CN104387459A - 一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，该方法包括高速离心获取发酵上清液，用10kda中空纤维柱进行超滤去除杂蛋白，用反渗透法进行浓缩和除盐，然后用CMSepharoseFF阳离子交换层析柱进行层析，得电泳纯抗菌肽，该方法简单易行，能耗低，获得的抗菌肽产品纯化高，是一种新型工业化分离纯化方法。

Description

一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白质多肽分离纯化领域，具体涉及一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法。

背景技术

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000道尔顿，由20～60个氨基酸残基组成，具有强碱性、热稳定性和广谱抗菌性，对细菌、真菌、原虫、病毒等均有杀灭作用，尤其是对某些耐药性病原菌具有杀灭作用，是解决当前抗药性问题的一种全新类型的抗菌物质。目前，抗菌肽主要来源于昆虫、哺乳动物、两栖动物、植物、细菌等。

   抗菌肽产业是一个新兴的高科技生物工程和生物技术产业，其市场应用广泛。在农业上，可用于饲料添加剂，并且适合于多种动物的饲养；医药上，可以作为优秀的抗菌素替代品；工业上，可以作为绿色防腐剂；人类生活上，可作为保健品与抗菌物的替代品。

    当前，我国抗菌肽产业仍处于起步阶段。在国内抗菌肽的基础研究已取得一定的成果，如华南农业大学黄自然教授等从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物（溶菌酶）--抗菌肽，是经过十几年的努力取得的一项首创性科研成果。抗菌肽分离纯化基础研究如华南农业大学陈海英博士论文中有论述，但在工业生产应用上有待进一步研究。国内抗菌肽产品主要用于动物用饲料及养殖，属于新一代动物保健产品，能有效解决现有抗生素使用过程中存在的诸多弊端，此种用法考虑成本因素一般不需要高纯度抗菌肽。

抗菌肽的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一类新型药物，具有广谱性杀菌作用，并能抑制乙型肝炎病毒的复制，特别是对耐药性细菌，抗菌肽有较强杀灭作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞，是一种具有作用靶点及新作用机制的化合物。目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经完成或接近完成三期临床试验，即将上市。国内，抗菌肽在生物医药上的研究甚少，工业化分离纯化方法鲜有报道。

发明内容

本发明为了克服现有技术中缺乏工业化分离抗菌肽的技术缺陷，提供一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，包括下列步骤：

    S1.将2500~6000L的细菌发酵液15000rpm/min离心，离心速度为750L/小时，去除菌体和发酵液残渣，收集上清液；

    S2.将上清液经10kda中空纤维柱超滤，去除大分子杂蛋白；

    S3.将S2超滤后的溶液经0.001um-0.0001um孔径反渗透膜超滤，去除液体中部分水分子、无机盐，得到抗菌肽浓缩液；

S4.以阳离子交换层析柱对抗菌肽浓缩液进行层析，分步收集洗脱液，得电泳纯抗菌肽。    

对于抗菌肽的分离纯化，现有技术中仅仅停留在实验室分离级别，实验室分离抗菌肽处理的菌体发酵液体积特别少，一般在几十毫升，最多也不会超过10L。所以，实验室分离抗菌肽的时候不会考虑材料昂贵、分离时柱子容易堵塞的问题。本发明通过大量的探索性试验，合理控制每一处理步骤的先后顺序和处理条件，得到一种适合工业化分离细菌源抗菌肽的方法。另外，本发明从技术上也适用于动物源抗菌肽的分离纯化，但抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，因此，在实际应用中，本发明并不适合分离纯化动物源抗菌肽。

    本发明首先利用高速离心去除菌体及发酵残渣，其目的是为了减少发酵液对中空纤维超滤的影响，提高中空纤维超滤的效率。而在超滤去除杂蛋白时，本发明选取截留分子量在10kda的中空纤维柱对发酵上清液去除大分子杂蛋白，检测抗菌肽效价表明，抗菌肽上清液经过超滤后，能够去除高分子量杂蛋白，且抗菌肽溶液的活性基本保持不变。选取多少截留分子量的中空纤维柱决定了杂蛋白去除的效果。虽然本领域技术人员都知道细菌源抗菌肽的分子量在1kda左右，只要选取截留分子量大于10kda的中空纤维柱就可以把抗菌肽留下来，但是，本领域技术人员并不知道杂蛋白的分子量有多大，到底选取截留分子量多大的中空纤维柱才可能尽可能多的将杂蛋白去除掉，发明人经过多年的研究发现，选取截留分子量在10kda的中空纤维柱可以尽可能多的将杂蛋白去除掉。

在反渗透浓缩中，选取的反渗透膜孔径在0.001um-0.0001um之间，选取的孔径可以最大量的去除水分子、无机盐、小分子物质等，但是抗菌肽分子不能透过反渗透膜。发明人经大量实验发现，选择0.001um-0.0001um孔径的反渗透膜可以去除80%以上的水，如果再增大或减小孔径的大小，都不利于水分、无机盐和小分子物质的析出。

在阳离交换柱层析中，本发明以阳离子交换层析柱对抗菌肽溶液层析。现有技术中对于蛋白的层析有多种选择，可以选择离子交换层析或凝胶层析，本发明通过研究发现，工业化分离抗菌肽不能采用凝胶层析，原因在于，凝胶层析的分辨率不高，分离操作较慢，因凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离效果。

优选地，所述阳离子交换层析柱为CM Sepharose FF阳离子交换层析柱或CM-A-Sephadex 25。

优选地，当所述阳离子交换层析柱为CM Sepharose FF阳离子交换层析柱时，所用的上柱缓冲液为pH5.0的 5mmol/L醋酸钠缓冲液。

本发明在阳离子交换层析时，先用洗脱液1去除掉杂蛋白，此时不必收集洗脱液；然后再使用洗脱液2，分阶段收集洗脱液，OD280值低于0.1时为第一阶段，OD280值高于0.1开始收集第二阶段，待OD280值低于0.1时洗脱液收集完毕。

所述洗脱液1为pH6.5的10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液；洗脱液2为pH8.0的10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液+10mmol/L甘氨酸，检测波长：280nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的细菌源抗菌肽分离纯化方法，操作简易、环保、能耗低，无需使用大量的化学试剂，特别是用中空纤维超滤去除杂蛋白和用反渗透法浓缩，自动化程度高，适宜于工业上生产，经过层析后的抗菌肽纯度高，纯化倍数为99倍 。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

抗菌肽活性的测定：采用企业标准，使用抗菌肽微生物检定法，抑菌指示菌为大肠杆菌（K₁₂D₃₁）。

实施例1

发酵培养基为糖蜜6%（Wt）、蛋白胨2%（Wt）、硫酸铵0.5%（Wt）、硫酸镁0.02%（Wt）、磷酸二氢钾0.2%（Wt），pH7.0、培养温度35℃。采用逐级扩大培养，即50L发酵罐→500L发酵罐→5000L发酵罐，发酵时间为20小时，发酵罐的装液量为50%，5000L发酵罐内含发酵液2500L。发酵完毕后，取样检测发酵液内抗菌肽效价为15200 IU/mL。

工业化分离纯化抗菌肽，包括如下步骤：

S1.离心收集上清液：采用转鼓式离心机离心上述发酵液，离心转速为15000rpm/min，离心速度为750L/h，去除菌体和发酵液残渣，收集上清液，上清液的体积约2500L；

    S2.超滤去除杂蛋白：取步骤S1的上清液，经10kda中空纤维柱超滤，去除抗菌肽溶液中大分子杂蛋白；使用二级超滤，超滤后，抗菌肽溶液的效价为15700 IU/mL，体积为2200L；

    S3.反渗透浓缩：取步骤S2的上清液，经反渗透膜超滤，去除液体中部分水分子、无机盐，反渗透膜的孔径为0.0005um，采用制水速度为500L/h规格的膜和泵，经过3-4h浓缩后，抗菌肽溶液的体积为210L，抗菌肽效价为163000 IU/mL；

S4.阳离子交换层析：将S3浓缩的抗菌肽溶液用CM Sepharose FF阳离子交换层析，具体操作步骤为：用醋酸将S3浓缩的抗菌肽溶液pH值调至5.00，加入阳离子树脂交换吸附，吸附时搅拌速度为30rpm/min，洗脱液洗脱，先用pH6.50 10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液去除杂蛋白，然后用pH8.00 10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液+10mmol/L甘氨酸缓冲液收集抗菌肽溶液，收集的高纯度抗菌肽溶液体积为16.9L，抗菌肽效价为1510000 IU/mL，纯度为发酵液的99倍。表1显示，经阳离子交换层析后抗菌肽的活性为1510000IU/mL。

表1分离纯化各步骤中抗菌肽效价的变化

项     目	溶液体积（L）	抗菌肽效价（IU/mL）
			发酵液	2500	15200
离心上清液	2500	15600
			中空纤维超滤	2200	15700
反渗透浓缩溶液	210	163000
			阳离子交换层析	16.9	1510000

实施例2

本实施例除了层析时所用层析柱的种类与实施例1不同，其他均与实施例1相同。本实施例所用的层析柱为Sephadex G-25凝胶层析柱。

本实施例发现：工业化分离抗菌肽不能采用凝胶层析，原因在于，第一、凝胶层析无法层析太大量的溶液，本实施例要想将210L抗菌肽浓缩液用凝胶层析柱进行层析，必须使用约1000L的凝胶总床体积，第二、在最大层析量的情况下，凝胶层析不利于抗菌肽的分离，用Sephadex G-25凝胶层析柱，最后收集得到的产物中抗菌肽纯度低于30%，仍含有较多杂蛋白。

实施例3 

本实施例采用硫酸铵盐析法从发酵液中提取抗菌肽蛋白。

发酵液经高速离心后取上清液，用不同饱和度（20%-90%）的硫酸铵溶液盐析沉淀，静置后离心收集沉淀蛋白，用生理盐水溶解，检测抗菌肽活性。

本实施例发现：抗菌肽蛋白在70%硫酸铵饱和度下可全部沉淀析出。若用本实施例从2500L发酵液中提取抗菌肽粗蛋白，需要1750kg的硫酸铵，用量非常大，难以工业化生产，生产成本高，且化学试剂的大量使用易造成环境污染。

Claims (3)

1.一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

    S1.将2500~6000L的细菌发酵液15000rpm/min离心，离心速度为750L/小时，去除菌体和发酵液残渣，收集上清液；

    S2.将上清液经10kda中空纤维柱超滤，去除大分子杂蛋白；

    S3.将S2超滤后的溶液经0.001um-0.0001um孔径反渗透膜超滤，去除液体中部分水分子、无机盐，得到抗菌肽浓缩液；

    S4.以阳离子交换层析柱对抗菌肽浓缩液进行层析，分步收集洗脱液，得电泳纯抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，其特征在于，所述细菌发酵液的体积为2500~4000L。

3.根据权利要求1所述的细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱为CM Sepharose FF阳离子交换层析柱或CM-A-Sephadex 25阳离子交换层析柱。