CN104370998B - 一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法 - Google Patents

一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，属于生物质纯化技术领域。为解决现有技术中纯化大豆球蛋白碱性多肽时处理时间长、产率低、且操作条件复杂的问题。本发明采用微生物膜吸附法纯化富集大豆球蛋白碱性多肽，针对其抗菌特性，菌体与大豆球蛋白碱性多肽溶液经振荡处理，菌体与大豆球蛋白碱性多肽产生吸附作用。本发明操作简单，处理条件温和，产量高，纯度高，可得到具有高活性的大豆球蛋白碱性多肽。使用本发明大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法纯化得到的大豆球蛋白碱性多肽的纯度达95%以上，得率达80%以上。

Description

一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法
技术领域
本发明涉及多肽物质纯化技术领域，特别涉及一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法。
背景技术
研究人员发现，除了具有一般蛋白质的营养价值外，多肽类物质对人体还具有非常重要的不可替代的生理调节作用，如抗氧化、降血脂、抗癌等作用。近年来，大豆蛋白的粘附性、起泡性、乳化性等功能特性已被研究人员广泛的研究和认识。为进一步提高大豆类产品的利用价值和附加值，大豆多肽的开发研究势在必行。
大豆球蛋白碱性多肽是通过断裂酸性多肽与碱性多肽之间的二硫键后，通过等电点沉淀法从大豆球蛋白中提取得到的一类多肽物质。已有研究表明大豆球蛋白碱性多肽具有抗菌活性，并且具有阳离子性和疏水性，这与已发现的大多数抗菌多肽具有相似性。目前，添加于食品中的防腐剂主要是人工化学合成防腐剂，若能将天然的抗菌多肽应用于食品防腐中，前景将非常广泛，市场潜力巨大。
目前，大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法有柱层析法、高效液相色谱法和模拟膜吸附法等。其中，柱层析法反应时间长，产率低；高效液相色谱法和模拟膜吸附法不仅反应时间长，产率低，而且操作条件复杂。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了一种操作简便、时间短、条件温和、产率高、所得大豆抗菌多肽纯度高且活性强的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法。
本发明的技术方案为：。
一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括以下步骤：
1）取浓度为5×108-2×109cfu/mL的葡萄球菌菌液，离心收集菌体；
2）用磷酸盐缓冲液洗涤步骤1）中离心收集的菌体以除去培养基，收集洗涤后的菌体；
3）取粗大豆球蛋白碱性多肽，加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，配制成0.5-5mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液；
4）将步骤2）中洗涤后的菌体重悬于步骤3）配制的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，该大豆球蛋白碱性多肽溶液中菌体浓度为1.1×108-2×108cfu/mL，在36-38℃下振荡处理20-40min；
5）振荡处理结束后，所得溶液采用微孔滤膜滤除滤液，然后采用磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，得到菌悬液；
6）将步骤5）所得菌悬液进行超声处理，离心，保留上清液；
7）将步骤6）所得上清液冷冻干燥，得纯化的大豆球蛋白碱性多肽。
优选的，步骤1）中所述的葡萄球菌为培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌。
优选的，步骤2）、步骤3）步骤5）中所用的磷酸盐缓冲液相同，所用磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7.3-7.5。步骤2）中选用磷酸盐缓冲液用以保持菌体所处环境的pH值稳定。步骤3）和步骤5）中所用的磷酸盐缓冲液与步骤2）用的磷酸盐缓冲液相同，以使菌体所处环境保持稳定，以避免由于环境变化引起的实验误差。
优选的，步骤3）中大豆球蛋白碱性多肽溶液的浓度为1-2mg/mL。
优选的，步骤4）中菌体浓度为1.1×108-1.66×108cfu/mL。高菌落浓度可增加菌体与大豆球蛋白碱性多肽的吸附作用，提高产量。
作为优选，步骤4）中在37℃下振荡处理30min。振荡处理目的是使菌体与大豆球蛋白碱性多肽充分接触，从而较快较好的产生吸附作用；37℃是菌体生存的最适温度，可保持菌体的最佳活性。
优选的，步骤5）中所述微孔滤膜为孔径为0.22微米的滤膜。
优选的，步骤6）中超声处理时，电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s间隙时间为4s，共循环作用10-12次。该频率可较好的增大细胞膜的通透性，增加菌体与大豆球蛋白碱性多肽产生吸附作用的几率，间隙时间（间隙时间内未进行超声处理）可避免由于长时间超声对细胞产生破坏作用。
本发明的有益效果为：
本发明采用微生物膜吸附法纯化富集大豆球蛋白碱性多肽，针对其抗菌特性，菌体与大豆球蛋白碱性多肽溶液经振荡处理，菌体与大豆球蛋白碱性多肽产生吸附作用。本发明操作简单，处理条件温和，产量高，纯度高，可得到具有高活性的大豆球蛋白碱性多肽。
具体实施方式
实施例1
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取1mL培养至对数生长期（菌落浓度为1.1×109cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500r/min下离心20min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取10mg纯度为57.2%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4），搅拌均匀，配制成1mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.1×108 cfu/mL，37℃振荡处理30min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯化后的大豆球蛋白碱性多肽4.7mg，得率为81.9%，纯度为95.7%。
实施例2
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取2 mL培养至对数生长期（菌落浓度为5.7×108 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取10mg纯度为61.8%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4），搅拌均匀，配制成1mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.14×108 cfu/mL，37℃振荡处理30min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽5.1mg，得率为82.5%，纯度为96.4%。
实施例3
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取2 mL培养至对数生长期（菌落浓度为8.3×108 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.3）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取20mg纯度为56.0%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.3），搅拌均匀，配制成2mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.66×108cfu/mL，37℃振荡处理40min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.3）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽9.3mg，得率为83.1%，纯度为96.5%。
实施例4
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取2 mL培养至对数生长期（菌落浓度为7.2×108 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取20mg纯度为59.3%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5），搅拌均匀，配制成2mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.44×108 cfu/mL， 37℃振荡处理20min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽8.6mg，得率为72.5 %，纯度为95.2%。
实施例5
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取2 mL培养至对数生长期（菌落浓度为7.9×108 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取5mg纯度为64.1%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4），搅拌均匀，配制成2mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.58×108 cfu/mL，36℃振荡处理30min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽10.1mg，得率为80.5%，纯度为98.1%。
实施例6
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取1 mL培养至对数生长期（菌落浓度为1.7×109 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取40mg纯度为51.3%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5），搅拌均匀，配制成4mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.7×108 cfu/mL，38℃振荡处理20min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.5）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽14.2mg，得率为62.8%，纯度为96.6%。
实施例7
大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，包括步骤：
（1）取1 mL培养至对数生长期（菌落浓度为1.9×109 cfu/mL）的金黄色葡萄球菌，在4500 r/min下离心20 min，收集菌体。
（2）将步骤（1）中收集的菌体用10 mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）洗涤二次，除去培养基，收集洗涤后的菌体备用。
（3）取40mg纯度为51.3%的大豆球蛋白碱性多肽，加入10mL的磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4），搅拌均匀，配制成4mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液。
（4）将步骤（2）中收集的菌体重悬于步骤（3）中制得的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，菌落浓度为1.9×108 cfu/mL，36℃振荡处理40min。
（5）将步骤（4）中处理结束后所得溶液用孔径为0.22微米的微滤膜除去滤液；用5mL磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液（10mmol/L, pH7.4）中。
（6）将步骤（5）中得到的菌悬液进行超声处理，超声处理电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s，间隙时间为4s，共作用30s。处理后在4500 r/min下离心20 min，保留上清液。
（7）将步骤（6）中上清液冷冻干燥得到纯的大豆球蛋白碱性多肽15.4mg，得率为70.6%，纯度为97.7%。

Claims (6)

1.一种大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取浓度为5×108-2×109cfu/mL的葡萄球菌菌液，离心收集菌体；
2）用磷酸盐缓冲液洗涤步骤1）中离心收集的菌体以除去培养基，收集洗涤后的菌体；
3）取粗大豆球蛋白碱性多肽，加入磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，配制成1-2 mg/mL的大豆球蛋白碱性多肽溶液；
4）将步骤2）中洗涤后的菌体重悬于步骤3）配制的大豆球蛋白碱性多肽溶液中，该大豆球蛋白碱性多肽溶液中菌体浓度为1.1×108-2×108cfu/mL，在36-38℃下振荡处理20-40min；
5）振荡处理结束后，所得溶液采用微孔滤膜滤除滤液，然后采用磷酸盐缓冲液反向冲洗滤膜，使菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，得到菌悬液；
6）将步骤5）所得菌悬液进行超声处理，离心，保留上清液；步骤6）中超声处理时，电功率为300W，频率为25Hz，每次作用时间3s间隙时间为4s，共循环作用10-12次；
7）将步骤6）所得上清液冷冻干燥，得纯化的大豆球蛋白碱性多肽。
2.如权利要求1所述的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于：步骤1）中所述的葡萄球菌为培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌。
3.如权利要求1所述的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于：步骤2）、步骤3）步骤5）中所用的磷酸盐缓冲液相同，所用磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、pH为7.3-7.5。
4.如权利要求1所述的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于：步骤4）中菌体浓度为1.1×108-1.66×108cfu/mL。
5.如权利要求1所述的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于：步骤4）中在37℃下振荡处理30min。
6.如权利要求1所述的大豆球蛋白碱性多肽的纯化方法，其特征在于：步骤5）中所述微孔滤膜为孔径为0.22µm的滤膜。
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