CN105861474B - 具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶及其制备方法和应用，该活性蛋白酶的N端氨基酸序列为Pro‑Phe‑Pro‑Val‑Pro‑Asp‑Pro‑Phe‑Val‑Trp‑Asp‑Thr‑Ser‑Phe‑Gln。本发明通过大量试验筛选，采用硫酸铵沉淀结合疏水作用层析、离子交换层析和凝胶过滤层析的方法对活性蛋白酶进行分离纯化，制备得到纯度高于95％以上的方格星虫活性蛋白酶。本发明首次采用纤维蛋白平板法的体外评价方法和FeCl3诱导的大鼠动脉血栓模型的体内评价方法对活性蛋白酶进行活性评价，实验结果表明，本发明制备得到的方格星虫活性蛋白酶具有很好的抗血栓性能，可用于制备抗血栓药物，具有很好的应用前景。

Description

具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶，具体涉及一种从方格星虫中分离得到的具有抗血栓活性的活性蛋白酶，属于生物医药技术领域。
背景技术
星虫，亦称沙虫、土笋、泥丁，世界分布广泛，在我国资源也非常丰富。由于其显著的药效作用和含量丰富的营养成分，其在我国具有悠久的药用、食用历史。本草记载星虫味咸、性寒，归肺、肾经，具有滋阴降火、清肺补虚、活血强身及补肾养颜之功效，主要用于治疗骨蒸潮热、肺虚喘咳、胸闷痰多、阴虚盗汗以及妇女产后乳汁稀少等症。
自20世纪80年代末以来，由于市场价格的刺激，方格星虫遭到掠夺式采掘，再加上海洋污染的加剧，其资源量急速下降，因此开始发展人工养殖。但由于方格星虫在稚虫时期遇到的虫害比较多，难以提高养殖的生产效益，从而浪费了许多生产资源。
据《中华本草》记载，其肉质脆嫩，鲜美甘甜，东南沿海居民称其为“海洋冬虫夏草”，并将其作为一种海味珍品和高级补品。现代研究结果显示星虫含有丰富的氨基酸、微量元素等营养物质以及一些特殊的活性成分，具有多种药理活性。自古星虫就有多种药食用法，比如晒干、水煎单用；去内脏，以好酒浸，具有活血强身之功效；去内脏，置于老鸭头部，加料、蒸烂、食之，达到治疗病后体弱的作用。
但是对方格星虫活性蛋白的深入研究较少，有待于进一步开发。
发明内容
发明目的：本发明的目的是在方格星虫现有研究的基础之上，通过大量实验筛选，采用现代化技术手段，对方格星虫的活性蛋白成分进行分离纯化，本发明首次采用硫酸铵沉淀结合疏水作用层析、离子交换层析和凝胶过滤层析的方法对星虫活性蛋白酶进行分离纯化，制备得到的方格星虫活性蛋白酶，纯度可达95％以上，抗血栓活性强，具有重要的应用价值。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：一种具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶，其特征在于，该活性蛋白酶的N端氨基酸序列为Pro-Phe-Pro-Val-Pro-Asp-Pro-Phe-Val-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln(脯氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-色氨酸-天冬氨酸-苏氨酸丝氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺)。
作为优选方案，以上所述的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶，其特征在于，方格星虫活性蛋白酶的相对分子质量为28003.67D。
本发明所述的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)活性蛋白酶粗水提物的制备
取新鲜方格星虫，洗去杂质和泥沙，解剖星虫，除去体内泥沙，将其剪碎并且匀浆后加入PBS缓冲液，搅拌均匀，于-10至-20℃中冷冻12～24h后再置于4℃解冻，然后离心，取上清液；沉淀部分加入PBS缓冲液继续重复上述步骤；将上清液进行冷冻干燥，-20℃保存备用；
(2)活性蛋白酶水提物的粗分离
硫酸铵沉淀区间的确定及星虫水提物硫酸铵沉淀
取步骤(1)制备得到的活性蛋白酶粗水提物，向其中分别一边搅拌一边加入硫酸铵固体粉末至30％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min，然后取盐析液进行离心，取上清，再向上清液中继续加入一定量的硫酸铵固体粉末至60％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min，再将盐析液离心，收集活性蛋白酶沉淀；
活性蛋白酶沉淀的透析脱盐除杂
将经硫酸铵沉淀得到的活性蛋白酶沉淀，用PBS缓冲液进行复溶后，加入到截留分子量大于3500D的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析24～48h，除盐除杂后冻干，得到活性蛋白酶粗品，备用；
(3)活性蛋白酶的精制
采用美国GE公司的
Figure BDA0000983441190000021
Pure蛋白纯化系统对活性蛋白酶进行精制
(3.1)疏水作用层析
样品处理：用1moL/L(NH4)2SO4溶液将活性蛋白酶粗品溶解，离心，并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱：
按柱体积的2％上样，流动相：A相为PBS缓冲液和B相为用PBS缓冲液溶解的1moL/L(NH4)2SO4溶液，梯度洗脱：100％B，3CV；100％-60％B，0.5CV；60％B，0.75CV；60％-40％B，0.25CV；40％B，0.75CV；40％-20％B，0.25CV；20％B，0.75CV；20％-0B，0.25CV；100％A，2CV；流速：3mL/min；紫外检测波长：280nm；以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力，合并收集；
(3.2)活性蛋白酶活性组分的透析脱盐除杂
将经步骤(3.1)疏水作用层析收集得到的活性蛋白酶活性组分用PBS缓冲液进行复溶后加入到截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析24～48h，冻干，-20℃保存备用；
(3.3)Q Sepharose High Performance离子交换层析
样品处理
用PBS缓冲液将上步骤(3.2)得到的活性蛋白酶活性组分溶解，离心，并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱
按柱体积的2％上样；流动相：A相为PBS缓冲液和B相为用PBS缓冲液溶解的0.8moL/LNaCl溶液，梯度洗脱：100％A，2CV；0-20％B，0.25CV；20％B，2CV；20％-30％B，0.25CV；30％B，1CV；30％-50％B，0.25CV；50％B，1CV；50％-70％B，0.25CV；70％B，0.75CV；70％-100％B，0.25CV；100％，2CV；流速：3mL/min；紫外检测波长：280nm；以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集；
样品脱盐除杂
采用Thermo Zeba脱盐离心柱对经离子交换层析收集得到的活性组分进行脱盐处理；将活性组分上样于脱盐离心柱中，离心，收集样品；
采用Millipore Amicon Ultra 3K超滤管对经离子交换层析并脱盐的活性组分进行除杂浓缩，将脱盐后的活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心，收集样品，冻干，-20℃保存备用；
(3.4)Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析
样品处理
用PBS缓冲液将上步骤得到的活性蛋白酶活性组分溶解，离心(8000r/min，30min，4℃)并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱
按柱体积的2％上样，流动相：PBS缓冲液；洗脱方式：5CV等度洗脱；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：280nm；以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集；
(3.5)样品除杂
采用MilliporeAmiconR Ultra 3K超滤管对经步骤(3.4)凝胶过滤层析后的活性组分进行除杂浓缩；将活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心，收集样品，冻干，得到精制的方格星虫活性蛋白酶。
作为优选方案，以上所述的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶的制备方法，所得方格星虫活性蛋白酶的纯度大于95％。
本发明所述的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶具有很好的抗血栓性能，可用于制备抗血栓药物。
有益效果：本发明提供的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过大量试验筛选，首次采用硫酸铵沉淀结合疏水作用层析、离子交换层析和凝胶过滤层析的方法对活性蛋白酶进行分离纯化，得到纯度高于95％以上的方格星虫活性蛋白酶。并且本发明首次采用电泳方法结合凝胶过滤色谱法对活性蛋白酶进行纯度鉴定；首次采用基质辅助激光解吸附联合飞行时间质谱法(MALDI-TOF)对活性蛋白酶进行分子量测定；首次采用经典的Edman降解法对活性蛋白酶进行N端序列测定。并且首次采用纤维蛋白平板法的体外评价方法和FeCl3诱导的大鼠动脉血栓模型的体内评价方法对活性蛋白酶进行活性评价。实验结果表明，本发明制备得到的方格星虫活性蛋白酶具有很好的抗血栓性能，可用于制备抗血栓药物。
本发明制备工艺设计合理，可操作性强，为方格星虫开发新的临床用途，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶的分离纯化
1实验材料
1.1仪器
GE
Figure BDA0000983441190000041
Pure，GE XK 26/20 Column，GE XK 16/100 Column(GEHealthcare,MA,USA)；Bio-rad Mini Protein 3 Cell小型垂直电泳系统，Bio-radChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统(Bio-rad,CA,USA)；Waters Alliance 2695型高效液相系统，Waters 2996型PDA检测器(Waters,MA,USA)；AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOFTM质谱系统(AB SCIEX,MA,USA)；PE Enspire型多功能酶标仪(Perkin Elmer,MA,USA)；PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪(SHIMADZU,Japan)；Bio-rad Mini Protein 3 Cell小型垂直电泳系统，Bio-rad ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统(Bio-rad,CA,USA)；TE 22 mini TankTransfer Mnit电转移槽(GE Healthcare,MA,USA)；LABCONCO FreeZone冷冻干燥机(LABCONCO,KS,USA)；SANYO SIM-F140AY65制冰机(SANYO,Osaka,Japan)；Millpore-QReference超纯水系统(Merck Millpore,MA,USA)；Beckman CoulterAllegra X-15R高速离心机(Beckman Coulter,CA,USA)；ML204/MS105型电子天平(Mettler-Toledo,Zurich,Switzerland)；泰斯特SPX-150BIII型恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)。
1.1.1试剂及试药
Phenyl SepharoseTM High Performance填料，Q SepharoseTM High Performance填料，SuperdexTM G-75填料(GE Healthcare,MA,USA)；TOSOH T活性蛋白酶gel G4000PWXL凝胶色谱柱(TOSOH,Yamaguchiken,Japan)；MD44 3500 Da透析袋(北京索莱宝科技有限公司)；Thermo Scientific SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladders，ThermoZebaTM脱盐离心柱，Thermo Scientific PierceTM BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher Scientific,MA,USA)；MilliporeAmiconR Ultra 3K超滤管，ZipTip C4(MerckMillpore,MA,USA)；尿激酶(中国食品药品检定研究院，140604-201224)；人纤维蛋白原(江西博雅生物制药股份有限公司，国药准字S20013006)；凝血酶，TEMED，SDS(Sigma-Aldrich,CA,USA)；琼脂糖(HydraGene有限公司，产品批号：111002025)；Acrylamide，BIS-Acrylamide(Amresco,OH,USA)；Ammonium Persulfate(BioLink,Sandnes,Norway)；Tris，Glycine(Affymetrix,OH,USA)；CHCA，乙腈，TFA，Proteo Mass Peptide&Protein MALDI-MSCalibration Kit，SA(Sigma-Aldrich,CA,USA)；样品靶(AB Sciex,MA,USA)；ThermoScientific SpectraTMMulticolor Broad Range Protein Ladders(Thermo FisherScientific,MA,USA)；CAPS buffer(Sigma-Aldrich,CA,USA)；PVDF膜(GE Healthcare,MA,USA)；Prosorb，Biobrene Plus(ABI,USA)；PTFE滤膜(SHIMADZU,Japan)；PTH-AminoAcisMixed，Ethylagetate，PTHAminoAcids Mobile Phase，Trifluoroacetic acid，Phenylisothiocyanaten-Heptane，Trimethylamine(Wako,Japan)；其它试剂均为国产分析纯，去离子水经Millpore-Q Reference超纯水系统自制。
裸体方格星虫(Sipunculus nudus Linnaeus)样品由厦门大学丁少雄教授鉴定并提供。
2实验方法
2.1蛋白浓度标准曲线的制作
采用Thermos Scientific公司的Pierce BCA Protein Assay Kit试剂盒测定样品蛋白浓度。用PBS缓冲液按表1-1-1对试剂盒中的BSA储备液(2mg/mL)进行稀释。
表1-1-1 BSA蛋白标准液配制表
Figure BDA0000983441190000051
待标准液和样品稀释后，用微量加样器向96孔板中每孔加25μL不同浓度标准品溶液或样品稀释液以及200μL试剂盒工作液(A液︰B液＝50︰1)，每个浓度标准液或样品溶液加三个复孔，将上述溶液加入振荡均匀后，于37℃恒温箱中30min，取出，放冷，于562nm波长处检测吸光度。以BSA蛋白标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作蛋白浓度标准曲线。
2.2酶活力标准曲线的制作
2.2.1纤维蛋白平板的制作
参照经典纤维蛋白平板制作方法[2]稍作改动后取5mL 0.5％纤维蛋白原溶液，向其中加入1mL含10IU凝血酶溶液，搅拌均匀后，迅速倒入已加入4mL 2％琼脂糖溶液的烧杯中，将以上溶液迅速搅拌均匀后迅速倒入无菌培养皿(90mm)中，静置1h后，4℃保存待用。
2.2.2尿激酶标准液的配制
取尿激酶(1240IU)用生理盐水溶解定容至1240IU/mL作为母液，其后用生理盐水逐级稀释，得到620.00IU/mL、310.00IU/mL、155.00IU/mL、77.50IU/mL、38.75IU/mL、19.38IU/mL、9.69IU/mL共7个浓度，4℃保存待用。
2.2.3酶活力标准曲线的制作
待加样前，用自制打孔器在已制成的纤维蛋白平板上平均打14个直径为3mm的孔，依次用自动加样器加各浓度尿激酶10μL，每个浓度加两个复孔。将加样后的纤维平板加盖倒置于37℃恒温培养箱中保温18h后，取出，用游标卡尺测量所形成溶圈相互垂直的两条直径。以尿激酶含量为横坐标，溶圈两垂直直径乘积(R1×R2)的自然对数为纵坐标制作酶活力标准曲线。
2.3活性蛋白酶的分离纯化
2.3.1活性蛋白酶粗水提物的制备
取新鲜方格星虫，用PBS缓冲液冲洗两遍洗去杂质和泥沙，再用吸水纸吸去表面多余水分，称重，得生药量。用洗净灭菌的手术剪解剖星虫，除去体内泥沙。将其剪碎并且匀浆(1000r/min，30s)后加入两倍的PBS缓冲液，搅拌均匀，于-20℃中冷冻12h后再置于4℃解冻。其后离心(5000r/min，10min，4℃)，取上清液，沉淀部分加入两倍的PBS缓冲液继续重复上述步骤。合并两次上清液后测定其蛋白浓度和纤溶活性，计算比活力。将上清液进行冷冻干燥，-20℃保存备用。
2.3.2活性蛋白酶水提物的粗分离
2.3.2.1硫酸铵沉淀区间的确定及星虫水提物硫酸铵沉淀
取7份活性蛋白酶水提液，每份50mL，向其中分别一边搅拌一边加入一定量的经研磨过的硫酸铵固体粉末至10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min。取上述7份盐析液进行离心(8000r/min，30min，4℃)取上清，再向7份上清液中继续加入一定量的硫酸铵固体粉末至20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min。再将7份盐析液离心(8000r/min，30min，4℃)后得到10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％共7个沉淀区间的活性蛋白酶蛋白沉淀。将7份沉淀蛋白分别透析除盐后加入相同量的PBS后用纤维平板法测定各个沉淀区间蛋白纤溶活性。
根据上述实验确定活性蛋白酶的最佳沉淀区间进行活性蛋白酶的粗分离并收集沉淀继续进行后续步骤。
2.3.2.2活性蛋白酶沉淀的透析脱盐除杂
将经硫酸铵沉淀得到的活性蛋白酶沉淀用少量PBS缓冲液进行复溶后加入截留分子量大于3500D的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析48h，冻干，-20℃保存备用。
2.3.3活性蛋白酶的精制
采用美国GE公司的
Figure BDA0000983441190000061
Pure蛋白纯化系统对活性蛋白酶进行精制。
2.3.3.1 Phenyl Sepharose High Performance疏水作用层析
样品处理
用1moL/L(NH4)2SO4溶液将活性蛋白酶粗品溶解，离心(8000r/min，30min，4℃)并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用。
上样洗脱
按柱体积(26mm×170mm)的2％约上样2mL。流动相：A(PBS缓冲液)和B(用PBS缓冲液溶解的1moL/L(NH4)2SO4溶液)，梯度洗脱：100％B，3CV；100％-60％B，0.5CV；60％B，0.75CV；60％-40％B，0.25CV；40％B，0.75CV；40％-20％B，0.25CV；20％B，0.75CV；20％-0B，0.25CV；100％A，2CV。流速：3mL/min；紫外检测波长：280nm。以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力，合并收集。
活性蛋白酶活性组分的透析脱盐除杂
将经疏水作用层析收集得到的活性蛋白酶活性组分用少量PBS缓冲液进行复溶后加入截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析48h，冻干，-20℃保存备用。
2.3.3.2 Q Sepharose High Performance离子交换层析
样品处理
用PBS缓冲液将上步骤得到的活性蛋白酶活性组分溶解，离心(8000r/min，30min，4℃)并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用。
上样洗脱
按柱体积(26mm×180mm)的2％约上样2mL。流动相：A(PBS缓冲液)和B(用PBS缓冲液溶解的0.8moL/L NaCl溶液)，梯度洗脱：100％A，2CV；0-20％B，0.25CV；20％B，2CV；20％-30％B，0.25CV；30％B，1CV；30％-50％B，0.25CV；50％B，1CV；50％-70％B，0.25CV；70％B，0.75CV；70％-100％B，0.25CV；100％，2CV。流速：3mL/min；紫外检测波长：280nm。以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集。
样品脱盐除杂
采用Thermo Zeba脱盐离心柱对经离子交换层析收集得到的活性组分进行脱盐处理。将活性组分上样于预先根据说明书预处理过的脱盐离心柱中，离心(1000×g，2min)，收集样品。
采用Millipore Amicon Ultra 3K超滤管对经离子交换层析并脱盐的活性组分进行除杂浓缩。将脱盐后的活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心(5000×g，60min)，收集样品，冻干，-20℃保存备用。
2.3.3.3 Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析
样品处理：
用PBS缓冲液将上步骤得到的活性蛋白酶活性组分溶解，离心(8000r/min，30min，4℃)并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用。
上样洗脱：
按柱体积(16mm×500mm)的2％约上样2mL。流动相：PBS缓冲液；洗脱方式：5CV等度洗脱；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：280nm。以9mL/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集。
样品除杂
采用MilliporeAmiconR Ultra 3K超滤管对经凝胶柱层析的活性组分进行除杂浓缩。将活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心(5000×g，60min)，收集样品，冻干，-20℃保存备用。
2.4活性蛋白酶的纯度鉴定、分子量测定及N端氨基酸序列测定
2.4.1活性蛋白酶的纯度鉴定
2.4.1.1 Native-PAGE和SDS-PAGE相结合进行纯度鉴定
电泳方法参照经典的Laemmli方法[3]稍作改动，采用15％的分离胶和5％的基层胶。
相关溶液的配制
(1)30％(W/V)Acrylamide：称取290gAcrylamide和10g BIS，加入约600mL去离子水，充分搅拌溶解后加去离子水定容至1L，用0.45μm滤器滤去杂质，并于棕色瓶中4℃保存。
(2)1.5M Tirs-HCl,pH 8.8溶液：称取18.21g Tris base，加入约80mL去离子水，用HCl调节pH值至8.8，加去离子水定容至100mL，4℃保存。
(3)1.0M Tris-HCl,pH 6.8溶液：称取12.10g Tris base，加入约80mL去离子水，用HCl调节pH值至6.8，加去离子水定容至100mL，4℃保存。
(4)10％SDS溶液：称取10g SDS，加入约90mL去离子水，搅拌均匀，加热溶解，再加入去离子水定容至100mL，室温保存。
(5)10％APS溶液：称取1g APS，加入约8mL去离子水，震荡溶解均匀，加入去离子水定容至10mL，现配现用。
(6)10×电极缓冲液,pH 8.3：称取30.3g Tris base、144g甘氨酸和10g SDS，加入约800mL去离子水溶解，搅拌均匀，用去离子水定容至1000mL，4℃保存。
(7)SDS-PAGE 5×样品溶解液：取25mg溴酚蓝和0.5g SDS溶液，向其中加入2.5mL甘油和1.25mL Tris-HCl(1M,pH 6.8)，将其混合均匀，用去离子水定容至5mL。分装成500μL/份，后-20℃保存使用前将25μL的β-巯基乙醇加入每一小份中。
(8)Native-PAGE 5×样品溶解液：取25mg溴酚蓝，向其中加入2.5mL甘油和1.25mLTris-HCl(1M,pH 6.8)，将其混合均匀，用去离子水定容至5mL。分装成500μL/份，-20℃保存使用。
(9)0.1％考马斯亮蓝染液：取0.5g考马斯亮蓝R250，向其中加入50mL冰醋酸和200mL甲醇，搅拌均匀后，用去离子水定容至500mL，用0.45μm滤器滤去杂质，并于棕色瓶中室温保存。
(10)考马斯亮蓝脱色液：250mL无水乙醇、60mL冰醋酸和0.5mL甲醛混合均匀，用去离子水定容至500mL，室温保存。
凝胶电泳分离胶和积层胶的配制
依据表1-1-2配制SDS-PAGE和Native-PAGE的分离胶和积层胶，分别将分离胶和积层胶均一次性注入模具中，插上5mm的10孔梳子。
表1-1-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶和积层胶的配制
Figure BDA0000983441190000091
加样和跑胶：
将一定量的样品分别与SDS-PAGE 5×样品溶解液和Native-PAGE 5×样品溶解液进行混合，于98℃加热15min，Marker也与适量样品溶解液进行混合。再向内外槽中各加入一定量的1×电极缓冲液后分别将样品和Marker加入样品孔道中。待各步骤就绪，接通电源，先将电压调至80V，待样品开始进入分离胶时，将电压升至100V，恒压跑至分离胶前沿至底部约0.5cm时，关闭电源。
染色和脱色
将凝胶小心取出，放入一表面皿中，加入0.1％考马斯亮蓝染液后盖上盖置于摇床上避光染色4h。将染液回收后，向其中加入脱色液脱色直至背景干净。
2.4.1.2凝胶过滤色谱法纯度鉴定
采用Waters 2695型高效液相色谱仪串联Waters 2996型PDA检测器，T活性蛋白酶gel G4000PWXL凝胶色谱柱(7.8mm I.D.×30cm,10μm)，流动相：去离子水；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.5mL/min；柱温：37℃。用去离子水将活性蛋白酶溶解成2mg/mL的溶液并通过0.45μm水膜过滤除杂后上样10μL。
2.4.2活性蛋白酶的分子量测定
采用美国AB Sciex公司的AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOFTM对活性蛋白酶相对分子量进行测定。
取1μL活性蛋白酶样品点至样品靶(384 Opti-TOF 123mm×81mm)上，自然干燥后，再取0.6μL SA基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品。采用校准范围为39212±100和66430±100的标准物质进行校准测试。检测条件：脉冲激光波长：355nm；离子模式：正离子模式下线性方法测试样品分子量；由4000 SeriesExplorer V 3.5软件导出原始数据及图谱。
2.4.3活性蛋白酶的N端序列测定
本实验中采用了经典的Edman降解法对活性蛋白酶的N端序列进行测定。
2.4.3.1 SDS-PAGE凝胶电泳
2.4.3.2转膜
准备PVDF膜，剪成和凝胶一致的大小，在100％甲醇中均匀润湿约5min。将凝胶置于也在转移缓冲液中浸过的厚滤纸上，然后将PVDF膜覆于凝胶上，再盖上一张浸湿的厚滤纸(避免在每一层间留有气泡)，适当用手按压以便排出空气使其充满液体，最后将它们一起夹入转印夹，放入转印槽中。加入大约1L转移缓冲液，打开外循环制冷，打开电转移槽下的磁力搅拌仪。打开电源，250mA湿转通电90min后，取出转印夹，取下PVDF膜用立春红染液染色，再用纯化水漂洗至背景没有红色条带清晰。
2.4.3.3蛋白质N端测序
组装好反应器，将PVDF膜中的待测样品剪下，放置到反应器中置于仪器固定位置，仪器设置完成后开始测试。
2.4.3.4数据处理
PPSQ-33A产生的原始数据及图谱由PPSQ-30DataProcessing软件识别标峰并导出。
3实验结果
3.1蛋白含量标准曲线
依据试剂盒说明测得9个浓度蛋白标准溶液的吸光度值，见表1-1-3。以标准溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制蛋白蛋白浓度标准曲线。其标准曲线方程为Y＝0.0012X+0.1681，R2＝0.9929。
表1-1-3 蛋白标准溶液测定值
Figure BDA0000983441190000101
3.2酶活力标准曲线
采用纤维蛋白平板法测得7个浓度尿激酶标准液的溶圈直径，见表1-1-4。以尿激酶标准溶液浓度为横坐标，溶圈两垂直直径乘积(R1×R2)的自然对数为纵坐标，绘制酶活力标准曲线。其标准曲线方程为Y＝0.0024X+0.4124，R2＝0.9952。
表1-1-4 尿激酶标准溶液活力测定值
Figure BDA0000983441190000102
3.3活性蛋白酶(活性蛋白酶)的分离纯化
3.3.1活性蛋白酶粗水提物的粗分离
根据设定的7个硫酸铵沉淀区间得到7份沉淀蛋白，将7份沉淀蛋白配成溶液，分别加入自制的纤维蛋白平板中测定其纤维活性，结果表明，在10％-20％和20％-30％区间，沉淀蛋白纤溶活性很弱，在30％-40％，40％-50％和50％-60％区间，沉淀蛋白的纤溶活性均很强，在60％-70％和70％-80％区间，沉淀蛋白纤溶活性也很弱。上述结果表明活性蛋白酶在硫酸铵30％饱和度时开始大量沉淀，一直到硫酸铵60％饱和度时基本沉淀完全。根据以上结果，选择30％-60％的沉淀区间对星虫水提物进行盐析，可以最大限度地对具有纤溶活性的活性蛋白酶进行粗分离。
根据上述实验确定活性蛋白酶的最佳沉淀区间向星虫水提液中一边搅拌一边加入一定量硫酸铵固体粉末至30％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min，离心(8000r/min，30min，4℃)取上清，继续向其中加入一定量的硫酸铵固体粉末至60％的百分饱和度，离心(8000r/min，30min，4℃)，收集沉淀。将沉淀用截留分子量大于3500D的透析袋低温透析除盐除杂后冻干进行下一步精制。
3.3.2活性蛋白酶的精制
3.3.2.1 Phenyl Sepharose High Performance疏水作用层析
利用Phenyl Sepharose High Performance疏水作用层析，将粗酶样品根据蛋白的疏水性由高到低进行第一步精制。将经疏水作用层析后的流出液进行收集，9mL一管，逐管检测纤溶活性，合并纤溶活性高流份。用截留分子量大于3500D的透析袋低温透析除盐除杂后冻干进行下一步精制。
3.3.2.2 Q Sepharose High Performance阴离子交换层析
利用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析，将经上一步层析后收集到的活性组分根据不同离子强度下与填料基团的结合能力将其进一步分离精制。收集经离子交换层析作用后的流出液，9mL一管，逐管检测纤溶活性，合并纤溶活性较强流份。分别采用Thermo Zeba脱盐离心柱脱盐和MilliporeAmicon Ultra 3000D超滤管除去小分子杂质并浓缩，冻干继续进行下一步精制。
3.3.2.3 Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析
利用Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析，将经上一步层析后收集到的活性组分基于分子量大小进行分离。收集层析作用后的流出液，9mL一管，逐管检测纤溶活性，收集纤溶活性较强流份。并采用Millipore Amicon Ultra 3K超滤管进一步除去小分子杂质并浓缩蛋白，冻干，-20℃保存备用。
活性蛋白酶分离纯化结果
本发明中分别考虑样品量、样品纯度等因素后分别选择了不同原理的硫酸铵分级沉淀法、疏水作用层析法、离子交换层析法和凝胶过滤层析法结合透析、超滤等方法从多角度进行活性蛋白酶提取、分离和纯化。将每步骤后的样品根据纤维蛋白平板活性测定结果进行合并、除盐、除杂和浓缩，并测定每一步骤过后的样品总蛋白含量和总酶活力，并计算酶比活力，总得率和纯度，得到结果见表1-1-5。与此同时，为了更直观体现出经过提取、硫酸铵沉淀、疏水作用层析、离子交换层析和凝胶过滤层析后活性蛋白酶的纯度情况，本发明还采用了SDS-PAGE法对上述每一步骤后的样品进行凝胶电泳分离。
表1-1-5 活性蛋白酶分离纯化结果
Figure BDA0000983441190000121
3.4活性蛋白酶的纯度鉴定和分子量测定。
3.4.1活性蛋白酶的纯度鉴定
采用15％的分离胶和5％的积层胶分别在还原和非还原下对分离得到的活性蛋白酶进行纯度鉴定。经过多步分离纯化后的活性蛋白酶在还原和非还原的聚丙烯酰胺凝胶电泳下均只有单条带，说明制备出的活性蛋白酶的纯度达到了电泳纯。采用凝胶过滤色谱法对活性蛋白酶进行纯度鉴定，结果显示在20min处出现一个单一峰，纯度达95％以上。
3.4.2活性蛋白酶的分子量测定
为保证供试品相对分子质量测试的准确性，在测试供试品相对分子质量之前，通过测试标准品对样品靶进行校准。标准品校准测试通过后，进行活性蛋白酶相对分子质量测试，测试结果显示活性蛋白酶相对分子质量为28003.67D。
3.4.3活性蛋白酶的N端氨基酸序列测定
转膜结束的PVDF膜经丽春红染色后，用去离子水漂洗至背景清晰，目的条带显著。。利用含19种PTH氨基酸的混合标准品对仪器进行校准后，对活性蛋白酶进行了15个循环的N端测序，得到活性蛋白酶的N端序列为NH2-Pro-Phe-Pro-Val-Pro-Asp-Pro-Phe-Val-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln。
实施例2活性蛋白酶活性测试
1实验材料
1.1仪器
泰斯特SPX-150BIII型恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；Millpore-QReference超纯水系统(Merck Millpore,MA,USA)；ML204/MS105型电子天平(Mettler-Toledo,Zurich,Switzerland)；超低温冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；游标卡尺(上海海凌量具有限公司)。
1.2试剂及试药
尿激酶(中国食品药品检定研究院，140604-201224)；人纤维蛋白原(江西博雅生物制药股份有限公司，国药准字S20013006)；凝血酶，TEMED，SDS(Sigma-Aldrich,CA,USA)；琼脂糖(HydraGene有限公司，产品批号：111002025)；三氯化铁(国药集团化学试剂有限公司)；无菌注射用水(上海信谊金珠药业有限公司，国药准字：H31022048)；二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原含量(FIB)试剂盒购自北京世帝科学仪器公司；TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2Elisa试剂盒购自上海酶联生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯，去离子水经Millpore-Q Reference超纯水系统自制。方格星虫活性蛋白酶(活性蛋白酶，自制)。
2实验方法
2.1活性蛋白酶对纤维蛋白平作用量效关系
溶液的配制：活性蛋白酶溶液的配制：称取100mg实施例1制备得到的方格星虫活性蛋白酶，用1mL PBS缓冲液溶解，然后用PBS缓冲液逐级稀释，得到100.00mg/mL、50.00mg/mL、25.00mg/mL、12.50mg/mL、6.25mg/mL 5个浓度，4℃保存待用。
实验步骤：用自制打孔器在已制成的纤维蛋白平板上打直径为3mm的孔，将实施例1制备得到的活性蛋白酶配制溶液分别加入自制纤维平板中。将加样后的纤维平板加盖后置于37℃恒温培养箱中保温18h，取出，用游标卡尺测量所形成溶圈相互垂直的两条直径，计算乘积(R1×R2)研究不同浓度活性蛋白酶溶解纤维蛋白平板量效关系。
2.2活性蛋白酶对FeCl3诱导的大鼠动脉血栓形成的影响
2.2.1分组、给药与造模
大鼠48只，随机平均分为空白组(C)、动脉血栓模型组(M)、尿激酶给药组(UK,40000IU/kg)、实施例1方格星虫活性蛋白酶高剂量组(活性蛋白酶H,100mg/kg)、方格星虫活性蛋白酶中剂量组(活性蛋白酶M,50mg/kg)和方格星虫活性蛋白酶低剂量组(活性蛋白酶L,10mg/kg)。用无菌注射用水作溶媒，连续7天尾静脉注射给药，假手术组和模型组注射等量无菌注射用水。第七天给药半小时后用10％水合氯醛麻醉后固定，分离大鼠右侧颈总动脉，用浸有50μL 10％FeCl3溶液的无菌滤纸(1mm×2mm)覆盖在右侧颈总动脉上，假手术组将浸有50μL无菌生理盐水的滤纸覆盖在大鼠右侧颈总动脉上。计时3min，将滤纸取下，用浸有无菌生理盐水的无菌纱布覆盖伤口20min。
2.2.2血浆指标的检测
观察血栓形成后，大鼠腹主动脉取血8mL，其中6mL以枸橼酸钠(3.8％)1︰9抗凝，另外2mL以EDTA(1.5％)1︰9抗凝，静置。先将以枸橼酸钠(3.8％)1︰9抗凝的全血以800r/min离心10min取上层富血小板血浆，采用血小板聚集凝血因子分析仪按照试剂盒说明测定ADP诱导的血小板聚集率。其后继续以3000r/min离心10min取血浆，采用血小板聚集凝血因子分析仪按照试剂盒说明测定凝血四项指标(APTT、TT、PT和FIB)。
将以枸橼酸钠(3.8％)1︰9抗凝的全血以3000r/min离心10min的得到的各组血浆按照试剂盒说明进行TXB2、PAI-1、PLG和tPA的含量的测定。将以EDTA(1.5％)1︰9抗凝的各组血浆按照试剂盒说明进行CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2的含量的测定。
2.2.3大鼠动脉血栓质量的测定及动脉血栓组织形态学观察
大鼠取血完成后，采用用游标卡尺测量，迅速剪下每组大鼠右侧动脉血栓造模段和左侧动脉对应位置的动脉段，迅速称重，计算栓重。
栓重＝右侧颈总动脉血栓造模段-左侧颈总动脉对应位置的动脉。
将各组称重后的血栓段永10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片厚4-5μm，HE染色，病理专业人员阅片。
3实验结果
3.1活性蛋白酶对纤维蛋白作用量效关系
表1-1-6显示，设定的活性蛋白酶的溶液浓度范围为6.25-100.00mg/mL，各设定浓度溶液在纤维蛋白平板上所形成的溶圈大小两相互垂直直径的乘积范围为1.55-2.44cm2。由此得出的结论为在一定剂量范围内，活性蛋白酶溶液溶解纤维蛋白平板所形成的溶圈大小与其剂量存在一定的量效关系。
表1-1-6 不同浓度活性蛋白酶溶解纤维蛋白平板活力情况
Figure BDA0000983441190000141
3.2活性蛋白酶对FeCl3诱导的大鼠动脉血栓形成的影响
3.2.1活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血栓质量的影响
表1-1-7显示，与假手术组比较，模型组大鼠的血栓质量显著性减少，差异有统计学意义(P<0.01)，表明模型成功；与模型组比较，尿激酶组的血栓质量显著性减少，(P<0.01)，活性蛋白酶的低、中、高剂量组也均明显减少(P<0.01)，且随剂量增加，对血栓质量的减小作用增加。结果提示，本发明制备得到的活性蛋白酶对抑制动脉血栓模型大鼠血栓的形成具有显著作用，并且在一定剂量范围内，随剂量增加，作用递增。
表1-1-7 活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血栓质量的影响(
Figure BDA0000983441190000142
n＝8)
Figure BDA0000983441190000143
Figure BDA0000983441190000151
注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。*P<0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
3.2.2活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠凝血四项和血小板聚集的影响
表1-1-8显示，与假手术组相比，模型组的凝血四项指标和血小板聚集率均有显著差异，其中APTT、PT、TT和ADP四个指标均显著降低，FIB含量显著升高(P<0.01)；与模型组相比，尿激酶组的凝血四项和ADP均有显著改善(P<0.05或P<0.01)，本发明活性蛋白酶的低、中、高剂量组的凝血四项和ADP也均有显著改善(P<0.05或P<0.01)，且随剂量增加，改善作用逐渐增强。以上结果提示，本发明制备得到的活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠的凝血四项和血小板聚集率均有显著改善，并且在一定剂量范围内，随剂量增加，作用增强。
表1-1-8 活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠凝血四项和血小板聚集的影响(
Figure BDA0000983441190000152
n＝8)
Figure BDA0000983441190000153
注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。*P<0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
3.2.3活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血浆TXB2、PAI-1、PLG、tPA、CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2含量的影响。
表1-1-9显示，与假手术组相比，模型组大鼠血浆TXB2、PAI-1、PLG和tPA的含量均有显著差异，其中TXB2和PAI-1的含量均显著升高，PLG和tPA的含量均显著降低(P<0.01)；与模型组相比，尿激酶组的TXB2、PAI-1、PLG和tPA四项指标均有显著改善(P<0.01)，本发明活性蛋白酶的低、中、高剂量组的TXB2、PAI-1、PLG和tPA四项指标也均有显著改善(P<0.05或P<0.01)，且随剂量增加，改善作用逐渐增强。以上结果提示，活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血浆中TXB2、PAI-1、PLG和tPA均有显著改善，并且在一定剂量范围内，随剂量增加，改善作用增强。
表1-1-10显示，与假手术组相比，模型组大鼠血浆CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2的含量均有显著差异，其中ET1、FDP和6-keto-PGFI2的含量均显著升高，CGRP和PGI2的含量均显著降低(P<0.01)；与模型组相比，尿激酶组的CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2五项指标均有显著改善(P<0.01)，本发明提供的活性蛋白酶的低、中、高剂量组的CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2五项指标也均有显著改善(P<0.05或P<0.01)，且随剂量增加，改善作用逐渐增强。以上结果提示，活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血浆中CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2均有显著改善，并且在一定剂量范围内，随剂量增加，改善作用增强。
表1-1-9 活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血浆TXB2、PAI-1、PLG和tPA含量的影响(
Figure BDA0000983441190000161
n＝8)
Figure BDA0000983441190000162
注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。*P<0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
表1-1-10 活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠血浆CGRP、ET1、FDP、6-keto-PGFI2和PGI2含量的影响(
Figure BDA0000983441190000163
n＝8)
Figure BDA0000983441190000164
Figure BDA0000983441190000171
注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01。*P<0.05,**P<0.01 vs Control group；#P<0.05,##P<0.01 vs Model group.
3.2.4活性蛋白酶对动脉血栓模型大鼠动脉血栓组织形态学的影响
组织形态学结果表明，假手术组大鼠动脉三层组织结构清晰，内膜上皮细胞无变性、坏死、脱落，中膜和外膜未见水肿和炎细胞浸润等病理变化；模型组大鼠动脉外膜严重损伤，中膜和内皮下层明显增厚，管腔内可见明显紧密的纤维化血栓。尿激酶组大鼠动脉外膜损伤，管腔内血栓明显减少，部分内皮完整。本发明提供的活性蛋白酶的低、中、高剂量组的大鼠动脉管腔中血栓随剂量递增逐渐松散并减少，活性蛋白酶高剂量组血栓也看不到明显血栓；动脉外膜损伤，但是动脉中膜和内膜结构逐渐完整，在活性蛋白酶高剂量组可以看到整个血管管腔轮廓清晰，内膜也趋于完整连续。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京中医药大学
<120> 具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶及其制备方法和应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Phe Pro Val Pro Asp Pro Phe Val Trp Asp Thr Ser Phe Gln
1 5 10 15

Claims (2)

1.一种具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶，其特征在于，该活性蛋白酶的N端氨基酸序列为Pro-Phe-Pro-Val-Pro-Asp-Pro-Phe-Val-Trp-Asp-Thr-Ser-Phe-Gln；
方格星虫活性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)活性蛋白酶粗水提物的制备
取新鲜方格星虫，洗去杂质和泥沙，解剖星虫，除去体内泥沙，将其剪碎并且匀浆后加入PBS缓冲液，搅拌均匀，于-10至-20℃中冷冻12～24h后再置于4℃解冻，然后离心，取上清液；沉淀部分加入PBS缓冲液继续重复上述步骤；将上清液进行冷冻干燥，-20℃保存备用；
(2)活性蛋白酶水提物的粗分离
硫酸铵沉淀区间的确定及硫酸铵沉淀
取步骤(1)制备得到的活性蛋白酶粗水提物，向其中分别一边搅拌一边加入硫酸铵固体粉末至30％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min，然后取盐析液进行离心，取上清，再向上清液中继续加入一定量的硫酸铵固体粉末至60％的百分饱和度，混匀后于0℃孵育30min，再将盐析液离心，收集活性蛋白酶沉淀；
活性蛋白酶沉淀的透析脱盐除杂
将经硫酸铵沉淀得到的活性蛋白酶沉淀，用PBS缓冲液进行复溶后，加入到截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析24～48h，除盐除杂后冻干，得到活性蛋白酶粗品，备用；
(3)活性蛋白酶粗品的精制
采用美国GE公司的
Figure FDA0002639992670000011
Pure蛋白纯化系统对活性蛋白酶粗品进行精制
(3.1)疏水作用层析
样品处理：用1mol/L(NH4)2SO4溶液将活性蛋白酶粗品溶解，离心，并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱：
按柱体积的2％上样，流动相：A相为PBS缓冲液和B相为用PBS缓冲液溶解的1mol/L(NH4)2SO4溶液，梯度洗脱：100％B，3CV；100％-60％B，0.5CV；60％B，0.75CV；60％-40％B，0.25CV；40％B，0.75CV；40％-20％B，0.25CV；20％B，0.75CV；20％-0B，0.25CV；100％A，2CV；流速：3ml/min；紫外检测波长：280nm；以9ml/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力，合并收集；
(3.2)活性蛋白酶活性组分的透析脱盐除杂
将经步骤(3.1)疏水作用层析收集得到的活性蛋白酶活性组分用PBS缓冲液进行复溶后加入到截留分子量大于3500Da的透析袋中，在4℃储存柜中用PBS缓冲液磁力搅拌透析24～48h，冻干，-20℃保存备用；
(3.3)Q Sepharose High Performance离子交换层析
样品处理
用PBS缓冲液将上步骤(3.2)得到的活性蛋白酶活性组分溶解，离心，并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱
按柱体积的2％上样；流动相：A相为PBS缓冲液和B相为用PBS缓冲液溶解的0.8mol/LNaCl溶液，梯度洗脱：100％A，2CV；0-20％B，0.25CV；20％B，2CV；20％-30％B，0.25CV；30％B，1CV；30％-50％B，0.25CV；50％B，1CV；50％-70％B，0.25CV；70％B，0.75CV；70％-100％B，0.25CV；100％，2CV；流速：3ml/min；紫外检测波长：280nm；以9ml/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集；
样品脱盐除杂
采用Thermo Zeba脱盐离心柱对经离子交换层析收集得到的活性蛋白酶活性组分进行脱盐处理；将活性蛋白酶活性组分上样于脱盐离心柱中，离心，收集样品；
采用Millipore AmiconR Ultra 3K超滤管对经离子交换层析并脱盐的活性蛋白酶活性组分进行除杂浓缩，将脱盐后的活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心，收集样品，冻干，-20℃保存备用；
(3.4)Superdex prep grade G-75凝胶过滤层析
样品处理
用PBS缓冲液将上步骤得到的活性蛋白酶活性组分溶解，4℃，8000r/min，离心30min，并通过0.45μm水膜过滤除杂后备用；
上样洗脱
按柱体积的2％上样，流动相：PBS缓冲液；洗脱方式：5CV等度洗脱；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：280nm；以9ml/管进行收集，测定每管蛋白浓度和酶活力，计算比活力进行合并收集；
(3.5)样品除杂
采用Millipore AmiconR Ultra 3K超滤管对经步骤(3.4)凝胶过滤层析后的活性蛋白酶活性组分进行除杂浓缩；将活性蛋白酶活性组分上样于预先用去离子水预处理过的超滤管中，离心，收集样品，冻干，得到精制的方格星虫活性蛋白酶。
2.权利要求1所述的具有抗血栓作用的方格星虫活性蛋白酶在制备抗血栓药物中的应用。
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