CN103382463A - 海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋无脊椎动物纤溶酶，它是从海洋方格星虫消化腺体液经匀浆，过滤除脂，冻干，盐析，脱盐，DEAE层析和凝胶过滤层析得到的蛋白，其N端部分氨基酸序列为Seq.2，分子量15KDa，实验研究证明，所述纤溶酶在抗血栓和中风防治方面有很好的效果。

Description

海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用

技术领域：

本发明涉及海洋无脊椎动物溶栓蛋白及其在心脑血管疾病治疗中的应用。

背景技术：

血栓形成是个体正常生理反应中一个非常重要的保护机制，当机体遭受创伤后能够有效止血，从而达到保护作用。止血和血栓的形成有3个主要影响因素：血管内血液流速、血小板和凝血因子。相对于生理性止血，病理性血栓形成则发生在血管腔内，如果累及到动脉，则导致器官、组织缺血和（或）坏死；如果发生在静脉内，则会导致血液回流障碍。某一部位形成的血栓还可以沿血流方向到其他部位的血管，这个过程叫栓塞。正常人体内血管内壁应该是光滑的，并且无斑块和狭窄，而病变患者则可能出现动脉粥样硬化的早期病变，即脂质条纹，随年龄增长逐渐演变为动脉粥样硬化斑块，斑块会越来越大。在斑块形成的早期可以没有任何症状，狭窄发展到一定程度就会出现稳定的缺血症状，在心脏表现为稳定性心绞痛，下肢表现为间歇性跛行。如果斑块不稳定，并在一定外因作用下发生破裂，则在斑块破裂的基础上发生保护作用，形成血栓，继而发生血管病变，甚至导致血管性死亡，这就是动脉粥样硬化血栓形成。

血栓相关疾病主要分为三类：动脉粥样血栓形成、动脉血栓栓塞和静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)。动脉管腔细，压力高，血液流速快，血液对血管壁的剪切应力大，因此血小板容易被激活，尤其在血管狭窄或者损伤的部位，应强化抗血小板治疗，只有在病变急性期或者急性损伤情况下才使用抗凝药物。静脉管腔粗，压力低，血液流速慢，血液对血管壁的剪切应力小，血小板不容易被激活，形成的血栓是以纤维蛋白作为网架结构的红色血栓，治疗则主要针对抑制凝血酶的产生及级联反应，抗血小板治疗效果不佳甚至无效

影响静脉血栓形成的主要因素有：血流滞缓、血液粘稠及血管壁损伤。当静脉血流迟缓，血液高凝状态及血管内膜损伤条件下，静脉发生急性非化脓性炎症，并继发血栓形成静脉血栓栓塞疾病。绝大多数静脉血栓形成发生在盆腔及下肢的深静脉。血栓形成早期易于脱落，可造成大片肺梗塞，这也是常常造成猝死原因之一。因此，早期应选用溶栓药物进行治疗，继而用抗凝药物进行预防，避免血栓再形成及扩展，是有效的预防治疗手段。

对于已经形成的血栓，最佳的治疗途径就是溶栓。溶栓治疗包括动脉内溶栓、静脉内溶栓、动静脉联合溶栓、器械辅助溶栓、超声波溶栓等方法。目前临床上已正式批准使用的溶栓剂有：组织型纤溶酶激活剂(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)、重组t-PA(rt-PA)、对-2-甲氧苯甲酚纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)、重组型葡萄球菌激酶(STAR)、和TNK-tPA等。

从溶栓剂开始作为药物使用到现在，溶栓剂的开发基本分为三代。

第一代溶栓剂包括链激酶(SK)和尿激酶(UK)，它们虽然具有较好的溶栓效果，但缺乏纤维蛋白选择性，除了能激活血栓表面的纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解，产生全身性出血的副作用，且SK重复使用容易造成过敏反应。UK为人尿中提取的一种蛋白水解酶，能激活纤溶酶原，预防血栓再形成。由于源自人体，无特异性抗原性，溶栓效率高，因此国内脑血栓溶栓治疗仍以UK为主。但是UK半衰期较短（约15min），长期大量用药会有全身性出血的倾向，口服一般无效。第一代溶栓分子具有自身难以克服的缺陷如出血负作用大等，已经被淘汰。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶原(pro-UK)和对-甲氧苯甲酰(茴香酰)纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC)均属于第二代溶栓剂。t-PA和pro-UK体外和动物实验中都有明显的纤维蛋白亲和性，出血副作用较小。第二代溶栓剂已有所改进，但还不理想。今后研究目标是：提高对纤维蛋白的特异性，减少出血等副作用；提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性；延长其在血液循环中的作用时间；增加导向溶栓性能；在溶栓的同时，起到抗血栓形成的效果。静脉溶栓治疗通过静脉注入溶栓剂来达到溶解血栓的目的，该方法在临床应用最早，积累的经验最多，应用也比较普遍。由于操作简便，给药及时，无需特殊设备，因而至今仍广为应用。其主要缺点是用药量大、特异性低、疗效欠佳且并发出血的可能性较大。

正在研究开发的第三代溶栓药均为t-PA变异体，如TNKase(teneplase,TNK-t-PA)、Monteplase、Lanoteplase(Lanateplase,n-PA)等，其共同特点是能快速溶栓、开通堵塞的冠状动脉、恢复血液循环，治愈率达到73％～83％，而且勿须在医院内进行静脉注射、不需依体重而调整剂量、半衰期长等优点，但同时也具有价格高昂，伴随有副作用的缺点。

随着人口的老龄化到来，中风的发病率有持续增加的趋势。据WHO报导，到2020年中风将成为全球导致死亡和残疾的主要疾病之一，而缺血性中风将占85%。在美国，每年有137,000由于中风而死亡，仅次于心血管疾病与癌症。在我国，每年新发病例也有195万（其中75%以上是缺血性中风），死亡达到156万，死亡率高于癌症和心脏病，居三大死因之首。不仅如此，幸存者中1/3以上的病人成为残疾，给家庭和社会造成沉重的负担。所以，中风的防治，特别是针对缺血性中风，具有十分重要的意义。

星虫动物门(Sipuncula)是动物界的一个小门类，属具闭管式循环系统。身体柔软，长筒状，形似蠕虫，无疣足，不具体节，亦无刚毛。一般体长约10厘米，最大的可达30～40厘米。营底栖穴居生活。体前端有一细长能伸缩的吻，是摄食和钻穴的辅助器官。吻前为口，口的周围有触手，展开似星芒状，因而称为星虫。生物体一直是溶栓药物的主要来源，其中来源于蚯蚓体内的溶栓剂---蚓激酶(Lumbrokinase/Earthwormfibrinolytic enzyme,EFE)，属国家Ⅱ类新药，目前已在美国、加拿大、日本及东南亚等国家和地区上市。而中国福建沿海方格星虫(Sipunculus nudus)，具有与蚯蚓类似的“自溶”现象，且在生活水域环境变化时，体腔内会有大量蛋白粉末排出，鉴于此，我们推测中国福建沿海方格星虫体内具有纤溶酶类活性物质，并且其体内所含的纤溶酶可能具有较蚯蚓更多的优越性。原因在于：第一，与陆地相比，海洋环境更为复杂，物种也更为丰富，为了生存竞争，海洋生物进化出了高效的新陈代谢机制，来源于海洋生物体内的生物活性物质具有结构新颖、生物活性高等特点；第二，方格星虫长期作为福建特色小吃---土笋冻的主要原料，其特有的无毒无害，美味保健功能已被历史所证明，同时它所具有的的“自溶”现象，以及“腐蚀”手纹现象较为明显和确切，表明沙蚕体内具有的纤溶活性物质的活力很强；第三，中国福建沿海方格星虫，分布广泛，可以人工养殖，易存活且繁殖周期短，为纤溶活性成分的研究提供了丰富的原料资源。

本实验室经过不懈努力和研究，从海洋无脊椎动物海洋星虫的提取物中发现一种纤溶酶，其在抗血栓治疗和中风防治方面有很好的效果。该项研究成果，迄今尚未见有相关报道。

发明内容：

本发明的目的之一是，提供一种海洋方格星虫(Sipunculus nudus)纤溶酶；

本发明的目的之二是，提供所述纤溶酶的药物组合物；

本发明的目的之三是，提供所述纤溶酶在抗血栓治疗及中风防治中的应用。

本发明所述纤溶酶，是从海洋方格星虫(Sipunculus nudus)中分离出来的一种新型溶栓蛋白，其N端部分氨基酸序列（150个）为：

NAGGDDEIENLRKSGQRAIEELQRTIVEIETKLKAEISRLKKKYDIEIRELELQLDAANKANDELGRANKALNNRVRELEIQLEEERRAGDEARATITVLERKRIALQTELEDVRALLEAAERARKNAENELGDANSRINEMDIVIPTGV，分子量15KDa，命名为方格星虫纤溶酶N-150，简称星纤N-150。

本发明所述纤溶酶的分离纯化方法是，先将鲜活海洋星虫置于海鲜池中用清洁海水通气饲养24h，以净化其体内杂物，磷酸缓冲液冲洗，滤纸吸干虫体表面液体后，在4℃冷库中解剖虫体，收集消化腺体液，与缓冲液混匀，经匀浆机匀浆后，离心，上清液用滤纸过滤除脂，滤液经冷冻干燥机冻干，获得粗提蛋白粉末。将蛋白粗提液冻干粉溶于缓冲液，进行盐析、离心，PBS溶解沉淀，通过凝胶色谱G-25洗脱脱盐，然后进行DEAESepharose和Sephacryl S-100凝胶过滤层析纯化，获得星纤N-150蛋白。

本发明还提供了所述纤溶酶的药物组合物，该组合物是以本发明海洋星虫纤溶酶作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

本发明进一步提供了所述纤溶酶在制备抗血栓和防治中风药物中的应用。

所述的应用，是通过抗血栓的形成和降解血栓而发挥抗血栓的作用；

所述的应用，是通过防止血栓的形成和溶解血栓，避免心脑血管组织受到损害，达到治疗血栓堵塞和中风防治的作用。；

所述的应用，是通过减缓血栓形成进程，增强抗血栓能力，进而保护心脑细胞不受损伤；

所述的应用，是通过对纤维蛋白原α-链，β-链以及γ-链特异性的降解抑制血栓形成，阻断信号转导，改善心脑组织坏死程度，促进血栓的降解，减少血栓的生成；

所述的应用，是通过保护心脑血管细胞，改善心脑血管的微循环，减缓及减低血栓形成进程，增强抗血栓能力，提高血管再通和神经保护能力，进而避免心脑细胞膜受到损害，通过保护受损神经元以及促进侧支循环的建立而改善缺血症状，发挥抗血栓和防治中风的功能。

附图说明：

图1：星纤蛋白N-150SDS-PAGE电泳分析

其中：1.纤溶酶粗提液；2.50%盐析液；3.DEAE阴离子柱活性成分；4.SephadexS-100凝胶层析活性成分；5.蛋白maker。

图2：星纤蛋白N-150对pH和温度的耐受特性

其中：A-37°C的最适pH为6.5-6.8；B-pH6.5时的最适温度为44°C；C-室温下pH7.4时25h酶活稳定；D-35°C时酶活60min稳定。

图3：SDS-PAGE检测星纤蛋白N-150对纤维蛋白原的降解作用，

其中：1.纤维蛋白原；2-9.不同时间（1,2,3,4,5,6,8,10min）纤蛋白N-150对纤维蛋白原的降解作用电泳结果。

图4;大鼠MCAO再灌注成功模型HE染色观察

其中：a正常组织，b组织周围的缺血半影区对，c组织梗死坏死中心。

图5：大鼠MCAO再灌注成功模型神经功能观察

其中：A正常大鼠，B轻度神经功能缺失，C重度神经功能缺失

图6：星纤N-150纤溶酶对大脑中动脉栓塞(MCAO)的治疗作用（TTC染色）

其中：1.正常组，2.阴性对照组，3.模型组，4.星纤N-150纤溶酶高剂量组，5.星纤N-150纤溶酶中剂量组，6.星纤N-150纤溶酶低剂量组，7.尿激酶（4×10⁴U/kg）.

图7.星纤N-150纤溶酶对大脑中动脉栓塞(MCAO)梗死体积的治疗作用

其中：纵坐标-梗死面积(mm³),横坐标：1.正常组，2.阴性对照组，3.模型组，4.星纤N-150纤溶酶高剂量组，5.星纤N-150纤溶酶中剂量组，6.星纤N-150纤溶酶低剂量组，7.尿激酶（4×10⁴U/kg）.

最佳实施方案：

以下实施例为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施所用主要材料：海洋星虫，购于闽南海鲜市场。

试剂来源：DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100High Resolution、SephadexG-25Superfine凝胶层析填料（GE公司USA)；牛纤维蛋白原、牛凝血酶、牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)（Sigma公司USA)；丙烯酰胺(Acr)、N,Nˊ-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、N,N,N,N,-四甲基乙二胺(TEMED)、考马斯亮蓝-G250、考马斯亮蓝-R250（E.Merk公司），L-酪蛋白Bruker公司）；MicroBCA蛋白质分析试剂盒、低相对分子量标准蛋白（碧云天公司）。

《实施例1》海洋方格星虫(Sipunculus nudus)纤溶酶星纤N-150蛋白制备

将鲜活海洋方格星虫置于海鲜池中用清洁海水通气饲养24h，以净化其体内杂物，用磷酸缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)冲洗，滤纸吸干虫体表面液体后，在4℃冷库中解剖虫体并收集消化腺体测定活性，并与2倍体积磷酸缓冲液(0.01mol/L,pH7.4)混匀，经匀浆机匀浆后，4℃10000rpm离心5min，上清液经滤纸过滤除脂，滤液经冷冻干燥机冻干，冻干品为粗提蛋白粉末，即为海洋星虫纤溶酶粗取物。

将蛋白粗提液冻干粉溶解，进行50%硫酸铵盐析，加入硫酸铵前将pH值调至7.4，4℃依次放置12h，10000rpm离心15min，收集沉淀。以PBS(0.01M pH7.4)溶解沉淀并通过凝胶色谱G-25脱盐。先用2～3倍柱床体积的0.01mol/LPBS(pH7.4)洗脱液平衡层析柱(90×3cm),以洗脱液进行洗脱，流速3mL/min。按紫外检测仪（280nm）及纤溶活性收集活性组分；脱盐后的纤溶酶提取液经DEAE Sepharose Fast Flow层析，用2倍柱床体积的洗脱液预平衡阴离子柱(20×3.0cm)。上样后，以1倍柱床体积0.1-0.5mol/L NaCl洗脱液进行洗脱，流速5mL/min，收集NaCl为0.2-0.3mol/L活性部分；然后进行Sephacryl S-100凝胶过滤层析，用2～3倍柱床体积0.05mol/L NaCl溶液预平衡凝胶过滤层析柱(90×3.0cm)。上样后，以洗脱液进行洗脱（流速1.5mL/min）。以紫外检测（280nm）收集活性部分。冷冻干燥后可得到纯化后的星纤N-150蛋白。各步蛋白分离纯化的SDS-PAGE电泳分析见图1。根据凝胶成像测定，星纤N-150蛋白分子量大概为15KD左右。

《实施例2》星纤N-150纤溶活性检测

依据Astrup法和Deogny法，即纤维蛋白平板法。具体操作如下，将100mg牛纤维蛋白原及100u牛凝血酶分别溶解于10ml磷酸0.01mol/L缓冲液中，将80ml含有1g琼脂糖的0.01mol/L磷酸缓冲液加热煮沸使其溶解，降温至65℃，将牛纤维蛋白原溶液及牛凝血酶溶液共同加入到琼脂糖溶液中，搅拌均匀后倒入直径为90mm的培养皿中，每只培养皿含有5ml混合液。室温静置30min使其凝结。利用打孔器打孔，直径为3mm，将待测样品点于平板上，37℃孵育4h，测量溶解圈的直径。依据此法，观测到的清晰透明区域即为纤维蛋白被水解的区域。根据溶解面积来对比纤维蛋白溶解活性大小。

《实施例3》星纤N-150纤溶蛋白浓度的检测

本发明星纤N-150纤溶活性的测定，是以单位蛋白具有的纤溶活性来计算。星纤N-150纤溶蛋白浓度是利用Micro BCA蛋白质分析试剂盒测定。牛血清白蛋白（BSA）作为标定蛋白质浓度的标准品。碱性条件下，蛋白质将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂形成紫色的络合物，吸光度强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，以确定星纤N-150纤溶蛋白浓度。

《实施例4》星纤N-150纤溶蛋白的特性鉴定

1、pH值和温度对酶活性的影响

纤溶酶首先溶解在10mM的磷酸缓冲液(pH7.4)中，混合不同pH值的缓冲液。所用的缓冲液包括：0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH2.0～5.0)；磷酸盐缓冲液(pH6.0～7.0)；Tris–HCl缓冲液(pH8.0～9.0)；甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.0～12.0)。反应混合物在37°C孵育1h，酶活性通过纤溶平板测定。最适条件下酶活性定义为100%。进行四次重复，取其平均值。结果表明，该酶37℃时在较大的pH值范围内具有活性，其最适pH值为6.5～6.8。在pH值为6.5条件下，酶活性的最适温度为44°C，在室温及pH值为7.4条件下25h后纤溶酶仍然具有活性，在35°C下60min纤溶酶活性稳定（图2）。

2、蛋白酶抑制剂及金属离子对酶活性的影响

在pH为6.5条件下，将不同蛋白酶抑制剂（1mM）及金属离子（5mM）与星纤N-150纤溶蛋混合，37°C孵育10min，酶活性通过纤溶平板测定，结果表明5mMFe²⁺及1mM二异丙基氟磷酸盐(DFP)对纤溶酶活性有明显抑制作用；5mM Cd²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺及Zn²⁺等及1mM PMSF、EDTA、EGTA及组织蛋白酶E-64等抑制剂对该酶没有抑制作用。；5mM Mg²⁺对纤溶酶活性有促进作用（表1）。

表1.金属离子及蛋白酶抑制剂对星纤N-150纤溶蛋白活性的影响。

金属离子/抑制剂	Activity(%)
		对照	100
CdCl2	91.8
		CuSO4	92.1
MgCl2	125.0
		FeCl2	42.3
MnCl2	97.8
		NiCl2	85.5
ZnCl2	100.0
		PMSF	94.8
EDTA	99.2
		EGTA	97.5

E-64	99.0
		亮抑酶肽	98.5
二异丙基氟磷酸盐	38.4

3、纤维蛋白原溶解特性的鉴定

37°C条件下，将0.1ml0.2%纤维蛋白原溶液(w/v)及0.05ml纤溶酶溶液(100ng)加入到50mM Tris–HCl缓冲液(pH7.4)中，反应不同时间(1～10min)分组对照，然后均加入0.15ml SDS变性上样缓冲液，(0.125mM Tris-HCl，pH6.8，0.1%[w/v]SDS及1%[w/v]β-2巯基乙醇)，并在100℃加热3min。25μl(约15μg纤维蛋白原)上样，SDS-PAGE电泳分析，结果表明，星纤N-150可以非常有效地特异性降解纤维蛋白原的Aα-链及Bβ-链，显示该蛋白酶对纤维蛋白原的Aα-链Bβ-链有特异性，而对γ-链的降解作用不显著(图3)。

《实施例5》星纤N-150纤溶蛋白的N段氨基酸序列测定

本发明采用蛋白在SDS-PAGE分离，转膜方法测定了星纤N-150纤溶蛋白N端7个氨基酸。将星纤N-150纤溶蛋白SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，送到中国农科院以Edman法测定氨基酸序列，测定N端7个氨基酸序列为NAGGDDE。随后又通过方格星虫总RNA的提取，逆转录合成cDNA文库，以N端的7氨基酸序列设计的简并引物5’-AAYGCNGGNGGNGAYGAYGA–3’和Oligo dT为上下游引物，扩增获得PCR产物500bp，测定结果450bp大小片段，编码150个氨基酸，测序测定的N端前7个氨基酸与蛋白质转膜测定的序列一致。

星纤N-150纤溶蛋白部分基因450bp序列Seq.1

1taacgccggt ggtgatgacg agatcgagaa ccttcgcaag agcggccagc gcgccatcga

61ggagcttcag cgtaccatcg ttgagatcga gactaagctg aaggccgaga tcagccgcct

121gaagaagaaa tacgacatcg agatccgtga actcgagctc cagctggacg ctgccaacaa

181ggctaacgat gagctgggcc gcgccaacaa ggctctcaac aacagagtga gggagcttga

241gattcagctg gaggaggaac gtcgtgctgg agatgaggcc cgcgccacca tcactgtcct

301ggagaggaag aggattgctc ttcagaccga gcttgaggat gtccgtgccc tgctcgaggc

361ggctgagcgt gcccgcaaga acgccgagaa cgagcttgga gacgccaaca gccgcatcaa

421cgagatggac atcgtcatcc ccaccggcgt

编码150个氨基酸序列Seq.2

NAGGDDEIENLRKSGQRAIEELQRTIVEIETKLKAEISRLKKKYDIEIRELELQLDAANKANDELGRANKALNNRVRELEIQLEEERRAGDEARATITVLERKRIALQTELEDVRALLEAAERARKNAENELGDANSRINEMDIVIPTGV

《实施例6》星纤N-150纤溶酶对大脑动脉栓塞(MCAO)的治疗作用

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，二级动物，3～4月龄，体重量285±16g，由福建福州吴氏动物提供；三苯基氯化四氮唑（TTC）购于Sigma公司，水合氯醛购于上海生化试剂公司，栓线为本实验室自制。参考Longa EZ etal Stroke1989,2091）：84-91方法建立SD大鼠MCAO模型。仰卧位固定，在颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离单侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用血管钳子暂时夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA，然后在距CCA分叉部4mm处剪一个小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊子轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18mm时，紧紧系牢CCA远心端的细线。缝合伤口，缺血2h后，拔出拴线，再灌注72h。造模成功后在动物清醒下进行行为学（神经功能）评分。72小时再灌注后断头取脑。大鼠取脑后，去除嗅球、小脑、低位脑干，冠状切片，切片：一般切成5-6片，每隔2mm切一片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处；第二刀在视交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间，其它依次进行，拟行HE染色或TTC染色。阴性对照组进行颈部血管分离成功后，把栓线插入劲内动脉10～15mm处，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现血管栓塞的同侧霍钠（Horner）征和对侧肢体运动障碍即为模型成功。

动物分为假手术组、模型组、星纤N-150蛋白给药组1.2mg/kg（高剂量）、0.6mg/kg(中剂量)、0.3mg/kg(低剂量）及阳性对照组，假手术组及模型对照组腹腔注射生理盐水(5ml/kg)，给药组在缺血后4h按相同方式给药，以后依次间隔6h给药，72h再灌注后断头取脑。对成功模型进行神经功能中风的检测。缺血再灌注72h后，由未参与本实验的实验人员对各组大鼠进行Longa EZ行为学5分制检测。标准如下：0分，无神经功能缺失症状；1分，轻度局灶性神经功能缺失（不能完全伸展损伤对侧前肢）；2分，中度神经功能缺失（向对侧转圈）；3分，重度神经功能缺失（向对侧倾倒）；4分，不能自发行走，意识水平丧失。

本实验成功模型脑组织切片HE染色结果见图4；成功模型神经功能观察正常大鼠、轻度神经功能缺失、重度神经功能缺失表现见图5，缺血再灌注模型组的大鼠麻醉清醒后表能障碍，提鼠尾可见其对侧前肢内收紧贴胸壁，行走时偏向一侧或向一侧旋转，严重的甚至发生倾倒。星纤N-150纤溶酶治疗组与模型组相比在中风表现方面有一定改观。

本实验对给药组进行了脑梗死体积的测定。水合氯醛腹腔麻醉大鼠，断头取脑，每组随机取5只采用TTC染色方法测定脑梗死体积，每隔2mm取脑组织切片测量梗死面积，将脑组织切片置于TTC液，37℃水浴中染色15min，每5min摇动切片，染色后正常脑组织染成鲜红色，缺血梗死区呈白色。Image-pro plus6.0专业图象分析软件计算每一层面的梗死面积及右前脑面积，按Swanson RA et al J Cereb Blood Flow Metab,1990.10(2):290-3的方法计算出梗死灶体积及对侧正常脑体积，并计算出两者比值，即梗死体积占半球体积的百分比。星纤N-150纤溶酶对大脑中动脉栓塞(MCAO)治疗作用见图6。TTC染色显示梗死灶位于单侧纹状体和大脑大部分皮质。梗死区较周围脑组织苍白，且有不同程度的肿胀。同时由一个不了解实验分组的研究者使用Image-pro plus6.0图像分析软件测量全脑5片切片上的梗死体积和半球体积，为避免脑水肿的影响，采用梗死体积=对侧半球体积-同侧半球非梗死区体积。星纤N-150纤溶酶对大脑中动脉栓塞(MCAO)梗死体积的治疗作用见图7,表明本发明的纤溶酶对MCAO缩小梗死体积有一定的治疗作用，且治疗效果与剂量相关。

Claims (4)

1.一种海洋方格星虫纤溶酶，其特征是，所述纤溶酶是将海洋星虫在海水池通气饲养后，经解剖收集消化腺体液，匀浆，过滤除脂，冻干，盐析，脱盐，DEAE层析和凝胶过滤层析获得；所述纤溶酶N端部分氨基酸序列1-150如Seq.2所示，分子量15Kda；命名为方格星虫纤溶酶N-150，简称星纤N-150；所述纤溶酶活性在温度37°C时最适pH6.5-6.8，pH6.5时最适温度44°C；所述纤溶酶活性明显受Fe²⁺及二异丙基氟磷酸盐的抑制，不受Cd²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、PMSF、EDTA、EGTA及组织蛋白酶E-64抑制剂的抑制；所述纤溶酶对纤维蛋白原的α-链和β-链有降解作用，对γ链作用不明显；所述纤溶酶对大鼠大脑动脉阻塞再灌注有一定保护作用。

2.权利要求1所述纤溶酶在制备抗血栓及防治中风药物中的应用。

3.权利要求1所述纤溶酶的药物组合物，是以海洋方格星虫纤溶酶作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

4.权利要求3所述组合物在制备抗血栓及防治中风中药物中的应用。

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