CN101602799B - 一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸氨沉淀、以及超滤膜等步骤纯化得到分子量8.5KD的具有抗菌活性的多肽，为维吾尔药食两用植物鹰嘴豆的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗菌活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽作为制备食品、药品添加剂的用途。
Description
鹰嘴豆(Cicer arietinumol/L L.)属于豆科，豌豆族，鹰嘴豆属，在新疆有2500年的生长历史，是维吾尔医常用药材，维吾尔语名为诺胡提，已被收载在中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册和《维吾尔药志》中，“它具有清除异常体液，开通体液闭阻，调节机体等作用。用于身体瘦弱，性欲低下，食欲不振，皮肤瘙痒及糖尿病等疾病”。虽然鹰嘴豆用药历史悠久，但其功能因子不清楚，特别是具有生物活性多肽类化合物的研究空白；
生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，被称为抗菌肽，由于最早被发现的是其抗细菌功能，因而被命名为抗菌肽(antibacterial peptides，AMOL/LPs)。它是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，是生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一类小分子多肽，具有广谱抗菌活性，不仅可以抑制多种细菌或真菌，甚至可以在不伤及正常细胞的情况下抑制动物体内的肿瘤细胞。因此，抗菌肽的研究已成为基因工程、药物开发等领域的研究热点，具有着极为广阔的市场应用前景。
与传统的抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机理独特等优点。抗菌肽一般含有10～100个氨基酸残基，成熟的抗菌肽来源于前体蛋白的水解，大多数抗菌多肽由于富含碱性氨基酸而带正电荷。
植物抗菌肽虽然是一类小分子蛋白质，但其结构与组成复杂多样。根据植物抗菌肽的氨基酸序列及二级结构，并已发表的植物抗菌肽有以下9类：植物抗菌肽的氨基酸序列同源性不是很高，但存在一些共同特征，绝大多数的植物抗菌肽富含半胱氨酸(Cys)，而且所有的Cys都形成分子内二硫键，这可能是植物抗菌肽对热非常稳定的原因。二硫键的数量与植物抗菌肽的分类无直接关系，甚至在同一类型中就有变化。同一类型植物抗菌肽的二硫键一般都有典型的连接方式及相似三维空间构型。
迄今分离的大多数植物抗菌肽都有广谱抗真菌或细菌的特性外，还发现环肽kalataB1具有抑制棉铃虫等昆虫的生长和发育的功能，circulins A和B具有抗艾滋病毒HIV的功能，而一些植物防御素对α淀粉酶的活性有抑制能力。
传统抗生素是通过消除微生物生长或生存必需的功能，如阻挠细菌蛋白质的合成或者改变酶的活性来达到杀菌的目的，而细菌通过改变一种基因就足以对付抗生素的这种进攻。抗菌肽则作用于细菌细胞膜，导致膜的通透性增大，以此穿透、杀灭细菌。细菌必须改变膜的结构，即改变相当部分的基因才能防御抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的。因此，抗菌肽极大地减少了微生物或细菌产生耐药性的可能。而且抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核生物细胞不起作用。原因在于原核生物和真核生物的细胞膜结构不同，真核细胞膜中含有大量的胆固醇，而胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。此外高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，其存在也抵抗了抗菌肽的作用。癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发达，这是抗菌肽对其产生抑制作用的原因之一。
目前，抗菌肽在农业、医药、食品和化妆品等领域已经有了一定的应用实践并取得了较好的效果。在农业领域，抗菌肽成分为易消化吸收的氨基酸，可作为畜禽饲料添加剂取代或部分取代目前饲喂动物所用的抗生素，减少抗生素对动物体的危害。另有研究表明，抗菌肽对流感病毒、疱疹病毒、乙型肝炎病毒等也有抑制作用。有报道，一些抗菌肽在亚毒性浓度下可抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达。抗菌肽能特异性抑制某些肿瘤的生长，对人体正常细胞无害，极有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药。在食品和化妆品领域，如从乳酸菌中分离的抗菌肽细菌素，可抑制食品中的各种病原微生物的生长而作保藏剂。抗菌肽在化妆品上用作防腐剂，鱼类抗菌肽不仅是营养成分，更重要的是它的抗菌和美容作用，比化学防腐剂用于化妆品具有独特的优势和广泛的市场潜力。
由于抗菌肽的分子小，所以直接从动植物组织中提取天然抗菌肽时，天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵，故化学合成和基因工程法成为获得抗菌肽的主要手段。但是化学合成抗菌肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，由于抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，而且表达产物可能对宿主有害，从而影响了基因的高水平表达。如何提高生产效率、降低成本成为抗菌肽基因工程研究亟待解决的问题。在国内植物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段，研究范围小，研究主要集中在药理、基因表达和综述等方面，对于多肽类化合物的化学研究文献很有限，而且使用的方法中植物多肽类化合物回收低，不适用于大规模制备，这很大程度上限制了多肽类活性化合物的应用和工业化生产。因此，寻找安全高效的抗生素替代品就显得十分重要。
本发明的目的在于提供一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸氨沉淀、以及超滤膜等步骤纯化得到分子量8.5KDa的具有抗菌活性的多肽，为维吾尔药食两用植物鹰嘴豆的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗菌活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽作为制备食品、药品添加剂的用途。
本发明所述的一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，按下列步骤进行：
a、将脱脂鹰嘴豆用液氮冰冻，机械粉碎，过筛10-100目，再用磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取，时间为1-8小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
c、将步骤b粗提多肽用重蒸水溶解，用超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
d、再利用常规方法SDS-PAAG确定提取的多肽的分子量，并利用银染色确认所提取分离的多肽纯度，以及对所提取分离的多肽作金黄色葡萄糖球菌的抑制作用来确定其抗菌活性。
步骤a、b和c中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
步骤a、b和d中的低温离心速度为12000转/分。
步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝6.0-8.0。
步骤b中无水硫酸铵饱和度为30％-80％。
步骤c中的超滤膜为3-30KD。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
附图说明
图1为本发明抗菌活性筛选图，其中A：标准样品4：超滤纯化多肽样品。
图2为本发明SDS-PAAG凝胶电泳-银染色图，其中1为标准蛋白标记，2为超滤纯化样品。
具体实施方式
实施例1
多肽的提取：
取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞，并机械粉碎，过筛10目，再用磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH＝6.0)在温度4℃搅拌提取1小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为30％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
多肽的超滤膜纯化：
将粗提多肽用重蒸水溶解，用30KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
多肽的分子量及其纯度的确定：(选择下层小分子量多肽)
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH：6.8)、2mL的10％SDS、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克Tris、94克甘氨酸、50mL的10％SDS溶解并定容至4L。SDS-PAGE储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％SDS-PAGE的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、1.3mL的1.5mol/L的Tris-HCL(pH8.8)、0.05mL的10％(W/V)SDS、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的TEMED；
5％SDS-PAGE的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、0.13mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、0.01mL的10％(W/V)SDS、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的TEMED；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
多肽分子量的确定：
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰醋酸。
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝pG-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止，即确定下层为8.5KD的小分子抗菌多肽；
多肽纯度的确定：
银染色：电泳结束后，在直径13cm培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作(每块凝胶需最低试剂量为20mL)；
固定：将凝胶置固定液(含冰醋酸10％，甲醇40％的水溶液)中浸泡10m in；
漂洗：将固定的凝胶片置重蒸馏水中洗5min；
增敏：将凝胶片置5％的戊二醛水溶液中7min；
漂洗：重蒸馏水洗3次，每次3min；
银染：将凝胶片转入染液(20％硝酸银200μL；浓氨水200μL；4％氢氧化钠1.00mL；20％乙醇18.6mL，新鲜配制)中10min；
漂洗：20％乙醇洗两次，每次3m in；
显影：将凝胶片置于显影剂(20％乙醇20mL，37％甲醛20μL，饱和柠檬酸5μL)中显色至满意为止(约需3-6min)，再转入重蒸馏水中终止显色，换水两次。
多肽抗菌活性的确定：
将未纯化的多肽和纯化后的多肽用重蒸水配成1mg/mL的溶液，做对金黄色葡萄糖球菌抑制作用的研究，结果显示其对金黄色葡萄糖球菌有抑制作用。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
实施例2
多肽的提取：
取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞，机械粉碎过筛30目，用磷酸缓冲液(0.08mol/L，pH＝7.0)在温度4℃搅拌提取4小时，提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为40％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
多肽的超滤膜纯化：
将粗提多肽用重蒸水溶解，用3KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
多肽的分子量及其纯度的确定：(选择下层小分子量多肽)
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、2mL的10％SDS、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克Tris、94克甘氨酸、50mL的10％SDS溶解并定容至4L，SDS-PAGE储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％SDS-PAGE的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、1.3mL的1.5mol/L的Tris-HCL(pH8.8)、0.05mL的10％(W/V)SDS、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的TEMED；
5％SDS-PAGE的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、0.13mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、0.01mL的10％(W/V)SDS、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的TEMED；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
多肽分子量的确定：
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰醋酸；
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝pG-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止，即确定下层为8.5KD的小分子抗菌多肽；
多肽纯度的确定：
银染色：电泳结束后，在直径13cm培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作(每块凝胶需最低试剂量为20mL)；
固定：将凝胶置固定液(含冰醋酸10％，甲醇40％的水溶液)中浸泡10m in；
漂洗：将固定的凝胶片置重蒸馏水中洗5min；
增敏：将凝胶片置5％的戊二醛水溶液中7min；
漂洗：重蒸馏水洗3次，每次3min；
银染：将凝胶片转入染液(20％硝酸银200μL；浓氨水200μL；4％氢氧化钠1.00mL；20％乙醇18.6mL，新鲜配制)中10min；
漂洗：20％乙醇洗两次，每次3min；
显影：将凝胶片置于显影剂(20％乙醇20mL，37％甲醛20μL，饱和柠檬酸5μL)中显色至满意为止(约需3-6min)，再转入重蒸馏水中终止显色，换水两次。
多肽抗菌活性的确定：
将未纯化的多肽和纯化后的多肽用重蒸水配成1mg/mL的溶液，做对金黄色葡萄糖球菌抑制作用的研究，结果显示对金黄色葡萄糖球菌有抑制作用。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
实施例3
多肽的提取：
取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞，机械粉碎过筛50目，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH＝6.5)在温度4℃搅拌提取6小时，提取液先用纱布过滤，滤液利用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为50％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
多肽的超滤膜纯化：
将粗提多肽用重蒸水溶解，用10KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
多肽的分子量及其纯度的确定：(选择下层小分子量多肽)
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、2mL的10％SDS、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克Tris、94克甘氨酸、50mL的10％SDS溶解并定容至4L，SDS-PAGE储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％SDS-PAGE的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、1.3mL的1.5mol/L的Tris-HCL(pH8.8)、0.05mL的10％(W/V)SDS、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的TEMED；
5％SDS-PAGE的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、0.13mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH：6.8)、0.01mL的10％(W/V)SDS、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的TEMED；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
多肽分子量的确定：
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰醋酸；
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝pG-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止，即确定下层为8.5KD的小分子抗菌多肽；
多肽纯度的确定：
银染色：电泳结束后，在直径13cm培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作(每块凝胶需最低试剂量为20mL)；
固定：将凝胶置固定液(含冰醋酸10％，甲醇40％的水溶液)中浸泡10min；
漂洗：将固定的凝胶片置重蒸馏水中洗5min；
增敏：将凝胶片置5％的戊二醛水溶液中7min；
漂洗：重蒸馏水洗3次，每次3min；
银染：将凝胶片转入染液(20％硝酸银200μL；浓氨水200μL；4％氢氧化钠1.00mL；20％乙醇18.6mL，新鲜配制)中10min；
漂洗：20％乙醇洗两次，每次3min；
显影：将凝胶片置于显影剂(20％乙醇20mL，37％甲醛20μL，饱和柠檬酸5μL)中显色至满意为止(约需3-6min)，再转入重蒸馏水中终止显色，换水两次。
多肽抗菌活性的确定：
将未纯化的多肽和纯化后的多肽用重蒸水配成1mg/mL的溶液，做对金黄色葡萄糖球菌抑制作用的研究，结果显示其对金黄色葡萄糖球菌有抑制作用。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
实施例4
多肽的提取：
取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞，机械粉碎过筛80目，用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH＝7.5)在温度4℃搅拌提取8小时，提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为50％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
多肽的超滤膜纯化：
将粗提多肽用重蒸水溶解，用15KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
多肽的分子量及其纯度的确定：(选择下层小分子量多肽)
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、2mL的10％SDS、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克Tris、94克甘氨酸、50mL的10％SDS溶解并定容至4L，SDS-PAGE储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％SDS-PAGE的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、1.3mL的1.5mol/L的Tris-HCL(pH8.8)、0.05mL的10％(W/V)SDS、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的TEMED；
5％SDS-PAGE的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、0.13mL的0.5mol/L的Tri s-HCL(pH6.8)、0.01mL的10％(W/V)SDS、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的TEMED；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
多肽分子量的确定：
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰醋酸；
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝pG-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止，即确定下层为8.5KD的小分子抗菌多肽；
多肽纯度的确定：
银染色：电泳结束后，在直径13cm培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作(每块凝胶需最低试剂量为20mL)；
固定：将凝胶置固定液(含冰醋酸10％，甲醇40％的水溶液)中浸泡10min；
漂洗：将固定的凝胶片置重蒸馏水中洗5min；
增敏：将凝胶片置5％的戊二醛水溶液中7min；
漂洗：重蒸馏水洗3次，每次3min；
银染：将凝胶片转入染液(20％硝酸银200μL；浓氨水200μL；4％氢氧化钠1.00mL；20％乙醇18.6mL，新鲜配制)中10min；
漂洗：20％乙醇洗两次，每次3min；
显影：将凝胶片置于显影剂(20％乙醇20mL，37％甲醛20μL，饱和柠檬酸5μL)中显色至满意为止(约需3-6min)，再转入重蒸馏水中终止显色，换水两次。
多肽抗菌活性的确定：
将未纯化的多肽和纯化后的多肽用重蒸水配成1mg/mL的溶液，做对金黄色葡萄糖球菌抑制作用的研究，结果显示其对金黄色葡萄糖球菌有抑制作用。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
实施例5
多肽的提取：
取100克脱脂的鹰嘴豆用液氮冰冻鹰嘴豆细胞并机械粉碎过筛100目，用磷酸缓冲液(0.03mol/L，pH＝8.0)在温度4℃搅拌提取6小时，提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为80％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
多肽的超滤膜纯化：
将粗提多肽用重蒸水溶解，用20KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
多肽的分子量及其纯度的确定：(选择下层小分子量多肽)
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、2mL的10％SDS、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克Tris、94克甘氨酸、50mL的10％SDS溶解并定容至4L，SDS-PAGE储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％SDS-PAGE的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、1.3mL的1.5mol/L的Tris-HCL(pH8.8)、0.05mL的10％(W/V)SDS、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的TEMED。
5％SDS-PAGE的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)SDS-PAGE储存液、0.13mL的0.5mol/L的Tris-HCL(pH6.8)、0.01mL的10％(W/V)SDS、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的TEMED；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
多肽分子量的确定：
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰醋酸；
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝pG-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止，即确定下层为8.5KD的小分子抗菌多肽；
多肽纯度的确定：
银染色：电泳结束后，在直径13cm培养皿中按以下步骤在摇床上进行操作(每块凝胶需最低试剂量为20mL)；
固定：将凝胶置固定液(含冰醋酸10％，甲醇40％的水溶液)中浸泡10min；
漂洗：将固定的凝胶片置重蒸馏水中洗5min；
增敏：将凝胶片置5％的戊二醛水溶液中7min；
漂洗：重蒸馏水洗3次，每次3min；
银染：将凝胶片转入染液(20％硝酸银200μL；浓氨水200μL；4％氢氧化钠1.00mL；20％乙醇18.6mL，新鲜配制)中10min；
漂洗：20％乙醇洗两次，每次3min；
显影：将凝胶片置于显影剂(20％乙醇20mL，37％甲醛20μL，饱和柠檬酸5μL)中显色至满意为止(约需3-6min)，再转入重蒸馏水中终止显色，换水两次。
多肽抗菌活性的确定：
将未纯化的多肽和纯化后的多肽用重蒸水配成1mg/mL的溶液，做对金黄色葡萄糖球菌抑制作用的研究，结果显示对金黄色葡萄糖球菌有抑制作用。
所述的方法获得的鹰嘴豆抗菌多肽作为制备食品或药品的添加剂的用途。
Claims (3)
1.一种鹰嘴豆中原生抗菌多肽的快速制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将脱脂鹰嘴豆用液氮冰冻，机械粉碎，过筛10-100目，再用浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝6.0-8.0磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取，时间为1-8小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入饱和度为30％-80％无水硫酸胺，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽，上清液可以用来提取其它的有用多肽；
c、将步骤b粗提多肽用重蒸水溶解，用3-30KD超滤膜过滤，多肽经超滤膜过滤后分为两部分，下层为小分子量多肽，上层为大分子量多肽，将两部分分别低温干燥得到不同分子量范围的多肽，收集下层小分子抗菌多肽；
d、再利用常规方法SDS-PAGE确定提取的多肽的分子量，并利用银染色确认所提取分离的多肽纯度，以及对所提取分离的多肽作金黄色葡萄糖球菌的抑制作用来确定其抗菌活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b和c中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b和d中的低温离心速度为12000转/分。
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