CN105087531B - 一种制备尿激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种直接在小便池或便斗中用装改性硅胶的滤布袋吸附尿液中的尿蛋白，并将吸附尿蛋白的滤布袋运至加工点进行后续处理的尿蛋白富集方法。本方法利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括改性硅胶,大孔树脂，甲壳素，离子树脂等；对尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法对厕所的卫生状况无明显影响，并大幅度降低了尿液运输的成本以及带来的一系列环境问题。

Description

一种制备尿激酶的方法
技术领域
本发明属于分离纯化领域，特别涉及一种制备尿激酶的方法。
背景技术
尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人体及哺乳动物的尿液中，血液凝固时人体的正常机能，但是某些病理状态下，在血管内形成血酸，堵塞血液流通时就会造成严重后果，尿激酶是溶血栓药物，但它并不直接用于血块本身，而是首先激活体内的纤溶酶脘，成为有活性的纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白酶凝块，使其分解成可溶性多碳。
尿激酶由多种分子量形式，高分子量的尿激酶溶解血栓临床效果要比低分子量的约高一倍，因此，国际上把尿激酶的分子量作为质量标准的检查项目之一。
尿激酶在冻干状态下可稳定数年，1mg/ml的无菌溶液可以在冰箱中保存数月，在盐浓度低于0.03MNaCl时稳定性下降，在极低的盐浓度时，随着酶的失活产生沉淀，人血蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。
由于尿激酶有着重要的医药价值，所以相继有很多专刊报道了尿激酶粗品的提取方法，因人体尿液中尿激酶含量很低，取尿激酶的主要关键就是如何从大量的尿液中富集尿激酶，从目前发表的专刊来看，主要有三类方法：（1）、发泡法：即以高速搅拌使酶液发泡，然后使泡沫液化，加入硫酸铵使尿激酶沉淀。（2）、沉淀剂法：在尿液中加入沉淀剂，使尿激酶沉淀，尿激酶则保留在沉淀中，（3）、吸附剂，此法应用最多，选择适当的吸附剂，有选择的吸附尿激酶。本工艺就采用离子交换树脂做吸附剂，生产尿激酶粗品。
随着经济的发展，人们生活水平日益改善，社会对环境重视程度不断提高，尿蛋白的收集越来越困难。按照目前男性尿蛋白制备通行的工艺：先收集尿液，再集中到加工点进行尿蛋白吸附和后续处理。该法收集男性尿液，气味较大，不符合城市卫生要求，生产尿蛋白粗品所需尿液，已从大中城市已经全面退出，目前，收集的尿液主要来自小城镇、乡村，收集的成本越来越高，而且收集时间间隔也越来越长，尿蛋白的降解、变性较为严重，给后续的纯化也带来更多的困难。
国内外也展开了大量了对尿激酶的分离研究工作。吉林大学生物化学教研室尿激酶组（吉林大学学报自然科学版1979 年第二期）采用724 离子交换树脂作为尿激酶吸附剂，收率达到60-70% ；华东理工大学的周昕等（中国医药工业杂志199627（6））研究了用大孔离子交换树脂HD-2 对尿激酶的吸附，吸附效率达到85% ；西北大学的董聿生等（高等学校化学学报VOL.23NO.6）等采用了磁性高分子微球对尿激酶的吸附，活性回收率在40% ～70% 之间；张博达（专利号：CN91108119.4）采用高岭土吸附尿激酶和集落刺激因子；郑光会（专利号：CN91100702.4）采用氧化锌和硫酸铜作为沉淀剂，沉淀人尿中的尿激酶。然而，上述方法均需要吸附材料在原尿中的长时间的浸泡、搅拌，因此采用这些方法也无法避免大量原尿的收集和运输，因此不仅成本高，而且收集、运输原料不方便。
CN88103076.7 公开了一种采用碱处理的聚丙烯腈超滤膜浓缩原尿，使得尿激酶吸附在膜上，该方法能得到纯度比较高的尿激酶，然而该膜的价格昂贵，而且在浓缩过程中需要加压设备，大规模生产也难以实现，同时也无法避免大量原尿的收集和运输问题。
发明内容
本发明的目的就是在符合城市卫生化要求的基础上，对尿液或稀释尿液中尿激酶、尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等尿蛋白进行现场吸附，解决了上述难题。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种制备尿激酶的方法，包括：
1) 将滤布袋直接放置在卫生间的便斗或者便池中；
2) 尿液流经滤布袋，尿蛋白被吸附；
3) 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理。
步骤1）所述的滤布袋，包括自外而内依次设置的棉纱布层、改性纤维素层和改性硅胶层。
改性硅胶为苯基酰胺化官能团硅胶。
苯基酰胺化官能团硅胶通过以下方法制得：
1）硅胶在盐酸溶液中浸泡后，洗涤至无氯离子，干燥；
2）将步骤（1）干燥后的硅胶于200-300℃中活化后，加入2-氯-6-甲基苯胺，苯基三氯硅烷回流反应，过滤，沉淀洗涤、烘干得前驱体；
3）将前驱体和8.0mL吡啶溶解于70.6mL THF中，置于冰水浴中，控制温度在0-5℃之间，向溶液中缓慢的加入10.000g，74.4mmol 3-乙氧基丙烯酰氯，约15min滴完。混合物温热至20℃并在该温度下搅拌2h，然后再将三颈瓶置于冰水浴中（0-10℃），加入1mol/L的盐酸13.5mL，加入35mL水，减压蒸馏使溶液浓缩成稠的於浆，冷却至室温，将於浆用33.0mL甲苯稀释，并搅拌15min（温度20-22℃)，然后将其置于冰水浴（0℃）中搅拌1h。真空过滤收集固体，用70mL的水洗涤两次，洗至中性，即得。
活化温度优选230℃，2-氯-6-甲基苯胺、一苯基三氯硅烷和干燥后的硅胶的用量比为（5-10）ml ：（1-3）g ：1g；回流反应时间为10-40h。
步骤3) 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理，包括以下步骤：
1）收集吸附尿蛋白的吸附剂，用pH6.0，0.1mol/L 磷酸缓冲液400ml 溶解，搅拌30分钟，静置倒出上清液，再用16％（w/v）硫酸铵400ml 溶解，搅拌30 分钟，取上清。
2）再补加4.6g 硫酸铵，搅拌溶解后，用1N 的NaOH 溶液调节pH 至8.4，静置2 小时；
3）滤纸过滤收集沉淀，用生理盐水洗涤一次，再用一定浓度的EDTA溶液螯合Cu2+洗涤，
4）然后再向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液。
5）将尿激酶溶液置于冷冻干燥机。
测定活性为4.12×105 IU。
EDTA均为4.5mmol，5℃条件下轻轻搅拌15min。
本发明相对于最接近的现有技术具有以下优点：
本发明提供的尿激酶快速吸附袋结构简单、使用方便，通过改性纤维素层和改性硅胶层联合使用，制得的吸附袋能够在卫生间便池即时、快速吸附尿激酶，减少传统方法中原尿收集、运输等环节，大大简化了尿激酶粗体的提取工序和工作量，方便、快速、大大节约了成本，易于大规模工业生产。
利用特定尿蛋白的等电点性质，通过使用包括离子交换树脂等特定吸附剂，对流经吸附剂的包括尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、尿激酶等尿蛋白直接进行有效吸附，避免了尿液的收集步骤。该方法对厕所的卫生状况无明显影响，并大幅度降低了尿液运输的成本以及带来的一系列环境问题。
该方法整个过程时间短，操作很简单，成本低，不需要特殊设备，降低设备的投入成本；不会引起尿激酶的明显降解，且明显提高了尿激酶的比活。
具体实施方式
实施例1
苯基酰胺化官能团硅胶通过以下方法制得：
1）硅胶在盐酸溶液中浸泡后，洗涤至无氯离子，干燥；
2）将步骤（1）干燥后的硅胶于200-300℃中活化后，加入2-氯-6-甲基苯胺，苯基三氯硅烷回流反应，过滤，沉淀洗涤、烘干得前驱体；
3）将前驱体和8.0mL吡啶溶解于70.6mL THF中，置于冰水浴中，控制温度在0-5℃之间，向溶液中缓慢的加入10.000g，74.4mmol 3-乙氧基丙烯酰氯，约15min滴完。混合物温热至20℃并在该温度下搅拌2h，然后再将三颈瓶置于冰水浴中（0-10℃），加入1mol/L的盐酸13.5mL，加入35mL水，减压蒸馏使溶液浓缩成稠的於浆，冷却至室温，将於浆用33.0mL甲苯稀释，并搅拌15min（温度20-22℃)，然后将其置于冰水浴（0℃）中搅拌1h。真空过滤收集固体，用70mL的水洗涤两次，洗至中性，即得。
活化温度优选230℃，2-氯-6-甲基苯胺、一苯基三氯硅烷和干燥后的硅胶的用量比为（5-10）ml ：（1-3）g ：1g；回流反应时间为10-40h。
实施例2
一种制备尿激酶的方法，包括：
1) 将滤布袋直接放置在卫生间的便斗或者便池中，所述的滤布袋包括自外而内依次设置的棉纱布层、改性纤维素层和改性硅胶层。改性硅胶为苯基酰胺化官能团硅胶；
2) 尿液流经滤布袋，尿蛋白被吸附；
3) 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理。
实施例3 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理
运至加工点进行后续处理，包括以下步骤：
1）收集吸附尿蛋白的吸附剂，用pH6.0，0.1mol/L 磷酸缓冲液400ml 溶解，搅拌30分钟，静置倒出上清液，再用16％（w/v）硫酸铵400ml 溶解，搅拌30 分钟，取上清。
2）再补加4.6g 硫酸铵，搅拌溶解后，用1N 的NaOH 溶液调节pH 至8.4，静置2 小时；
3）滤纸过滤收集沉淀，用生理盐水洗涤一次，再用一定浓度的EDTA溶液螯合Cu2+洗涤，
4）然后再向沉淀中加入一定量的氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液。
5）将尿激酶溶液置于冷冻干燥机。
6）最后将尿激酶沉淀置于冷冻干燥机。测定活性为4.12×105 IU。
EDTA均为4.5mmol，5℃条件下轻轻搅拌15min。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种制备尿激酶的方法，包括：
1) 将装改性硅胶的滤布袋直接放置在卫生间的便斗或者便池中；
2) 尿液流经滤布袋，尿蛋白被吸附；
3) 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理；
其中，步骤3) 收集吸附尿蛋白的滤布袋，运至加工点进行后续处理包括如下步骤：
1）收集吸附尿蛋白的吸附剂，用pH6.0，0.1mol/L 磷酸缓冲液400ml 溶解，搅拌30 分钟，静置倒出上清液，再用16％硫酸铵400ml 溶解，搅拌30 分钟，取上清；
2）再补加4.6g 硫酸铵，搅拌溶解后，用1N 的NaOH 溶液调节pH 至8.4，静置2 小时；
3）滤纸过滤收集沉淀，用生理盐水洗涤一次，再用EDTA溶液螯合Cu2+洗涤，Cu2+浓度为3-4mmol/L，加入Cu2+时要控制尿液的pH在6.0；EDTA为4.5mmol/L，8℃条件下轻轻搅拌15min；
4）然后再向沉淀中加入氨水，使沉淀中的尿激酶充分解离，得尿激酶溶液；
5）将尿激酶溶液置于冷冻干燥机。
2.如权利要求1所述的方法，所述的滤布袋，包括自外而内依次设置的棉纱布层、改性纤维素层和改性硅胶层，改性硅胶为苯基酰胺化官能团硅胶。
3.如权利要求2所述的方法，苯基酰胺化官能团硅胶通过以下方法制得：
1）硅胶在盐酸溶液中浸泡后，洗涤至无氯离子，干燥；
2）将步骤（1）干燥后的硅胶于200-300℃中活化后，加入2-氯-6-甲基苯胺，苯基三氯硅烷回流反应，过滤，沉淀洗涤、烘干得前驱体；
3）将前驱体和8.0mL吡啶溶解于70.6mL THF中，置于冰水浴中，控制温度在0-5℃之间，向溶液中缓慢的加入10.000g，74.4mmol 3-乙氧基丙烯酰氯，约15min滴完；混合物温热至20℃并在该温度下搅拌2h，然后再置于0-10℃冰水浴中，加入1mol/L的盐酸13.5mL，加入35mL水，减压蒸馏使溶液浓缩成稠的於浆，冷却至室温，将於浆用33.0mL甲苯稀释，并在温度20-22℃下搅拌15min，然后将其置于0℃冰水浴中搅拌1h；真空过滤收集固体，用70mL的水洗涤两次，洗至中性，即得；
4.如权利要求3所述的方法，活化温度为220℃，2-氯-6-甲基苯胺、苯基三氯硅烷和干燥后的硅胶的用量比为（5-10）ml ：（1-3）g ：1g；回流反应时间为10-40h。
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