CN111471660A

CN111471660A - 一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用

Info

Publication number: CN111471660A
Application number: CN202010169136.0A
Authority: CN
Inventors: 黄新珠; 邹翠云; 江福能; 张蓓; 钟惟德; 朱建国; 贺俊波
Original assignee: Guangzhou Huiyuanyuan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guangzhou Huiyuanyuan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-03-12
Also published as: CN111471660B

Abstract

本发明提供一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用，该重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所编码的人源乙醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该重组基因的人工合成方法包括：将NCBI数据库获取的ALDH2基因序列进行密码子优化得到ALDH2‑CO(Codon optimized)酶基因；在ALDH2‑CO酶基因的5’端和3’端分别引入限制性内切酶KpnI和EcoNI酶切位点，并依次通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和胶回收获得ALDH2目的基因片段；将ALDH2目的基因片段连接至乳酸菌表达载体，转化成乳酸菌细胞。本发明提供了一种新型的重组乙醛脱氢酶基因以及表达该重组基因的乳酸菌，为解酒产品的研发提供了一条新途径和理论基础。

Description

一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用。

背景技术

在生物体中，乙醛是乙醇的一种高反应性和高毒性代谢产物，已在实验动物中显示出致癌性，乙醇及其代谢物乙醛主要在消化道中被吸收，消化道中丰富的血循环使得在此定植的需氧菌、兼性厌氧菌以及消化道内皮细胞快速将乙醇氧化代谢为乙醛，但它们代谢乙醛的能力很差。因此，消化道成为体内乙醛的重要聚集部位。例如在结直肠，肠道菌高度富集，种类众多，一些细菌的乙醇脱氢酶活性甚至比肝脏的乙醇脱氢酶还高得多，此部位乙醛浓度与乙醇成线性相关，成为酒后乙醛的局部聚集部位。研究表明，乙醛毒性是乙醇的30倍，能与细胞内外蛋白质、DNA结合，形成乙醛-蛋白质产物，破坏蛋白质的结构和性质，使某些酶活性降低或活性完全丧失；同时乙醛能与体内DNA形成加合物，这种加合物将成为癌症发生的启动因子。乙醛不仅存在于酒精饮料和烟草中，还广泛存在于食物、工业和环境中，是人类最常见的致癌物质。

乙醛脱氢酶2(acetaldehydedehydrogenase，ALDH2)是机体内降解乙醛最重要的酶，其活性强弱很大程度上决定饮酒和(或)吸烟等来源的乙醛对人体危害大小。ALDH2主要表达在肝脏，而在包括消化道等部位的表达极少甚至不表达。ALDH2缺活型表现出喝酒后血液中乙醛浓度升高显著，面部潮红以及心动过速等特征，这是由于乙醛具有快速扩张毛细血管的作用。由于高度遗传多态性的特征性分布，约40％东亚人的ALDH2表现为缺活型，不能及时有效代谢体内的乙醛，体内乙醛累积在口腔、咽、食管、胃、肝脏或大肠等局部，数倍地增加这些部位癌症发生的风险。过量酒精摄入导致机体机能紊乱，长期过度饮酒对神经系统和肝脏的损伤尤其严重，并显著提高消化道相关肿瘤的发生风险。

益生菌是能调节人体微生态平衡的非致病性微生物：它们通过改善肠道微生物菌群，分泌抗炎症因子，提高肠道屏障完整性，并减少有害菌产生的促炎性因子的释放等等，从而起到促进宿主健康的效果。其中对鼠李糖乳杆菌的研究最多，应用最为广泛。益生菌对酒精性肝病的治疗效果已获得不少动物试验和临床试验研究证据。基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效表达。很多科研工作者将乙醛脱氢酶基因导入适宜的表达体系中，以构建高产乙醛脱氢酶的工程菌。2005年，裘丽珍在大肠杆菌BL21中实现了乙醛脱氢酶基因的异源高效表达，重组乙醛脱氢酶的比活达到331.7U/mg(参考文献:裘丽珍.人乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达.浙江大学2005.)，但鉴于大肠杆菌存在食品安全问题，不适宜用于保健食品的制备。2010年，黄锟等将乙醛脱氢酶基因导入毕赤酵母SMD1168中，分泌表达的重组乙醛脱氢酶的比活达到4.87U/mg，活性远低于大肠杆菌。目前尚未有采用乳酸菌工程菌表达乙醛脱氢酶的应用研究。

亚洲血统的大部分人(约40％)在编码ALDH2(ALDH2*2)的基因中具有功能性多态性，导致该酶部分失活。这导致乙醛积累和酒精引起的潮红反应，对酒精的反应水平提高，结果，该人群的酒精中毒率降低。

发明内容

有鉴于此，有必要针对现有技术存在的问题，提供一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种人源重组乙醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第二个方面，本发明提供上述人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，包括以下步骤：

1)将NCBI数据库获取的ALDH2基因序列进行密码子优化得到ALDH2-CO(Codonoptimized)酶基因；

2)在ALDH2-CO酶基因的5’端和3’端分别引入限制性内切酶KpnI和EcoNI酶切位点，并依次通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和胶回收过程获得ALDH2目的基因片段；

3)将ALDH2目的基因片段以电转化的方式连接至乳酸菌表达载体；

4)将步骤3)获得的乳酸菌表达载体进行细菌培养；

5)提取乳酸菌细胞的质粒并进行双酶切，将构建的重组乳酸菌菌种复苏三代培养至约为加终浓度5ng/ml Nisin的诱导，每隔一段时间取10ml培养液离心收集菌体，PBS重悬采用超声破碎法裂解菌体，得到乙醛脱氢酶粗酶液。

进一步的，所述步骤1)中进行密码子优化的具体方法为：采用Signal P 3.0Server在线分析网站对ALDH2基因序列进行分析，并根据乳酸菌的密码子偏好，将ALDH2基因序列中在目的乳酸菌中使用频率低的密码子替换为使用频率高的密码子。

优选的，所述步骤2)中PCR扩增的具体操作为：扩增体系：2×TaqMaster/Mix 12.5μL，引物各1ul，DNA模板2ul，共计25μL；扩增程序：2×(94℃3min，70℃5min)，94℃30s，55℃30s，70℃5min，共10个循环。

优选的，所述步骤2)中琼脂糖凝胶电泳的条件为：将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，电压100v，时间30min。

进一步的，所述步骤4)中细胞培养的控制条件为：37℃培养13-14小时。

第三个方面，本发明提供一种编码上述人源重组乙醛脱氢酶的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第四个方面，本发明提供一种乳酸菌工程菌，是表达上述重组基因的乳酸菌。

第五个方面，本发明提供上述人源重组乙醛脱氢酶及其合成方法、上述重组基因以及上述乳酸菌工程菌在制备含乙醛脱氢酶产品中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新型的重组乙醛脱氢酶基因以及表达该重组基因的乳酸菌，该新型突变体是通过以蛋白质结构为依据的蛋白工程改造，设计出能够抗酶消化的重组乙醛脱氢酶，其酶活最高可达到3.22U/10⁹CFU/L，将其应用于解酒，可以延长乙醛脱氢酶在人体内的半衰期，降低人体内乙醛浓度从而实现解酒或提高耐酒能力，为解酒产品的研发提供了一条新途径和理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1的乳酸菌载体pNZ8148-coALDH2重组质粒鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M为Marker、泳道1为阴性对照pMG36e、泳道2为pNZ8148-ALDH2质粒双酶切产物、泳道3为pNZ8148-coALDH2重组质粒双酶切产物。

图2为本发明实施例2的乳酸菌载体pNZ8148-coALDH2的构建示意图。

图3为本发明实施例3中应用载体pMG36e在乳酸菌NZ3900中表达乙醛脱氢酶的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为阴性对照菌株蛋白提取物，泳道2为带有pNZ8148-ALDH2的转化子的菌株提取物，泳道3为带有pNZ8148-coALDH2的转化子的菌株提取物。

图4是本发明实施例3中出发菌株(NZ3900)、对照菌株(pNZ8148-ALDH2)、密码子优化菌株的乙醛脱氢酶活性。

图5为本发明实施例4中乳酸乳球菌基因工程菌与枯草芽孢杆菌基因工程菌和酿酒酵母工程菌的活性检测对比图。

具体实施方式

本发明实施例采用的PCR扩增试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

本发明实施例采用的PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

本发明实施例采用的乳酸菌表达载体pNZ8148购自武汉淼灵生物科技有限公司。

本发明实施例采用的乳酸菌NZ3900购自广东农业科学院。

本发明实施例采用的ALDH活性检测试剂盒购自Abnova亚诺法生物科技股份有限公司。

本发明实施例采用的酿酒酵母菌株W303-1A(＝ATCC208352)购自美国ATCC。

本发明实施例采用的枯草芽孢杆菌菌株168(＝ATCC23857)购自美国ATCC。

本发明实施例采用的乳酸菌发酵培养基(MRS培养基)、GM17葡萄糖肉汤培养基购自Oxoid公司。

本发明实施例采用的酵母菌发酵培养基(马铃薯葡萄糖培养基)配制方法为：20％马铃薯浸汁(马铃薯200g去渣取汁)、葡萄糖20g，补足水至1000ml，自然pH。

本发明实施例采用的枯草芽孢杆菌发酵培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)配制方法为：10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖、蒸馏水1000ml，自然pH。

本发明实施例采用的LB培养基购自上海生工生物工程股份有限公司。

本发明实施例采用的电转染仪为自主研发并申请专利(申请号分别为201910636489.4和201921104216.7)。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种编码人源重组乙醛脱氢酶的重组基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。该重组基因的人工合成方法如下：

1)在NCBI数据库获取ALDH2基因序列(编号为CR45699)，采用Signal P 3.0Server在线分析网站分析并根据乳酸菌的密码子偏爱性，将ALDH2基因序列中在目的乳酸菌中使用频率低的密码子，替换为使用频率高的密码子，合成优化的ALDH2-CO(Codonoptimized)酶基因。

2)在ALDH2-CO酶基因的5’端和3’端分别引入限制性内切酶KpnI和EcoNI酶切位点，并依次通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和胶回收获得ALDH2目的基因片段。

其中，PCR扩增的具体操作为：扩增体系：2×TaqMaster/Mix12.5μL，引物各1ul，DNA模板2ul，共计25μL；扩增程序：2X(94℃3min，70℃5min)，94℃30s，55℃30s，70℃5min，共10个循环。琼脂糖凝胶电泳的条件为：将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，电压100v，时间30min；琼脂糖凝胶电泳如图1所示。并测序确证，其序列如SEQ ID NO：1所示，获得了编码该人源重组乙醛脱氢酶的重组基因。

3)将ALDH2目的基因片段在电转染仪中以电转化的方式连接至乳酸菌表达载体，控制参数参照申请号分别为201910636489.4和201921104216.7的专利，既得。

4)提取乳酸菌细胞的质粒并进行KpnI和EcoNI双酶切，条带大小和co-ALDH2相同，如图3所示，说明ALDH2基因已构建到载体上(该乳酸菌载体的具体建立方法见实施例2)。琼脂糖凝胶电泳如图1所示。

5)将构建的重组乳酸菌菌种复苏三代培养至约为加终浓度5ng/ml Nisin的诱导，每隔一段时间取10ml培养液离心收集菌体，PBS重悬采用超声破碎法裂解菌体，得到乙醛脱氢酶粗酶液，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2

本实施例提供一种乳酸菌工程菌pNZ8148-coALDH2，是表达实施例1的重组基因的乳酸菌表达载体，该载体的建立方法如图2所示，具体为：NZ9000乳酸菌冰水浴至融化，200μL体系中，含有菌液OD 600nm为0.4、10μg质粒，吹打混匀，冰水浴15min后将混合物转入电转杯继续冰浴15min。电转条件为电压1400V/cm、电阻400Ω、电容25μF，电转5ms后立即冰水浴；电转产物200μL加入含有终浓度为20mM的MgCl₂和2mM的CaCl₂的800μLGM17液体培养基中，30℃培养2h。将菌液涂在含有10μg/ml氯霉素的MRS培养基板上等待氯霉素抗性菌落长出，经PCR和测序鉴定的阳性克隆为基因工程菌，其中提供测序的单位为广州艾基生物技术有限公司。

实施例3

出发菌株(NZ3900)、对照菌株(pNZ8148-ALDH2)、实施例2获得的密码子优化菌株(pNZ8148-coALDH2)发酵及不同条件下的酶活力。

对照菌株(pNZ8148-ALDH2)的构建方法与上述pNZ8148-coALDH2构建的方法基本相同，区别在于采用了pNZ8148-ALDH2载体，其中ALDH2的密码子没有经过优化。

将出发菌株NZ3900、对照菌株(pNZ8148-ALDH2)、密码子优化菌株(pNZ8148-coALDH2)分别接种于MRS乳酸菌培养基，于30℃进行活化培养，然后将三个菌液同时转接于新鲜的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基进行培养，具体操作步骤如下：

(1)菌种活化

分别取甘油管保存的原始菌和基因工程菌30μL加入3mL的乳酸菌发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下过夜培养，获得种子液。

(2)菌种发酵

分别取活化的种子液2mL加入到200mL的菌株对应的发酵培养基中，在30℃、200rpm条件下发酵一段时间，在发酵20h、40h、60h、80h、100h和120h时分别取5mL的发酵液用于比活的测定。

(3)发酵液的处理

10mL的发酵液在8000rpm条件下离心5min，用无菌水洗涤菌体一次，取2×10⁹CFU的菌体，用液氮冷冻菌体，最后加入和菌体等体积的600μL的PBS溶液，冰浴超声波破碎仪破碎30min，离心，留上清用来测定酶活和蛋白含量。

酶活和蛋白含量的测定：由于NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化态))、NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原态))分别在260nm、340nm处有最大的吸收峰，酶、辅酶NAD+和底物在一定条件下反应，通过测定一定时间340nm吸光度的变化值，可以计算出NAD+转化为NADH的量，根据酶活的定义计算得到该酶的酶活。

a、酶活测定：

乙醛脱氢酶活性测定，根据ALDH活性检测试剂盒说明书具体操作如下：

1.NADH标准曲线：添加0、2、4、6、8、10μLNADH标准品到96板中，作为0,2,4,6,8,10nmol/孔的标准曲线。调整至50μL/孔。

2.样品制备：液体样品可直接测定。组织(50毫克)或细胞(1x 10 6)应与～200μL冰冷ALDH缓冲液快速研磨破碎在冰上10分钟,在12000rpm 5min去除沉淀。收集1-50μL上清的到96板，用ALDH缓冲液调整样品制备液到50μL体积。

3.每孔100μL反应体系包含：NAD底物混合物2ul，乙醛5ul，ALDH试剂缓冲液43ul，样本制备液50ul，共100ul。室温孵育5分钟，在450nm处测量样品的OD值。根据NADH标准曲线推算样本OD值对应的ALDH活性。

检测出发菌株(NZ3900)、对照菌株(pNZ8148-ALDH2)、密码子优化菌株的乙醛脱氢酶活性。

根据ALDH酶活检测试剂盒说明书检测样本，使用UV-2600分光光度计监测340nm处NAD+的还原，在25℃下测定乙醛脱氢酶活性。

酶活的定义：最适条件下，每分钟转化1μmol乙醛底物为1个酶活力单位，可得到反应体系里ALDH2的酶活计算公式为：

酶活＝U/10⁹CFU/L；

检测结果如图4所示，可以发现，实施例2获得的密码子优化菌株(pNZ8148-coALDH2)的酶活力最高，并且其酶活最高可达到3.22U/10⁹CFU/L。

b、蛋白含量测定

对于蛋白质表达，将含有pNZ8148(作为阴性对照)和上述得到的工程菌pNZ8148-ALDH和pNZ8148-ALDH-CO的乳酸乳球菌NZ3900的过夜培养物以5％(v/v)接种到新鲜的GM17培养基中。将培养物分成由未诱导的样品和用50ng/ml乳链菌肽诱导的样品组成的子样品(每个50mL)(如下所述，在诱导条件下)。

对于蛋白质表达，将含有pNZ8148-ALDH的乳酸乳球菌NZ3900或载体pNZ8148(作为阴性对照)的过夜培养物以5％(v/v)接种到新鲜的GM17培养基中。将培养物分成由未诱导的样品和用50ng/ml乳链菌肽30℃诱导20h、40h、80h、100h、120h(在诱导条件下)的样品组成的子样品(每个50mL)。诱导后，将50mL样品中的菌体收集到1mL裂解缓冲液中，该缓冲液由50mM磷酸钾(pH 8.0)，300mM甘油和3mM Triton X-100组成，重悬后超声破碎。然后通过8000×g离心去除细胞碎片20分钟收集上清液，将上清的蛋白质浓度调整为500μg/mL，每份样本取15μL添加到12％聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，60V电泳10min，110V电泳2小时。其结果如图3所示，表明工程菌的蛋白条带比出发菌株多了一条ALDH-CO蛋白的条带，条带大小符合位置。

实施例4

本实施例将乳酸菌工程菌、现有的酿酒酵母菌工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌的酶活进行比较，因为目前有将这两种现有工程菌用于解酒的应用，本实施例正是为了验证乳酸菌工程菌应用于解酒的潜力。

1)乳酸菌工程菌的构建

参考实施例2的方法构建乳酸菌工程菌，但培养时间延长至120h，培养过程中分别在20h、40h、80h、100h、120h定时取样，测定酶活。

2)枯草芽孢杆菌工程菌的构建

参考专利CN201810148121构建枯草芽孢杆菌基因工程菌，同样培养时间为120h，培养过程中分别在20h、40h、80h、100h、120h定时取样，测定酶活。

3)酿酒酵母工程菌的构建

参考专利CN201711261238构建酿酒酵母工程菌，同样培养时间为120h，培养过程中分别在20h、40h、80h、100h、120h定时取样，测定酶活。

4)三种工程菌的酶活测定方法

将三种工程菌的发酵液分别取5mL，在8000rpm条件下离心5min，用无菌水洗涤菌体一次，再用液氮冷冻菌体，5mL裂解缓冲液中，该缓冲液由50mM磷酸钾(pH 8.0)，300mM甘油和3mM Triton X-100组成，重悬后超声破碎。最后加入和菌体等体积PBS溶液，在涡旋振荡器上震30s，之后在冰上放置1min，整个过程持续45min，离心，留上清测定酶活。

6)结果讨论

乳酸菌工程菌、现有的酵母菌工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌的酶活性比较方法同实施例3，如图5所示，乳酸菌工程菌发酵100h时活性达到最高3.22U/10⁹ CFU/L，并且在120h的发酵过程中，本发明的乳酸菌工程菌一直远远高于现有的酵母菌工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，显示本发明在解酒方面的能力要远高于这两种现有的基因工程菌。

综上，本发明提供了一种新型的重组乙醛脱氢酶基因以及表达该重组基因的乳酸菌，该新型突变体是通过以蛋白质结构为依据的蛋白工程改造，设计出能够抗酶消化的重组乙醛脱氢酶，其酶活最高可达到3.22U/10⁹CFU/L，将其应用于解酒，可以延长乙醛脱氢酶在人体内的半衰期，降低人体内乙醛浓度从而实现解酒或提高耐酒能力，为解酒产品的研发提供了一条新途径和理论基础。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州辉园苑医药科技有限公司

<120> 一种乙醛脱氢酶重组基因及其乳酸菌载体和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

ggtaccatgc ttcgtgctgc tgctcgtttc ggtccacgtc ttggtcgtcg tcttctttca 60

gctgctgcta ctcaagctgt tccagctcca aaccaacaac cagaagtttt ctgtaaccaa 120

atcttcatca acaacgaatg gcacgaagct gtttcaaaga aaactttccc aactgttaac 180

ccatcaactg gtgaagttat ctgtcaagtt gctgaaggtg ataaagaaga tgttgataaa 240

gctgttaaag ctgctcgtgc tgctttccaa cttggttcac catggcgtcg tatggatgct 300

tcacaccgtg gtcgtcttct taaccgtctt gctgatctta tcgaacgtga tcgtacttac 360

cttgctgctc ttgaaactct tgataacggt aaaccatacg ttatctcata ccttgttgat 420

cttgatatgg ttcttaaatg tcttcgttac tacgctggtt gggctgataa ataccacggt 480

aaaactatcc caatcgatgg tgatttcttc tcatacactc gtcacgaacc agttggtgtt 540

tgtggtcaaa tcatcccatg gaacttccca cttcttatgc aagcttggaa acttggtcca 600

gctcttgcta ctggtaacgt tgttgttatg aaagttgctg aacaaactcc acttactgct 660

ctttacgttg ctaaccttat caaagaagct ggtttcccac caggtgttgt taacatcgtt 720

ccaggtttcg gtccaactgc tggtgctgct atcgcttcac acgaagatgt tgataaagtt 780

gctttcactg gttcaactga aatcggtcgt gttatccaag ttgctgctgg ttcatcaaac 840

cttaaacgtg ttactcttga acttggtggt aaatcaccaa acatcatcat gtcagatgct 900

gatatggatt gggctgttga acaagctcac ttcgctcttt tcttcaacca aggtcaatgt 960

tgttgtgctg gttcacgtac tttcgttcaa gaagatatct acgatgaatt cgttgaacgt 1020

tcagttgctc gtgctaaatc acgtgttgtt ggtaacccat tcgattcaaa aactgaacaa 1080

ggtccacaag ttgatgaaac tcaattcaaa aaaatccttg gttacatcaa cactggtaaa 1140

caagaaggtg ctaaacttct ttgtggtggt ggtatcgctg ctgatcgtgg ttacttcatc 1200

caaccaactg ttttcggtga tgttcaagat ggtatgacta tcgctaaaga agaaatcttc 1260

ggtccagtta tgcaaatcct taaattcaaa actatcgaag aagttgttgg tcgtgctaac 1320

aactcaactt acggtcttgc tgctgctgtt ttcactaaag atcttgataa agctaactac 1380

ctttcacaag ctcttcaagc tggtactgtt tgggttaact gttacgatgt tttcggtgct 1440

caatcaccat tcggtggtta caaaatgtca ggttcaggtc gtgaacttgg tgaatacggt 1500

cttcaagctt acactgaagt taaaactgtt actgttaaag ttccacaaaa aaactcataa 1560

gaattc 1566

<210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro

20 25 30

Glu Val Phe Lys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala

35 40 45

Val Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val

50 55 60

Ile Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val

65 70 75 80

Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met

85 90 95

Asp Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile

100 105 110

Glu Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly

115 120 125

Lys Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys

130 135 140

Cys Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr

145 150 155 160

Ile Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr Thr Arg His Glu Pro Val

165 170 175

Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Gln

180 185 190

Ala Trp Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn Val Val Val Met

195 200 205

Lys Val Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Val Ala Asn Leu

210 215 220

Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly

225 230 235 240

Phe Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Glu Asp Val Asp

245 250 255

Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Val Ile Gln Val

260 265 270

Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly

275 280 285

Lys Ser Pro Asn Ile Ile Met Ser Asp Ala Asp Met Asp Trp Ala Val

290 295 300

Glu Gln Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys

305 310 315 320

Ala Gly Ser Arg Thr Phe Val Gln Glu Asp Ile Tyr Asp Glu Phe Val

325 330 335

Glu Arg Ser Val Ala Arg Ala Lys Ser Arg Val Val Gly Asn Pro Phe

340 345 350

Asp Ser Lys Thr Glu Gln Gly Pro Gln Val Asp Glu Thr Gln Phe Lys

355 360 365

Lys Ile Leu Gly Tyr Ile Asn Thr Gly Lys Gln Glu Gly Ala Lys Leu

370 375 380

Leu Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro

385 390 395 400

Thr Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu

405 410 415

Ile Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu

420 425 430

Val Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val

435 440 445

Phe Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln

450 455 460

Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser

465 470 475 480

Pro Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ser Gly Arg Glu Leu Gly Glu

485 490 495

Tyr Gly Leu Gln Ala Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Val

500 505 510

Pro Gln Lys Asn Ser

515

Claims

1.一种人源重组乙醛脱氢酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

4)将步骤3)获得的乳酸菌表达载体进行细菌培养；

3.根据权利要求2所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，其特征在于：所述步骤1)中进行密码子优化的具体方法为：采用Signal P 3.0Ser ver在线分析网站对ALDH2基因序列进行分析，并根据乳酸菌的密码子偏好，将ALDH2基因序列中在目的乳酸菌中使用频率低的密码子替换为使用频率高的密码子。

4.根据权利要求2所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR扩增的具体操作为：扩增体系：2×TaqMaster/Mix 12.5μL，引物各1ul，DNA模板2ul，共计25μL；扩增程序：2×(94℃3min，70℃5min)，94℃30s，55℃30s，70℃5min，共10个循环。

5.根据权利要求2所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，其特征在于：所述步骤2)中琼脂糖凝胶电泳的条件为：将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，电压100v，时间30min。

6.根据权利要求2所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法，其特征在于：所述步骤4)中细胞培养的控制条件为：37℃培养13-14小时。

7.一种编码权利要求1所述的人源乙醛脱氢酶的重组基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

8.一种乳酸菌工程菌，其特征在于：是表达权利要求7所述的重组基因的乳酸菌。

9.权利要求1所述的人源重组乙醛脱氢酶、权利要求2～6任意一项所述的人源重组乙醛脱氢酶的人工合成方法、权利要求7所述的重组基因或者权利要求8所述的乳酸菌工程菌在制备含乙醛脱氢酶产品中的应用。