CN105175510A - 噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗凝血活性多肽及通过噬菌体展示技术筛选抗凝血活性多肽的方法，属于抗凝血药物研发与应用技术领域；本发明通过蛋白表达载体的构建、靶蛋白的表达和纯化、靶蛋白的验证、噬菌体展示淘选特异性结合靶蛋白的生物活性肽、多肽抗凝血作用体内体外检测和毒性实验等过程，最终筛选得到的具有抗凝血活性的多肽；这些多肽是以肝素结合表皮生长因子为靶分子，经三轮噬菌体展示技术的淘选，以肝素钠为有效成分洗脱特异性结合靶分子的噬菌体得到的，该多肽可用于制备抗凝血药物；本发明多肽序列较短，易于合成和实现规模化生产，且在体内对小鼠无显著的短期和长期毒性，显示其在抗凝血药物研发方面具有重要应用价值。

Description

噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽

技术领域

本发明涉及利用噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽，属于抗凝血药物研发与应用技术领域。

背景技术

凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性血栓严重危害着人类健康。血栓栓塞症已经成为临床上常见的致残及致死的重要原因之一，它主要发生在心脑血管疾病患者、手术后病人以及孕产妇当中。此外，现代临床检验中，许多检验项目的血液标本需要抗凝来检测，而在体外血液很容易凝固。这就使得研究高效、稳定、副作用小的抗凝血药物或制剂成为一个有巨大临床应用价值和前景的热点。

能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。目前应用在临床检验的抗凝剂主要有天然抗凝剂(如肝素)、Ca²⁺鳌合剂(柠檬酸钠、氟化钾、EDTA、草酸盐等)，应用于临床治疗的主要有肝素、水蛭素、丹参、阿司匹林以及华法林等。其中肝素是一种酸性不对称结构的糖胺聚糖，抗凝作用在体内外均较强，在临床上应用比较广泛，但用量过大时会引起出血、血小板减少、骨质疏松、耐药性和过敏等副反应。水蛭素及其衍生物比伐卢定是肝素安全有效的替代药，可用于肝素诱导的血小板减少症，且不易发生导管血栓。水蛭素衍生物基因工程双功能水蛭素(RGD-hirudin)已于2005年获国家食品药品监督管理局批准进入临床研究，临床适应症为血管吻合术后的抗凝、防栓治疗，并可用于治疗心绞痛、深静脉血栓等疾病。比伐卢定(Bivalirudin,Hirulog)地西卢定(desirudin)及来匹卢定(lepirudin)是水蛭素的衍生肽。其中比伐卢定的效果较好，能通过用序列(D)-F-P-R-P结合凝血酶抑制凝血。小分子类肽代替(D)-F-P-R-P合成价廉及给药方便的抗凝血药,目前已取得很大进展,它们均为功能单一的凝血酶催化中心抑制剂或因子Ⅹa等抑制剂。丹参和阿司匹林通过抑制血小板聚集达到抗凝血作用。华法林是目前应用最广泛的口服抗凝药之一，为双香豆素衍生物，它通过与维生素K竞争羧化酶，阻碍凝血因子激活和阻滞抗凝，从而达到抗凝作用。临床用于预防或治疗血管内血栓形成及手术或受伤后引起的血栓性静脉炎等。

除此以外，目前国内外临床使用的主要抗凝血药物还存在能透过胎盘致畸、损害肝肾等副作用。而多肽药物由于其拥有小分子量，对天然蛋白酶酶解的稳定性相对更好，更易被人体吸收，而且其毒性小、副作用低、无蓄积性、分子认知性良好、构效关系明显、药效学显著，已成为国际抗凝新药研究的热点，已进入临床应用及临床研究的多肽主要有阿加曲班(argatroban)、希美加群(ximelagatran)、达比加群(dabigatran)等，还有一系列类肽化合物被合成。

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内，这样使得大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。

目前抗凝血多肽的筛选方法主要包括从生化分离技术、基于序列同源性的生物信息学方法、在现有天然多肽上进行修饰合成等等，往往具有工作量大、效率低等缺点。随着噬菌体展示技术的发展，我们以特定的分子为靶标，以特定的分子洗脱特异性结合的噬菌体，使所产生的多肽功能便有了可预测性和较强的目的性。由于肝素能够和肝素结合表皮生长因子HB-EGF高度特异性结合且具备确定的高度抗凝的作用，因此，HB-EGF被选择作为靶标，肝素钠竞争性洗脱此类噬菌体，筛选得到类似于肝素抗凝血活性的多肽。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽。

本发明首先成功将靶标HB-EGF的目的基因导入了原核表达载体pET-30a，经IPTG诱导后，带有载体上标签的重组蛋白(His)₆-HB-EGF大量表达。

经两步亲和层析纯化后，我们得到了较纯的重组蛋白(His)₆-HB-EGF，然后为了排除噬菌体会结合标签蛋白从而造成非特异性序列产生的可能性，我们利用重组蛋白上的肠激酶酶切位点将其标签酶解去掉，之后利用镍柱亲和层析去掉酶切后蛋白样品中的标签蛋白，最终得到了HB-EGF。

HB-EGF经包被固定以后，使随机十二肽噬菌体文库中的噬菌体与之结合，以具有抗凝血活性的肝素钠为有效成分竞争性洗脱特异性结合靶分子的噬菌体，经过3轮淘选，富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增提取之后，对其进行测序，并合成了出现频率较高(73％，17％)的两个多肽，多肽1(SEQ.ID.NO.1)和多肽2(SEQ.ID.NO.2)。

经APTT、试管法、剪尾法对多肽进行体内外抗凝血活性验证，结果表明其中多肽2具有显著的抗凝血活性(P<0.05或P<0.01)且呈剂量依赖性，而多肽1并没有明显的抗凝活性(P>0.05)。将体内注入多肽的小鼠留作观察一周，发现小鼠各项生理指标和行为基本正常，且没有发生死亡。

本发明所提供的多肽序列如表1.所示：

表1.多肽的序列.

本发明的有益效果：

本发明利用噬菌体展示技术筛选得到的多肽，在体内和体外实验均具有显著的抗凝血活性，并且，未观察到小鼠的急性或慢性毒性作用。本发明中原料靶标HB-EGF和其配体肝素钠来源广、成本低；而且在淘选多肽的后期，可以通过提取噬菌体很容易得到其所对应随机多肽的信息；多肽序列较短，在体内容易运输，且易于实现规模化生产，所以整个生产过程耗时短、成本低、操作易行，同时又大大提高了药物筛选的成功率，使得本发明具有广阔的临床应用价值和前景。

附图说明

图1.重组蛋白(His)₆-HB-EGF的氨基酸序列；阴影部分为(His)₆标签，加粗斜体部分为肠激酶酶切位点，下划线部分为目的蛋白HB-EGF。

图2.蛋白表达载体pET-30a/(His)₆/HB-EGF的构建验证结果；其中A.1％琼脂糖凝胶电泳验证HB-EGFPCR扩增产物；B.重组质粒pET-30a/(His)₆/HB-EGF双酶切验证结果。

图3.蛋白表达载体pET-30a/(His)₆/HB-EGF的测序结果，其中GeneBankSeq表示注册的HB-EGF序列，InsertSeq表示实际插入载体的目的基因序列测序结果。

图4.SDS-PAGE和WesternBlotting验证重组蛋白(His)₆-HB-EGF的表达、纯化及酶切结果；其中A.15％SDS-PAGE验证蛋白诱导表达结果，其中M是蛋白标记，1是pET-30a空载体表达的蛋白，2是未经IPTG诱导的pET-30a/(His)₆/HB-EGF表达的蛋白，3-4是0.8mMIPTG诱导的pET-30a/(His)₆/HB-EGF表达的蛋白；B.WesternBlotting验证(His)₆-HB-EGF表达和肠激酶酶切结果，所用抗体为HB-EGF单克隆抗体，其中1是蛋白(His)₆-HB-EGF，2是酶切之后的蛋白样品HB-EGF；C.15％SDS-PAGE分析蛋白纯化结果，1-4是连续收集的蛋白洗脱样品；D.WesternBlotting检测肠激酶酶切(His)₆-HB-EGF蛋白结果，所用抗体为(His)₆单克隆抗体，其中1表示全长蛋白(His)₆-HB-EGF，2-3表示酶切之后的蛋白样品(His)₆。

图5.噬菌体展示流程图，其中A.以HB-EGF为靶分子，使噬菌体随机十二肽库与预先固定好的靶分子结合；B.洗掉未结合的噬菌体；C.用HB-EGF配体0.5mM的肝素钠溶液洗脱特异性结合靶分子的噬菌体；D.将洗脱下来的噬菌体扩增后进行下一轮的筛选；E.按照A、B、C、D进行3轮淘选，最终富集到与靶分子特异性结合的噬菌体。

图6.噬菌体淘选序列分布结果图；经3轮淘选之后，对得到的噬菌体随机多肽序列进行测序，共得到5种序列，多肽1即序列1，其氨基酸序列为TNCVQTRSLCPP；多肽2即序列2，其氨基酸序列为AGAEVEALFNNK。

图7.多肽体内外的抗凝血效果检测图，其中A.试管法检测多肽1和多肽2体内抗凝血作用；B.剪尾法检测多肽2体内抗凝血作用；C.APTT检测多肽2体外抗凝血作用。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，NS表示无统计学意义。

具体实施方式

实施例1.pET-30a/(His)₆/HB-EGF蛋白表达载体的构建

从GeneBank里提取编码HB-EGF的片段(aa63–149，GenBank注册号NM_001945)，设计PCR引物：Forwardprimer5’-CGGGATCCGACTTGCAAGAGGCAGAT-3’(SEQ.ID.NO.3)和Reverseprimer5’-CCAAGCTTTCATGGGAGGCTCAGCCC-3’(SEQ.ID.NO.4)，下划线部分别为酶切位点BamHI和HindIII。PCR产物和载体pET-30a(Novagen，#69909-3)经BamHI(NEWENGLANDBioLabs，#R0136S)和HindIII(NEWENGLANDBioLabs，#R0104S)37℃酶切3h之后，用T4DNA连接酶(NEWENGLANDBioLabs，#M0202S)在16℃连接12h。将连接产物转化进入DH5α感受态细胞(全式金，CD201)，然后将转化产物涂布在卡那霉素抗性(50μg/ml)LB平板上培养直至单菌落长出，挑取单菌落，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒送华大基因测序，得到质粒pET-30a/(His)₆/HB-EGF。

为大量获得目的蛋白HB-EGF并利于后续的纯化，本发明将HB-EGF基因插入表达载体pET-30a中，蛋白大量表达后经镍柱亲和层析和肝素亲和层析纯化，最后利用肠激酶将(His)₆标签切掉，如图1所示，为重组蛋白(His)₆-HB-EGF的氨基酸序列。图2A显示PCR反应后得到了目的基因；目的基因被连入载体pET-30a后进行双酶切验证，图2B中显示出现两个条带，分别是pET-30a载体部分和目的基因HB-EGF部分；最后经过测序验证，图3显示实际插入载体的目的基因序列与GeneBank中注册的序列比对结果完全相同。

实施例2.(His)₆-HB-EGF的诱导表达、纯化、酶切及验证

(His)₆-HB-EGF的诱导表达：将重组质粒pET-30a/(His)₆/HB-EGF转化宿主菌BL21(DE3)(全式金，CD601)，利用卡那霉素抗性LB平板筛选重组子，挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8。将培养物以体积比1:50的比例接种于LB液体培养基，37℃剧烈震荡培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8，加入终浓度为0.8mM的IPTG(Amresco，#0478)于25℃诱导12h。

镍柱亲和层析纯化(His)₆-HB-EGF：将菌液6,000rpm离心5min，去上清，以体积比菌液:裂解液＝20:1的比例将细菌沉淀重悬于裂解液(50mMTris–HCl，20mM咪唑，100mMNaCl，10％甘油，1％曲拉通，1mM蛋白酶抑制剂PMSF，1mg/ml溶菌酶，PH8.0)，在冰上静置30min，200W超声1.5h，12,000g离心30min收集上清得到总蛋白。将总蛋白进行BCA定量后，以蛋白:Ni-NTA＝10mg:1ml的比例在蛋白液中加入Ni-NTA(QIAGEN，#30210)，在4℃下结合5h；600g，4℃离心1min，去上清；装柱，用裂解液平衡，最后用10倍柱体积的洗脱液(250mM咪唑，其他组分与裂解液相同)收集洗脱下来的蛋白。

肝素亲和层析纯化(His)₆-HB-EGF：经镍柱亲和层析纯化之后的蛋白用肝素亲和层析结合缓冲液(10mM磷酸钠盐，PH7.0)透析2次，每次3h。将透析好的蛋白结合于肝素柱(GEHealthcare，#17-0406-01)，用结合缓冲液平衡，最后用10倍柱体积的洗脱液(10mM磷酸钠盐，1MNaCl，PH7.0)收集洗脱下来的蛋白。

肠激酶酶切(His)₆-HB-EGF：经两步亲和层析纯化之后的蛋白用肠激酶(NEWENGLANDBioLabs，#P8070V)缓冲液(20mMTris–HCl，100mMNaCl，2mMCaCl₂，PH8.0)透析3次，每次8h。对透析后的蛋白进行BCA定量后，以质量比为0.001％的比例将酶加入蛋白液中，4℃下反应16h。将酶切后的蛋白混合液重新结合Ni-NTA5h，于流穿液中收集蛋白液。

SDS-PAGE和WesternBlotting验证蛋白的表达、纯化及酶切：将蛋白样品用BCA方法定量后，按照每孔加入30-50μg(纯化后蛋白为2-5μg)的蛋白量上样。15％聚丙烯酰胺凝胶(SDS－PAGE)100V恒压下电泳100min分离蛋白。转膜条件为200mA恒流60min，将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉将膜封闭1h后，分别加入鼠源His单抗(proteintech，#66005-1-Ig，稀释度为1:1000)和兔源HB-EGF单抗(LifweSpan，#LS-C166802/44318，稀释度为1:1000)4℃孵育过夜，TBST溶液(20mMTris–HCl，150mMNaCl，0.05％[v/v]吐温，PH7.3)充分漂洗后，加入辣根过氧化物酶标记的分别抗鼠(CellSignaling，#7076，稀释度1:1000)和抗兔的二抗(CellSignaling，#7074，稀释度为1:1000)，孵育1h，ECL试剂盒(ThermoScientific，#34080)显色，曝光。

目的基因成功克隆进入表达载体后，将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选得到重组子，图4A显示在相同大小的位置，只有IPTG诱导的重组子产生了较多蛋白。在此基础上用WesternBlotting进一步验证，图4B显示在相同位置HB-EGF单克隆抗体检测到重组蛋白(His)₆-HB-EGF。蛋白被成功诱导表达之后，经两步亲和层析纯化后的效果如图4C显示，杂蛋白量很少，目的蛋白的纯度达到80％以上，符合后续实验要求。全长蛋白经过肠激酶酶切之后，结果如图4B所示用HB-EGF抗体检测到HB-EGF，以及如图4D所示用(His)₆抗体检测到(His)₆标签，表示酶切成功去掉了(His)₆标签，最终得到了蛋白HB-EGF。

实施例3.噬菌体展示淘选特异性结合HB-EGF的生物活性肽

噬菌体淘选流程如图5所示。

(1)靶分子固定化：将600μl浓度为17μg/ml的靶分子溶液(溶于0.1M的NaHCO₃PH8.6)加入六孔板中，置于摇床上轻微振荡，4℃孵育过夜。除去靶分子溶液并用TBST(50mMTris-HClPH7.5，150mMNaCl，0.1％[v/v]Tween-20)清洗6次。最后用封阻液(0.1MNaHCO₃PH8.6，5mg/mlBSA，0.02％NaN₃)封闭1h。

(2)噬菌体随机肽库与靶分子结合：除去封阻液，并用TBST(0.1％[v/v]Tween-20)清洗10次。噬菌体库或扩增后的噬菌体经TBST(0.1％[v/v]Tween-20)稀释后，噬菌体的拷贝数理论值在10⁹～10¹¹之间，将稀释好的噬菌体加入到六孔板上使之与靶分子结合，室温孵育10～60min。

(3)洗掉未结合噬菌体：TBST(第一轮用0.1％，之后都用0.5％[v/v]Tween-20)清洗10次，每次清洗后用力在无菌纸上拍甩，去除残留液。

(4)洗脱特异性结合噬菌体：将1ml0.5mM肝素钠溶液加入六孔板中，室温温和摇动10～60min。收集洗脱液，即得到被竞争性洗脱下来的特异性结合靶分子的噬菌体。

(5)噬菌体扩增：将洗脱下来的噬菌体加入20mlOD₆₀₀＝0.01～0.05的ER2738宿主菌中，37℃剧烈摇晃4h。将培养物转入新鲜离心管中，4℃8,000g离心20min，上清液转入另一离心管中，重复离心。将上清的上部80％转入新鲜离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％[w/v]PEG-8000，2.5MNaCl)，4℃沉淀过夜。再次离心、1mlTBS重悬、PEG/NaCl沉淀20min之后，将其溶于200μlTBS，14,000rpm，离心1min，将上清转移至另一新鲜Ep管中，即为扩增后的洗脱物。取出1μl用于滴度测定，其他用来进行下一轮淘选或保存。

(6)单克隆噬菌体信息的提取：3轮淘选后，将最后一轮洗脱下来的噬菌体感染宿主菌后铺在LB/IPTG/Xgal板上。13h后，噬菌体蓝斑长成，挑取蓝斑并进行单克隆噬菌体扩增。4h后将培养物14,000rpm离心30s，取上清，如此重复2次，最后取80％的上清即为扩增后的单克隆噬菌体。以单克隆噬菌体为模板，设计PCR引物Forwardprimer：5’-TTATTCGCAATTCCTTTAG-3’(SEQ.ID.NO.5)和Reverseprimer：5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’(SEQ.ID.NO.6)扩增随机多肽序列，对扩增产物进行测序并分析各种随机多肽所占比例，然后将候选多肽送金斯瑞公司合成。

经三轮噬菌体淘选后，挑取29个噬菌体蓝斑，对其分别进行扩增后收集噬菌体，设计引物对其随机多肽插入序列进行了PCR扩增，测序结果如图6所示，共得到了5种多肽序列，分别占比例73％(多肽1)，17％(多肽2)，4％，3％，3％。

实施例4.多肽抗凝血作用检测

(1)试管法检测多肽体内抗凝效果：将多肽用生理盐水稀释到500μg/ml后，通过尾静脉注射注入昆明小鼠体内200μl，注射对照组小鼠200μl生理盐水，20min后摘眼球取血12滴于Ep管中，开始计时，每隔10s倾斜45°，直至血液不再流动即为凝血时间。

(2)剪尾法检测多肽体内抗凝效果：将多肽用生理盐水稀释到2000μg/ml～5000μg/ml后，通过尾静脉注射注入小鼠体内200μl，注射对照组小鼠200μl生理盐水，20min后剪掉尾部末端5mm，待第一滴血流出后开始计时，每隔30s观察尾部伤口是否出血，直至无血流出后即为凝血时间。

(3)APTT检测多肽体外抗凝效果：兔耳缘静脉取血后，3,000rpm离心10min，取无血细胞血浆25μl，对照组血浆加入25μl的PBS(137mMNaCl，2.7mMKCl，4.3mMNa₂HPO₄，1.4mMKH₂PO₄，PH7.4)，实验组血浆加入25μl200μg/ml～500μg/ml的多肽后，37℃预热3min，加入50μlCaCl₂后半自动凝血仪(普利生，C2000-2)自动计时凝血时间。

如图7A所示，试管法检测多肽1体内抗凝效果与对照组相比无统计学意义(P＝0.055)，而多肽2体内抗凝效果显著(P＝0.011)，故本发明只对有抗凝效果的多肽2进行进一步验证；图7B剪尾法检测多肽体内抗凝效果结果显示低浓度多肽2抗凝效果不显著(P＝0.54)，而高浓度多肽2抗凝血效果具有显著差异(P＝0.0026)；体外检测抗凝效果如图7C所示，通过APTT检测，多肽2具有抗凝血活性，且呈剂量依赖性，其中低浓度多肽实验组与对照组差异P＝0.0032，高浓度多肽实验组与对照组差异P＝0.0093。综上所述，多肽2具有抗凝血活性，且在体内外均呈剂量依赖性，而多肽1虽然在淘选出来的多肽中所占比例最大，却在体内没有明显抗凝血活性。

实施例5.多肽2在体内对小鼠毒性作用观察

剪尾实验后，将实验组和对照组所有小鼠继续饲养并观察记录其各种行为学指征变化。结果如表2所示，注射多肽2后，小鼠没有受到明显影响，所记录各项行为学指征均正常，且一周之后没有发生死亡，表示多肽2注射进入小鼠体内对其没有急性或慢性毒性作用。

表2.多肽2在小鼠体内毒性作用观察

SEQUENCELISTING

<110>江苏大学

<120>噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽

<130>噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

ThrAsnCysValGlnThrArgSerLeuCysProPro

1510

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

AlaGlyAlaGluValGluAlaLeuPheAsnAsnLys

1510

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgggatccgacttgcaagaggcagat26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccaagctttcatgggaggctcagccc26

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttattcgcaattcctttag19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccctcatagttagcgtaacg20

Claims (5)

1.一种具有抗凝血活性的多肽，其特征是，所述多肽的氨基酸序列如Ι或Ⅱ所示：

Ι：TNCVQTRSLCPP；

Ⅱ：AGAEVEALFNNK。

2.根据权利要求1所述的具有抗凝血活性多肽在制备体内抗凝血药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的具有抗凝血活性多肽在制备体外抗凝血药物中的应用。

4.一种筛选抗凝血活性多肽的方法，其特征在于，所述方法是以肝素结合表皮生长因子为靶标，利用噬菌体展示技术，从随机十二肽噬菌体文库中淘选出高亲和力噬菌体，然后通过竞争性洗脱特异性结合噬菌体，得到具有权利要求1所述的抗凝血活性的随机多肽。

5.根据权利要求4所述一种筛选抗凝血活性多肽的方法，其特征在于，所述淘选过程中，是以肝素钠为有效成分竞争性洗脱特异性结合噬菌体。