CN106916803A - 一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶，含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的分子量为33.03kDa；所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的等电点为5.28；纤溶活性为10000±1000U/mg。本发明还提供了上述双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，对双齿围沙蚕进行预处理，然后将粗双齿围沙蚕酶经凝胶柱层析、凝胶过滤及超滤法脱盐，离子交换柱层析及电泳制备可得到一种纤溶活性强的纤溶蛋白酶，可作为用于治疗血栓疾病的原料药。本发明的方法操作简便，可控，用本发明方法可制得纤溶活性高且纯度高的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶。

Description

一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种蛋白酶，具体来说是一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶及其制备方法和用途。
背景技术
心脑血管疾病(cardiovascular and cerebrovascular diseases)是一种严重威胁人类，血栓性疾病属于心脑血管疾病，已经成为严重危害人类生命健康的“头号杀手”。控制心脑血管疾病蔓延已经成为我国21世纪提高人民健康生活水平的重中之重。国内外临床常用的溶栓药有尿激酶(urokinase,UK)、链激酶(streptokinase,SK)、葡激酶(staphyLokinase,SaK)、组织型纤溶酶原激活剂(tissuetype pLasminogen activator,t-PA)、蛇毒降纤酶类(东菱迪芙酶、蝮蛇抗栓酶)及妇激酶(lumbrokinase,LK)等，t-PA价格昂贵，UK出血副作用非常大，其余药物也有诸如需要的剂量大、溶解纤维蛋白特异性较低、出血副作用大、溶易再堵塞、毒性大、分子量大等缺点。所以，从各种天然生物资源中寻找和研发溶解纤维蛋白特异性高、出血副作用小及相对较便宜的具有我国自主知识产权的溶栓药物已经成了当务之急。
双齿围沙蚕为属于环节动物门(Annelida)，多毛纲(Polychaeta)，沙蚕目(Nereididae)，沙蚕科(Nereididae)。我国是世界上最早记述沙蚕的国家之一，典籍中有海虫、海蚕、沙蚕、凤肠、龙肠和禾虫等的记载。古书中记载的多味食补，现代主要用于抗血栓形成、抗肿瘤、提高免疫力、杀伤白血病肿瘤细胞及改善贫血作用。双齿围沙蚕是一种海洋生物，在我国沿海分布极为广泛，资源十分丰富，多数用来作为鱼虾饲料，并未得到充分利用，造成了极大的资源浪费。从其体内分离的活性物质可具备海洋生物活性物质的特点，即生物活性高、稳定性强、分子量小。从双齿围沙蚕体内提取的新型纤溶酶可充分利用我国海洋资源，且有可能发展成为新一代抗血栓药物。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶及其制备方法和用途，所述的这种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶及其制备方法和用途解决了现有技术中的溶解纤维蛋白特异性较低、出血副作用大、容易再堵塞、毒性大、分子量大、价格昂贵的技术问题。
本发明提供了一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶，含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
进一步的，所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的分子量为30.3kDa；所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的等电点为5.28；；纤溶活性为10000±1000U/mg。
进一步的，在所述的SEQ ID NO：1中，所述的蛋氨酸被氧化修饰过，在所述是SEQ ID NO：2中，所述的蛋氨酸被氧化修饰过。
本发明还提供了上述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：
1)将干品或鲜品双齿围沙蚕使用缓冲液浸泡后匀浆，自溶1～8小时，进行离心，收集上清液，得酶粗提液；
2)将粗酶提取液采用饱和硫酸铵溶液进行盐析，获得沉淀蛋白；
3)将步骤2)中的沉淀蛋白用缓冲液复溶后，离心配制成上样样品；
4)将高分离度凝胶层析柱用缓冲液平衡后，将步骤3)中的样品用上样缓冲液洗脱，收集的活性部位再用超滤浓缩脱盐或凝胶柱层析脱盐；
5)将高分辨离子交换层析柱用Tris-HCl缓冲溶液或PB缓冲溶液平衡平衡，将步骤4)中收集的样品上样，用含有0-1M氯化钠的缓冲液洗脱，收集的活性部位用超滤浓缩脱盐或凝胶柱层析脱盐；
6)采用高分辨率聚丙酰胺凝胶进一步纯化步骤5)中的样品，得到双齿围沙蚕纤溶蛋白酶。
进一步的，所述的高分离度凝胶层析柱为Sephadex-G75层析柱，所述的高分离度凝胶层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，所述的高分辨率聚丙酰胺凝胶采用质量百分比浓度为10～15％聚丙酰胺凝胶。
进一步的，步骤1)中干品双齿围或鲜品双齿围的自溶时间为3-6h。
进一步的，步骤1)、3)、4)、5)中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液；步骤4)中所述的上样缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、T ris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液平衡。
进一步的，步骤2)中，先用饱和硫酸铵溶液沉淀一次除去杂蛋白，沉淀后的硫酸铵溶液的终浓度为10％-20wt％，然后再用饱和硫酸铵溶液沉淀，沉淀后的硫酸铵溶液的终浓度为50％或60wt％，得到粗蛋白沉淀。
进一步的，步骤4)、5)中除盐用Sephadex-G25或截流分子量为3kDa、5kDa或10kDa超滤离心管，步骤5)中缓冲盐梯度洗脱时采用0-0.6M的氯化钠溶液。
本发明还提供了上述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶在用于制备溶栓药物中的用途。
本发明还提供了上述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶在降解纤维蛋白原Aα、Bβ、γ链中的用途。
本发明的纤溶蛋白酶具有如下生化特性：
(1)该成分的分子量为33.03kDa；
(2)该成分的等电点为5.28；
(3)SDS-PAGE电泳显示条带为单一条带；
(4)高效液相凝胶过滤色谱为单一峰；
(5)氨基酸序列为：
1)TTM(oxidation)YEAAAR，
2)ATYLGM(oxidation)VTGLGTSGNK，
3)YTSAGYSVAGTHR，
4)AFAGLDSSGLDGVAATK；
(6)具有降解纤维蛋白原α、β、γ链的作用；
(7)该蛋白酶最适宜温度为60℃；
(8)该蛋白酶最适宜pH为10左右。
本发明利用凝胶层析柱将具有纤溶活性的组分捕获，再利用高分辨离子层析进一步细分，最后利用电泳法精制，该方法操作简单，重复性好，易放大，用于工业生产制备溶栓药物。用该法获得的纤溶酶到达电泳纯，用等电点聚焦分析得等电点为5.28，纤溶活性高，可达到10000±1000U/mg(蚓激酶单位)。本发明可用于治疗血栓疾病的原料药。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明采用硫酸铵的分级盐析，阴离子交换层析、凝胶过滤层析以及电泳制备结合，纯化得到一种电泳纯的纤溶蛋白酶。其使用的层析介质具有载量大，重复使用等特点。用本发明方法可制得纤溶活性高且纯度高的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶。而且本发明的方法操作简便，可控。
附图说明
图1是对分离纯化得到的双齿围纤溶蛋白酶进行SDS-PAGE电泳的电泳图。
图2是采用高效液相凝胶过滤色谱法对纯化后的纤溶活性液进行纯度检测的结果
图3采用过多功能平板等电聚焦系统对双齿围沙蚕纤溶酶进行电泳的电泳图。
图4显示了双齿围沙蚕纤溶酶的部分蛋白质序列。
图5显示了双齿围沙蚕纤溶酶的纤溶活性。
图6显示了双齿围沙蚕纤溶酶水解纤维蛋白原各亚基的情况。
图7显示了温度对酶活性的影响。
图8显示了pH对酶活性的影响。
具体实施方式
本发明涉及制备双齿围纤溶蛋白酶所用的层析介质均来自GE公司。
实施例1
取2.5kg双齿围沙蚕干燥体，加入10倍体积pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液匀浆，室温放置4h自溶，离心后用饱和硫酸铵10％-50％分级盐析，离心后收集活性部分，用缓冲液复溶，上样于pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液平衡后的Sephadex-G75层析柱，用pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液洗脱，紫外波长280nm检测流份吸收值，分部收集主要纤溶活性部位后，用Sephadex-G25层析柱脱盐，冷冻干燥浓缩。用pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液复溶样品，上样于pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，用含有0-0.6M的氯化钠的缓冲液洗脱，收集主要活性部分，脱盐浓缩后用10％聚丙酰胺凝胶进一步纯化，收集的目标条带用电透析的方法回收目的蛋白。
实施例2
取2.5kg双齿围沙蚕干燥体，加入10倍体积pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液匀浆，室温放置6h自溶，离心后用饱和硫酸铵10％-50％分级盐析，离心后收集活性部分，用缓冲液复溶，上样于pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液平衡后的Sephadex-G75层析柱，用pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液洗脱，紫外波长280nm检测流份吸收值，分部收集主要纤溶活性部位后，用5kDa超滤离心管脱盐浓缩。用pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液复溶样品，上样于pH7.4 20mM磷酸盐缓冲液平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，用含有0-0.6M的氯化钠的缓冲液洗脱，收集主要活性部分，用5kDa超滤离心管脱盐脱盐浓缩后用10％聚丙酰胺凝胶进一步纯化，收集的目标条带用电透析的方法回收目的蛋白。
实施例3
取2.5kg双齿围沙蚕干燥体，加入10倍体积pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液匀浆，室温放置6h自溶，离心后用饱和硫酸铵20％-60％分级盐析，离心后收集活性部分，用缓冲液复溶，上样于pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡后的Sephadex-G75层析柱，用pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗脱，紫外波长280nm检测流份吸收值，分部收集主要纤溶活性部位后，用Sephadex-G25层析柱脱盐，冷冻干燥浓缩。用pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液复溶样品，上样于pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡后的DEAESepharose Fast Flow层析柱，用含有0-0.6M的氯化钠的缓冲液洗脱，收集主要活性部分，脱盐浓缩后用10％聚丙酰胺凝胶进一步纯化，收集的目标条带用电透析的方法回收目的蛋白。
实施例4
取2.5kg双齿围沙蚕干燥体，加入10倍体积pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液匀浆，室温放置6h自溶，离心后用饱和硫酸铵20％-60％分级盐析，离心后收集活性部分，用缓冲液复溶，上样于pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡后的Sephadex-G75层析柱，用pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗脱，紫外波长280nm检测流份吸收值，分部收集主要纤溶活性部位后，用5kDa超滤离心管脱盐浓缩。用pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液复溶样品，上样于pH7.4 20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡后的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，用含有0-0.6M的氯化钠的缓冲液洗脱，收集主要活性部分，用5kDa超滤离心管脱盐脱盐浓缩后用15％聚丙酰胺凝胶进一步纯化，收集的目标条带用电透析的方法回收目的蛋白。
实施例5
对实施例1中分离纯化得到的双齿围纤溶蛋白酶的鉴定如下：
(1)SDS-PAGE电泳检测
配制15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离胶，浓缩层浓度为5％，厚度为1.0mm。将样品加入非变性上样缓冲液溴酚蓝混匀后沸水浴5min，离心(10000g·min-1，30sec)后上样10μL，并在最左边泳道加入Mark，然后立即电泳。电压条件：浓缩层为80V电压，等样品到达分离胶后调为120V电压，当电泳至底部时，停止电泳，取下凝胶，用考马斯亮蓝染色15min，再用脱色液将凝胶脱色至无背景颜色。电泳图如图1，SDS-PAGE电泳显示条带为单一条带，根据蛋白质分子量Marker的迁移率计算，求得方程式y＝-0.783x+1.9126(y代表Marker分子量的对数，x代表相对迁移率Rf)，R2＝0.9923，计算得出其分子量为33.03kDa。
(2)高效液相色谱检测
采用高效液相凝胶过滤色谱法(HPLC gel-filtration)，对纯化后的纤溶活性液进行纯度检测，色谱柱：Shodex KS 804-802串联，柱温：室温流动相：20mM PB+0.15M NaCl(pH7.0)，检测波长：280nm，流速：1.0mL·min-1等度洗脱。结果见图2，色谱为单一峰。
(3)等电点测定
采用过多功能平板等电聚焦系统(GE HeaLthcare MμLtiphorⅡ)电泳，按照电压500V，电流50mA，功率为每1cm凝胶1W的电泳条件，电泳20分钟，之后设置电压2000V，电流50mA，功率为每1cm凝胶1W，再电泳90分钟，之后用ImageQuant TL Version 7.0软件分析供试品的等电点，凝胶中只单一蛋白电泳点，根据pI Marker的迁移率计算其等电点。结果见图3，该成分的等电点为5.28。
(4)De Novo测序
采用Tripe TOF 5600Plus LC-MS/MS串联质谱仪对上述实施例纯化的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶(FPA)进行De Novo测序，将质谱产生的数据利用protein pilot4.5软件检索，检索数据库为NCBIn全物种数据库，对于数据库检索不成功的主要图谱，denovo解析了部分主要峰的氨基酸序列，denovo方法基本过程为：将LC-MS/MS二级图谱导入analyst TF 1.6(ABSCIEX)软件，利用bioexplore下的sequence peptide工具进行denovo辅助分析，解析的序列再人工确认，主要依据b+y＝P(precusor ion)+1公式，得到各个氨基酸的主要b、y离子质量数，解析出部分特异性的蛋白质序列。结果见图4。
A显示了其氨基酸序列为：TTM(oxidation)YEAAAR；
B显示了其氨基酸序列为：ATYLGM(oxidation)VTGLGTSGNK；
C显示了其氨基酸序列为：YTSAGYSVAGTHR；
D显示了其氨基酸序列为：AFAGLDSSGLDGVAATK。
(5)纤溶活性测定
采用体外平板纤溶法测定纤溶活性：牛血纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液制成半透明凝固体。不同浓度尿激酶，及各个纯化过程中收集的溶液加样于平板中，加盖，37℃孵育5-12h，测溶圈直径。结果见图5，其中，1:UK 5000IU/mL；2:UK2500IU/mL；3:UK 1250IU/mL；4:UK 625IU/mL；5:UK 125IU/mL；6:UK 62.5IU/mL；7:31.25IU/mL；8：粗提液；9：盐析后的粗酶；10：Sephadex-G75；11：DEAE-Sepharose-FF；12：Native-PAGE；13：生理盐水。经过Native-PAGE纯化后的蛋白酶活性可达10970.23U/mg(蚓激酶单位)。
(6)纤维蛋白原水解活性的测定
采用SDS-PAGE电泳法分析双齿围沙蚕纤溶酶水解纤维蛋白原。具体方法：1mg牛血纤维蛋白原和0.5μg纯化的双齿围沙蚕纤溶酶溶解在1mL 20mMTris–HCl(pH 7.4)缓冲液中，37℃恒温孵育，在不同的时间间隔(0、1、10、30、60、120、180、300min)取出50μL进行SDS-PAGE电泳分析(5％浓缩胶、10分离胶)，观察双齿围沙蚕纤溶酶水解纤维蛋白原各亚基的情况。结果见图6。从图6可看出，牛血纤维蛋白原的Aα链在与双齿围沙蚕纤溶酶作用1min，就被其完全水解；Bβ链逐渐被水解，在30min内水解完全；γ链是最后被水解的，在作用300分钟时，被完全水解。这些结果说明，双齿围沙蚕纤溶酶具有降纤作用，而且水解纤维蛋白原各亚基的速度由快到慢的顺序为Aα链，Bβ链和γ链。
(7)温度对酶活性的影响
20μL的0.1g·L-1双齿围沙蚕纤溶酶在不同温度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)恒温孵育1小时，然后采用偶氮酪蛋白(azocasein)水解法检测酶的残余活性，绘制曲线，确定酶的最适温度及热稳定性。
双齿围纤溶酶活性在10℃～80℃间时，酶的活性随着温度的增加活性也逐渐增强，当温度超过60℃以后，酶的活性随着温度的增加活性逐渐减弱，温度在40℃～70℃之间，酶仍具有较高活性，说明其具有较好的温度稳定性，温度在60℃时酶的活性最强，结果见图7。
(8)pH对酶活性的影响
取20μL的0.1g·L-1双齿围沙蚕纤溶酶在不同pH的缓冲液(3、4、5、6、7、8、9、10、11)中，在37℃下作用1.5小时后，采用偶氮酪蛋白水解法分别检测残余蛋白酶活性，确定最适pH及pH稳定性。pH3-6选用50mM的醋酸盐缓冲液，pH7-9选用50mM的Tris–HCl缓冲液，pH10-11选用50mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
在比较宽的pH范围内(4-11)双齿围沙蚕纤溶蛋白酶都具有较高的活性，具有较的pH稳定性。由于酶的最大活性集中在碱性条件下(pH7-11)，说明该纤溶酶是一种碱性蛋白酶，最适宜pH为10，结果见图8。

Claims (11)

1.一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶，其特征在于：含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶，其特征在于：所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的分子量为33.03kDa；所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的等电点为5.28；纤溶活性为10000±1000U/mg。
3.根据权利要求1所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶，其特征在于：在所述的SEQ ID NO：1中，所述的蛋氨酸被氧化修饰过，在所述是SEQ ID NO：2中，所述的蛋氨酸被氧化修饰过。
4.权利要求1所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将干品或鲜品双齿围沙蚕使用缓冲液浸泡后匀浆，自溶1～8小时，进行离心，收集上清液，得酶粗提液；
2)将粗酶提取液采用饱和硫酸铵溶液进行盐析，获得沉淀蛋白；
3)将步骤2)中的沉淀蛋白用缓冲液复溶后，离心配制成上样样品；
4)将高分离度凝胶层析柱用缓冲液平衡后，将步骤3)中的样品用上样缓冲液洗脱，收集的活性部位再用超滤浓缩脱盐或凝胶柱层析脱盐；
5)将高分辨离子交换层析柱用Tris-HCl缓冲溶液或PB缓冲溶液平衡，将步骤4)中收集的样品上样，用含有0-1M氯化钠的缓冲液洗脱，收集的活性部位用超滤浓缩脱盐或凝胶柱层析脱盐；
6)采用高分辨率聚丙酰胺凝胶进一步纯化步骤5)中的样品，得到双齿围沙蚕纤溶蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的高分离度凝胶层析柱为Sephadex-G75层析柱，所述的高分离度凝胶层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，所述的高分辨率聚丙酰胺凝胶采用质量百分比浓度为10～15％聚丙酰胺凝胶。
6.根据权利要求4所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤1)中干品双齿围或鲜品双齿围的自溶时间为3-6h。
7.根据权利要求4所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤1)、3)、4)、5)中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液；步骤4)中所述的上样缓冲液为磷酸盐缓冲液、或三羟甲基氨基甲烷缓冲液、Tris-HCl缓冲溶液或PB缓冲溶液。
8.根据权利要求4所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤2)中，先用饱和硫酸铵溶液沉淀一次除去杂蛋白，沉淀后的硫酸铵溶液的终浓度为10％-20wt％，然后再用饱和硫酸铵溶液沉淀，沉淀后的硫酸铵溶液的终浓度为50％或60wt％，得到粗蛋白沉淀。
9.根据权利要求4所述的一种双齿围沙蚕纤溶蛋白酶的制备方法，其特征在于：步骤4)、5)中除盐用Sephadex-G25或截流分子量为3kDa、5kDa或10kDa超滤离心管，步骤5)中缓冲盐梯度洗脱时采用0-0.6M的氯化钠溶液。
10.权利要求1所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶在用于制备溶栓药物中的用途。
11.权利要求1所述的双齿围沙蚕纤溶蛋白酶在降解纤维蛋白原Aα、Bβ、γ链中的用途。
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