在小便池或便斗中用吸附剂吸附尿液或者稀释尿液中中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的吸附剂运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法，包括如下步骤：

(1)将吸附剂再生处理，水冲至中性；

(2)将处理好的吸附剂装在滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中；

(3)尿液流经吸附剂，尿蛋白被吸附；

(4)收集吸附尿蛋白的吸附剂，运至加工点进行后续处理。

2.根据权利要求1所述的尿蛋白富集方法，其特征在于吸附剂包括树脂、凝胶。

3.根据权利要求2所述的尿蛋白富集方法，其特征在于树脂为大孔型树脂，包括阴离子交换树脂，阳离子交换树脂，阴阳离子混合树脂或者两性树脂；树脂骨架材料包括聚苯乙烯、丙烯酸、酚醛树脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素中任意一种或几种；配基为包括磺酸基、羧酸基、磷酸基的阳离子交换基团或为包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺基的阴离子基团。

4.根据权利要求3所述的尿蛋白富集方法，所述的阳离子树脂为配基为-SO₃ ^-的大孔型聚丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂，阴离子交换树脂为配基为-N⁺(CH₃)₃的大孔型聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂，两性树脂为聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂，配基为〔-N⁺(CH₃)₃〕和COO^-。

5.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述的尿蛋白富集方法，其特征在于包括等电点低于5的尿蛋白和/或等电点高于8的尿蛋白。

6.根据权利要求4中所述的尿蛋白富集方法，其特征在于等电点低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶；等电点高于8的尿蛋白包括尿激酶。

7.根据权利要求3-6任一所述的尿蛋白富集方法，其特征在于包括但不限于如下步骤：

(1)将树脂再生处理，水冲至中性；

(2)将阴离子交换树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点低于5的尿蛋白，和/或将阳离子交换树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点高于8的尿蛋白，和/或将阴阳离子混合树脂或两性树脂装在透过性较好的滤布袋中，直接放置在卫生间的便斗或者便池中，吸附等电点低于5和/或高于8的尿蛋白；

(3)尿液流经树脂，尿蛋白被吸附；

(4)收集吸附尿蛋白的树脂，运至加工点进行后续处理。

8.根据权利要求7所述的尿蛋白富集方法，其特征在于离子交换树脂或两性树脂的骨架材料包括聚苯乙烯、丙烯酸、酚醛树脂、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、纤维素等任意一种或几种；配基为包括磺酸基、羧酸基、磷酸基的阳离子交换基团或为包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺基的阴离子基团。

9.根据权利要求7或8所述的尿蛋白富集方法，其中所述的两性树脂是指同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的树脂。

10.根据权利要求7-9任一所述的尿蛋白富集方法，其特征在于等电点低于5的尿蛋白包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶；等电点高于8的尿蛋白包括尿激酶。