CN113186140A - 用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种基因工程益生菌及其用途，所述基因工程益生菌包含外源表达盒，所述外源表达盒包含编码乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述益生菌肠道细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(EcN)。

Description

用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌
发明领域
本公开总体上涉及基因工程益生菌肠道细菌领域，及其在预防和/或治疗宿醉和肝病中的应用。
背景技术
宿醉是一个重大问题，是社会经济损失的一个巨大来源。宿醉及其相关问题(例如酒精性肝病)在西方和东方文化中已被认识了数千年。然而，很少有有效的预防和/或治疗宿醉和相关肝脏问题的方法。
因此，需要开发用于预防和/或治疗宿醉和酒精性肝病的新方法。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种基因工程益生菌肠道细菌，其包含外源表达盒，所述外源表达盒包含编码乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述益生菌肠道细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(EcN)。
在一些实施例中，乙醛脱氢酶是来自钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的天然存在的AcoD，或其功能等效物。
在一些实施例中，所述功能等效物至少保留氧化醛类的部分活性。
在一些实施例中，所述功能等效物包含天然存在的AcoD的突变体、片段、融合物、衍生物或其任意组合。
在一些实施例中，乙醛脱氢酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有至少80％序列同一性但仍保留氧化醛类的基本活性的氨基酸序列。
在一些实施例中，编码乙醛脱氢酶的核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行密码子优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，表达盒还包含一个或多个调控元件，所述调控元件包含选自下组的一个或多个元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。
在一些实施例中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
在一些实施例中，启动子是内源启动子或外源启动子。
在一些实施例中，组成型启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-49及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，组成型启动子包含SEQ ID NO:10的核酸序列。
在一些实施例中，诱导型启动子包含厌氧诱导型启动子。
在一些实施例中，厌氧诱导型启动子包含SEQ ID NO:53的核苷酸序列。
在一些实施例中，RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，终止子是T7终止子。
在一些实施例中，外源表达盒整合到基因工程益生菌肠道细菌的基因组中。
在一些实施例中，基因工程益生菌肠道细菌表达编码至少一种分子伴侣蛋白的至少一个核苷酸序列，所述分子伴侣蛋白选自下组：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
在一些实施例中，基因工程益生菌肠道细菌还包含在营养缺陷体相关基因中的至少一个失活或缺失。
在一些实施例中，益生菌肠道细菌是针对选自下组的一种或多种物质的营养缺陷体：胸苷、尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤和非天然存在的氨基酸。
在一个方面，本公开提供了一种重组表达盒，其包含编码AcoD的核苷酸序列和一个或多个调控元件，其中所述核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，重组表达盒还包含一个或多个选自下组的调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。
在一些实施例中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子(例如，厌氧诱导型启动子)。
在一些实施例中，启动子是内源启动子或外源启动子。
在一些实施例中，启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-53及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，启动子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在一些实施例中，RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
在一些实施例中，终止子是T7终止子。
在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文提供的基因工程益生菌肠道细菌和生理学上可接受的载体。
在一些实施例中，所述组合物是可食用的。
在一些实施例中，所述组合物是食品补充剂。
在一些实施例中，所述组合物还包含一种或多种生理学上可接受的载体，其选自乳酸发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、脂肪、油、芳香剂、调味剂、蛋白质和糖基化蛋白质、水、胶囊填料和胶状材料。
在一些实施例中，基因工程微生物是活细胞。
在一些实施例中，所述组合物是成品食品、粉末、颗粒、片剂、胶囊或液体。
在一些实施例中，所述组合物包含约0.01至约99.9重量％的基因工程微生物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于降低有需要的受试者体内乙醛水平的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的亚裔脸潮红的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一些实施例中，受试者缺乏一种或多种醇脱氢酶。
在一些实施例中，受试者缺乏一种或多种醛脱氢酶。
在一些实施例中，所述组合物在饮酒之前、期间或之后施用。
在一些实施例中，所述方法包括在开始饮酒前至多24小时向受试者施用所述组合物。
在一些实施例中，受试者是ALDH2变异等位基因的携带者。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精性肝病的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一些实施例中，酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎或酒精性肝硬化。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性脂肪肝疾病发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性肝炎发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的非酒精性脂肪肝(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NAFLD发展为NASH的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在一个方面，本公开提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NASH发展为肝纤维化的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在某些实施例中，受试者具有升高的血液乙醇水平和/或增加的产酒精肠道微生物群的丰度。
附图简要说明
图1示出了gRNA质粒ZL-003_kefB的质粒图谱。
图2示出了kefB-J23119-AcoD、kefB-J23101-AcoD和kefB-J23108-AcoD的PCR电泳图。
图3A示出了对照细菌、工程细菌1和工程细菌2的耐受性试验结果。
图3B示出了工程细菌1、工程细菌2和工程细菌3中AcoD的相对表达水平。
图4A示出了对照细菌、工程细菌1、工程细菌2和工程细菌3体外去除乙醛的能力。
图4B示出了剩余乙醛浓度与工程细菌1培育时间的线图。
图5示出了对照细菌和工程细菌1体内去除乙醛的能力。
图6示出了对照细菌、工程细菌1、表达Gro的工程细菌1和表达KJE的工程细菌1体外去除乙醛的能力。
具体实施方式
在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“抗体”是指一种抗体或多于一种抗体。
以下对本公开的描述仅旨在说明本公开的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对于所属领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本公开的范围的情况下进行各种等效物、改变和修改，且应理解这类等效实施例包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
I.定义
如本文所用，术语“有效量”或“药学上有效量”是指产生期望结果所必需的一种或多种药剂的量和/或剂量和/或剂量方案，例如足以在受试者中缓解与受试者正在接受疗法或组合物的病况或疾病相关的一种或多种症状的量，或足以减轻受试者中病况的严重性或延迟其进展的量(例如治疗有效量)，足以降低受试者中疾病或病况的发病风险或延迟其发病，和/或降低其最终严重性的量(例如预防有效量)。
如本文所用，术语“编码(encodes/encoded/encoding)”是指能够转录成mRNA和/或翻译成肽或蛋白质。术语“编码序列”或“基因”是指编码肽或蛋白质的多核苷酸序列。这两个术语可以在本公开中互换使用。在一些实施例中，编码序列是由信使RNA(mRNA)逆转录的互补DNA(cDNA)序列。在一些实施例中，编码序列是mRNA。
如本文所用，术语“同源”是指在最佳比对时，与另一序列具有至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
如本文所用，术语“核苷酸序列”、“核酸”或“多核苷酸”包括寡核苷酸(即短多核苷酸)。它们还指合成的和/或非天然存在的核酸分子(例如，包含核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键)。所述术语还指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语涵盖含有天然核苷酸类似物的核酸。所述术语还涵盖具有合成骨架的核酸样结构。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见Batzer等人,《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,《分子细胞探针》(Mol.Cell.Probes)8:91-98(1994))。
相对于氨基酸序列(或核酸序列)的术语“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空隙以获得最大数目的相同氨基酸(或核酸)后，候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代可视为或可不视为相同残基。出于确定氨基酸(或核酸)序列一致性百分比的目的进行的比对可以例如使用可公开获得的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得，另参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.),215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究》,25:3389-3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)网站上获得，另参见Higgins D.G.等人,《酶学方法》(Methods inEnzymology),266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(英格兰牛津)》(Bioinformatics(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现。所属领域的技术人员可使用所述工具所提供的默认参数，或可视需要例如通过选择合适算法来自定义比对的参数。
如本文所用，术语“益生菌”是指非致病性的。在一些实施例中，当以有效量施用时，益生菌微生物细胞提供对受试者的健康或幸福的有益效果，包括例如与改善人类或动物微生物群的平衡相关的健康益处，和/或用于恢复正常的微生物群。如本文所用，术语“益生菌”是指益生菌微生物细胞(例如活的微生物细胞)的制剂。
如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、猫、兔、羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除注明外，术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，疾病、病症或病况的“治疗(Treating/treatment)”包括预防或缓解疾病、病症或病况，减缓疾病、病症或病况的发作或发展速度，降低罹患疾病、病症或病况的风险，防止或延缓与疾病、病症或病况相关的症状的发展，减少或结束与疾病、病症或病况相关的症状，使疾病、病症或病况完全或部分消退，治愈疾病、病症或病况，或其某一组合。
如本文所用，关于AcoD的术语“天然存在的”是指AcoD多肽或多核苷酸的序列与自然界中发现的序列或那些序列相同。天然存在的AcoD可以是AcoD的原生或野生型序列，或其片段，即使所述片段本身可能在自然界中没有发现。天然存在的AcoD也可以包括天然存在的变体，如在不同细菌菌株中发现的突变体或同种型或不同的原生序列。天然存在的全长AcoD多肽具有506个氨基酸残基的长度。天然存在的AcoD的示例性氨基酸序列包括但不限于AcoD(SEQ ID NO:1)。
II.基因工程益生菌肠道细菌和重组表达盒
基因工程益生菌肠道细菌
乙醛脱氢酶AcoD
在一个方面，本公开提供了一种基因工程益生菌肠道细菌，其包含外源表达盒，所述外源表达盒包含编码乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述益生菌肠道细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(EcN)。
如本文所用，术语“乙醛脱氢酶”是指能够催化乙醛氧化成乙酸盐的酶或其功能等效物。在某些实施例中，乙醛脱氢酶来自人类。在某些实施例中，乙醛脱氢酶来自非人类生物，例如钩虫贪铜菌。在某些实施例中，乙醛脱氢酶是乙醛脱氢酶2(ALDH2)。术语“ALDH2”可以指ALDH2的蛋白质以及ALDH2的基因。在某些实施例中，乙醛脱氢酶是AcoD。如本文所用，关于乙醛脱氢酶、ALDH2或AcoD(例如来自钩虫贪铜菌)的术语“功能等效物”是指任何乙醛脱氢酶变体，尽管其氨基酸序列或多核苷酸序列或化学结构不同，但至少部分保留了乙醛脱氢酶、ALDH2或AcoD(例如来自钩虫贪铜菌)的一种或多种生物学功能。乙醛脱氢酶、ALDH2或AcoD(例如来自钩虫贪铜菌)的生物学功能包括但不限于催化乙醛氧化成乙酸盐、乙醇降解、酮降解。
在某些实施例中，乙醛脱氢酶是来自钩虫贪铜菌的天然存在的AcoD，或其功能等效物。如本文所用，术语“AcoD”是指来自钩虫贪铜菌的乙醛脱氢酶蛋白；以及编码这种AcoD蛋白的任何和所有基因。
在某些实施例中，天然存在的AcoD的功能等效物至少保留氧化醛类的部分活性。所述功能等效物可以包含天然存在的AcoD的突变体、片段、融合物、衍生物或其任意组合。在某些实施例中，AcoD包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有至少80％序列同一性但仍保留氧化醛类的基本活性的氨基酸序列。
在某些实施例中，编码AcoD的核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行密码子优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。如本文所用，术语“密码子优化”是指编码多肽的核苷酸序列已被配置为包含宿主细胞或生物体(例如EcN)优选的密码子，以改善宿主细胞或生物体中的基因表达并提高翻译效率。
调控元件
在某些实施例中，表达盒还包含一个或多个调控元件，所述调控元件包含选自下组的一个或多个元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。所述一个或多个调控元件可操作地连接于乙醛脱氢酶的多核苷酸序列。如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个相关生物序列在有或没有间隔子或连接子的情况下以这样的方式并置，使它们处于允许它们以预定方式发挥作用的关系中。关于多核苷酸也可以使用所述术语。举例来说，当编码多肽的多核苷酸可操作地连接于调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时，其意指所述多核苷酸序列以允许调控由多核苷酸表达多肽的方式连接。当关于多肽使用时，其意指多肽序列以允许连接的产物具有预期的生物学功能的方式连接。例如，抗体可变区可以可操作地连接于恒定区，以提供具有抗原结合活性的稳定产物。
1.启动子
在某些实施例中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
如本文所用，术语“启动子”是指可以控制编码序列转录的多核苷酸序列。启动子序列包括足以使RNA聚合酶识别、结合和转录启动的特定序列。此外，启动子序列可以包括任选地在本文提供的益生菌肠道细菌中调节RNA聚合酶的这种识别、结合和转录启动活性的序列。启动子可以影响与自身位于同一核酸分子上的基因或与自身位于不同核酸分子上的基因的转录。启动子序列的功能，取决于调控的性质，可以是组成性的或可由刺激物诱导的。
术语“组成型启动子”是指能够促进在其控制下和/或与其可操作地连接的编码序列或基因的连续转录的启动子。EcN的组成型启动子和变体是本领域中众所周知的，包括但不限于BBa_J23119、BBa_J23101、BBa_J23102、BBa_J23103、BBa_J23109、BBa_J23110、BBa_J23114、BBa_J23117、USP45_promoter、OmpA_promoter、BBa_J23100、BBa_J23104、BBa_J23105、BBa_I14018、BBa_J45992、BBa_J23118、BBa_J23116、BBa_J23115、BBa_J23113、BBa_J23112、BBa_J23111、BBa_J23108、BBa_J23107、BBa_J23106、BBa_I14033、BBa_K256002、BBa_K1330002、BBa_J44002、BBa_J23150、BBa_I14034、Oxb19、oxb20、BBa_K088007、Ptet、Ptrc、PlacUV5、BBa_K292001、BBa_K292000、BBa_K137031和BBa_K137029。示例性组成型启动子的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO:10-49及其具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。在一些实施例中，组成型启动子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。在一些实施例中，这样的启动子在体外，例如在培养、扩增和/或制造条件下具有活性。在一些实施例中，这样的启动子在体内，例如在体内环境，例如肠道微环境中发现的条件下具有活性。
如本文所用，术语“诱导型启动子”是指可以通过外部刺激，如化学、光、激素、应激、厌氧条件或病原体，在一种或多种细胞类型中开启的受调控的启动子。诱导型启动子和变体是本领域中众所周知的，包括但不限于PLteto1、galP1、PLlacO1、Pfnrs。在一些实施例中，示例性诱导型启动子的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：如表1所示的SEQ IDNO:50-53及其具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。在某些实施例中，诱导型启动子包含厌氧诱导型启动子。在一些实施例中，诱导型启动子包含SEQ ID NO:53的核苷酸序列。
在一些实施例中，启动子是内源启动子或外源启动子。如本文所用，“外源启动子”是指与编码区可操作结合的启动子，其中所述启动子不是生物体基因组中与编码区天然相关的启动子。基因组中与编码区天然相关或相连的启动子被称为该编码区的“内源启动子”。
在某些实施例中，组成型启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-49及其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施例中，组成型启动子包含SEQ ID NO:10。
2.核糖体结合位点(RBS)
在某些实施例中，RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。如本文所用，术语“核糖体结合位点”或“RBS”可互换使用，是指核糖体在启动蛋白质翻译时结合的序列。RBS为约35个核苷酸长，并含有三个离散域：(1)Shine-Dalgarno(SD)序列，(2)间隔区，和(3)编码序列(CDS)的前五至六个密码子。RBS和变体是本领域中众所周知的，包括但不限于USP45、合成型、OmpA。示例性RBS的核苷酸序列包含选自下组的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。在某些实施例中，RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:66及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
3.终止子
在某些实施例中，终止子是T7终止子。如本文所用，术语“终止子”是指可酶并入的核苷酸，其阻止核苷酸随后并入所得多核苷酸链，从而停止聚合酶介导的延伸。在一些实施例中，终止子包含选自下组的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO:68-69或其部分及其具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的同源序列。
表1.示例性启动子的核苷酸序列
Figure BDA0002974684450000101
Figure BDA0002974684450000111
Figure BDA0002974684450000121
Figure BDA0002974684450000131
4.分子伴侣
在某些实施例中，基因工程益生菌肠道细菌表达至少一种选自下组的分子伴侣蛋白：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
在某些实施例中，基因工程益生菌肠道细菌还包含分子伴侣表达盒，其包含编码至少一种分子伴侣蛋白的至少一个核苷酸序列，所述分子伴侣蛋白选自下组：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
分子伴侣蛋白参与了许多重要的生物学过程，如寡聚蛋白复合物的蛋白质折叠和聚集，使蛋白质前体维持在未折叠状态以利于蛋白质跨膜运输，并使变性的蛋白质能够解聚和修复。它主要是协助其它肽维持正常构象，以形成正确的寡聚结构，从而发挥正常的生理功能。各种分子伴侣蛋白是本领域中众所周知的。在一些实施例中，分子伴侣蛋白选自下组：70kDa热休克蛋白(Hsp70)的胞质SSA亚家族中的Ssa1p、Ssa2p、Ssa3p和Ssa4p、BiP、Kar2、Lhs1、Sil1、Sec63、蛋白二硫键异构酶Pdi1p。
5.基因组整合位点
在某些实施例中，外源表达盒整合到基因工程益生菌肠道细菌的基因组中。在某些实施例中，通过CRISPR-Cas基因组编辑系统将外源表达盒整合到基因工程益生菌肠道细菌的基因组中。本文提供的任何合适的宿主细胞都可以被工程化，以使外源表达盒整合到基因组中。可以选择各种基因组整合位点，只要异源基因的表达量达到一定程度，且对底盘益生菌肠道细菌的生化和生理活性没有大的负面影响即可。
在一些实施例中，外源表达盒在选自表2中所列的整合位点处整合在EcN基因组中。在一些实施例中，与EcN基因组中的外源表达盒整合的合适整合位点是kefB。不希望受任何理论束缚，但据信表2中列出的EcN的基因组位点对于插入AcoD的表达盒来说，在以下至少一个特征中是有利的：(1)所述位点的工程所影响的细菌基因不是EcN生长所必需的，并且不改变宿主细菌的生化和生理活性，(2)所述位点可以容易地被编辑，以及(3)所述位点中的AcoD基因盒可以被转录。下表2中显示了用于编辑EcN中相应基因组位点的sgRNA序列。
表2.用于编辑EcN中相应基因组位点的sgRNA序列.
整合位点 sgRNA SEQ ID NO.
agaI/rsmI(～3645kbp) ggcgagttaacgacgacaca 70
araBC(～69kbp) cgttgaactgggtgtggaat 71
cadA(～4822kbp) ctgaaaccgctgcggcgatg 72
cadA(～4822kbp) gttcgcagtggaagtaccgt 73
dapA(～2842kbp) ctgtgcaaacaagtgtctca 74
kefB(～3840kbp) gccggaagacactatgaagc 75
lacZ(～450kbp) tcgcacagcgtgtaccacag 76
maeB(～2819kbp) gaaggggaagaggcgcgcgt 77
malE/K:(～4687kbp) cggtttagttcacagaagcc 78
malP/T(～3908kbp) ttgcgtattttcaaaaagcg 79
rhtB/C:(～4409kbp) tcatcagagtaagtcggata 80
yicS/nepI(～4241kbp) ctgaccaacgcttctttacc 81
adhE(～1467kbp) ccgaagtccctgtgtgcttt 82
galK(～816kbp) ccctgccactcacaccattc 83
glk(～2763kbp) ccttctcctggcaagcttac 84
ldhA(～1586kbp) cgacaagaagtacctgcaac 85
lldD(～4148kbp) gttatcgtgatgcgcattct 86
maeA(～1675kbp) taacacccagcccgatgccc 87
nth(～1800kbp) atattactggaacaacataa 88
pflB(～975kbp) ccgtgacgttatccgcacca 89
rnC(～2939kbp) tatcgccttcatccacacga 90
tkrA(ghrB)(～4090kbp) ccgggctggatgtcttcgaa 91
yieN(ravA)(～2327kbp) gagggtgagccataatgaag 92
yjcS(～4772kbp) ggatatgtggggtaacgacg 93
LPP(～1846kbp) acgttcaggctgctaaagat 94
6.营养缺陷体
在某些实施例中，基因工程益生菌肠道细菌还包含在营养缺陷体相关基因中的至少一个失活或缺失。
为了生成环境友好型细菌，可以通过诱变删除或灭活细菌细胞生存所必需的一些必需基因，使工程细菌成为营养缺陷体。如本文所用，术语“营养缺陷体”是指宿主细胞(例如微生物菌株)的生长需要特定代谢物的外部来源，所述代谢物由于获得性遗传缺陷而不能合成。如本文所用，术语“营养缺陷体相关基因”是指宿主细胞(例如微生物如细菌)生存所需的基因。营养缺陷体相关基因可以是微生物为生存或生长所必需的营养素生产所必需的，或者可以是检测环境中调节转录因子活性的信号所必需的，其中信号的缺失将导致细胞死亡。
在一些实施例中，营养缺陷型修饰旨在使微生物在缺乏生存或生长所必需的外源添加的营养素时死亡，因为它们缺乏生产该必需营养素所必需的基因。在一些实施例中，本文所述的任何基因工程细菌还包含细胞生存和/或生长所需基因的缺失或突变。
细菌中的各种营养缺陷体相关基因是本领域中众所周知的。示例性营养缺陷体相关基因包括但不限于thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、ft>aA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、in/B、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yr/F、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、in/A、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。
在一种修饰中，必需基因thyA缺失或被另一基因替代，使得基因工程细菌依赖于外源胸腺嘧啶生长或生存。在生长培养基中添加胸腺嘧啶或天然具有高胸腺嘧啶水平的人体肠道可以支持thyA营养缺陷型细菌的生长和生存。这种修饰是为了确保基因工程细菌不能在肠道外或缺乏营养缺陷型基因产物的环境中生长和生存。
在一些实施例中，益生菌肠道细菌是针对选自下组的一种或多种物质的营养缺陷体：胸苷、尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤和非天然存在的氨基酸。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸选自下组：l-4,4'-联苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、对碘-l-苯丙氨酸和对叠氮基-l-苯丙氨酸。
在一些实施例中，益生菌肠道细菌包含变构调节的转录因子，其能够检测环境中调节转录因子活性的信号，其中信号的缺失将导致细胞死亡。这样的“信号传导分子-转录因子”对可以包括选自下组的任意一种或多种：色氨酸-TrpR、IPTG-LacI、苯甲酸酯衍生物-XylS、ATc-TetR、半乳糖-GalR、雌二醇-雌激素受体杂合蛋白、纤维二糖-CelR和高丝氨酸内酯-luxR。
重组表达盒
在另一个方面，本公开还提供了一种重组表达盒，其包含编码AcoD的核苷酸序列和一个或多个调控元件，其中所述核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
如本文所用，术语“表达盒”是指能够引导特定核苷酸序列在适当的益生菌肠道细菌中表达的DNA序列，包含可操作地连接于相关核苷酸序列的启动子，所述相关核苷酸序列可操作地连接于终止信号。它还通常包含核苷酸序列适当翻译所需的序列。编码区通常编码所关注的蛋白质，但也可以在反义方向的意义上编码所关注的功能RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含所关注的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着其组件中的至少一个相对于其它组件中的至少一个是异源的。
表达盒适合于在本文提供的益生菌肠道细菌中表达AcoD多肽。表达盒可以作为核酸载体(例如，如上所述的表达载体)的一部分引入。合适的益生菌肠道细菌的载体可以包括质粒。载体可以包括表达盒侧翼的序列，所述序列包括与真核生物基因组序列(如哺乳动物基因组序列)、原核生物基因组序列(如细菌基因组序列)或病毒基因组序列同源的序列。这将允许通过同源重组将表达盒引入真核细胞、原核基因组序列或病毒的基因组中。
如本文所用，术语“重组”是指在体外合成或以其它方式操纵的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”或“重组表达盒”)，指使用重组多核苷酸或重组表达盒在细胞或其它生物系统中产生产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白”)。重组多核苷酸涵盖连接到表达盒或载体中的来自不同来源的核酸分子，以表达例如融合蛋白；或通过诱导性或组成性表达多肽产生的蛋白质(例如，本发明的表达盒或载体可操作地连接于异源多核苷酸，例如AcoD编码序列)。重组表达盒涵盖可操作地连接于一个或多个调节元件的重组多核苷酸。
在一些实施例中，重组表达盒还包含一个或多个选自下组的调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。在一些实施例中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子(例如，厌氧诱导型启动子)。启动子可以是内源启动子或外源启动子。在一些实施例中，启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-49及其具有至少80％序列同一性的同源序列。在一些实施例中，启动子包含SEQ ID NO:10。
在一些实施例中，RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。在一些实施例中，终止子是T7终止子。
III.组合物
在另一个方面，本公开还提供了一种组合物，其包含表达AcoD或其功能等效物的基因工程益生菌肠道细菌和生理学上可接受的载体。所述载体可以是任何相容的、生理学上可接受的、无毒的物质，适合于将本文提供的基因工程益生菌肠道细菌递送到哺乳动物(例如人)的胃肠道(GI)中。在某些实施例中，所述组合物还包含一种或多种生理学上可接受的载体，其选自乳酸发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、脂肪、油、芳香剂、调味剂、蛋白质和糖基化蛋白质、水、胶囊填料和胶状材料。
在某些实施例中，所述组合物是可食用的。在某些实施例中，所述组合物是食品补充剂。在某些实施例中，所述组合物被配制成功能性食品，如饮料、发酵酸奶等。
在某些实施例中，所述组合物是药物组合物。在某些实施例中，所述组合物还可以被配制成药物，呈胶囊、丸剂、液体溶液形式，例如被配制成囊封的冻干细菌等。
在某些实施例中，所述组合物可以是液体形式，例如酏剂、糖浆和悬浮液；或固体形式，例如胶囊、片剂和粉末。
在某些实施例中，所述组合物包含冻干细菌细胞的粉末。冻干细菌细胞可采用冷冻保护剂如乳糖、海藻糖或糖原。
在某些实施例中，基因工程微生物是活细胞。在某些实施例中，所述组合物是成品食品、粉末、颗粒、片剂、胶囊或液体。在某些实施例中，所述组合物包含约0.01至约99.9重量％、约10.01至约89.9重量％、约20.01至约79.9重量％、约30.01至约69.9重量％、约40.01至约69.9重量％或约5.01至约59.9重量％的基因工程微生物。
本文所公开的组合物可以被配制成在单次施用或多次施用中对给定受试者有效。例如，在施用所述组合物的哺乳动物受试者中，单次施用基本上有效地减少目标疾病或病况(例如宿醉、酒精性肝病)的监测症状，或有效地预防目标疾病或病况(例如宿醉、酒精性肝病)的症状，或有效地预防目标疾病或病况的进展。
一般来说，重组细菌的剂量将根据受试者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和既往病史等因素而变化。在一些实施例中，配制组合物，使得单次口服剂量含有至少约1×104CFU的细菌实体和/或真菌实体，并且单次口服剂量通常将含有约1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012或1×1013CFU的细菌实体和/或真菌实体。在一些实施例中，配制组合物，使得单次口服剂量含有不超过约1×1013CFU的细菌实体和/或真菌实体。如果已知，例如给定菌株或所有菌株集合体的细胞浓度是每克组合物(任选为干组合物)或每一施用剂量约例如1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012或1×1013活细菌实体(例如CFU)。在某些实施例中，给定菌株或所有菌株集合体的细胞浓度不超过每克组合物(任选为干组合物)或每一施用剂量1×1013活细菌实体(例如CFU)。
在一些制剂中，组合物含有按质量计至少或至少约0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的本公开的益生菌肠道细菌。在一些制剂中，施用剂量在质量上不超过200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克的本公开的益生菌肠道细菌。
IV.使用方法
i.酒精宿醉
本公开提供了本文提供的基因工程益生菌肠道细菌和/或包含基因工程益生菌肠道细菌的组合物的治疗用途。乙醛是一种高度可溶的分子，可以被动地扩散穿过本文提供的基因工程细菌的细胞膜，充当工程细菌内部表达的AcoD的底物以氧化成乙酸盐。酶的内部定位比从细菌中分泌的酶更有优势，因为分泌的酶将不得不面对肠道腔内的恶劣和多变的环境，例如低pH值、出于防御或营养目的而要降解自由的游离蛋白的敌对细菌和真核细胞、对NAD等酶促辅助因子的激烈竞争，和细胞外蛋白酶，而细菌细胞内表达和起作用的酶可以免受恶劣环境的影响，从而大大提高了清除乙醛的活性和功效。
在一个方面，本公开提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。如本文所用，术语“宿醉”是指一系列不愉快的体征和症状，包括但不限于疲劳和虚弱、过度口渴和口干、头痛和肌肉酸痛、恶心、呕吐或胃痛、睡眠不佳或减少、对光和声音的敏感性增加、头晕或房间旋转感、摇晃、注意力集中能力降低、情绪紊乱(如抑郁、焦虑和易怒)以及心跳加快。宿醉可能是过度饮酒和/或快速饮酒导致乙醛在血液中积累的结果。如本文所用，“过量饮酒”是指饮酒量超出人的酒精耐受量。不同人群的酒精耐受性因人群的遗传条件而不同。例如，东亚人群中常见的乙醛脱氢酶基因的单核苷酸多态性(例如ALDH2变异等位基因)会降低酒精耐受性，甚至导致酒精不耐受，从而导致乙醛在体内积累。
如本文所用，术语“乙醛”是指通过醇脱氢酶氧化酒精而产生的酒精代谢途径中的毒性中间体。乙醛随后可在肝脏中通过乙醛脱氢酶氧化成乙酸盐。乙醛的积累是酒精宿醉的许多影响的原因。在不希望受任何理论束缚的情况下，相信通过引入外源催化活性乙醛脱氢酶来促进乙醛代谢将预防和/或减少酒精宿醉的症状。因此，将本公开的基因工程益生菌肠道细菌或组合物施用到受试者的肠道中，产生具有将乙醛氧化为乙酸盐的催化活性的外源乙醛脱氢酶，可以有效地减少和/或预防宿醉症状。
乙醛也被称为致癌物，其毒性作用已得到充分研究和记录。例如，它破坏上皮屏障并增加肠道上皮层的渗透性(Chaudhry KK等人,《酒精中毒，临床和实验研究》(Alcoholism,clinical and experimental research.)2015；39:1465-75)。肝细胞中乙醛积累增加也可导致肝纤维化，这已被证明与失活的ALDH2有关(Purohit V等人,《肝病学(马里兰州巴尔的摩)》(Hepatology(Baltimore,Md).)2006；43:872-8)。研究表明，ALDH2的过度表达可以减轻酒精诱导的慢性肝脏损伤和细胞凋亡(Guo等人,《临床和实验药理学和生理学》(Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology.)2009；36:463-8.)。因此，本公开还提供了用于降低有需要的受试者体内乙醛水平的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在另一个方面，本公开提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的亚裔脸潮红的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。如本文所用，术语“亚裔脸潮红”是指经常在亚洲人群中观察到的对饮酒的脸部潮红反应。亚裔脸潮红可以是一种防御机制，可以阻止饮酒。然而，在鼓励或挑战人们喝更多的酒的社交活动中，亚裔脸潮红的个体可能无法逃避或拒绝这种狂饮。因此，在社交饮酒不可避免的情况下，需要一种预防和/或治疗亚裔脸潮红的方法。
亚裔脸潮红一般与缺乏一种或多种醇脱氢酶，例如醛脱氢酶有关。在某些实施例中，受试者缺乏一种或多种乙醛脱氢酶。在某些实施例中，受试者缺乏乙醛脱氢酶2(ALDH2)。在某些实施例中，受试者是ALDH2变异等位基因的携带者。如本文所用，术语“ALDH2变异等位基因”可以指包含功能性单核苷酸多态性(SNP)的ALDH2等位基因，例如在外显子12中，其导致E487K取代，即ALDH2*487Lys，也称为ALDH2*2。ALDH2*2编码线粒体ALDH2酶的功能缺陷型，导致ALDH2的催化失活(Agarwal,《病理生物学(巴黎)》(PatholBiol(Paris).)2001年11月；49(9):703-9.；Ramchandani等人,《病理生物学(巴黎)》2001年11月；49(9):676-82.；Vasiliou等人,《药理学》(Pharmacology.)2000年9月；61(3):192-8；Yoshida,《药物遗传学》(Pharmacogenetics.)1992年8月；2(4):139-47)。术语“ALDH2变异等位基因”也可以包含ALDH2*1。由ALDH2*1/*2编码的酶是部分失活的，而由ALDH2*2/*2编码的酶是完全失活的。在某些实施例中，受试者是ALDH2*1/*2的携带者。在某些实施例中，受试者是ALDH2*2/*2的携带者。
可以在酶活性水平和/或遗传水平上检测ALDH2缺乏症。酶活性水平上的ALDH2缺乏症可以通过本领域已知的任何合适的功能测定法来测量。遗传水平上的ALDH2缺乏症可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如但不限于扩增测定法、杂交测定法或测序测定法。
iii.酒精性肝病
酒精代谢主要在肝脏中进行。除了上述对乙醛的解毒作用外，乙醛脱氢酶也被证实参与了肝病的发病机理。虽然ALDH2*2可以保护受试者免于患酒精性肝病(ALD)，因为其相关的亚裔脸潮红极有可能会阻止受试者饮酒，但ALDH2*2等位基因对ALD的这种保护会随着时间的推移而减弱，因为更多的饮酒会增加酒精的耐受性(Higuchi S等人,《柳叶刀》(The Lancet.)1994；343:741-2.)。因此，只要不避免饮酒，携带ALDH2*2等位基因的受试者仍可罹患ALD。
在另一个方面，本公开提供了用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精性肝病(ALD)的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。ALD是一个复杂的过程，包括从脂肪变性到肝硬化的广泛肝脏病变。细胞损伤、炎症、氧化应激、再生和细菌易位是酒精诱导的肝损伤的关键驱动因素。据报道，中国、美国、欧洲和日本ALD的发病率分别为4.5％、6.2％、6％和1.56-2.34％(Xiao J等人,《肝病学杂志》(Journal of hepatology.)019；71:212-21；Fan J-G等人,《胃肠病学和肝病学杂志》(Journal of Gastroenterology and Hepatology.)2013；28:11-7；Rehm J等人,《柳叶刀》2009；373:2223-33；和Szabo G等人,《肝病学(马里兰州巴尔的摩)》2019；69:2271-83.)。在某些实施例中，酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性纤维化或酒精性肝硬化。酒精性脂肪肝是ALD的初始阶段，可发展为伴有炎症的酒精性肝炎。酒精性肝炎可发展为酒精性肝纤维化，其可进一步发展为酒精性肝硬化，再发展为酒精性肝癌。这些病症不仅从脂肪肝到酒精性肝炎到纤维化再到肝硬化依次发展，而且可以一起发生。
在另一个方面，本公开提供了用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性脂肪肝疾病发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在另一个方面，本公开提供了用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性肝炎发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在另一个方面，本公开还提供了一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的非酒精性脂肪肝(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。在某些实施例中，NAFLD是脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化或肝癌。
如本文所用，“非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)”是用于描述在没有过量饮酒的情况下脂肪肝环境的全包术语。据估计，世界总人口中有25％符合NAFLD的诊断标准，NAFLD在男性中更为常见，并随年龄增长而增加。
NAFLD的初始阶段可以基于肝细胞异位脂肪堆积(脂肪变性)等特征来检测。脂肪变性通常是一种良性的、无症状的病况；然而，在同时存在肥胖/代谢紊乱的情况下，脂肪变性可发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其增加了肝纤维化的风险，严重时发展为肝细胞癌(HCC)和肝衰竭。
NASH可以通过如肝细胞气球样变性和炎症的特征在组织学上进行检测。与良性脂肪变性不同，NASH代表了一种重大的健康威胁，在10-28％的患者中会发展为纤维化/肝硬化。在这些患者中，从NASH进一步进展为纤维化/肝硬化高度预示死亡。
研究发现，尽管饮食中缺乏酒精，但患有NAFLD的患者发展为NASH仍与患者体循环和呼吸中酒精水平升高(即内源性酒精或肠道细菌衍生的乙醇)和醇脱氢酶基因的基因转录增加有关(Baker等人,《公共科学图书馆·综合》(PLoS One),第5卷第3期)。这种酒精可能由患者体内的产酒精微生物群(例如埃希氏菌属(Escherichia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia))通过碳水化合物发酵产生，内源性酒精可能通过对肝细胞的直接毒性作用，通过损害肠道屏障功能导致门静脉内毒素血症增加，以及通过上调外周细胞的核因子-κB(NF-κB)信号传导通路，参与NAFLD的发展(Zhu等人,《肝病学》2013年2月；57(2):601-9；Canfora等人,《自然评论内分泌学》(Nat RevEndocrinol.)2019年5月；15(5):261-273；和Yuan等人,2019,《细胞代谢》(CellMetabolism)30,675-688)。
研究还表明，NASH中4-HNE蛋白加合物的显著积累提示了显著的氧化应激和ALDH活性降低。4-HNE是ALDH2活性位点肽的共价修饰，据报道是ALDH2的强效不可逆抑制剂，这表明4-HNE使ALDH2失活可能是NASH的原因(Li等人,《毒理学：毒理学学会官方杂志》(Toxicological sciences:an official journal of the Society of Toxicology.)2018；164:428-38；和Doorn等人,《毒理学化学研究》(Chemical research intoxicology.)2006；19:102-10)。因此，本公开还提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NAFLD发展为NASH的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。在另一个方面，本公开还提供了一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NASH发展为肝纤维化的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。NAFLD/NASH患者可以受益于本公开的基因工程益生菌肠道细菌或组合物，其已被证明能在体外以及体内有效降解乙醛，补偿NASH患者体内失活的ALDH2，从而防止有毒乙醛在体内的积累。
在某些实施例中，受试者的血液乙醇或血清乙醇水平相对于参考水平有所升高。如本文所用，关于血液乙醇或血清乙醇的术语“参考水平”是指允许进行比较的基准水平。参考水平可由本领域技术人员根据所需目的来选择。确定合适的参考水平的手段是本领域技术人员已知的，例如，参考水平可以根据经验、现有知识或从临床研究中收集的数据来确定。例如，血液酒精的参考水平可以是具有相同性别和相当体重的正常健康人的血液酒精水平，并且可选地具有同样相当的其它因素，如身体状况、药物史、饮食、睡眠等。例如，据Zhu等人(《肝病学》,57(2):2013,第601-609页)报道，健康受试者的血清乙醇水平为约25μM，但在NASH患者中为约35μM。在某些实施例中，受试者的血清乙醇水平比参考水平高至少10％、15％、20％、25％或30％。
在某些实施例中，受试者的产醇肠道微生物群的丰度相对于参考水平增加。在某些实施例中，产醇肠道微生物群的丰度增加是指产醇微生物群相对于参考水平或健康人的这种微生物群的量的提升。产醇肠道微生物群的丰度增加也可以指与健康人中的产醇肠道微生物群相比，患者中产醇肠道微生物群产生酒精的能力增强。例如，产醇肠道微生物群可以是一种常见的肠道微生物群，其在异常情况下，例如在NASH患者中比在健康人中产生更多的酒精(无论是由于这种微生物群的量增加还是由于其产生酒精的能力增强)。示例性产醇肠道微生物群包括但不限于肺炎克雷伯氏菌、埃希氏菌属、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)及酵母(Yuan等人,2019,《细胞代谢》30,675-688；Frantz JC等人,《细菌学杂志》(J Bacteriol)1979；137:1263-1270；Zhu等人,《肝病学》2013年2月；57(2):601-9；Amaretti A等人.《应用与环境微生物学》(ApplEnviron Microbiol)2007；73:3637-3644；和Weimer PJ等人,《应用与环境微生物学》1977；33:289-297.)。受试者中产醇肠道微生物群的丰度可以通过例如测定从受试者分离的粪便样本在含有碳水化合物(如果糖或葡萄糖)的合适培养基中厌氧或好氧发酵后产生的酒精浓度来测量(Yuan等人,2019,《细胞代谢》30,675-688)。还可以通过从受试者的粪便样本中分离出基因组DNA，对基因组DNA进行测序(例如16S核糖体RNA焦磷酸测序)，然后对微生物群组成进行鉴定、分类和丰度分析，来测定受试者体内肠道微生物群的丰度(Zhu等人,《肝病学》.2013年2月；57(2):601-9)。为了确定丰度是否增加，可将按上述方法测量的受试者粪便样本产生的酒精浓度或按上述方法测量和分析的受试者微生物群丰度结果与正常受试者进行比较。
在某些实施例中，所述组合物在饮酒之前、期间或之后施用。在某些实施例中，所述组合物在开始饮酒前至多24小时向受试者施用。
宿醉预防可通过在饮酒前(例如，至多在24、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1或0.5小时前的任何时间)向受试者施用本文提供的组合物来实现。宿醉治疗和/或缓解可通过在饮酒期间和/或饮酒后或受试者出现宿醉症状的任何时间施用本文提供的组合物来实现。例如，可以在饮酒后24、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1或0.5小时中的任何时间施用所述组合物。
可以通过以规律的间隔(例如，每天一次、每天两次、每天三次等，持续一定时期)向受试者施用本文提供的组合物来实现酒精性肝病或非酒精性脂肪肝的预防和/或治疗。
ALDH2变异等位基因还被发现与数种其它疾病或病理生理状况相关，包括但不限于胃癌、阿尔茨海默氏症(Alzheimer's)、骨质疏松症、心肌梗塞、高血压、食道癌和头颈癌。因此，本公开还提供了用于预防、治疗和/或减缓上述任何疾病或病理生理状况的发展的方法，其包括向受试者的肠道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精宿醉的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于降低有需要的受试者体内乙醛水平的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或治疗有需要的受试者的亚裔脸潮红的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精性肝病的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性脂肪肝疾病发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性肝炎发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或治疗有需要的受试者的非酒精性脂肪肝(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或减缓有需要的受试者的NAFLD发展为NASH的药物中的用途。
在另一个方面，本公开还提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌肠道细菌或组合物在制造用于预防和/或减缓有需要的受试者的NASH发展为肝纤维化的药物中的用途。
实例
实例1.向导RNA(gRNA)质粒ZL-003_kefB的制备
gRNA质粒ZL-003_kefB的示意图在图1中示出，所述质粒是用本领域中已知的常规方法构建的。简而言之，在目标整合序列的两条链上寻找连同NGG PAM序列一起的20bp序列(N20NGG)，并针对EnN基因组进行blast处理。选择独特的20bp序列作为目标整合位点的sgRNA。选择sgRNA上游和下游的300-500bp序列作为左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA)。将sgRNA序列添加至ZL-003质粒上gRNA支架的反向引物的5'端，然后将gRNA支架与设计的sgRNA序列一起从ZL-003中扩增，将PCR产物和ZL-003质粒都进行消化，将消化后的ZL-003质粒进行去磷酸化处理，然后与消化后的PCR片段进行连接，生成gRNA质粒ZL-003_kefB。
实例2.供体基因盒(kefB_J23119_AcoD、kefB_J23101_AcoD和kefB_J23108_AcoD)的设计
欲整合到EcN基因组中的目标基因，即乙醛脱氢酶基因AcoD，来源于钩虫贪铜菌。AcoD的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出。通过GeneScript(pUC57_AcoD，SEQ ID NO:2)在克隆质粒(例如pUC57)上合成目标基因。从质粒pUC57_AcoD中扩增目标基因，从EcN的基因组中扩增所选整合位点的LHA和RHA。用于这些片段的PCR的引物彼此具有15-20bp的同源序列，因此它们可以通过重叠PCR与LHA和RHA侧翼的目标基因连接。线性PCR产物用作供体基因盒。
具体而言，用于EcN_kefB_J23119_AcoD盒的PCR的引物分别列于下表3。引物1和2用于使用高保真热稳定DNA聚合酶从质粒pUC57-AcoD(由上海桑尼生物科技有限公司合成)扩增AcoD片段。引物3和4用于从实验室合成的质粒ZL-003_kefB_J23119-GFP扩增终止子-kefB RH臂片段。引物5和6用于从实验室合成的质粒ZL-003_kefB_J23119-GFP扩增KefB LH臂-J23119-RBS片段。最后使用引物5和4以AcoD片段、终止子-kefB RH臂片段和KefB LH臂-J23119-RBS片段为模板扩增kefB_J23119-AcoD(SEQ ID NO:7)片段。除了使用不同的启动子外，以相同的方式合成kefB_J23101_AcoD片段和kefB_J23108_AcoD片段。
表3.kefB_J23119-AcoD引物
Figure BDA0002974684450000261
如图2所示，kefB-J23119-AcoD、kefB-J23101-AcoD和kefB-J23108-AcoD片段经确认大小正确(2489bp)，可用于下一步的进一步基因组整合。
SEQ ID NO:1(来自钩虫贪铜菌的AcoD的氨基酸序列)
Figure BDA0002974684450000262
SEQ ID NO:2(pUC57-AcoD质粒)
Figure BDA0002974684450000271
Figure BDA0002974684450000281
SEQ ID NO:111(密码子优化的AcoD)
Figure BDA0002974684450000291
实例3.基因工程EcN的构建
制备电穿孔感受态EcN细胞。将200ng如实例1中所述的gRNA切割质粒ZL-003_kefB和2μg如实例2中所述的用于同源重组的供体RNA片段添加至100μL的电穿孔感受态细胞中。混合后将细胞转移到预先冷却的2mm电穿孔比色皿中，并在表4所列条件下进行电穿孔。转化后，将细胞回收于30℃的900μL SOC培养基中，并在220RPM中培育3小时。此后，将细胞接种于补充有50μg/mL壮观霉素、50ng/mL链霉素和100μg/mL氨苄西林的LB琼脂平板上，并在30℃下培育过夜。
表4电穿孔条件
Figure BDA0002974684450000301
1.PCR验证
从三个板中各挑取8个单菌落：Ec001/kefB::J23119-AcoD、Ec001/kefB::J23101-AcoD和Ec001/kefB::J23108-AcoD，并重悬于30μL LB培养基中进行PCR验证。以1μL细菌悬浮液为模板，使用引物kefB-verify-f：GCAGACGAACATTTCGACTG(SEQ ID NO:101)和kefB-verify-r：ATCGCCATTGAATCCTGTGC(SEQ ID NO:102)进行PCR验证(2×rapid Taq MasterMix)。PCR反应系统在表5中示出。
表5 2×Rapid Taq Master Mix(50μL)的PCR反应系统
Figure BDA0002974684450000302
PCR反应条件列于表6中。
表6 Taq的PCR过程
Figure BDA0002974684450000303
将电泳结果中表现出与目标带一致的菌株的PCR产物进一步送去测序(上海桑尼生物科技有限公司)。从测序结果中选择基因组整合正确的菌株作为基因工程菌株，包括Ec001/kefB::J23119-AcoD(工程细菌1)、Ec001/kefB::J23101-AcoD(工程细菌2)和Ec001/kefB::J23108-AcoD(工程细菌3)。
2.分子伴侣质粒的构建
使用购自宝日医生物技术(北京)有限公司的分子伴侣质粒pKJE7(表达分子伴侣：dnaK、dnaJ和grpE)和pGro-TF2(表达分子伴侣：groES、groEL和tig)进行分子伴侣基因扩增。
使用引物grpE-ter-f：ACTGTAGCGAAAGCAAAAGCTTAATAACGCTGATAGTGCTAGTGTAGATCGC(SEQ ID NO:103)和RBS-dnaK-r：AGGTCGATACCAATTATTTTACCCATTGAGACCTTTCTCCTCTTTCCTCG(SEQ ID NO:104)，以ZL-003_lldD为模板(保存在我们实验室中)，使用高保真DNA聚合酶KOD扩增ZL-003_lldD骨架。同时，使用引物RBS-dnaK-f：GAAAGAGGAGAAAGGTCTCAATGGGTAAAATAATTGGTATCGACCT(SEQ ID NO:105)和grpE-ter-r：CACTAGCACTATCAGCGTTATTAAGCTTTTGCTTTCGCTACAGT(SEQ ID NO:106)，以质粒Pkje7为模板，使用高保真DNA聚合酶KOD扩增dnaK-dnaJ-grpE片段。使用Clon Express Ultra一步克隆试剂盒连接ZL-003_lldD骨架和dnaK-dnaJ-grpE片段，得到整合质粒ZL-003_IldD-J23115-KJE(SEQ ID NO:8)。
使用引物tig-ter-f：CTGATGAACCAGCAGGCGTAATAACGCTGATAGTGCTAGTGTAGATCGC(SEQ ID NO:107)和RBS-groES-r：CGATCATGCAATGGACGAATATTCATTGAGACCTTTCTCCTCTTTCCTC(SEQ ID NO:108)，以ZL-003_tkrA为模板，使用高保真DNA聚合酶KOD扩增ZL-003_tkrA骨架。同时，使用引物RBS-groES-f：GAAAGAGGAGAAAGGTCTCAATGAATATTCGTCCATTGCATGATCG(SEQ ID NO:109)和tig-ter-r：CACTAGCACTATCAGCGTTATTACGCCTGCTGGTTCATCAG(SEQ IDNO:110)，使用KOD DNA聚合酶以质粒pG-TF2为模板扩增groES-groEL-tig片段。使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒连接ZL-003_tkrA骨架和groES-groEL-tig片段，得到整合质粒ZL-003_tkrA-J23115-Gro(SEQ ID NO:9)。
制备119-4(Ec001/kefB::J23119-AcoD-4)感受态细胞，然后分别用质粒ZL-003_IldD-J23115-KJE和ZL-003_tkrA-J23115-Gro进行转化。经过PCR验证和测序后，获得了目标菌株119-4/IldD::J23115-KJE和119-4/tkrA::J23115-Gro。
本发明所用质粒和菌株分别列于表7和表8中。
表7本研究中使用的质粒和DNA片段
Figure BDA0002974684450000321
表8本研究中使用的菌株
Figure BDA0002974684450000322
图3B显示，工程细菌1中AcoD基因的转录水平是工程细菌2的三倍，是工程细菌3的六倍。结合图3A所示结果，表明工程细菌1中的启动子J23119在本发明中是优选的。
SEQ ID NO:3(
Figure BDA0002974684450000323
-RBS)
Figure BDA0002974684450000324
SEQ ID NO:4(
Figure BDA0002974684450000325
-RBS)
Figure BDA0002974684450000326
SEQ ID NO:5(
Figure BDA0002974684450000327
-RBS)
Figure BDA0002974684450000331
SEQ ID NO:6(ZL-003_kefB质粒：
Figure BDA0002974684450000332
-
Figure BDA0002974684450000333
-RBS-
Figure BDA0002974684450000334
)
Figure BDA0002974684450000335
Figure BDA0002974684450000341
SEQ ID NO:7(kefB-J23119-AcoD质粒：
Figure BDA0002974684450000342
-
Figure BDA0002974684450000343
-RBS-AcoD-终止子-
Figure BDA0002974684450000344
)
Figure BDA0002974684450000351
Figure BDA0002974684450000361
SEQ ID NO:8(ZL-003_IldD-J23115-KJE质粒：
Figure BDA0002974684450000362
-
Figure BDA0002974684450000363
-RBS-KJE-
Figure BDA0002974684450000364
-IldD-gRNA)
Figure BDA0002974684450000365
Figure BDA0002974684450000371
Figure BDA0002974684450000381
Figure BDA0002974684450000391
SEQ ID NO:9(ZL-003_tkrA-J23115-Gro质粒：
Figure BDA0002974684450000392
-
Figure BDA0002974684450000393
-RBS-Gro-
Figure BDA0002974684450000394
Figure BDA0002974684450000395
-tkrA-gRNA)
Figure BDA0002974684450000401
Figure BDA0002974684450000411
Figure BDA0002974684450000421
实例4.对工程细菌菌株的乙醛代谢活性的检测
1.对工程细菌菌株的乙醛耐受性的检测
从对照细菌和工程细菌1中挑取单菌落，分别接种于含有0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM乙醛的LB琼脂平板上，并在37℃下生长过夜。结果表明，即使在15mM的乙醛浓度下，对照细菌和工程细菌1也可以正常生长(图3)。
2.在体外对工程细菌菌株的乙醛代谢活性的检测
1)工程细菌反应样品的制备
(1)取一定量的2OD600细菌或6OD600细菌在室温下离心，重悬于1500μL 10mM乙醛(用无菌水制备)中并在37℃下反应1小时。
(2)离心后收获100μl上清液，并用900μL无菌水稀释10倍以进一步检测。
2)标准样品的制备：
(1)将2M乙醛用无菌水稀释至10mM，以与工程细菌培养基反应。
(2)将2M乙醛用无菌水稀释至1mM、0.5mM和0.25mM，以供我们作为HPLC标准品。
3)乙醛衍生
(1)衍生试剂的制备：将25ml的10％盐酸(23ml 35％HCl+77ml H2O)添加至12mg的2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH，生工生物工程(上海)股份有限公司，分析试剂)中，并通过超声溶解，得到衍生试剂。
(2)衍生反应：在1.5mL EP管中，加入900μl超纯水、300μl工程细菌反应样品或标准溶液，然后加入300μl按上述方法制备的2,4-二硝基苯肼溶液。充分混合后，接着将该管在60℃下培育60分钟。在冰上冷却后，在HPLC检测前立即应用0.22μm水系统滤膜过滤。
(3)HPLC检测：将20μL样品在Athena C18 HPLC柱(上海安谱实验科技股份有限公司，4.6×250mm，5μm)上进行HPLC检测。样品以1.0mL·min-1运行，其中流动相为H2O:乙腈(40:60)，柱温为40℃。在360nm的检测波长下检测样品。
(4)检测结果：图4A显示，与初始乙醛含量为10mM相比，与2OD600对照细菌反应后的剩余乙醛为9.82mM；与2OD600细菌1、细菌2和细菌3反应后的剩余乙醛分别为2.82mM、4.32mM和5.54mM。这表明启动子的强度会影响醛脱氢酶的活性。一般认为，较强的启动子更可能对细菌菌株的生长产生负面影响。然而，本公开的发明人却预想不到地发现，包含最强启动子J23119的细菌菌株和包含相对较弱的启动子J23101的细菌菌株都可以良好生长，并且可以耐受浓度高达15mM的乙醛(图3A)。本公开的发明人还令人惊讶地发现，选择EcN作为底盘细菌比其他细菌菌株，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有优势。图4A显示，6OD600的本发明的工程细菌(EcN)在用10mM乙醛培育0.5小时后，可以消耗约70％的乙醛，这比如ZBiotics等人，US2019076489A1中所示的工程枯草芽孢杆菌的乙醛降解效率高得多(其用相同量的细菌和培育相同的时间，只降解了约40％的乙醛)。
图6显示，在乙醛起始浓度为10mM的情况下，过量表达分子伴侣：groES-groEL-tig的工程细菌，即工程细菌1/Gro消耗5.19mM乙醛，过量表达dnaK-dnaJ-grpE的工程细菌，即工程细菌1/KJE消耗4.99mM乙醛，而工程细菌1消耗4.37mM乙醛。这些数据表明，过度表达分子伴侣可以有效促进乙醛脱氢酶的催化活性。
3.在体内对工程细菌菌株的乙醛代谢活性的检测
动物实验委托澎立生物医药技术(上海)有限公司进行。将8-9周龄的雄性SD大鼠随机分为两组，每组6只大鼠。每组进行500μL(5×1011CFU)对照细菌或工程细菌1的胃内施用。3小时后，每只大鼠以2g/kg体重的剂量口服乙醇(使用制备的60％酒精(V/10))。在口服乙醇后0、1、2.5和5小时，从颈静脉取血并收集其中的血清。
1)乙醇/乙醛标准品的制备：采集同龄非实验SD大鼠血清样品，向其中添加一定浓度的乙醇和乙醛(三种标准品分别含有40μm乙醇和4μm乙醛、20μm乙醇和2μm乙醛、以及10μm乙醇和1μm乙醛)。
2)血清中酒精和乙醛含量的检测(顶空气相色谱法)
(1)检测条件：在FID检测器中，当样品注入器和检测器加热至140℃，柱烘箱由35℃逐渐加热至70℃，并且载气(N2)、H2和空气的流速分别为20、50和500Ml/min时，对0.2ml顶空样品进行检测。
(2)样品分析：将如上所述制备的100μl实验动物血清样品或100μl乙醇/乙醛标准品加入相应的顶空瓶中，然后在70℃的培育箱中培育20分钟，提取0.2ml顶空气体并注入色谱仪进行分析。
(3)检测结果：图5显示，用乙醇喂养后一小时，用工程细菌喂养的大鼠体内剩余乙醇含量和乙醛含量不到用对照细菌喂养的大鼠的一半。趋势线表明，用工程细菌喂养的大鼠体内乙醇和乙醛的代谢速率明显快于用对照细菌喂养的大鼠。
乙醇含量的变化：用乙醇喂养后1小时，对照细菌组和工程细菌组血液中的乙醇含量分别为53.65±17.88μM和20.76±8.39μM。用乙醇喂养后2.5小时，上述各组血液中的乙醇含量分别为25.86±17.19μM和18.03±5.01μM。5小时后，两组血液中的酒精含量恢复到正常水平。
乙醛含量的变化：用乙醇喂养后1小时，对照细菌组和工程细菌组血液中的乙醛含量分别为8.12±1.20μM和4.23±1.39μM。用乙醇喂养后2.5小时，上述各组血液中的乙醛含量分别为3.34±0.19μM和2.12±0.81μM。5小时后，两组血液中的乙醛恢复到正常水平。
序列表
<110> 和度生物医药（上海）有限公司
<120> 用于预防和/或治疗宿醉和肝病的基因工程细菌
<130> 079065-8003CN01
<150> PCT/CN2021/076102
<151> 2021-02-08
<160> 111
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 506
<212> PRT
<213> 钩虫贪铜菌
<400> 1
Met Asn Met Ala Glu Ile Ala Gln Leu Gly Val Ser Asn Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Gln Gln Tyr Glu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Trp Val Pro Pro Ala Gly
20 25 30
Gly Glu Tyr Phe Glu Ser Thr Thr Pro Ile Thr Gly Lys Pro Phe Thr
35 40 45
Arg Val Pro Arg Ser Gly Gln Gln Asp Val Asp Ala Ala Leu Asp Ala
50 55 60
Ala His Ala Ala Lys Ala Ala Trp Ala Arg Thr Ser Thr Thr Glu Arg
65 70 75 80
Ala Asn Ile Leu Asn Arg Ile Ala Asp Arg Ile Glu Ala Asn Leu Lys
85 90 95
Leu Leu Ala Val Ala Glu Ser Ile Asp Asn Gly Lys Pro Val Arg Glu
100 105 110
Thr Thr Ala Ala Asp Leu Pro Leu Ala Val Asp His Phe Arg Tyr Phe
115 120 125
Ala Gly Cys Ile Arg Ala Gln Glu Gly Gly Ile Ser Glu Ile Asp Ala
130 135 140
Asp Thr Ile Ala Tyr His Phe His Glu Pro Leu Gly Val Val Gly Gln
145 150 155 160
Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Leu Ala
165 170 175
Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Cys Val Val Leu Lys Pro Ala Glu Gln
180 185 190
Thr Pro Ala Ser Ile Leu Val Leu Met Glu Val Ile Gly Asp Leu Leu
195 200 205
Pro Pro Gly Val Val Asn Val Ile Asn Gly Phe Gly Leu Glu Ala Gly
210 215 220
Lys Pro Leu Ala Ser Ser Pro Arg Ile Ser Lys Val Ala Phe Thr Gly
225 230 235 240
Glu Thr Thr Thr Gly Arg Leu Ile Met Gln Tyr Ala Ser Gln Asn Leu
245 250 255
Ile Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile Phe Phe
260 265 270
Glu Asp Val Leu Ala Ala Asp Asp Ala Phe Phe Asp Lys Ala Leu Glu
275 280 285
Gly Phe Ala Met Phe Ala Leu Asn Gln Gly Glu Val Cys Thr Cys Pro
290 295 300
Ser Arg Ala Leu Ile Gln Glu Ser Ile Tyr Asp Arg Phe Met Glu Arg
305 310 315 320
Ala Leu Lys Arg Val Ala Ala Ile Arg Gln Gly His Pro Leu Asp Thr
325 330 335
Gly Thr Met Ile Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Gln Leu Glu Lys Ile
340 345 350
Leu Ser Tyr Ile Asp Leu Gly Arg Lys Glu Gly Ala Gln Cys Leu Thr
355 360 365
Gly Gly Glu Arg Asn Val Leu Asp Gly Asp Leu Ala Gly Gly Tyr Tyr
370 375 380
Val Lys Pro Thr Val Phe Ala Gly His Asn Lys Met Arg Ile Phe Gln
385 390 395 400
Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Ser Val Thr Thr Phe Lys Asp Glu
405 410 415
Glu Glu Ala Leu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Leu Tyr Gly Leu Gly Ala
420 425 430
Gly Val Trp Thr Arg Asp Gly Ala Arg Ala Phe Arg Met Gly Arg Gly
435 440 445
Ile Gln Ala Gly Arg Val Trp Thr Asn Cys Tyr His Ala Tyr Pro Ala
450 455 460
His Ala Ala Phe Gly Gly Tyr Lys Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu Asn
465 470 475 480
His Arg Met Met Leu Asp His Tyr Gln Gln Thr Lys Asn Leu Leu Val
485 490 495
Ser Tyr Ser Pro Asn Ala Leu Gly Phe Phe
500 505
<210> 2
<211> 4228
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatgaatatg gcagaaattg cccagctggg tgtgagtaat ccgtataaac 480
agcagtatga aaattatatt ggtggtgcat gggttccgcc agctggcggt gaatattttg 540
aatcaaccac cccgattacc ggcaaaccgt ttacccgtgt tccgcgtagc ggtcagcagg 600
atgtggatgc cgcactggat gcagcacatg cagccaaagc cgcatgggca cgtacctcta 660
ccaccgaacg tgccaatatt ctgaatcgca ttgccgatcg cattgaagcc aatctgaaac 720
tgctggcagt tgccgaatct attgataatg gtaaaccggt tcgtgaaacc accgccgccg 780
atctgccgtt agcagtggat cattttcgct attttgcagg ttgtattcgc gcccaggaag 840
gcggcattag cgaaattgat gcagatacca ttgcatatca ttttcatgaa ccgttaggcg 900
ttgtgggcca gattattccg tggaattttc cgctgttaat ggcaacctgg aaactggccc 960
cggccttagc agcaggtaat tgtgttgtgc tgaaacccgc cgaacagacc ccggcctcaa 1020
ttctggtgtt aatggaagtg attggcgatt tactgccgcc gggcgttgtt aatgtgatta 1080
atggctttgg cttagaagca ggtaaaccgc tggcaagctc tccgcgcatt tctaaagttg 1140
cctttaccgg cgaaaccacc accggtcgtc tgattatgca gtatgcaagt cagaatctga 1200
ttccggtgac cttagaactg ggtggtaaaa gtccgaatat tttttttgaa gatgtgctgg 1260
ccgccgatga tgcctttttt gataaagccc tggaaggctt tgccatgttt gcactgaatc 1320
agggcgaagt ttgtacctgt ccgtcacgcg cactgattca ggaatcaatt tatgatcgct 1380
ttatggaacg cgccttaaaa cgggttgcag caattcgtca gggccatccg ttagataccg 1440
gtaccatgat tggcgcacag gcctctgccg aacagttaga aaaaattctg agctatattg 1500
atctgggtcg caaagaaggc gcccagtgtc tgaccggcgg tgaacgtaat gtgctggatg 1560
gcgatttagc cggtggctat tatgttaaac cgaccgtgtt tgcaggtcat aataaaatgc 1620
gcatttttca ggaagaaatt tttggtccgg ttgtgagcgt gaccaccttt aaagatgaag 1680
aagaagcctt agccattgcc aatgataccc tgtatggttt aggtgcaggc gtgtggaccc 1740
gcgatggtgc acgcgccttt cgtatgggtc gtggtattca ggcaggtcgc gtttggacca 1800
attgttatca tgcctatccg gcacatgcag cctttggcgg ctataaacag agcggtattg 1860
gtcgcgaaaa tcatcgtatg atgttagatc attatcagca gaccaaaaat ctgttagtgt 1920
cttatagtcc gaatgccctg ggcttttttt aaggatcccg ggcccgtcga ctgcagaggc 1980
ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 2040
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 2100
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 2160
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 2220
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 2280
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2340
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2400
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2460
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2520
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2580
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2640
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2700
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2760
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2820
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2880
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2940
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3000
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3060
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 3120
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 3180
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3240
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3300
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 3360
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 3420
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 3480
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 3540
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 3600
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 3660
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 3720
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 3780
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 3840
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 3900
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 3960
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 4020
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 4080
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 4140
ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 4200
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 4228
<210> 3
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
ctagagtctc gagttgacag ctagctcagt cctaggtata atgctagcct cgaggaaaga 60
ggagaaag 68
<210> 4
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
ctagagtctc gagtttacag ctagctcagt cctaggtatt atgctagcct cgaggaaaga 60
ggagaaag 68
<210> 5
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
ctagagtctc gagctgacag ctagctcagt cctaggtata atgctagcct cgaggaaaga 60
ggagaaag 68
<210> 6
<211> 3958
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc 60
acgaggcaga atttcagata aaaaaaatcc ttagctttcg ctaaggatga tttctggaat 120
tcgcggccgc atttgtttat ggatgcgctg gggttgtcga tggcgctcgg tacgtttatt 180
gcgggtgtgc tactggcgga aagtgaatat cgccatgaac tggaaacggc tatcgatccc 240
ttcaaaggct tgctgctcgg tttgttcttt atctctgtcg gcatgtcgct caacctcggg 300
gtgctttata cccatctgtt gtgggtagtg ataagtgtgg ttgtgctggt ggcggtgaaa 360
attctcgtgc tgtatctgct ggcgcgattg tatggcgtgc gcagttctga gcggatgcag 420
tttgctggcg tgttgagtca gggcggtgag tttgcctttg tcctcttttc taccgcttct 480
tcacaacgct tattccaggg cgaccagatt ctagagtctc gagttgacag ctagctcagt 540
cctaggtata atgctagcct cgaggaaaga ggagaaaggt ctcaatgcgt aaaggcgaag 600
agctgttcac tggtgtcgtc cctattctgg tggaactgga tggtgatgtc aacggtcata 660
agttttccgt gcgtggcgag ggtgaaggtg acgcaactaa tggtaaactg acgctgaagt 720
tcatctgtac tactggtaaa ctgccggtac cttggccgac tctggtaacg acgctgactt 780
atggtgttca gtgctttgct cgttatccgg accatatgaa gcagcatgac ttcttcaagt 840
ccgccatgcc ggaaggctat gtgcaggaac gcacgatttc ctttaaggat gacggcacgt 900
acaaaacgcg tgcggaagtg aaatttgaag gcgataccct ggtaaaccgc attgagctga 960
aaggcattga ctttaaagaa gacggcaata tcctgggcca taagctggaa tacaatttta 1020
acagccacaa tgtttacatc accgccgata aacaaaaaaa tggcattaaa gcgaatttta 1080
aaattcgcca caacgtggag gatggcagcg tgcagctggc tgatcactac cagcaaaaca 1140
ctccaatcgg tgatggtcct gttctgctgc cagacaatca ctatctgagc acgcaaagcg 1200
ttctgtctaa agatccgaac gagaaacgcg atcatatggt tctgctggag ttcgtaaccg 1260
cagcgggcat cgcgcatggt atggatgaac tgtacagatg ataacgctga tagtgctagt 1320
gtagatcgct actagagcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 1380
ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac tagagtcaca ctggctcacc 1440
ttcgggtggg cctttctgcg tttatatact agaagcggcc gctgcagttg catattcttg 1500
cgcgagcgcg cggacgtgtg gaagcgcatg agttattaca ggcaggggtg acgcagtttt 1560
cccgtgaaac attctccagt gcgttagagc tggggcgcaa gacgctggtc acgcttggca 1620
tgcatccgca tcaggcgcag cgcgcgcaac tgcattttcg ccgcctggat atgcgaatgc 1680
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gacgtgaact ggaagagatt ttccagcgtg aaatgcaaca agaacgacgc cagctggacg 1800
gctgggatga atttgagttg caggaattca aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc 1860
aagttgataa cggactagcc ttattttaac ttgctatttc tagctctaaa acgcttcata 1920
gtgtcttccg gcactagtat tatacctagg actgagctag ctgtcaagga tccagcatat 1980
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 2040
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2100
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2160
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2220
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2280
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2340
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2400
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2460
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2520
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2580
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2640
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2700
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2760
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2820
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 2880
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2940
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3000
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3060
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgtgaccc 3120
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3180
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3240
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3300
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3360
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
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gccacaaagc tggcgaagag ttcaccatcg acgtgacctt cccggaagaa taccacgcag 3420
aaaacctgaa aggtaaagca gcgaaattcg ctatcaacct gaagaaagtt gaagagcgtg 3480
aactgccgga actgactgca gaattcatca aacgtttcgg cgttgaagat ggttccgtag 3540
aaggtctgcg cgctgaagtg cgtaaaaaca tggagcgcga gctgaagagc gccatccgta 3600
accgcgttaa gtctcaggcg atcgaaggtc tggtaaaagc taacgacatc gacgtaccgg 3660
ctgcgctgat cgacagcgaa atcgacgttc tgcgtcgcca ggctgcacag cgtttcggtg 3720
gcaacgaaaa acaagctctg gaactgccgc gcgaactgtt cgaagaacag gctaaacgcc 3780
gcgtagttgt tggcctgctg ctgggcgaag ttatccgcac caacgagctg aaagctgacg 3840
aagagcgcgt gaaaggcctg atcgaagaga tggcttctgc gtacgaagat ccgaaagaag 3900
ttatcgagtt ctacagcaaa aacaaagaac tgatggacaa catgcgcaat gttgctctgg 3960
aagaacaggc tgttgaagct gtactggcga aagcgaaagt gactgaaaaa gaaaccactt 4020
tcaacgagct gatgaaccag caggcgtaat aacgctgata gtgctagtgt agatcgctac 4080
tagagccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 4140
ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc 4200
tttctgcgtt tatatactag aagcggccgc tgcagtcgaa caagagccac tgtccgtaga 4260
ttcgccgttg ctctcaatgg ccaacgtcgt cgcagtaccg catattggat ctgccactca 4320
tgagacgcgt tatggcatgg ccgcctgtgc cgtggataat ttgattgatg cgttacaagg 4380
aaaggttgag aagaactgtg tgaatccgca cgtcgcggac taagccgcga ctgcgtggag 4440
taaagcccga taatcgctcg ggcttttact ctttattggg ttgcagtaac tgctgtagtc 4500
caggcctgat taaacgcctg atgttgtgcc ggtaatggcg caatcagttt gttatattca 4560
cttgcctgct gtgaagtcgg gaacttgcag gaattcaaaa aaagcaccga ctcggtgcca 4620
ctttttcaag ttgataacgg actagcctta ttttaacttg ctatttctag ctctaaaacc 4680
cgggctggat gtcttcgaaa ctagtattat acctaggact gagctagctg tcaaggatcc 4740
agcatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 4800
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 4860
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 4920
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 4980
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 5040
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 5100
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 5160
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 5220
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 5280
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 5340
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 5400
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 5460
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 5520
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 5580
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 5640
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 5700
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 5760
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 5820
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 5880
gtgacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 5940
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 6000
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 6060
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 6120
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 6180
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 6240
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 6300
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 6360
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 6420
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 6480
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 6540
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 6600
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 6660
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 6720
aagtg 6725
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<212> DNA
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tttacagcta gctcagtcct aggtattatg ctagc 35
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<212> DNA
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ttgacagcta gctcagtcct aggtactgtg ctagc 35
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ctgatagcta gctcagtcct agggattatg ctagc 35
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tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagc 35
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tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagc 35
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aaagtgtttt gtaatcataa agaaatatta aggtggggta ggaatagtat aatatgttta 60
ttcaaccgaa cttaatg 77
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<223> 合成的
<400> 19
gtaaatttag gattaatcct ggaacttttt ttgtcgccca gccaatgctt tcagtcgtga 60
ctaattttcc ttgcggaggc ttgtctgaag cggtttccgc gattttcttc tgtaaattgt 120
cgctgacaaa aaagattaaa cgtaccttat acaagacttt tttttcatat gcctgacgga 180
gttcacactt gtaagttttc aactacgttg tagactttac atcgccaggg gtgctcggca 240
taagccgaag atatcggtag agttaatatt gagcagatcc ccggtgaagg atttaaccgt 300
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ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta tcactcatta ggcaccccag 120
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taattcctaa tttttgttga cactctatcg ttgatagagt tattttacca ctccctatca 60
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<212> DNA
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tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagatactga gcacatcagc 60
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cgc 63
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gaattagcga aaagagtttc tggtaaaaca aaccgaaaac ttgtagcaac aatgttgtct 120
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ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact 120
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cgagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata aaacgaaaga 60
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ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatactagaa gcggccgctg cag 173
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<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
gttcgcagtg gaagtaccgt 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
ctgtgcaaac aagtgtctca 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 75
gccggaagac actatgaagc 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 76
tcgcacagcg tgtaccacag 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
gaaggggaag aggcgcgcgt 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 78
cggtttagtt cacagaagcc 20
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<213> 人工序列
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ttgcgtattt tcaaaaagcg 20
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tcatcagagt aagtcggata 20
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ctgaccaacg cttctttacc 20
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ccgaagtccc tgtgtgcttt 20
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ccctgccact cacaccattc 20
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ccttctcctg gcaagcttac 20
<210> 85
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<213> 人工序列
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<400> 85
cgacaagaag tacctgcaac 20
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<213> 人工序列
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<400> 86
gttatcgtga tgcgcattct 20
<210> 87
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taacacccag cccgatgccc 20
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<400> 88
atattactgg aacaacataa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgtgacgtt atccgcacca 20
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<213> 人工序列
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tatcgccttc atccacacga 20
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<213> 人工序列
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ccgggctgga tgtcttcgaa 20
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<213> 人工序列
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gagggtgagc cataatgaag 20
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<213> 人工序列
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ggatatgtgg ggtaacgacg 20
<210> 94
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acgttcaggc tgctaaagat 20
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<213> 人工序列
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cgaggaaaga ggagaaagaa gcttatgaat atggcagaaa ttgcccag 48
<210> 96
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 96
atctacacta gcactatcga gctcttaaaa aaagcccagg gcattcgg 48
<210> 97
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
ccgaatgccc tgggcttttt ttaagagctc gatagtgcta gtgtagat 48
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 98
actcaaattc atcccagccg tccagctg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgtttatgg atgcgctggg gttgtcgatg g 31
<210> 100
<211> 48
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<213> 人工序列
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<400> 100
ctgggcaatt tctgccatat tcataagctt ctttctcctc tttcctcg 48
<210> 101
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<213> 人工序列
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<400> 101
gcagacgaac atttcgactg 20
<210> 102
<211> 20
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<400> 102
atcgccattg aatcctgtgc 20
<210> 103
<211> 52
<212> DNA
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<400> 103
actgtagcga aagcaaaagc ttaataacgc tgatagtgct agtgtagatc gc 52
<210> 104
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 104
aggtcgatac caattatttt acccattgag acctttctcc tctttcctcg 50
<210> 105
<211> 46
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<213> 人工序列
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<400> 105
gaaagaggag aaaggtctca atgggtaaaa taattggtat cgacct 46
<210> 106
<211> 44
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<213> 人工序列
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<400> 106
cactagcact atcagcgtta ttaagctttt gctttcgcta cagt 44
<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 107
ctgatgaacc agcaggcgta ataacgctga tagtgctagt gtagatcgc 49
<210> 108
<211> 49
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<213> 人工序列
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cgatcatgca atggacgaat attcattgag acctttctcc tctttcctc 49
<210> 109
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 109
gaaagaggag aaaggtctca atgaatattc gtccattgca tgatcg 46
<210> 110
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 110
cactagcact atcagcgtta ttacgcctgc tggttcatca g 41
<210> 111
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
atgaatatgg cagaaattgc ccagctgggt gtgagtaatc cgtataaaca gcagtatgaa 60
aattatattg gtggtgcatg ggttccgcca gctggcggtg aatattttga atcaaccacc 120
ccgattaccg gcaaaccgtt tacccgtgtt ccgcgtagcg gtcagcagga tgtggatgcc 180
gcactggatg cagcacatgc agccaaagcc gcatgggcac gtacctctac caccgaacgt 240
gccaatattc tgaatcgcat tgccgatcgc attgaagcca atctgaaact gctggcagtt 300
gccgaatcta ttgataatgg taaaccggtt cgtgaaacca ccgccgccga tctgccgtta 360
gcagtggatc attttcgcta ttttgcaggt tgtattcgcg cccaggaagg cggcattagc 420
gaaattgatg cagataccat tgcatatcat tttcatgaac cgttaggcgt tgtgggccag 480
attattccgt ggaattttcc gctgttaatg gcaacctgga aactggcccc ggccttagca 540
gcaggtaatt gtgttgtgct gaaacccgcc gaacagaccc cggcctcaat tctggtgtta 600
atggaagtga ttggcgattt actgccgccg ggcgttgtta atgtgattaa tggctttggc 660
ttagaagcag gtaaaccgct ggcaagctct ccgcgcattt ctaaagttgc ctttaccggc 720
gaaaccacca ccggtcgtct gattatgcag tatgcaagtc agaatctgat tccggtgacc 780
ttagaactgg gtggtaaaag tccgaatatt ttttttgaag atgtgctggc cgccgatgat 840
gccttttttg ataaagccct ggaaggcttt gccatgtttg cactgaatca gggcgaagtt 900
tgtacctgtc cgtcacgcgc actgattcag gaatcaattt atgatcgctt tatggaacgc 960
gccttaaaac gggttgcagc aattcgtcag ggccatccgt tagataccgg taccatgatt 1020
ggcgcacagg cctctgccga acagttagaa aaaattctga gctatattga tctgggtcgc 1080
aaagaaggcg cccagtgtct gaccggcggt gaacgtaatg tgctggatgg cgatttagcc 1140
ggtggctatt atgttaaacc gaccgtgttt gcaggtcata ataaaatgcg catttttcag 1200
gaagaaattt ttggtccggt tgtgagcgtg accaccttta aagatgaaga agaagcctta 1260
gccattgcca atgataccct gtatggttta ggtgcaggcg tgtggacccg cgatggtgca 1320
cgcgcctttc gtatgggtcg tggtattcag gcaggtcgcg tttggaccaa ttgttatcat 1380
gcctatccgg cacatgcagc ctttggcggc tataaacaga gcggtattgg tcgcgaaaat 1440
catcgtatga tgttagatca ttatcagcag accaaaaatc tgttagtgtc ttatagtccg 1500
aatgccctgg gcttttttta a 1521

Claims (50)

1.一种基因工程益生菌肠道细菌，其包含外源表达盒，所述外源表达盒包含编码乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述益生菌肠道细菌是大肠杆菌菌株Nissle 1917(EcN)。
2.根据权利要求1所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述乙醛脱氢酶是来自钩虫贪铜菌的天然存在的AcoD或其功能等效物。
3.根据权利要求2所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述功能等效物至少保留氧化醛类的部分活性。
4.根据权利要求2或3所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述功能等效物包含所述天然存在的AcoD的突变体、片段、融合物、衍生物或其任何组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述乙醛脱氢酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或其具有至少80％序列同一性但仍保留氧化醛类的基本活性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中编码所述乙醛脱氢酶的所述核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行密码子优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述表达盒还包含一个或多个调控元件，所述调控元件包含选自下组的一个或多个元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。
8.根据权利要求7所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
9.根据权利要求8所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述启动子是内源启动子或外源启动子。
10.根据权利要求8所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述组成型启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-49及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
11.根据权利要求10所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述组成型启动子包含SEQID NO:10。
12.根据权利要求8所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述诱导型启动子包含厌氧诱导型启动子，任选地为SEQ ID NO:53的核苷酸序列。
13.根据权利要求7所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
14.根据权利要求7所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述终止子是T7终止子。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述外源表达盒整合在所述基因工程益生菌肠道细菌的基因组中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其表达至少一种选自下组的分子伴侣蛋白：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其还包含在营养缺陷体相关基因中的至少一个失活或缺失。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，其中所述益生菌肠道细菌是针对选自下组的一种或多种物质的营养缺陷体：胸苷、尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤和非天然存在的氨基酸。
19.一种重组表达盒，其包含编码AcoD的核苷酸序列和一个或多个调控元件，其中所述核苷酸序列已针对在EcN中的表达进行优化，并且任选地，密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO:111的序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。
20.根据权利要求19所述的重组表达盒，其还包含一个或多个选自下组的调控元件：启动子、核糖体结合位点(RBS)、终止子及其任意组合。
21.根据权利要求20所述的重组表达盒，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子(例如，厌氧诱导型启动子)。
22.根据权利要求21所述的重组表达盒，其中所述启动子是内源启动子或外源启动子。
23.根据权利要求22所述的重组表达盒，其中所述启动子包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:10-53及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
24.根据权利要求23所述的重组表达盒，其中所述启动子包含SEQ ID NO:10。
25.根据权利要求20所述的重组表达盒，其中所述RBS包含选自下组的核苷酸序列：SEQID NO:65-67及其具有至少80％序列同一性的同源序列。
26.根据权利要求20所述的重组表达盒，其中所述终止子是T7终止子。
27.一种组合物，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌，和生理学上可接受的载体。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述组合物是可食用的。
29.根据权利要求27或28所述的组合物，其中所述组合物是食品补充剂。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种生理学上可接受的载体，其选自乳酸发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、脂肪、油、芳香剂、调味剂、蛋白质和糖基化蛋白质、水、胶囊填料和胶状材料。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述基因工程益生菌肠道细菌是活细胞。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物是成品食品、粉末、颗粒、片剂、胶囊或液体。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.01至约99.9重量％的基因工程微生物。
34.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
35.一种用于降低有需要的受试者体内乙醛水平的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
36.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的亚裔脸潮红的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33所述的组合物。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述受试者缺乏一种或多种醇脱氢酶。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者缺乏一种或多种醛脱氢酶。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述组合物在饮酒之前、期间或之后施用。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其包括在开始饮酒前至多24小时向所述受试者施用所述组合物。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述受试者是ALDH2变异等位基因的携带者。
42.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的酒精性肝病的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎或酒精性肝硬化。
44.一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性脂肪肝疾病发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
45.一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的酒精性肝炎发展为酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
46.一种用于预防和/或治疗有需要的受试者的非酒精性脂肪肝(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
47.一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NAFLD发展为NASH的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
48.一种用于预防和/或减缓有需要的受试者的NASH发展为肝纤维化的方法，其包括向所述受试者的肠道施用有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的基因工程益生菌肠道细菌或根据权利要求27至33中任一项所述的组合物。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述受试者具有升高的血液乙醇水平。
50.根据权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述受试者具有增加的产酒精肠道微生物群的丰度。
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