CN106497950B - 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用 - Google Patents

一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106497950B
CN106497950B CN201610977735.9A CN201610977735A CN106497950B CN 106497950 B CN106497950 B CN 106497950B CN 201610977735 A CN201610977735 A CN 201610977735A CN 106497950 B CN106497950 B CN 106497950B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sipunculus nudus
fibrinolysin
recombination
gene
plasmin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610977735.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106497950A (zh
Inventor
马伏宁
郭刚
谭琳
金志强
马蔚红
臧小平
郭素霞
殷晓敏
孙佩光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Original Assignee
Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences filed Critical Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority to CN201610977735.9A priority Critical patent/CN106497950B/zh
Publication of CN106497950A publication Critical patent/CN106497950A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106497950B publication Critical patent/CN106497950B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6408—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用，属于基因工程技术领域。所述方格星虫纤溶酶cDNA基因序列及其氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，其cDNA序列编码834个核苷酸，即277个氨基酸。通过pGAPZaA载体将方格星虫纤溶酶cDNA基因转入巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行分泌表达，该重组纤溶酶具有直接溶解血栓中纤维蛋白的能力，可用于制备溶栓药物治疗血栓性疾病。

Description

一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种方格星虫纤溶酶cDNA基因以及方格星虫重组纤溶酶及其应用。
背景技术
血栓栓塞性疾病是一种常见的心脑血管疾病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等。随着人民生活水平的提高和人口老龄化的到来，心脑血管疾病已取代癌症成为我国第一大致死病因。目前临床应用溶栓药物降低血栓病患者的死亡率和致残率，但现有溶栓药还存在半衰期短、易出血及再栓塞等缺点。从生物中寻找溶栓药物的基因，开发新型的溶栓物质来治疗血栓性疾病是治疗心脑血管疾病的研究方向之一。
方格星虫(Sipunculus nudus)俗称沙虫，隶属于星虫动物门、星虫纲、方格星虫属。方格星虫是我国星虫中种群数量较大的一个种，分布于我国东南沿海，广布于广西、广东、海南岛、福建和浙江，栖息于潮间带、高潮区的泥滩内，营底栖穴居生活。方格星虫主要供人食用，广西北海的“沙虫干”是当地有名的特产，其肉质鲜美，国内主要是对方格星虫的营养成分及增养殖方面进行研究。方格星虫以海洋中微藻和动植物碎片为食料，内脏存在有多种纤溶酶。
目前，报道过方格星虫纤溶酶的相关专利有以下几篇：申请号：201010210919.5，方格星虫纤溶酶及其制备方法，该专利公开的是从方格星虫提取纤溶酶，分子量在27000～35000之间；申请号：201310142498.0，一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用，该专利公开的是从方格星虫中提取纤溶酶的分子量为24917Da；申请号：201310170384.7，海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用，该专利公开的从方格星虫消化腺体分离提取分子量15KDa的纤溶酶。上述公开的专利报道均是从自然界的方格星虫中提取纤溶酶，因此受到原料供应的限制，导致不能大批量生产，制备过程具有局限性。
因此，急需一种通过基因工程的手段将溶血栓基因转入工程菌株中表达，研发出效果更好，副作用更低，更安全溶栓药物。
发明内容
本发明的目的是提供了一种方格星虫纤溶酶cDNA基因及重组纤溶酶；通过基因工程方法将纤溶酶基因转入基因工程菌株进行表达，能达到药物不受限制的进行制备生产。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，及具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
通过酵母蛋白表达系统所述方格星虫纤溶酶基因进行重组蛋白诱导表达，得到方格星虫重组纤溶酶，具体制备过程如下：
(1)方格星虫纤溶酶cDNA序列的克隆：
根据丝氨酸胰蛋白酶家族高度保守序列设计兼并引物，以海南儋州沿海方格星虫(S.nudus)消化道mRNA为模板，利用3’RACE和5’RACE技术扩增出方格星虫纤溶酶cDNA序列全长，连接TA克隆载体，转化E.coli DH5a感受态细胞。
(2)毕赤酵母细胞转化表达
构建酵母细胞pGAPZaA表达载体，选用EcoRI，Xbal内切酶酶切位点连接方格星虫纤溶酶cDNA基因，T4连接酶连接基因与载体，内切酶AvrII将载体线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞进行分泌表达。
(3)方格星虫重组纤溶酶纯化与酶活
用Ni柱纯化方格星虫重组纤溶酶，纤维蛋白平板检测重组纤溶酶酶活，与尿激酶相比，方格星虫重组纤溶酶酶比活力为75083IU/mg蛋白。SDS-PAGE检测分子量在29-44kDa之间。
所述方格星虫重组纤溶酶用于血栓性疾病治疗以及制备溶栓药物。
本发明根据NCBI上报道的多种纤溶酶基因保守位点设计兼并引物，从方格星虫内脏mRNA中扩增出部分纤溶酶cDNA基因，利用5’RACE和3’RACE技术获得该基因全长，并将该cDNA基因在毕赤酵母中获得表达，获得具有溶栓活性的重组方格星虫纤溶酶，可作为新型基因工程药物。
附图说明
图1是本发明中方格星虫纤溶酶cDNA基因PCR琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明中方格星虫重组纤溶酶在纤维平板法上纤溶活性示意图。
图3是本发明中方格星虫重组纤溶酶在热处理纤维平板法上纤溶活性示意图。A为85℃热处理30min灭活纤维蛋白酶原的平板，B为未热处理平板。
图4是本发明中方格星虫重组纤溶酶SDS-PAGE图。
具体实施方式
实施例一
方格星虫纤溶酶全长cDNA基因的克隆
实验材料：方格星虫，来自海南儋州海边；
试剂：Trizol试剂(Invtrogen)，RACE 5’/3’Kit，T-Vector pMD19，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，MiniBEST Plasmid PurificationKit Ver.4.0，Premix TaqTM，E.coli DH5a Competent Cells，DL2000Marker(TAKARA)，引物合成及基因测序(生工生物工程有限公司，深圳华大基因科技服务有限公司)。
具体的实施方法如下：
(1)方格星虫纤溶酶基因中间保守片段核苷酸序列的获得
通过NCBI查找丝氨酸胰蛋白酶家族纤溶酶基因，查找保守序列设计兼并引物。
上游引物ER：'5’-aac agg gtc ctg tgc gcn gcn cay tg 3’，(简并度为32，Tm＝60.9)
下游引物BF：'5’-ggg ccg ccg gag tcn ccr ttr ca 3’，(简并度为16，Tm＝62.5)
方格星虫纤溶酶第一条链cDNA合成：方格星虫放入海水中暂养24h，排尽消化道泥沙，解剖虫体取黄色肠道组织用灭菌滤纸吸去溶液，液氮研磨成粉状，TRIzol法提取总RNA，-70℃冰箱保存。用RACE 5’/3’Kit进行反转录实验，冰浴中加入5ul总RNA，1ul 5’/3’CDS Primer A，4ul 5×First-Stand Buffer，0.5uL DTT(100mM)，1.0uldNTPs(20mM)，0.5ul RNase Inhibitior(40u/ul)，2.0ul SMARTScribe ReverseTranscriptase(100U)，用ddH2O补至20ul，混匀，短暂离心后将PCR管置于PCR仪中，42℃孵育90min，70℃10min，10uL TE稀释，获得5’/3’cDNA第一链，-20℃保存。
克隆方格星虫纤溶酶基因：冰浴中加入12.5ul 2×Premix TaqTM，引物ER、BF各1ul，1ul 3’RACE cDNA第一链产物，ddH2O 10ul混匀，按以下程序进行反应：预变性，94℃，3min，(变性94℃，30S，退火55℃-45℃，30S，延伸72℃，30S)20个循环，延伸72℃，7min，4℃终止反应，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳。采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0进行PCR产物凝胶回收。
重组克隆载体转化：取感受态细胞DH5a置于冰浴融化，分别向感受态细胞悬液中加入10ul pMD19T重组克隆载体和目的基因PCR产物，混匀，冰浴中静置30min，42℃热激90s，迅速转移至冰浴中静置2-3min，加入900ul SOC液体培养基，37℃，150rpm振荡培养45min，吸取菌液100ul到LB(Amp+)固体琼脂培养基平板上，涂板，倒置37℃培养12-16h。在长满菌落的平板上随机挑取10个单克隆，分别溶解到10ul ddH2O中，吸取5ul稀释菌液至干净的200ul PCR管中，99℃热处理5min，冰浴中加入15ul 2×Premix TaqTM，1ul上游引物ER，1ul下游引物BF，1ul热处理后的菌液，ddH2O补至25ul，混匀，短暂离心后按以下程序进行PCR反应，1％糖凝胶上电泳，将阳性克隆对应的单菌落加入到3ml LB(Amp+)液体培养基中，37℃，振荡培养过夜，送样测序。
(2)方格星虫纤溶酶cDNA序列3’末端扩增
根据测序成功的纤溶酶特异性片段序列设计引物，如下
引物名称 引物序列
3’RACE GSP1primer：5’AAGGGTTGGGTTCCGTGTCCGTGCTG3’
PCR：冰浴中加入2.5ul 3’RACE cDNA，5ul 10*UPM，1uL3’RACE GSP1primer，15.5uL ddH2O，25ul SeqAmp Buffer，1.0uL SeqAmp DNA Polymerase混匀，短暂离心后按以下程序进行PCR反应：预变性，(变性94℃,30S，退火72℃3min)5个循环，(变性94℃，30s，退火70℃，30S，延伸72℃，3min)5个循环，(变性94℃，30s，退火68℃，30S，延伸72℃，3min)25个循环，终止4℃。吸取5ul PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，3’RACE产物纯化后克隆测序。
(3)方格星虫纤溶酶cDNA序列5'端扩增
根据测序的3’RACE纤溶酶特异性片段序列设计引物，如下
引物名称 引物序列
5’RACE GSP1primer：5’AAATGTAGGCAGTGTTTCCAGCGTAG3’
PCR：冰浴中加入2.5ul 5’RACE cDNA，5ul 10*UPM，1uL 5’RACE GSP1primer，15.5uL ddH2O，25ul SeqAmp Buffer，1.0uL SeqAmp DNA Polymerase混匀，短暂离心后按以下程序进行PCR反应：预变性，(变性94℃，30S，退火72℃，3min)5个循环，(变性94℃，30s，退火70℃，30S，延伸72℃，3min)5个循环，(变性94℃，30s，退火68℃，30S，延伸72℃，3min)25个循环，终止4℃。吸取5ul PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，5’RACE产物纯化后克隆测序。
(4)方格星虫纤溶酶序列拼接及全长基因克隆
将方格星虫纤溶酶基因3’RACE产物、5’RACE产物测序结果拼接得到纤溶酶全长基因如SEQ ID NO:1所示，根据拼接全长基因序列设计引物，如下
引物名称 引物序列
St primer：5’ATGGGGACGTCACACCGGACTCGACC 3’
Ed primer：5’GAAACAGTTTATTGTTAGCAGACCAG 3’
以5’RACE cDNA为模板，PCR扩增cDNA全长。冰浴中加入12.5ul2×Premix TaqTM，引物St、Ed各1ul，1ul 5’RACE cDNA第一链产物，ddH2O 10ul混匀，按以下程序进行反应：预变性，94℃，3min，(变性94℃，30S，退火70℃-62℃，30S，延伸72℃，30S)30个循环，延伸72℃，7min，4℃终止反应，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示凝胶电泳图。PCR产物胶回收后连接19T载体转入DH5a，测序验证。
实施例二
方格星虫纤溶酶基因真核表达
实验材料：pGAPZaA载体，毕赤酵母GS115(Invtrogen)；BTXECM830Electroporation System；
试剂：ECORI，QuickCutTMXba I，Premixed Protein Marker Low，DL5000Marker，DL2000Marker(TAKARA)，AvrII(NOVA)，BCA Protein Assay Kit(康为世纪)。
(1)目的片段扩增：
根据pGAPZaA载体图谱，在目的基因两端加上ECORI和Xba I的限制酶位点(下划线)，设计引物如下：
引物名称 引物序列
EC primer：5’CCGGAATTCATGGGGACGTCACACCGGACT 3’
XB primer：5’TGCTCTAGAGTTGGAGTCAATCCAGCTACG 3’
冰浴上依次加cDNA全长基因片段1ul，EC、XB引物各1uL，2×Premix TaqTM25uL，灭菌水22uL于PE管中混匀，进行PCR反应：预变性，94℃，3min，(变性94℃，30s，退火56℃，30S，延伸72℃，30S)30个循环，延伸72℃，7min，终止4℃，1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化克隆测序。
(2)基因重组表达载体的构建：
冰上依次将10×buffer，pGAPZaA载体/目的基因纯化片段，双切酶ECORI，Xbal，去离子水加至PE管中，37℃水浴30分钟，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。双酶切的pGAPZaA载体和目的基因片段、T4连接酶、buffer、去离子水于管混匀22℃孵育1h，并立即转化DH5a感受态细胞，测序并保存菌种，命名为菌D-GEXB。提取D-GEXB质粒，AvrII酶37℃30min酶切质粒。
(3)电转毕赤酵母：
将酶切线性化质粒与毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至的预冷的电转化杯中，1mm电转化杯冰浴，电压600V，电击时间5ms，加入冰预冷的山梨醇溶液，转至离心管中30℃，培养约待菌体液完全吸收后，将平板在30℃培养箱倒置培养，直到有单菌落出现，挑取单菌落，载体引物PCR检验。
(4)毕赤酵母阳性重组子筛选：
阳性转化子划于MD平板，30℃培养2d，挑取平板中生长较好，分别点在含500，1000，2000ug/mLZeocin的YPD固体培养基上，28℃培养3d，选取在高浓度Zeocin平板上生长良好的菌株加入YPD液体培养基培养。
实施例三
方格星虫重组纤溶酶纯化及活性初步鉴定
试剂：牛纤维蛋白原，凝血酶，尿激酶(Sigma分装)，Zeocin(Invtrogen)，咪唑，Ni-NTA-Agarose(QIAGEN)，考马斯亮蓝R-250，SDS，YPD，BMMY，BMGY，冰醋酸为国产分析纯。
(1)方格星虫重组纤溶酶利用纤维平板法进行纤溶活性实验
分别在0，24h，48h，72h，96h，120h提取BMMY液体培养基的重组工程菌发酵菌液上清，等体积丙酮沉淀蛋白后以灭菌水溶解，进行纤维蛋白平板活性测试。从纤维蛋白平板活性结果判定目的蛋白的表达量在48h达到高峰。以1000U尿激酶为对照，重组蛋白的比活性为75083IU/mg蛋白。在85℃处理30min的纤维蛋白平板上，方格星虫重组纤溶酶仍然有溶解纤维蛋白的作用，尿激酶则无效，表明方格星虫重组纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白的能力，如图2所示为方格星虫重组纤溶酶在纤维平板法上纤溶活性示意图。如图3所示为方格星虫重组纤溶酶在热处理纤维平板法上纤溶活性示意图。A为85℃热处理30min灭活纤维蛋白酶原的平板，B为未热处理平板。
(2)SDS-PAGE电泳检测
配制12％分离胶和5％浓缩胶，取不同时间的重组工程菌发酵菌液蛋白10uL，加入6×SDS-PAGE loading buffer，100℃沸水煮5min，冷却后上样，电压80V样品进入浓缩胶与分离胶的界面，电压升高至100V，待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，考马斯亮蓝R-250染色，脱色摇床上脱色30min，取出后检测拍照。所述方格星虫重组纤溶酶SDS-PAGE电泳图谱相对分子质量为29kDa-44kDa之间。如图4所示为方格星虫重组纤溶酶SDS-PAGE图。
(3)方格星虫重组纤溶酶纯化
经Ni-NTA-Agarose纯化重组纤溶酶，缓冲液平衡镍柱后将20ml蛋白上样，再用缓冲液洗柱后，分别用20mM、50mM、100mM、200mM和400mM咪唑缓冲液进行阶段洗脱，收集各阶段洗脱峰，纤维蛋白平板检测峰活性，活性峰主要分布在50-100mM洗脱阶段。
(4)方格星虫纤溶酶溶血块实验
将方格星虫重组纤溶酶用生理盐水配制成1000ug/mL，取200uL作用在1.00g小鼠全血凝血块，24h溶解率达84.12％。实验结果表明方格星虫重组纤溶酶具有直接溶解血块中纤维蛋白的能力。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院海口实验站
<120> 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 834
<212> DNA
<213> 方格星虫（Sipunculus nudus）
<400> 1
atggggacgt cacaccggac tcgacctgct agaaacatgt ggacgatact ggctctctgc 60
gtcttggctg tcgttgaagc acgccctcgc gctgagttct acgcgagctt tagctttcca 120
aagattgttg ggggctctcc tgcttcaaaa ggtgacttcc cgcaccagtt gtcgctccag 180
catgatagtg gaggatggta ccacacctgc ggcgccagcc ttctcagctc caggaaagct 240
ctcacagccg ctcattgtac gcagggaaga tttggtttcc gtgtgcgtgc tggagccact 300
aggctgagtc catctgatca cgagggggag gcaatggtgg gcgggatagt tgagcatcca 360
ggttacgact caggggcgtc aggcatcccc aatgacgtcg ccactcttca tctttcttca 420
tcaatcaatt caggaggagc cattggttac gcatccttgc catcctctag cgccggaagt 480
ttcgctggaa atgctgtcta tatttccggt tggggtaaaa cagacggatc ggctgacggc 540
ggctcgaatg tgttgaacca agtacggaca actgttatct ctgagagtga ctgcaggaac 600
agaatgcctg gaaccctcgg cagtggtatc tctgctatgc atatctgtat tttctccgga 660
aacagcggct cctgtcaggg tgactctggt ggcccgatga cccatgcctc caacggattg 720
atgatcggtg tgacctcctg gggtgttgga aacattttcg tcagctgttt gacagaatac 780
ccctctgtat acgctcgtgt cagttacttc cgtagctgga ttgactccaa ctaa 834
<210> 2
<211> 277
<212> PRT
<213> 方格星虫（Sipunculus nudus）
<400> 2
Met Gly Thr Ser His Arg Thr Arg Pro Ala Arg Asn Met Trp Thr Ile
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Val Leu Ala Val Val Glu Ala Arg Pro Arg Ala Glu
20 25 30
Phe Tyr Ala Ser Phe Ser Phe Pro Lys Ile Val Gly Gly Ser Pro Ala
35 40 45
Ser Lys Gly Asp Phe Pro His Gln Leu Ser Leu Gln His Asp Ser Gly
50 55 60
Gly Trp Tyr His Thr Cys Gly Ala Ser Leu Leu Ser Ser Arg Lys Ala
65 70 75 80
Leu Thr Ala Ala His Cys Thr Gln Gly Arg Phe Gly Phe Arg Val Arg
85 90 95
Ala Gly Ala Thr Arg Leu Ser Pro Ser Asp His Glu Gly Glu Ala Met
100 105 110
Val Gly Gly Ile Val Glu His Pro Gly Tyr Asp Ser Gly Ala Ser Gly
115 120 125
Ile Pro Asn Asp Val Ala Thr Leu His Leu Ser Ser Ser Ile Asn Ser
130 135 140
Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ala Ser Leu Pro Ser Ser Ser Ala Gly Ser
145 150 155 160
Phe Ala Gly Asn Ala Val Tyr Ile Ser Gly Trp Gly Lys Thr Asp Gly
165 170 175
Ser Ala Asp Gly Gly Ser Asn Val Leu Asn Gln Val Arg Thr Thr Val
180 185 190
Ile Ser Glu Ser Asp Cys Arg Asn Arg Met Pro Gly Thr Leu Gly Ser
195 200 205
Gly Ile Ser Ala Met His Ile Cys Ile Phe Ser Gly Asn Ser Gly Ser
210 215 220
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Thr His Ala Ser Asn Gly Leu
225 230 235 240
Met Ile Gly Val Thr Ser Trp Gly Val Gly Asn Ile Phe Val Ser Cys
245 250 255
Leu Thr Glu Tyr Pro Ser Val Tyr Ala Arg Val Ser Tyr Phe Arg Ser
260 265 270
Trp Ile Asp Ser Asn
275

Claims (4)

1.一种方格星虫纤溶酶cDNA基因，其特征在于：为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种方格星虫纤溶酶，其特征在于：为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种方格星虫重组纤溶酶，其特征在于：通过酵母蛋白表达系统对权利要求1进行重组蛋白诱导表达，得到所述方格星虫重组纤溶酶。
4.权利要求3所述的方格星虫重组纤溶酶在制备溶栓药物中的应用。
CN201610977735.9A 2016-11-08 2016-11-08 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用 Active CN106497950B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610977735.9A CN106497950B (zh) 2016-11-08 2016-11-08 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610977735.9A CN106497950B (zh) 2016-11-08 2016-11-08 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106497950A CN106497950A (zh) 2017-03-15
CN106497950B true CN106497950B (zh) 2019-05-10

Family

ID=58323347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610977735.9A Active CN106497950B (zh) 2016-11-08 2016-11-08 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106497950B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205411A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 国家海洋局第三海洋研究所 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用
CN103382463A (zh) * 2013-05-09 2013-11-06 许瑞安 海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用
CN105255920A (zh) * 2015-10-27 2016-01-20 华侨大学 可口革囊星虫纤溶酶基因、可口革囊星虫重组纤溶酶及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205411A (zh) * 2013-04-23 2013-07-17 国家海洋局第三海洋研究所 一种小分子量方格星虫纤溶酶及其制备方法与应用
CN103382463A (zh) * 2013-05-09 2013-11-06 许瑞安 海洋方格星虫纤溶酶及其制备和应用
CN105255920A (zh) * 2015-10-27 2016-01-20 华侨大学 可口革囊星虫纤溶酶基因、可口革囊星虫重组纤溶酶及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
海南方格星虫纤溶酶分离纯化及部分基因克隆;马伏宁等;《基因组学与应用生物学》;20180225;第37卷(第2期);第698-703页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106497950A (zh) 2017-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109912699B (zh) 樟疫霉效应子蛋白Avh87及其编码基因与应用
WO2020029564A1 (zh) 雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用
CN109081865B (zh) 毛竹PeVQ28蛋白及其编码基因与应用
CN111471660A (zh) 一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用
CN109517812A (zh) 杜鹃花查尔酮合成酶RsCHS蛋白及其编码基因
CN114989272A (zh) 樟疫霉效应子蛋白scr97226及其应用
CN106497950B (zh) 一种方格星虫纤溶酶cDNA基因、重组纤溶酶及其应用
CN110846293B (zh) 一种溶血磷脂酸酰基转移酶
CN108315335A (zh) 梨干旱诱导转录因子PbrWRKY53及其在提高植物抗旱能力方面的应用
CN110452931A (zh) 一种提高酵母中角鲨烯含量的方法
CN115161332B (zh) 一种刺葡萄VdERF2基因及其编码蛋白和应用
CN104946606B (zh) 一种基因工程改造的耐热抗逆sod及其编码基因与应用
CN107828749B (zh) 一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法
CN110452290A (zh) 来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在蔬菜生防上的应用
CN106399529B (zh) 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法
CN105063040B (zh) 番茄晚疫病菌pcr检测引物、试剂盒及检测方法
CN101525600B (zh) 一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法
CN102021188A (zh) 白沙蒿△12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途
CN110872582B (zh) 一种适冷过氧化物还原酶及其编码基因与应用
CN108659108B (zh) 一种与黄金梨果顶硬化相关的nac转录因子
CN104911155B (zh) 采用基因工程改造的耐热抗逆sod及其编码基因和应用
CN115896048B (zh) 一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD及其制备方法和用途
CN104152465A (zh) 一种岷江百合细胞色素b5基因LrCyt-b5及其应用
CN109679985A (zh) 植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用
CN109679986A (zh) 植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant