TW202241475A - 用於預防和／或治療宿醉和肝病的基因改造細菌 - Google Patents

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王彦寧
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Abstract

本揭露內容提供了一種基因工程益生菌及其用途，所述基因工程益生菌包含外源表達盒，所述外源表達盒包含編碼乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述益生菌腸道細菌是大腸桿菌菌株 Nissle 1917 (EcN)。

Description

用於預防和/或治療宿醉和肝病的基因改造細菌
本揭露內容總體上關於基因工程益生菌腸道細菌領域，及其在預防和/或治療宿醉和肝病中的應用。
宿醉是一個重大問題，是社會經濟損失的一個巨大來源。宿醉及其相關問題（例如酒精性肝病）在西方和東方文化中已被認識了數千年。然而，很少有有效的預防和/或治療宿醉和相關肝臟問題的方法。
因此，需要開發用於預防和/或治療宿醉和酒精性肝病的新方法。
在一個方面，本揭露內容提供了一種基因工程益生菌腸道細菌，其包含外源表達盒，所述外源表達盒包含編碼乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述益生菌腸道細菌是大腸桿菌菌株 Nissle 1917 (EcN)。
在一些實施例中，乙醛脫氫酶是來自鉤蟲貪銅菌（ Cupriavidus necator）的天然存在的AcoD，或其功能等效物。
在一些實施例中，所述功能等效物至少保留氧化醛類的部分活性。
在一些實施例中，所述功能等效物包含天然存在的AcoD的突變體、片段、融合物、衍生物或其任意組合。
在一些實施例中，乙醛脫氫酶包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，或其具有至少80%序列同一性但仍保留氧化醛類的基本活性的胺基酸序列。
在一些實施例中，編碼乙醛脫氫酶的核苷酸序列已針對在EcN中的表達進行密碼子最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，表達盒還包含一個或多個調控元件，所述調控元件包含選自下組的一個或多個元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子、順反子及其任意組合。
在一些實施例中，啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子。
在一些實施例中，啟動子是內源啟動子或外源啟動子。
在一些實施例中，組成型啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-49及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，組成型啟動子包含SEQ ID NO: 10的核酸序列。
在一些實施例中，誘導型啟動子包含厭氧誘導型啟動子。
在一些實施例中，厭氧誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 53的核苷酸序列。
在一些實施例中，RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，終止子是T7終止子。
在一些實施例中，所述順反子是BCD2。
在一些實施例中，所述順反子包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列或與其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，外源表達盒整合到基因工程益生菌腸道細菌的基因組中。
在一些實施例中，基因工程益生菌腸道細菌表達編碼至少一種分子伴侶蛋白的至少一個核苷酸序列，所述分子伴侶蛋白選自下組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
在一些實施例中，基因工程益生菌腸道細菌還包含在營養缺陷體相關基因中的至少一個失活或缺失。
在一些實施例中，益生菌腸道細菌是針對選自下組的一種或多種物質的營養缺陷體：胸腺嘧啶、脲嘧啶、白胺酸、組胺酸、色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。
在一個方面，本揭露內容提供了一種重組表達盒，其包含編碼AcoD的核苷酸序列和一個或多個調控元件，其中所述核苷酸序列已針對在 EcN中的表達進行最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，重組表達盒還包含一個或多個選自下組的調控元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子、順反子及其任意組合。
在一些實施例中，啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子（例如，厭氧誘導型啟動子）。
在一些實施例中，啟動子是內源啟動子或外源啟動子。
在一些實施例中，啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-53及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列。
在一些實施例中，RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一些實施例中，終止子是T7終止子。
在一些實施例中，所述順反子是BCD2。
在一些實施例中，所述順反子包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列或與其具有至少80%序列同一性的同源序列。
在一個方面，本揭露內容提供了一種組合物，其包含本文提供的基因工程益生菌腸道細菌和生理學上可接受的載體。
在一些實施例中，所述組合物是可食用的。
在一些實施例中，所述組合物是食品補充劑。
在一些實施例中，所述組合物還包含一種或多種生理學上可接受的載體，其選自乳酸發酵食品、發酵乳製品、抗性澱粉、膳食纖維、碳水化合物、脂肪、油、芳香劑、調味劑、蛋白質和糖基化蛋白質、水、膠囊填料和膠狀材料。
在一些實施例中，基因工程微生物是活細胞。
在一些實施例中，所述組合物是成品食品、粉末、顆粒、片劑、膠囊或液體。
在一些實施例中，所述組合物包含約0.01至約99.9重量%的基因工程微生物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於降低有需要的受試者體內乙醛含量的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或治療有需要的受試者的亞裔臉潮紅的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一些實施例中，受試者缺乏一種或多種醇脫氫酶。
在一些實施例中，受試者缺乏一種或多種醛脫氫酶。
在一些實施例中，所述組合物在飲酒之前、期間或之後施用。
在一些實施例中，所述方法包括在開始飲酒前至多24小時向受試者施用所述組合物。
在一些實施例中，受試者是 ALDH2變異等位基因的攜帶者。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精性肝病的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一些實施例中，酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎或酒精性肝硬化。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性脂肪肝疾病發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性肝炎發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或治療有需要的受試者的非酒精性脂肪肝（NAFLD）或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NAFLD發展為NASH的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在一個方面，本揭露內容提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NASH發展為肝纖維化的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在某些實施例中，受試者具有升高的血液乙醇含量和/或增加的產酒精腸道微生物群的豐度。
在整個本揭露內容中，冠詞「一（a/an）」和「所述」在本文中用於指一個（種）或多於一個（種）（即，至少一個（種））所述冠詞的語法對象。舉例來說，「抗體」是指一種抗體或多於一種抗體。
以下對本揭露內容的描述僅旨在說明本揭露內容的各種實施例。因此，所討論的具體修改不應被解釋為對本揭露內容範圍的限制。對於所屬技術領域的通常知識者將顯而易見的是，可在不脫離本揭露內容的範圍的情況下進行各種等效物、改變和修改，且應理解這類等效實施例包括在本文中。本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利和專利申請，均以全文引用的方式併入本文中。
I. 定義
如本文所用，術語「有效量」或「藥學上有效量」是指產生期望結果所必需的一種或多種藥劑的量和/或劑量和/或劑量方案，例如足以在受試者中緩解與受試者正在接受療法或組合物的病況或疾病相關的一種或多種症狀的量，或足以減輕受試者中病況的嚴重性或延遲其進展的量（例如治療有效量），足以降低受試者中疾病或病況的發病風險或延遲其發病，和/或降低其最終嚴重性的量（例如預防有效量）。
如本文所用，術語「編碼（encodes/encoded/encoding）」是指能夠轉錄成mRNA和/或轉譯成肽或蛋白質。術語「編碼序列」或「基因」是指編碼肽或蛋白質的多核苷酸序列。這兩個術語可以在本揭露內容中互換使用。在一些實施例中，編碼序列是由傳訊RNA（mRNA）逆轉錄的互補DNA（cDNA）序列。在一些實施例中，編碼序列是mRNA。
如本文所用，術語「同源」是指在最佳比對時，與另一序列具有至少60%（例如至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性的核酸序列（或其互補鏈）或胺基酸序列。
如本文所用，術語「核苷酸序列」、「核酸」或「多核苷酸」包括寡核苷酸（即短多核苷酸）。它們還指合成的和/或非天然存在的核酸分子（例如，包含核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵）。所述術語還指單鏈或雙鏈形式的去氧核醣核苷酸或核醣核苷酸寡核苷酸。所述術語涵蓋含有天然核苷酸類似物的核酸。所述術語還涵蓋具有合成骨架的核酸樣結構。除非另外指示，否則特定多核苷酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾變體（例如簡並密碼子取代）、等位基因、直系同源物、SNP和互補序列，以及明確指示的序列。具體而言，簡併密碼子取代可以通過產生其中一個或多個選定（或全部）密碼子的第三位被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代的序列來實現（參見Batzer等人, 《核酸研究》（ Nucleic Acid Res.） 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, 《生物化學雜誌》（ J. Biol. Chem.） 260:2605-2608 (1985)；和Rossolini等人, 《分子細胞探針》（ Mol. Cell. Probes） 8:91-98 (1994)）。
相對於胺基酸序列（或核酸序列）的術語「序列同一性百分比（%）」定義為在比對序列並在必要時引入空隙以獲得最大數目的相同胺基酸（或核酸）後，候選序列中與參考序列中的胺基酸（或核酸）殘基相同的胺基酸（或核酸）殘基的百分比。換句話說，胺基酸序列（或核酸序列）的序列同一性百分比（%）可以通過將相對於其比較的參考序列相同的胺基酸殘基（或鹼基）的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基（或鹼基）的總數（以較短者為準）來計算。胺基酸殘基的保守取代可視為或可不視為相同殘基。出於確定胺基酸（或核酸）序列一致性百分比的目的進行的比對可以例如使用可公開獲得的工具，如BLASTN、BLASTp（可在美國國家生物技術信息中心（NCBI）的網站上獲得，另參見Altschul S.F.等人, 《分子生物學雜誌》（ J. Mol. Biol.）, 215:403-410 (1990)；Stephen F.等人, 《核酸研究》, 25:3389-3402 (1997)）、ClustalW2（可在歐洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute）網站上獲得，另參見Higgins D.G.等人, 《酶學方法》（ Methods in Enzymology）, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等人, 《生物信息學（英格蘭牛津）》（Bioinformatics (Oxford, England)）, 23(21):2947-8 (2007)）和ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件實現。所屬技術領域的通常知識者可使用所述工具所提供的預設參數，或可視需要例如通過選擇合適運算法來自定義比對的參數。
如本文所用，術語「益生菌」是指非致病性的。在一些實施例中，當以有效量施用時，益生菌微生物細胞提供對受試者的健康或幸福的有益效果，包括例如與改善人類或動物微生物群的平衡相關的健康益處，和/或用於恢復正常的微生物群。如本文所用，術語「益生菌」是指益生菌微生物細胞（例如活的微生物細胞）的製劑。
如本文所用，術語「受試者」包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除註明外，術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
如本文所用，疾病、病症或病況的「治療（Treating/treatment）」包括預防或緩解疾病、病症或病況，減緩疾病、病症或病況的發作或發展速度，降低罹患疾病、病症或病況的風險，防止或延緩與疾病、病症或病況相關的症狀的發展，減少或結束與疾病、病症或病況相關的症狀，使疾病、病症或病況完全或部分消退，治癒疾病、病症或病況，或其某一組合。
如本文所用，關於AcoD的術語「天然存在的」是指AcoD多肽或多核苷酸的序列與自然界中發現的序列或那些序列相同。天然存在的AcoD可以是AcoD的原生或野生型序列，或其片段，即使所述片段本身可能在自然界中沒有發現。天然存在的AcoD也可以包括天然存在的變體，如在不同細菌菌株中發現的突變體或同種型或不同的原生序列。天然存在的全長AcoD多肽具有506個胺基酸殘基的長度。天然存在的AcoD的示例性胺基酸序列包括但不限於AcoD（SEQ ID NO: 1）。
II. 基因工程益生菌腸道細菌和重組表達盒
基因工程益生菌腸道細菌
乙醛脫氫酶 AcoD
在一個方面，本揭露內容提供了一種基因工程益生菌腸道細菌，其包含外源表達盒，所述外源表達盒包含編碼乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述益生菌腸道細菌是大腸桿菌菌株 Nissle 1917 (EcN)。
如本文所用，術語「乙醛脫氫酶」是指能夠催化乙醛氧化成乙酸鹽的酶或其功能等效物。在某些實施例中，乙醛脫氫酶來自人類。在某些實施例中，乙醛脫氫酶來自非人類生物，例如鉤蟲貪銅菌。在某些實施例中，乙醛脫氫酶是乙醛脫氫酶2（ALDH2）。術語「ALDH2」可以指ALDH2的蛋白質以及ALDH2的基因。在某些實施例中，乙醛脫氫酶是AcoD。如本文所用，關於乙醛脫氫酶、ALDH2或AcoD（例如來自鉤蟲貪銅菌）的術語「功能等效物」是指任何乙醛脫氫酶變體，儘管其胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構不同，但至少部分保留了乙醛脫氫酶、ALDH2或AcoD（例如來自鉤蟲貪銅菌）的一種或多種生物學功能。乙醛脫氫酶、ALDH2或AcoD（例如來自鉤蟲貪銅菌）的生物學功能包括但不限於催化乙醛氧化成乙酸鹽、乙醇降解、酮降解。
在某些實施例中，乙醛脫氫酶是來自鉤蟲貪銅菌的天然存在的AcoD，或其功能等效物。如本文所用，術語「AcoD」是指來自鉤蟲貪銅菌的乙醛脫氫酶蛋白；以及編碼這種AcoD蛋白的任何和所有基因。
在某些實施例中，天然存在的AcoD的功能等效物至少保留氧化醛類的部分活性。所述功能等效物可以包含天然存在的AcoD的突變體、片段、融合物、衍生物或其任意組合。在某些實施例中，AcoD包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，或其具有至少80%序列同一性但仍保留氧化醛類的基本活性的胺基酸序列。
在某些實施例中，編碼AcoD的核苷酸序列已針對在 EcN中的表達進行密碼子最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。如本文所用，術語「密碼子最佳化」是指編碼多肽的核苷酸序列已被配置為包含宿主細胞或生物體（例如 EcN）較佳的密碼子，以改善宿主細胞或生物體中的基因表達並提高轉譯效率。
調控元件
在某些實施例中，表達盒還包含一個或多個調控元件，所述調控元件包含選自下組的一個或多個元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子及其任意組合。所述一個或多個調控元件可操作地連接於乙醛脫氫酶的多核苷酸序列。如本文所用，術語「可操作地連接」是指兩個或更多個相關生物序列在有或沒有間隔子或連接子的情況下以這樣的方式併置，使它們處於允許它們以預定方式發揮作用的關係中。關於多核苷酸也可以使用所述術語。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接於調控序列（例如啟動子、增強子、沉默子序列等）時，其意指所述多核苷酸序列以允許調控由多核苷酸表達多肽的方式連接。當關於多肽使用時，其意指多肽序列以允許連接的產物具有預期的生物學功能的方式連接。例如，抗體可變區可以可操作地連接於恒定區，以提供具有抗原結合活性的穩定產物。
1. 啟動子
在某些實施例中，啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子。
如本文所用，術語「啟動子」是指可以控制編碼序列轉錄的多核苷酸序列。啟動子序列包括足以使RNA聚合酶識別、結合和轉錄啟動的特定序列。此外，啟動子序列可以包括任選地在本文提供的益生菌腸道細菌中調節RNA聚合酶的這種識別、結合和轉錄啟動活性的序列。啟動子可以影響與自身位於同一核酸分子上的基因或與自身位於不同核酸分子上的基因的轉錄。啟動子序列的功能，取決於調控的性質，可以是組成性的或可由刺激物誘導的。
術語「組成型啟動子」是指能夠促進在其控制下和/或與其可操作地連接的編碼序列或基因的連續轉錄的啟動子。EcN的組成型啟動子和變體是本技術領域中習知的，包括但不限於BBa_J23119、BBa_J23101、BBa_J23102、BBa_J23103、BBa_J23109、BBa_J23110、BBa_J23114、BBa_J23117、USP45_promoter、OmpA_promoter、BBa_J23100、BBa_J23104、BBa_J23105、BBa_I14018、BBa_J45992、BBa_J23118、BBa_J23116、BBa_J23115、BBa_J23113、BBa_J23112、BBa_J23111、BBa_J23108、BBa_J23107、BBa_J23106、BBa_I14033、BBa_K256002、BBa_K1330002、BBa_J44002、BBa_J23150、BBa_I14034、Oxb19、oxb20、BBa_K088007、Ptet、Ptrc、PlacUV5、BBa_K292001、BBa_K292000、BBa_K137031和BBa_K137029。示例性組成型啟動子的核苷酸序列包含選自下組的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO: 10-49及其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性的同源序列。在一些實施例中，組成型啟動子包含SEQ ID NO: 10的核苷酸序列。在一些實施例中，這樣的啟動子在體外，例如在培養、擴增和/或製造條件下具有活性。在一些實施例中，這樣的啟動子在體內，例如在體內環境，例如腸道微環境中發現的條件下具有活性。
如本文所用，術語「誘導型啟動子」是指可以通過外部刺激，如化學、光、激素、壓力、厭氧條件或病原體，在一種或多種細胞類型中開啟的受調控的啟動子。誘導型啟動子和變體是本技術領域中習知的，包括但不限於PLteto1、galP1、PLlacO1、Pfnrs。在一些實施例中，示例性誘導型啟動子的核苷酸序列包含選自下組的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO: 50-53及其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性的同源序列。在某些實施例中，誘導型啟動子包含厭氧誘導型啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子包含SEQ ID NO: 53的核苷酸序列。
在一些實施例中，啟動子是內源啟動子或外源啟動子。如本文所用，「外源啟動子」是指與編碼區可操作結合的啟動子，其中所述啟動子不是生物體基因組中與編碼區天然相關的啟動子。基因組中與編碼區天然相關或相連的啟動子被稱為該編碼區的「內源啟動子」。
在某些實施例中，組成型啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-49及其具有至少80%序列同一性的同源序列。在某些實施例中，組成型啟動子包含SEQ ID NO: 10。
2. 核醣體結合位點（ RBS ）
在某些實施例中，RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。如本文所用，術語「核醣體結合位點」或「RBS」可互換使用，是指核醣體在啟動蛋白質轉譯時結合的序列。RBS為約35個核苷酸長，並含有三個離散域：(1) Shine-Dalgarno（SD）序列，(2)間隔區，和(3)編碼序列（CDS）的前五至六個密碼子。RBS和變體是本技術領域中習知的，包括但不限於USP45、合成型、OmpA。示例性RBS的核苷酸序列包含選自下組的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性的同源序列。在某些實施例中，RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 66及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
3. 終止子
在某些實施例中，終止子是T7終止子。如本文所用，術語「終止子」是指可酶併入的核苷酸，其阻止核苷酸隨後併入所得多核苷酸鏈，從而停止聚合酶介導的延伸。在一些實施例中，終止子包含選自下組的核苷酸序列：如表1所示的SEQ ID NO: 68-69或其部分及其具有至少80%（例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）序列同一性的同源序列。
表 1. 示例性啟動子的核苷酸序列
調控元件 名稱 核苷酸序列 SEQ ID NO.
組成型啟動子 BBa_J23119 ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc 10
BBa_J23101 tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc 11
BBa_J23102 ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc 12
BBa_J23103 ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc 13
BBa_J23109 tttacagctagctcagtcctagggactgtgctagc 14
BBa_J23110 tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc 15
BBa_J23114 tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc 16
BBa_J23117 ttgacagctagctcagtcctagggattgtgctagc 17
USP45_promoter aaagtgttttgtaatcataaagaaatattaaggtggggtaggaatagtataatatgtttattcaaccgaacttaatg 18
OmpA_promoter gtaaatttaggattaatcctggaactttttttgtcgcccagccaatgctttcagtcgtgactaattttccttgcggaggcttgtctgaagcggtttccgcgattttcttctgtaaattgtcgctgacaaaaaagattaaacgtaccttatacaagacttttttttcatatgcctgacggagttcacacttgtaagttttcaactacgttgtagactttacatcgccaggggtgctcggcataagccgaagatatcggtagagttaatattgagcagatccccggtgaaggatttaaccgtgttatctcgttggagatattcatggcgtattttggatga 19
BBa_J23100 ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc 20
BBa_J23104 ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc 21
BBa_J23105 tttacggctagctcagtcctaggtactatgctagc 22
BBa_I14018 gtttatacataggcgagtactctgttatgg 23
BBa_J45992 ggtttcaaaattgtgatctatatttaacaa 24
BBa_J23118 ttgacggctagctcagtcctaggtattgtgctagc 25
BBa_J23116 ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc 26
BBa_J23115 tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc 27
BBa_J23113 ctgatggctagctcagtcctagggattatgctagc 28
BBa_J23112 ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc 29
BBa_J23111 ttgacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc 30
BBa_J23108 ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc 31
BBa_J23107 tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc 32
BBa_J23106 tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc 33
BBa_I14033 agaggttccaactttcaccataatgaaaca 34
BBa_K256002 caccttcgggtgggcctttctgcgtttata 35
BBa_K1330002 ggctagctcagtcctaggtactatgctagc 36
BBa_J44002 aaagtgtgacgccgtgcaaataatcaatgt 37
BBa_J23150 ggctagctcagtcctaggtattatgctagc 38
BBa_I14034 taaacaactaacggacaattctacctaaca 39
Oxb19 aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtatcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggtgctggttagcgcttgctat 40
oxb20 aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtagaaacgccgtgtgctcgatcgcttgataaggtccacgtagctgctataattgcttcaacagaacatattgactatccggtattacccggc 41
BBa_K088007 catacgccgttatacgttgtttacgctttg 42
Ptet taattcctaatttttgttgacactctatcgttgatagagttattttaccactccctatcagtgatagagaaaa 43
Ptrc ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgag 44
PlacUV5 cccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgag 45
BBa_K292001 tgctagctactagagattaaagaggagaaa 46
BBa_K292000 ggctagctcagtcctaggtacagtgctagc 47
BBa_K137031 ccccgaaagcttaagaatataattgtaagc 48
BBa_K137029 atatatatatatatataatggaagcgtttt 49
誘導型啟動子 PLteto1 tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc 50
galP1 attccactaatttattccatgtcacacttttcgcatctttgttatgctatggttatttcataccataa 51
PLlacO1 ataaatgtgagcggataacaattgacattgtgagcggataacaagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc 52
Pfnrs aaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctctt 53
訊息肽 Usp45 atgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcg 54
OmpA atgaagaaaaccgcgattgcgattgcggtggcgctggcgggtttcgcgaccgttgcgcaggcg 55
DsbA atgaagaaaatctggctggcgctggcgggtctggtgctggcgttcagcgcgagcgcg 56
pelB atgaagtacctgctgccgaccgcggcggcgggtctgctgctgctggcggcgcagccggcgatggcg 57
celCD atggaaggaaacactcgtgaagacaattttaaacatttattaggtaatgacaatgttaaacgc 58
sat atgaataaaatatactcccttaaatatagtgctgccactggcggactcattgctgtttctgaattagcgaaaagagtttctggtaaaacaaaccgaaaacttgtagcaacaatgttgtctctggctgttgccggtacagtaaatgca 59
Amuc_1100的內源訊息肽 atgagcaactggatcaccgacaacaaaccggctgcgatggttgcgggtgtgggcctgctgctgttcctgggtctgagcgcgaccggctac 60
順反子 GFP atgcgtaaaggcgaagagaaggaggttaactga 61
BCD2 atgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgctaaggaggttttcta   62
熒光素酶 atgattatgtccggttataaggaggttaactga 63
  MBP atgaaaatcgaagcaggtaaactggtacagaaggaggttaactga 64
RBS USP45 ggaggaaaaattaaaaaagaac 65
合成型 aaagaggagaaa 66
OmpA taacgagg 67
終止子 終止子1 cgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 68
終止子2 cgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 69
4. 分子伴侶
在某些實施例中，基因工程益生菌腸道細菌表達至少一種選自下組的分子伴侶蛋白：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
在某些實施例中，基因工程益生菌腸道細菌還包含分子伴侶表達盒，其包含編碼至少一種分子伴侶蛋白的至少一個核苷酸序列，所述分子伴侶蛋白選自下組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
分子伴侶蛋白參與了許多重要的生物學過程，如寡聚蛋白複合物的蛋白質折疊和聚集，使蛋白質前體維持在未折疊狀態以利於蛋白質跨膜運輸，並使變性的蛋白質能夠解聚和修復。它主要是協助其它肽維持正常構型，以形成正確的寡聚結構，從而發揮正常的生理功能。各種分子伴侶蛋白是本技術領域中習知的。在一些實施例中，分子伴侶蛋白選自下組：70 kDa熱休克蛋白（Hsp70）的胞質SSA亞家族中的Ssa1p、Ssa2p、Ssa3p和Ssa4p、BiP、Kar2、Lhs1、Sil1、Sec63、蛋白二硫鍵異構酶Pdi1p。
5. 基因組整合位點
在某些實施例中，外源表達盒整合到基因工程益生菌腸道細菌的基因組中。在某些實施例中，通過CRISPR-Cas基因組編輯系統將外源表達盒整合到基因工程益生菌腸道細菌的基因組中。本文提供的任何合適的宿主細胞都可以被改造，以使外源表達盒整合到基因組中。可以選擇各種基因組整合位點，只要異源基因的表達量達到一定程度，且對基礎益生菌腸道細菌的生化和生理活性沒有大的負面影響即可。
在一些實施例中，外源表達盒在選自表2中所列的整合位點處整合在EcN基因組中。在一些實施例中，與EcN基因組中的外源表達盒整合的合適整合位點是kefB。不希望受任何理論束縛，但據信表2中列出的 EcN的基因組位點對於插入AcoD的表達盒來說，在以下至少一個特徵中是有利的：(1)所述位點的改造所影響的細菌基因不是EcN生長所必需的，並且不改變宿主細菌的生化和生理活性，(2)所述位點可以容易地被編輯，以及(3)所述位點中的AcoD基因盒可以被轉錄。下表2中顯示了用於編輯EcN中相應基因組位點的sgRNA序列。
表 2. 用於編輯 EcN 中相應基因組位點的 sgRNA 序列 .
整合位點 sgRNA SEQ ID NO.
agaI/rsmI (~3645kbp) ggcgagttaacgacgacaca 70
araBC (~69kbp) cgttgaactgggtgtggaat 71
cadA (~4822kbp) ctgaaaccgctgcggcgatg 72
cadA (~4822kbp) gttcgcagtggaagtaccgt 73
dapA (~2842kbp) ctgtgcaaacaagtgtctca 74
kefB (~3840kbp) gccggaagacactatgaagc 75
lacZ (~450kbp) tcgcacagcgtgtaccacag 76
maeB (~2819kbp) gaaggggaagaggcgcgcgt 77
malE/K: (~4687kbp) cggtttagttcacagaagcc 78
malP/T (~3908kbp) ttgcgtattttcaaaaagcg 79
rhtB/C: (~4409kbp) tcatcagagtaagtcggata 80
yicS/nepI (~4241kbp) ctgaccaacgcttctttacc 81
adhE (~1467kbp) ccgaagtccctgtgtgcttt 82
galK (~816kbp) ccctgccactcacaccattc 83
glk (~2763kbp) ccttctcctggcaagcttac 84
ldhA (~1586kbp) cgacaagaagtacctgcaac 85
lldD (~4148kbp) gttatcgtgatgcgcattct 86
maeA (~1675kbp) taacacccagcccgatgccc 87
nth (~1800kbp) atattactggaacaacataa 88
pflB (~975kbp) ccgtgacgttatccgcacca 89
rnC (~2939kbp) tatcgccttcatccacacga 90
tkrA(ghrB) (~4090kbp) ccgggctggatgtcttcgaa 91
yieN (ravA) (~2327kbp) gagggtgagccataatgaag 92
yjcS (~4772kbp) ggatatgtggggtaacgacg 93
LPP(~1846kbp) acgttcaggctgctaaagat 94
6. 營養缺陷體
在某些實施例中，基因工程益生菌腸道細菌還包含在營養缺陷體相關基因中的至少一個失活或缺失。
為了生成環境友好型細菌，可以通過誘變刪除或滅活細菌細胞生存所必需的一些必需基因，使改造細菌成為營養缺陷體。如本文所用，術語「營養缺陷體」是指宿主細胞（例如微生物菌株）的生長需要特定代謝物的外部來源，所述代謝物由於獲得性遺傳缺陷而不能合成。如本文所用，術語「營養缺陷體相關基因」是指宿主細胞（例如微生物如細菌）生存所需的基因。營養缺陷體相關基因可以是微生物為生存或生長所必需的營養素生產所必需的，或者可以是檢測環境中調節轉錄因子活性的訊息所必需的，其中訊息的缺失將導致細胞死亡。
在一些實施例中，營養缺陷型修飾旨在使微生物在缺乏生存或生長所必需的外源添加的營養素時死亡，因為它們缺乏生產該必需營養素所必需的基因。在一些實施例中，本文所述的任何基因改造細菌還包含細胞生存和/或生長所需基因的缺失或突變。
細菌中的各種營養缺陷體相關基因是本技術領域中習知的。示例性營養缺陷體相關基因包括但不限於thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、ft＞aA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、in/B、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yr/F、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、in/A、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。
在一種修飾中，必需基因thyA缺失或被另一基因替代，使得基因工程細菌依賴於外源胸腺嘧啶生長或生存。在生長培養基中添加胸腺嘧啶或天然具有高胸腺嘧啶含量的人體腸道可以支持thyA營養缺陷型細菌的生長和生存。這種修飾是為了確保基因改造細菌不能在腸道外或缺乏營養缺陷型基因產物的環境中生長和生存。
在一些實施例中，益生菌腸道細菌是針對選自下組的一種或多種物質的營養缺陷體：胸腺嘧啶、脲嘧啶、白胺酸、組胺酸、色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。在一些實施例中，非天然存在的胺基酸選自下組：l-4,4'-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。
在一些實施例中，益生菌腸道細菌包含變構調節的轉錄因子，其能夠檢測環境中調節轉錄因子活性的訊息，其中訊息的缺失將導致細胞死亡。這樣的「訊息傳導分子-轉錄因子」對可以包括選自下組的任意一種或多種：色胺酸-TrpR、IPTG-LacI、苯甲酸酯衍生物-XylS、ATc-TetR、半乳糖-GalR、雌二醇-雌激素受體雜合蛋白、纖維二糖-CelR和高絲胺酸內酯-luxR。
重組表達盒
在另一個方面，本揭露內容還提供了一種重組表達盒，其包含編碼AcoD的核苷酸序列和一個或多個調控元件，其中所述核苷酸序列已針對在 EcN中的表達進行最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
如本文所用，術語「表達盒」是指能夠引導特定核苷酸序列在適當的益生菌腸道細菌中表達的DNA序列，包含可操作地連接於相關核苷酸序列的啟動子，所述相關核苷酸序列可操作地連接於終止信號。它還通常包含核苷酸序列適當轉譯所需的序列。編碼區通常編碼所關注的蛋白質，但也可以在反義方向的意義上編碼所關注的功能RNA，例如反義RNA或非轉譯RNA。包含所關注的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這意味著其組件中的至少一個相對於其它組件中的至少一個是異源的。
表達盒適合於在本文提供的益生菌腸道細菌中表達AcoD多肽。表達盒可以作為核酸載體（例如，如上所述的表達載體）的一部分引入。合適的益生菌腸道細菌的載體可以包括質體。載體可以包括表達盒側翼的序列，所述序列包括與真核生物基因組序列（如哺乳動物基因組序列）、原核生物基因組序列（如細菌基因組序列）或病毒基因組序列同源的序列。這將允許通過同源重組將表達盒引入真核細胞、原核基因組序列或病毒的基因組中。
如本文所用，術語「重組」是指在體外合成或以其它方式操縱的多核苷酸（例如，「重組多核苷酸」或「重組表達盒」），指使用重組多核苷酸或重組表達盒在細胞或其它生物系統中產生產物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽（「重組蛋白」）。重組多核苷酸涵蓋連接到表達盒或載體中的來自不同來源的核酸分子，以表達例如融合蛋白；或通過誘導性或組成性表達多肽產生的蛋白質（例如，本發明的表達盒或載體可操作地連接於異源多核苷酸，例如AcoD編碼序列）。重組表達盒涵蓋可操作地連接於一個或多個調節元件的重組多核苷酸。
在一些實施例中，重組表達盒還包含一個或多個選自下組的調控元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子及其任意組合。在一些實施例中，啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子（例如，厭氧誘導型啟動子）。啟動子可以是內源啟動子或外源啟動子。在一些實施例中，啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-49及其具有至少80%序列同一性的同源序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 10。
在一些實施例中，RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。在一些實施例中，終止子是T7終止子。
III. 組合物
在另一個方面，本揭露內容還提供了一種組合物，其包含表達AcoD或其功能等效物的基因工程益生菌腸道細菌和生理學上可接受的載體。所述載體可以是任何相容的、生理學上可接受的、無毒的物質，適合於將本文提供的基因工程益生菌腸道細菌遞送到哺乳動物（例如人）的胃腸道（GI）中。在某些實施例中，所述組合物還包含一種或多種生理學上可接受的載體，其選自乳酸發酵食品、發酵乳製品、抗性澱粉、膳食纖維、碳水化合物、脂肪、油、芳香劑、調味劑、蛋白質和糖基化蛋白質、水、膠囊填料和膠狀材料。
在某些實施例中，所述組合物是可食用的。在某些實施例中，所述組合物是食品補充劑。在某些實施例中，所述組合物被配製成功能性食品，如飲料、發酵酸奶等。
在某些實施例中，所述組合物是藥物組合物。在某些實施例中，所述組合物還可以被配製成藥物，呈膠囊、丸劑、液體溶液形式，例如被配製成囊封的凍乾細菌等。
在某些實施例中，所述組合物可以是液體形式，例如酏劑、糖漿和懸浮液；或固體形式，例如膠囊、片劑和粉末。
在某些實施例中，所述組合物包含凍乾細菌細胞的粉末。凍乾細菌細胞可採用冷凍保護劑如乳糖、海藻糖或糖原。
在某些實施例中，基因工程微生物是活細胞。在某些實施例中，所述組合物是成品食品、粉末、顆粒、片劑、膠囊或液體。在某些實施例中，所述組合物包含約0.01至約99.9重量%、約10.01至約89.9重量%、約20.01至約79.9重量%、約30.01至約69.9重量%、約40.01至約69.9重量%或約5.01至約59.9重量%的基因工程微生物。
本文所揭露的組合物可以被配製成在單次施用或多次施用中對給定受試者有效。例如，在施用所述組合物的哺乳動物受試者中，單次施用基本上有效地減少目標疾病或病況（例如宿醉、酒精性肝病）的監測症狀，或有效地預防目標疾病或病況（例如宿醉、酒精性肝病）的症狀，或有效地預防目標疾病或病況的進展。
一般來說，重組細菌的劑量將根據受試者的年齡、體重、身高、性別、一般醫療狀況和既往病史等因素而變化。在一些實施例中，配製組合物，使得單次口服劑量含有至少約1×10 4CFU的細菌實體和/或真菌實體，並且單次口服劑量通常將含有約1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10、1×10 11、1×10 12或1×10 13CFU的細菌實體和/或真菌實體。在一些實施例中，配製組合物，使得單次口服劑量含有不超過約1×10 13CFU的細菌實體和/或真菌實體。如果已知，例如給定菌株或所有菌株集合體的細胞濃度是每克組合物（任選為乾組合物）或每一施用劑量約例如1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10、1×10 11、1×10 12或1×10 13活細菌實體（例如CFU）。在某些實施例中，給定菌株或所有菌株集合體的細胞濃度不超過每克組合物（任選為乾組合物）或每一施用劑量1×10 13活細菌實體（例如CFU）。
在一些製劑中，組合物含有按質量計至少或至少約0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或大於90%的本揭露內容的益生菌腸道細菌。在一些製劑中，施用劑量在質量上不超過200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克的本揭露內容的益生菌腸道細菌。
IV. 使用方法
i. 酒精宿醉
本揭露內容提供了本文提供的基因工程益生菌腸道細菌和/或包含基因工程益生菌腸道細菌的組合物的治療用途。乙醛是一種高度可溶的分子，可以被動地擴散穿過本文提供的基因改造細菌的細胞膜，充當改造細菌內部表達的AcoD的基質以氧化成乙酸鹽。酶的內部定位比從細菌中分泌的酶更有優勢，因為分泌的酶將不得不面對腸道腔內的惡劣和多變的環境，例如低pH值、出於防禦或營養目的而要降解自由的游離蛋白的敵對細菌和真核細胞、對NAD等酶促輔助因子的激烈競爭，和細胞外蛋白酶，而細菌細胞內表達和起作用的酶可以免受惡劣環境的影響，從而大大提高了清除乙醛的活性和功效。
在一個方面，本揭露內容提供了用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。如本文所用，術語「宿醉」是指一系列不愉快的體徵和症狀，包括但不限於疲勞和虛弱、過度口渴和口乾、頭痛和肌肉酸痛、噁心、嘔吐或胃痛、睡眠不佳或減少、對光和聲音的敏感性增加、頭暈或房間旋轉感、搖晃、注意力集中能力降低、情緒紊亂（如抑鬱、焦慮和易怒）以及心跳加快。宿醉可能是過度飲酒和/或快速飲酒導致乙醛在血液中累積的結果。如本文所用，「過量飲酒」是指飲酒量超出人的酒精耐受量。不同人群的酒精耐受性因人群的遺傳條件而不同。例如，東亞人群中常見的乙醛脫氫酶基因的單核苷酸多態性（例如ALDH2變異等位基因）會降低酒精耐受性，甚至導致酒精不耐受，從而導致乙醛在體內累積。
如本文所用，術語「乙醛」是指通過醇脫氫酶氧化酒精而產生的酒精代謝途徑中的毒性中間體。乙醛隨後可在肝臟中通過乙醛脫氫酶氧化成乙酸鹽。乙醛的累積是酒精宿醉的許多影響的原因。在不希望受任何理論束縛的情況下，相信通過引入外源催化活性乙醛脫氫酶來促進乙醛代謝將預防和/或減少酒精宿醉的症狀。因此，將本揭露內容的基因工程益生菌腸道細菌或組合物施用到受試者的腸道中，產生具有將乙醛氧化為乙酸鹽的催化活性的外源乙醛脫氫酶，可以有效地減少和/或預防宿醉症狀。
乙醛也被稱為致癌物，其毒性作用已得到充分研究和記錄。例如，它破壞上皮屏障並增加腸道上皮層的滲透性（ Chaudhry KK等人, 《酒精中毒，臨床和實驗研究》（ Alcoholism, clinical and experimental research.） 2015; 39: 1465-75）。肝細胞中乙醛累積增加也可導致肝纖維化，這已被證明與失活的ALDH2有關（ Purohit V等人, 《肝病學（馬裡蘭州巴爾的摩）》（ Hepatology (Baltimore, Md).） 2006; 43: 872-8）。研究表明，ALDH2的過度表達可以減輕酒精誘導的慢性肝臟損傷和細胞凋亡（Guo等人, 《臨床和實驗藥理學和生理學》（Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology.） 2009; 36: 463-8.）。因此，本揭露內容還提供了用於降低有需要的受試者體內乙醛含量的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在另一個方面，本揭露內容提供了用於預防和/或治療有需要的受試者的亞裔臉潮紅的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。如本文所用，術語「亞裔臉潮紅」是指經常在亞洲人群中觀察到的對飲酒的臉部潮紅反應。亞裔臉潮紅可以是一種防禦機制，可以阻止飲酒。然而，在鼓勵或挑戰人們喝更多的酒的社交活動中，亞裔臉潮紅的個體可能無法逃避或拒絕這種狂飲。因此，在社交飲酒不可避免的情況下，需要一種預防和/或治療亞裔臉潮紅的方法。
亞裔臉潮紅一般與缺乏一種或多種醇脫氫酶，例如醛脫氫酶有關。在某些實施例中，受試者缺乏一種或多種乙醛脫氫酶。在某些實施例中，受試者缺乏乙醛脫氫酶2（ALDH2）。在某些實施例中，受試者是ALDH2變異等位基因的攜帶者。如本文所用，術語「ALDH2變異等位基因」可以指包含功能性單核苷酸多態性（SNP）的ALDH2等位基因，例如在外顯子12中，其導致E487K取代，即 ALDH2*487 Lys，也稱為ALDH2*2。ALDH2*2編碼粒線體ALDH2酶的功能缺陷型，導致ALDH2的催化失活（ Agarwal, 《病理生物學（巴黎）》（ Pathol Biol (Paris).） 2001 年 11 月 ; 49(9):703-9.； Ramchandani等人, 《病理生物學（巴黎）》 2001 年 11 月 ; 49(9):676-82.； Vasiliou等人, 《藥理學》（ Pharmacology.） 2000 年 9 月 ; 61(3):192-8； Yoshida, 《藥物遺傳學》（ Pharmacogenetics.） 1992 年 8 月 ; 2(4):139-47）。術語「ALDH2變異等位基因」也可以包含ALDH2*1。由ALDH2*1/*2編碼的酶是部分失活的，而由ALDH2*2/*2編碼的酶是完全失活的。在某些實施例中，受試者是ALDH2*1/*2的攜帶者。在某些實施例中，受試者是ALDH2*2/*2的攜帶者。
可以在酶活性含量和/或遺傳含量上檢測ALDH2缺乏症。酶活性含量上的ALDH2缺乏症可以通過本技術領域已知的任何合適的功能測定法來測量。遺傳含量上的ALDH2缺乏症可以通過本技術領域已知的任何方法來測量，例如但不限於擴增測定法、雜交測定法或定序測定法。
iii. 酒精性肝病
酒精代謝主要在肝臟中進行。除了上述對乙醛的解毒作用外，乙醛脫氫酶也被證實參與了肝病的發病機理。雖然ALDH2*2可以保護受試者免於患酒精性肝病（ALD），因為其相關的亞裔臉潮紅極有可能會阻止受試者飲酒，但ALDH2*2等位基因對ALD的這種保護會隨著時間的推移而減弱，因為更多的飲酒會增加酒精的耐受性（ Higuchi S等人, 《柳葉刀》（ The Lancet.） 1994; 343: 741-2.）。因此，只要不避免飲酒，攜帶ALDH2*2等位基因的受試者仍可罹患ALD。
在另一個方面，本揭露內容提供了用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精性肝病（ALD）的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。ALD是一個複雜的過程，包括從脂肪變性到肝硬化的廣泛肝臟病變。細胞損傷、炎症、氧化壓力、再生和細菌易位是酒精誘導的肝損傷的關鍵驅動因素。據報導，中國、美國、歐洲和日本ALD的發病率分別為4.5%、6.2%、6%和1.56-2.34%（ Xiao J等人, 《肝病學雜誌》（ Journal of hepatology.） 019; 71: 212-21； Fan J-G等人, 《胃腸病學和肝病學雜誌》（ Journal of Gastroenterology and Hepatology.） 2013; 28: 11-7； Rehm J等人, 《柳葉刀》 2009; 373: 2223-33；和 Szabo G等人, 《肝病學（馬裡蘭州巴爾的摩）》 2019; 69: 2271-83.）。在某些實施例中，酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性纖維化或酒精性肝硬化。酒精性脂肪肝是ALD的初始階段，可發展為伴有炎症的酒精性肝炎。酒精性肝炎可發展為酒精性肝纖維化，其可進一步發展為酒精性肝硬化，再發展為酒精性肝癌。這些病症不僅從脂肪肝到酒精性肝炎到纖維化再到肝硬化依次發展，而且可以一起發生。
在另一個方面，本揭露內容提供了用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性脂肪肝疾病發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在另一個方面，本揭露內容提供了用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性肝炎發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在另一個方面，本揭露內容還提供了一種用於預防和/或治療有需要的受試者的非酒精性脂肪肝（NAFLD）或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。在某些實施例中，NAFLD是脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化或肝癌。
如本文所用，「非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）」是用於描述在沒有過量飲酒的情況下脂肪肝環境的概括術語。據估計，世界總人口中有25%符合NAFLD的診斷標準，NAFLD在男性中更為常見，並隨年齡增長而增加。
NAFLD的初始階段可以基於肝細胞異位脂肪堆積（脂肪變性）等特徵來檢測。脂肪變性通常是一種良性的、無症狀的病況；然而，在同時存在肥胖/代謝紊亂的情況下，脂肪變性可發展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其增加了肝纖維化的風險，嚴重時發展為肝細胞癌（HCC）和肝衰竭。
NASH可以通過如肝細胞氣球樣變性和炎症的特徵在組織學上進行檢測。與良性脂肪變性不同，NASH代表了一種重大的健康威脅，在10-28%的患者中會發展為纖維化/肝硬化。在這些患者中，從NASH進一步進展為纖維化/肝硬化高度預示死亡。
研究發現，儘管飲食中缺乏酒精，但患有NAFLD的患者發展為NASH仍與患者體循環和呼吸中酒精含量升高（即內源性酒精或腸道細菌衍生的乙醇）和醇脫氫酶基因的基因轉錄增加有關（ Baker等人, 《公共科學圖書館 · 綜合》（ PLoS One ）, 第5卷第3期）。這種酒精可能由患者體內的產酒精微生物群（例如埃希氏菌屬（ Escherichia）、瘤胃球菌屬（ Ruminococcus）、肺炎克雷伯氏菌（ Klebsiella pneumonia））通過碳水化合物發酵產生，內源性酒精可能通過對肝細胞的直接毒性作用，通過損害腸道屏障功能導致門靜脈內毒素血症增加，以及通過上調外週細胞的核因子-κB（NF-κB）信號傳導通路，參與NAFLD的發展（ Zhu 等人 , 《肝病學》 2013 年 2 月 ;57(2):601-9 ； Canfora 等人 , 《自然評論內分泌學》（ Nat Rev Endocrinol. ） 2019 年 5 月 ; 15(5): 261-273 ；和 Yuan 等人 , 2019, 《細胞代謝》（ Cell Metabolism ） 30, 675-688）。
研究還表明，NASH中4-HNE蛋白加合物的顯著累積提示了顯著的氧化壓力和ALDH活性降低。4-HNE是ALDH2活性位點肽的共價修飾，據報導是ALDH2的強效不可逆抑制劑，這表明4-HNE使ALDH2失活可能是NASH的原因（ Li 等人 , 《毒理學：毒理學學會官方雜誌》（ Toxicological sciences: an official journal of the Society of Toxicology. ） 2018; 164: 428-38 ；和 Doorn 等人 , 《毒理學化學研究》（ Chemical research in toxicology. ） 2006; 19: 102-10）。因此，本揭露內容還提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NAFLD發展為NASH的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。在另一個方面，本揭露內容還提供了一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NASH發展為肝纖維化的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。NAFLD/NASH患者可以受益於本揭露內容的基因工程益生菌腸道細菌或組合物，其已被證明能在體外以及體內有效降解乙醛，補償NASH患者體內失活的ALDH2，從而防止有毒乙醛在體內的累積。
在某些實施例中，受試者的血液乙醇或血清乙醇含量相對於參考含量有所升高。如本文所用，關於血液乙醇或血清乙醇的術語「參考含量」是指允許進行比較的基準含量。參考含量可由本技術領域具有通常知識者根據所需目的來選擇。確定合適的參考含量的手段是本技術領域具有通常知識者已知的，例如，參考含量可以根據經驗、現有知識或從臨床研究中收集的數據來確定。例如，血液酒精的參考含量可以是具有相同性別和相當體重的正常健康人的血液酒精含量，並且可選地具有同樣相當的其它因素，如身體狀況、藥物史、飲食、睡眠等。例如，據Zhu等人（《肝病學》, 57(2): 2013, 第601-609頁）報導，健康受試者的血清乙醇含量為約25 µM，但在NASH患者中為約35 µM。在某些實施例中，受試者的血清乙醇含量比參考含量高至少10%、15%、20%、25%或30%。
在某些實施例中，受試者的產醇腸道微生物群的豐度相對於參考含量增加。在某些實施例中，產醇腸道微生物群的豐度增加是指產醇微生物群相對於參考含量或健康人的這種微生物群的量的提升。產醇腸道微生物群的豐度增加也可以指與健康人中的產醇腸道微生物群相比，患者中產醇腸道微生物群產生酒精的能力增強。例如，產醇腸道微生物群可以是一種常見的腸道微生物群，其在異常情況下，例如在NASH患者中比在健康人中產生更多的酒精（無論是由於這種微生物群的量增加還是由於其產生酒精的能力增強）。示例性產醇腸道微生物群包括但不限於肺炎克雷伯氏菌、埃希氏菌屬、擬桿菌屬（ Bacteroides）、雙歧桿菌屬（ Bifidobacterium）、梭菌屬（ Clostridium）及酵母菌（ Yuan 等人 , 2019, 《細胞代謝》 30, 675-688 ； Frantz JC 等人 , 《細菌學雜誌》（ J Bacteriol ） 1979;137:1263-1270 ； Zhu 等人 , 《肝病學》 2013 年 2 月 ;57(2):601-9 ； Amaretti A 等人 . 《應用與環境微生物學》（ Appl Environ Microbiol ） 2007; 73:3637-3644 ；和 Weimer PJ 等人 , 《應用與環境微生物學》 1977;33:289-297.）。受試者中產醇腸道微生物群的豐度可以通過例如測定從受試者分離的糞便樣本在含有碳水化合物（如果糖或葡萄糖）的合適培養基中厭氧或好氧發酵後產生的酒精濃度來測量（ Yuan 等人 , 2019, 《細胞代謝》 30, 675-688）。還可以通過從受試者的糞便樣本中分離出基因組DNA，對基因組DNA進行定序（例如16S核醣體RNA焦磷酸定序），然後對微生物群組成進行鑒定、分類和豐度分析，來測定受試者體內腸道微生物群的豐度（ Zhu 等人 , 《肝病學》 . 2013 年 2 月 ;57(2):601-9）。為了確定豐度是否增加，可將按上述方法測量的受試者糞便樣本產生的酒精濃度或按上述方法測量和分析的受試者微生物群豐度結果與正常受試者進行比較。
在某些實施例中，所述組合物在飲酒之前、期間或之後施用。在某些實施例中，所述組合物在開始飲酒前至多24小時向受試者施用。
宿醉預防可通過在飲酒前（例如，至多在24、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1或0.5小時前的任何時間）向受試者施用本文提供的組合物來實現。宿醉治療和/或緩解可通過在飲酒期間和/或飲酒後或受試者出現宿醉症狀的任何時間施用本文提供的組合物來實現。例如，可以在飲酒後24、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、1或0.5小時中的任何時間施用所述組合物。
可以通過以規律的間隔（例如，每天一次、每天兩次、每天三次等，持續一定時期）向受試者施用本文提供的組合物來實現酒精性肝病或非酒精性脂肪肝的預防和/或治療。
ALDH2變異等位基因還被發現與數種其它疾病或病理生理狀況相關，包括但不限於胃癌、阿茲海默症（Alzheimer's）、骨質疏鬆症、心肌梗塞、高血壓、食道癌和頭頸癌。因此，本揭露內容還提供了用於預防、治療和/或減緩上述任何疾病或病理生理狀況的發展的方法，其包括向受試者的腸道施用有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精宿醉的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於降低有需要的受試者體內乙醛含量的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或治療有需要的受試者的亞裔臉潮紅的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精性肝病的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性脂肪肝疾病發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性肝炎發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或治療有需要的受試者的非酒精性脂肪肝（NAFLD）或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或減緩有需要的受試者的NAFLD發展為NASH的藥物中的用途。
在另一個方面，本揭露內容還提供了有效量的本文提供的基因工程益生菌腸道細菌或組合物在製造用於預防和/或減緩有需要的受試者的NASH發展為肝纖維化的藥物中的用途。
實例
實例 1. 嚮導 RNA （ gRNA ）質體 ZL-003_kefB 的製備
gRNA質體ZL-003_kefB的示意圖在圖1中示出，所述質體是用本技術領域中已知的常規方法建構的。簡而言之，在目標整合序列的兩條鏈上尋找連同NGG PAM序列一起的20 bp序列（N20NGG），並針對EnN基因組進行blast處理。選擇獨特的20 bp序列作為目標整合位點的sgRNA。選擇sgRNA上游和下游的300-500 bp序列作為左同源臂（LHA）和右同源臂（RHA）。將sgRNA序列添加至ZL-003質體上gRNA支架的反向引子的5'端，然後將gRNA支架與設計的sgRNA序列一起從ZL-003中擴增，將PCR產物和ZL-003質體都進行消化，將消化後的ZL-003質體進行去磷酸化處理，然後與消化後的PCR片段進行連接，生成gRNA質體ZL-003_kefB。
實例 2. 供體基因盒（ kefB_J23119_AcoD 、 kefB_J23101_AcoD 和 kefB_J23108_AcoD ）的設計
欲整合到EcN基因組中的目標基因，即乙醛脫氫酶基因AcoD，來源於鉤蟲貪銅菌。AcoD的胺基酸序列在SEQ ID NO: 1中示出。通過GeneScript（pUC57_ AcoD，SEQ ID NO: 2）在基因轉殖質體（例如pUC57）上合成目標基因。從質體pUC57_ AcoD中擴增目標基因，從EcN的基因組中擴增所選整合位點的LHA和RHA。用於這些片段的PCR的引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以通過重疊PCR與LHA和RHA側翼的目標基因連接。線性PCR產物用作供體基因盒。
具體而言，用於EcN_kefB_J23119_AcoD盒的PCR的引子分別列於下表3。引子1和2用於使用高保真熱穩定DNA聚合酶從質體pUC57-AcoD（由上海桑尼生物科技有限公司合成）擴增AcoD片段。引子3和4用於從實驗室合成的質體ZL-003_kefB_J23119-GFP擴增終止子-kefB RH臂片段。引子5和6用於從實驗室合成的質體ZL-003_kefB_J23119-GFP擴增KefB LH臂-J23119-RBS片段。最後使用引子5和4以AcoD片段、終止子-kefB RH臂片段和KefB LH臂-J23119-RBS片段為模板擴增kefB_J23119-AcoD（SEQ ID NO: 7）片段。除了使用不同的啟動子外，以相同的方式合成kefB_J23101_AcoD片段和kefB_J23108_AcoD片段。
表3. kefB_J23119-AcoD引子
引子編號 名稱 序列 SEQ ID NO.
1 RBS-AcoD-f CGAGGAAAGAGGAGAAAGAAGCTTATGAATATGGCAGAAATTGCCCAG 95
2 AcoD-ter-r ATCTACACTAGCACTATCGAGCTCTTAAAAAAAGCCCAGGGCATTCGG 96
3 AcoD-ter-f CCGAATGCCCTGGGCTTTTTTTAAGAGCTCGATAGTGCTAGTGTAGAT 97
4 kefB RH-r ACTCAAATTCATCCCAGCCGTCCAGCTG 98
5 kefB LH-f TTGTTTATGGATGCGCTGGGGTTGTCGATGG 99
6 RBS-AcoD-r CTGGGCAATTTCTGCCATATTCATAAGCTTCTTTCTCCTCTTTCCTCG 100
如圖2所示，kefB-J23119-AcoD、kefB-J23101-AcoD和kefB-J23108-AcoD片段經確認大小正確（2489 bp），可用於下一步的進一步基因組整合。
SEQ ID NO: 1（來自鉤蟲貪銅菌的AcoD的胺基酸序列）
Figure 02_image001
SEQ ID NO: 2（pUC57-AcoD質體）
Figure 02_image003
Figure 02_image005
SEQ ID NO: 111（密碼子最佳化的AcoD）
Figure 02_image007
實例 3. 基因工程 EcN 的建構
製備電穿孔感受態 EcN細胞。將200 ng如實例1中所述的gRNA切割質體ZL-003_kefB和2 μg如實例2中所述的用於同源重組的供體RNA片段添加至100 μL的電穿孔感受態細胞中。混合後將細胞轉移到預先冷卻的2 mm電穿孔比色皿中，並在表4所列條件下進行電穿孔。轉化後，將細胞回收於30℃的900 μL SOC培養基中，並在220RPM中培育3小時。此後，將細胞接種於補充有50 μg/mL壯觀黴素、50 μg/mL鏈黴素和100 μg/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上，並在30℃下培育過夜。
表4 電穿孔條件
參數 條件
電壓（V） 2500
電容（μF） 25
電阻（Ω） 200
電穿孔比色皿（mm） 2
1.     PCR驗證
從三個平板中各挑取8個單菌落：EcN/kefB::J23119-AcoD、EcN/kefB::J23101-AcoD和EcN/kefB::J23108-AcoD，並重懸於30 μL LB培養基中進行PCR驗證。以1 μL細菌懸浮液為模板，使用引子kefB-verify-f：GCAGACGAACATTTCGACTG（SEQ ID NO: 101）和kefB-verify-r：ATCGCCATTGAATCCTGTGC（SEQ ID NO: 102）進行PCR驗證（2×rapid Taq Master Mix）。PCR反應系統在表5中示出。
表5 2×Rapid Taq Master Mix（50 μL）的PCR反應系統
試劑 體積
2 × Rapid Taq Master Mix 25 μL
引子1（10 μM） 1 μL
引子2（10 μM） 1 μL
細菌懸浮液 1 μL
H 2O 補足至50 μg
PCR反應條件列於表6中。
表6 Taq的PCR過程
步驟 溫度 時間 過程
預變性 98℃ 5min  
變性 98℃ 15s （變性 退火 延伸）持續35個循環
退火 (Tm-2)℃ 15s
延伸 68℃ 1kb/15s
保存 16℃ -----  
將電泳結果中表現出與目標帶一致的菌株的PCR產物進一步送去定序（上海桑尼生物科技有限公司）。從定序結果中選擇基因組整合正確的菌株作為基因工程菌株，包括EcN/kefB::J23119-AcoD（改造細菌119）、EcN/kefB::J23101-AcoD（改造細菌101）和EcN/kefB:: J23108-AcoD（改造細菌108）。
2.     分子伴侶質體的建構
使用購自寶日醫生物技術(北京)有限公司的分子伴侶質體pKJE7（表達分子伴侶：dnaK、dnaJ和grpE）和pGro-TF2（表達分子伴侶：groES、groEL和tig）進行分子伴侶基因擴增。
使用引子grpE-ter-f：ACTGTAGCGAAAGCAAAAGCTTAATAACGCTGATAGTGCTAG TGTAGATCGC（SEQ ID NO: 103）和RBS-dnaK-r：AGGTCGATACCAATTATTTTACCC ATTGAGACCTTTCTCCTCTTTCCTCG（SEQ ID NO: 104），以ZL-003_lldD為模板（保存在我們實驗室中），使用高保真DNA聚合酶KOD擴增ZL-003_lldD骨架。同時，使用引子RBS-dnaK-f：GAAAGAGGAGAAAGGTCTCAATGGGTAAAATAATTGGTATCGACCT（SEQ ID NO: 105）和grpE-ter-r：CACTAGCACTATCAGCGTTATTAAGCTTTTGCTTTCGC TACAGT（SEQ ID NO: 106），以質體Pkje7為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD擴增dnaK-dnaJ-grpE片段。使用Clon Express Ultra一步基因轉殖試劑盒連接ZL-003_lldD骨架和dnaK-dnaJ-grpE片段，得到整合質體ZL-003_IldD-J23115-KJE（SEQ ID NO: 8）。
使用引子tig-ter-f：CTGATGAACCAGCAGGCGTAATAACGCTGATAGTGCTAGTGTA GATCGC（SEQ ID NO: 107）和RBS-groES-r：CGATCATGCAATGGACGAATATTCATTGA GACCTTTCTCCTCTTTCCTC（SEQ ID NO: 108），以ZL-003_tkrA為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD擴增ZL-003_tkrA骨架。同時，使用引子RBS-groES-f：GAAAGAGGAGAAAGGTCTCAATGAATATTCGTCCATTGCATGATCG（SEQ ID NO: 109）和tig-ter-r：CACTAGCACTATCAGCGTTATTACGCCTGCTGGTTCATCAG（SEQ ID NO: 110），使用KOD DNA聚合酶以質體pG-TF2為模板擴增groES-groEL-tig片段。使用Clon Express Ultra一步基因轉殖試劑盒連接ZL-003_tkrA骨架和groES-groEL-tig片段，得到整合質體ZL-003_tkrA-J23115-Gro（SEQ ID NO: 9）。
製備119-4（EcN/kefB::J23119-AcoD-4）感受態細胞，然後分別用質體ZL-003_IldD-J23115-KJE和ZL-003_tkrA-J23115-Gro進行轉化。經過PCR驗證和定序後，獲得了目標菌株119-4/IldD:: J23115-KJE和119-4/tkrA:: J23115-Gro。
本發明所用質體和菌株分別列於表7和表8中。
表7 本研究中使用的質體和DNA片段
名稱 功能 SEQ ID 號 來源
ZL-003_kefB kefB基因切割質體 SEQ ID NO:6 存放在我們實驗室
pUC57-AcoD AcoD基因模板 SEQ ID NO:2 由上海桑尼生物科技有限公司合成
kefB-J23119-AcoD 整合片段（J23119-AcoD整合到位點kefB） SEQ ID NO:7 通過本研究建構
ZL-003_IldD-J23115-KJE 整合質體（dnaK-dnaJ-grpE基因整合到位點IldD） SEQ ID NO:8 通過本研究建構
ZL-003_tkrA-J23115-Gro 整合質體（groES-groEL-tig基因整合到位點tkrA） SEQ ID NO:9 通過本研究建構
表8 本研究中使用的菌株
菌株名稱 基因型 基礎細菌 來源
對照細菌 大腸桿菌nissle 1917（EcN）   中國普通微生物菌種保藏管理中心
改造細菌119 EcN/kefB::J23119-AcoD EcN   通過本研究建構
改造細菌101 EcN/kefB::J23101-AcoD EcN 通過本研究建構
改造細菌108 EcN/kefB::J23108-AcoD EcN 通過本研究建構
KJE EcN/kefB::J23119-AcoD/IldD::J23115- dnaK-dnaJ-grpE 改造細菌119 通過本研究建構
Gro EcN/kefB::J23119-AcoD/tkrA::groES- groEL-tig 改造細菌119 通過本研究建構
圖3B顯示，改造細菌119中AcoD基因的轉錄含量是改造細菌101的三倍，是改造細菌108的六倍。結合圖3A所示結果，表明改造細菌119中的啟動子J23119在本發明中是較佳的。
SEQ ID NO: 3（啟動子J23119-RBS）
Figure 02_image009
SEQ ID NO: 4（啟動子J23101-RBS）
Figure 02_image011
SEQ ID NO: 5（啟動子J23108-RBS）
Figure 02_image013
SEQ ID NO: 6（ZL-003_kefB質體：kefB LH臂-啟動子J23119-RBS-kefB RH臂）
Figure 02_image015
Figure 02_image017
SEQ ID NO: 7（kefB-J23119-AcoD質體：KefB LH臂-啟動子J23119-RBS- AcoD- 終止子-KefB LH臂）
Figure 02_image019
Figure 02_image021
Figure 02_image023
SEQ ID NO:8（ZL-003_IldD-J23115-KJE質體：IldD LH臂-啟動子J23115-RBS- KJE-IldD RH臂-IldD-gRNA）
Figure 02_image025
Figure 02_image027
Figure 02_image029
Figure 02_image031
SEQ ID NO:9（ZL-003_tkrA-J23115-Gro質體：tkrA LH臂-啟動子J23115-RBS- Gro-tkrA RH臂-tkrA-gRNA）
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
實例 4. 對改造細菌菌株的乙醛代謝活性的檢測
1.     對改造細菌菌株的乙醛耐受性的檢測
從對照細菌，改造細菌119和改造細菌101中挑取單菌落，分別接種於含有0 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、30 mM乙醛的LB瓊脂平板上，並在37℃下生長過夜。結果表明，即使在15 mM的乙醛濃度下，對照細菌，改造細菌119和改造細菌101也可以正常生長（圖3）。
2.     在體外對改造細菌菌株的乙醛代謝活性的檢測
1)     改造細菌反應樣品的製備 (1)     取一定量的細菌在室溫下離心，重懸於1500 μL 10 mM乙醛（用無菌水製備）中並在37℃下反應1小時。 (2)     離心後收穫100 μl上清液，並用900 μL無菌水稀釋10倍以進一步檢測。
2)     標準樣品的製備： (1)     將2 M乙醛用無菌水稀釋至10 mM，以與改造細菌培養基反應。 (2)     將2 M乙醛用無菌水稀釋至1 mM、0.5 mM和0.25 mM，以供我們作為HPLC標準品。
3)     乙醛衍生 (1)     衍生試劑的製備：將25 ml的10%鹽酸（23 ml 35% HCl + 77 ml H 2O）添加至12 mg的2,4-二硝基苯肼（2,4-DNPH，生工生物工程(上海)股份有限公司，分析試劑）中，並通過超音波溶解，得到衍生試劑。 (2)     衍生反應：在1.5 mL EP管中，加入900 μl超純水、300 μl改造細菌反應樣品或標準溶液，然後加入300 μl按上述方法製備的2,4-二硝基苯肼溶液。充分混合後，接著將該管在60℃下培育60分鐘。在冰上冷卻後，在HPLC檢測前立即應用0.22 μm水系統濾膜過濾。 (3)     HPLC檢測：將20 μL樣品在Athena C18 HPLC柱（上海安譜實驗科技股份有限公司，4.6×250 mm，5 μm）上進行HPLC檢測。樣品以1.0mL·min -1運行，其中流動相為H 2O:乙腈（40:60），柱溫為40℃。在360 nm的檢測波長下檢測樣品。 (4)     檢測結果：圖4顯示，與對照菌株相比，6×10 9CFU的119菌株反應1h後剩餘乙醛低於1 mM；6×10 9CFU的101菌株反應1.5h後的剩餘乙醛低於1mM；6×10 9CFU的108菌株反應1.5h後的剩餘乙醛為4.4mM。這表明啟動子的強度會影響醛脫氫酶的活性。一般認為，較強的啟動子更可能對細菌菌株的生長產生負面影響。然而，本揭露內容的發明人卻預想不到地發現，包含最強啟動子J23119的細菌菌株和包含相對較弱的啟動子J23101的細菌菌株都可以良好生長，並且可以耐受濃度高達15 mM的乙醛（圖3A）。本揭露內容的發明人還令人驚訝地發現，選擇 EcN作為基礎細菌比其他細菌菌株，例如枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）具有優勢。圖4顯示，本發明的6×10 9CFU的119菌株在10 mM乙醛中反應1h後，可以消耗約90%的乙醛，這比如ZBiotics等人，US2019076489A1中所示的工程枯草芽孢桿菌的乙醛降解效率高得多（其用相同量的細菌和培育相同的時間，只降解了約40%的乙醛）。
圖6顯示，在乙醛起始濃度為10 mM的情況下，與對照菌株相比，過量表達分子伴侶：groES-groEL-tig的改造細菌119/Gro與過量表達dnaK-dnaJ-grpE的改造細菌119/KJE在1h內均能消耗9 mM左右的乙醛。這些數據表明，過表達分子伴侶對乙醛脫氫酶的催化活性有一定促進作用，但影響並不顯著。
實施例 5 改造細菌菌株的最佳化
1.     乙醛脫氫酶
考慮到Nissle1917菌株自身同樣表達乙醛脫氫酶（AldB）基因，如前面的結果顯示，單獨的Nissle1917菌株對乙醛的代謝效率很低，我們推測如果增加AldB的表達量，也有可能提高菌株代謝乙醛的活性。於是，本實施例在Nissle1917基因組的kefB位點插入單拷貝的J23119-AldB表達盒（序列如SEQ ID NO: 112所示，），建構了過表達AldB的改造菌株。結果如圖7所示，過表達AldB的改造菌株相比於Nissle1917天然菌株，乙醛的代謝效率顯著提高，在10mM乙醛中反應1h後，能降解5mM左右的乙醛，這說明提高大腸桿菌內源AldB基因確實能夠提高乙醛代謝活性，不過與插入J23119-AcoD表達盒的改造菌株119相比，改造菌株119能夠在相同時間內代謝9mM乙醛，遠高於過表達AldB的改造菌株。由此可見，本實施例意外的證實了使用來自鉤蟲貪銅菌的AcoD相比於nissle1917菌株自身內源的AldB，更適合於乙醛代謝改造菌株的建構。
包含J23119-AldB表達盒的序列如下，其中大寫正體為kefB的上下游同源片段，斜體部分為AldB基因的表達盒，包含啟動子、AldB基因及T7終止子，小寫斜體序列為J23119啟動子及RBS位點，大寫斜體加下劃線序列為AldB基因的開放閱讀框架。 TTGTTTATGGATGCGCTGGGGTTGTCGATGGCGCTCGGTACGTTTATTGCGGGTGTGCTACTGGCGGAAAGTGAATATCGCCATGAACTGGAAACGGCTATCGATCCCTTCAAAGGCTTGCTGCTCGGTTTGTTCTTTATCTCTGTCGGCATGTCGCTCAACCTCGGGGTGCTTTATACCCATCTGTTGTGGGTAGTGATAAGTGTGGTTGTGCTGGTGGCGGTGAAAATTCTCGTGCTGTATCTGCTGGCGCGATTGTATGGCGTGCGCAGTTCTGAGCGGATGCAGTTTGCTGGCGTGTTGAGTCAGGGCGGTGAGTTTGCCTTTGTCCTCTTTTCTACCGCTTCTTCACAACGCTTATTCCAGGGCGACCAGATT ctagagtctcgagttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagctt ATGACCAATAATCCCCCTTCAGCACAGATTAAGCCCGGCGAGTATGGTTTCCCCCTCAAGTTAAAAGCCCGCTATGACAACTTTATTGGCGGCGAATGGGTAGCCCCTGCCGACGGCGAGTATTACCAGAATCTGACGCCGGTGACCGGGCAGCTGCTGTGCGAAGTGGCGTCTTCGGGCAAACGAGACATCGATCTGGCGCTGGATGCTGCGCACAAAGTGAAAGATAAATGGGCGCACACCTCGGTGCAGGATCGTGCGGCGATTCTGTTTAAGATTGCCGATCGAATGGAACAAAACCTCGAGCTGTTAGCGACAGCTGAAACCTGGGATAACGGCAAACCCATTCGCGAAACCAGTGCTGCGGATGTACCGCTGGCGATTGACCATTTCCGCTATTTCGCCTCGTGTATTCGGGCGCAGGAAGGTGGGATCAGTGAAGTTGATAGCGAAACCGTGGCCTATCATTTCCATGAACCGTTAGGCGTGGTGGGGCAGATTATCCCGTGGAACTTCCCGCTGCTGATGGCGAGCTGGAAAATGGCTCCCGCGCTGGCGGCGGGCAACTGTGTGGTGCTGAAACCCGCACGTCTTACCCCGCTTTCTGTACTGCTGCTAATGGAAATTGTCGGTGATTTACTGCCGCCGGGCGTGGTGAACGTGGTCAATGGCGCAGGTGGGGTAATTGGCGAATATCTGGCGACCTCGAAACGCATCGCCAAAGTGGCGTTTACCGGCTCAACGGAAGTGGGCCAACAAATTATGCAATACGCAACGCAAAACATTATTCCGGTGACGCTGGAGTTGGGCGGTAAGTCGCCAAATATCTTCTTTGCTGATGTGATGGATGAAGAAGATGCCTTTTTCGATAAAGCGCTGGAAGGCTTTGCACTGTTTGCCTTTAACCAGGGCGAAGTTTGCACCTGTCCGAGTCGTGCTTTAGTGCAGGAATCTATCTACGAACGCTTTATGGAACGCGCCATCCGCCGTGTCGAAAGCATTCGTAGCGGTAACCCGCTCGACAGCGTGACGCAAATGGGCGCGCAGGTTTCTCACGGGCAACTGGAAACCATCCTCAACTACATTGATATCGGTAAAAAAGAGGGCGCTGACGTGCTCACAGGCGGGCGGCGCAAGCTGCTGGAAGGTGAACTGAAAGACGGCTACTACCTCGAACCGACGATTCTGTTTGGTCAGAACAATATGCGGGTGTTCCAGGAGGAGATTTTTGGCCCGGTGCTGGCGGTGACCACCTTCAAAACGATGGAAGAAGCGCTGGAGCTGGCGAACGATACGCAATATGGCCTGGGCGCGGGCGTCTGGAGCCGCAACGGTAATCTGGCCTATAAGATGGGGCGCGGCATACAGGCTGGGCGCGTGTGGACCAACTGTTATCACGCTTACCCGGCACATGCGGCGTTTGGTGGCTACAAACAATCAGGTATCGGTCGCGAAACCCACAAGATGATGCTGGAGCATTACCAGCAAACCAAGTGCCTGCTGGTGAGCTACTCGGATAAACCGTTGGGGCTGTTCTGAGAGCTCGATAGTGCTAGTGTAGATCGCTACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCG TTTATATACTAGAAGCGGCCGCTGCAGTTGCATATTCTTGCGCGAGCGCGCGGACGTGTGGAAGCGCATGAGTTATTACAGGCAGGGGTGACGCAGTTTTCCCGTGAAACATTCTCCAGTGCGTTAGAGCTGGGGCGCAAGACGCTGGTCACGCTTGGCATGCATCCGCATCAGGCGCAGCGCGCGCAACTGCATTTTCGCCGCCTGGATATGCGAATGCTGCGGGAGTTAATCCCGATGCATGCTGATACCGTACAAATTTCTCGCGCCAGGGAAGCCCGACGTGAACTGGAAGAGATTTTCCAGCGTGAAATGCAACAAGAACGACGCCAGCTGGACGGCTGGGATGAATTTGAG （SEQ ID NO: 114）
2. 順反子
本實施例進一步研究了在AcoD的開放性閱讀框架內（ORF）前添加BCD2順反子（序列如SEQ ID NO: 62所示），是否能夠進一步提高改造菌株代謝乙醛的活性。在Nissle1917菌株的基因組kefB位點插入單拷貝的J23119-BCD2-AcoD表達盒（序列如SEQ ID NO：113所示），從而建構了AcoD開放閱讀框前攜帶有BCD2順反子的改造菌株。結果如圖8所示，與不含BCD2順反子的AcoD菌株相比，含有BCD2的改造菌株代謝掉90%的乙醛僅需45min，而AcoD菌株需要1h。這說明了添加順反子能夠進一步提高工程菌的乙醛代謝活性。
包含J23119-BCD2-AcoD表達盒的序列如下，其中大寫正體為kefB的上下游同源片段，斜體部分為AcoD基因的表達盒，包含啟動子、BCD2順反子、AcoD基因及T7終止子，小寫斜體序列為J23119啟動子及RBS位點，大寫斜體加下劃線序列為AcoD基因的開放閱讀框架，大寫斜體加雙下劃線序列為BCD2順反子。 TTGTTTATGGATGCGCTGGGGTTGTCGATGGCGCTCGGTACGTTTATTGCGGGTGTGCTACTGGCGGAAAGTGAATATCGCCATGAACTGGAAACGGCTATCGATCCCTTCAAAGGCTTGCTGCTCGGTTTGTTCTTTATCTCTGTCGGCATGTCGCTCAACCTCGGGGTGCTTTATACCCATCTGTTGTGGGTAGTGATAAGTGTGGTTGTGCTGGTGGCGGTGAAAATTCTCGTGCTGTATCTGCTGGCGCGATTGTATGGCGTGCGCAGTTCTGAGCGGATGCAGTTTGCTGGCGTGTTGAGTCAGGGCGGTGAGTTTGCCTTTGTCCTCTTTTCTACCGCTTCTTCACAACGCTTATTCCAGGGCGACCAGATT ctagagtctcgagttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcctcgaggaaagaggagaaagAAGCTT ATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCTAAGGAGGTTTTCTA ATGAATATGGCAGAAATTGCCCAGCTGGGTGTGAGTAATCCGTATAAACAGCAGTATGAAAATTATATTGGTGGTGCATGGGTTCCGCCAGCTGGCGGTGAATATTTTGAATCAACCACCCCGATTACCGGCAAACCGTTTACCCGTGTTCCGCGTAGCGGTCAGCAGGATGTGGATGCCGCACTGGATGCAGCACATGCAGCCAAAGCCGCATGGGCACGTACCTCTACCACCGAACGTGCCAATATTCTGAATCGCATTGCCGATCGCATTGAAGCCAATCTGAAACTGCTGGCAGTTGCCGAATCTATTGATAATGGTAAACCGGTTCGTGAAACCACCGCCGCCGATCTGCCGTTAGCAGTGGATCATTTTCGCTATTTTGCAGGTTGTATTCGCGCCCAGGAAGGCGGCATTAGCGAAATTGATGCAGATACCATTGCATATCATTTTCATGAACCGTTAGGCGTTGTGGGCCAGATTATTCCGTGGAATTTTCCGCTGTTAATGGCAACCTGGAAACTGGCCCCGGCCTTAGCAGCAGGTAATTGTGTTGTGCTGAAACCCGCCGAACAGACCCCGGCCTCAATTCTGGTGTTAATGGAAGTGATTGGCGATTTACTGCCGCCGGGCGTTGTTAATGTGATTAATGGCTTTGGCTTAGAAGCAGGTAAACCGCTGGCAAGCTCTCCGCGCATTTCTAAAGTTGCCTTTACCGGCGAAACCACCACCGGTCGTCTGATTATGCAGTATGCAAGTCAGAATCTGATTCCGGTGACCTTAGAACTGGGTGGTAAAAGTCCGAATATTTTTTTTGAAGATGTGCTGGCCGCCGATGATGCCTTTTTTGATAAAGCCCTGGAAGGCTTTGCCATGTTTGCACTGAATCAGGGCGAAGTTTGTACCTGTCCGTCACGCGCACTGATTCAGGAATCAATTTATGATCGCTTTATGGAACGCGCCTTAAAACGGGTTGCAGCAATTCGTCAGGGCCATCCGTTAGATACCGGTACCATGATTGGCGCACAGGCCTCTGCCGAACAGTTAGAAAAAATTCTGAGCTATATTGATCTGGGTCGCAAAGAAGGCGCCCAGTGTCTGACCGGCGGTGAACGTAATGTGCTGGATGGCGATTTAGCCGGTGGCTATTATGTTAAACCGACCGTGTTTGCAGGTCATAATAAAATGCGCATTTTTCAGGAAGAAATTTTTGGTCCGGTTGTGAGCGTGACCACCTTTAAAGATGAAGAAGAAGCCTTAGCCATTGCCAATGATACCCTGTATGGTTTAGGTGCAGGCGTGTGGACCCGCGATGGTGCACGCGCCTTTCGTATGGGTCGTGGTATTCAGGCAGGTCGCGTTTGGACCAATTGTTATCATGCCTATCCGGCACATGCAGCCTTTGGCGGCTATAAACAGAGCGGTATTGGTCGCGAAAATCATCGTATGATGTTAGATCATTATCAGCAGACCAAAAATCTGTTAGTGTCTTATAGTCCGAATGCCCTGGGCTTTTTTTAAGAGCTCGATAGTGCTAGTGTAGATCGCTACTAGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCG TTTATATACTAGAAGCGGCCGCTGCAGTTGCATATTCTTGCGCGAGCGCGCGGACGTGTGGAAGCGCATGAGTTATTACAGGCAGGGGTGACGCAGTTTTCCCGTGAAACATTCTCCAGTGCGTTAGAGCTGGGGCGCAAGACGCTGGTCACGCTTGGCATGCATCCGCATCAGGCGCAGCGCGCGCAACTGCATTTTCGCCGCCTGGATATGCGAATGCTGCGGGAGTTAATCCCGATGCATGCTGATACCGTACAAATTTCTCGCGCCAGGGAAGCCCGACGTGAACTGGAAGAGATTTTCCAGCGTGAAATGCAACAAGAACGACGCCAGCTGGACGGCTGGGATGAATTTGAGT （SEQ ID NO: 115）
3.     在體內對改造細菌菌株的乙醛代謝活性的檢測
動物實驗委託澎立生物醫藥技術(上海)有限公司進行。將8-9週齡的雄性SD大鼠隨機分為兩組，每組6隻大鼠。每組進行500 μL（5×10 11CFU）對照細菌或改造細菌119的胃內施用。3小時後，每隻大鼠以2 g/kg體重的劑量口服乙醇（使用製備的60%酒精（V/10））。在口服乙醇後0、1、2.5和5小時，從頸靜脈取血並收集其中的血清。
1)     乙醇/乙醛標準品的製備：採集同齡非實驗SD大鼠血清樣品，向其中添加一定濃度的乙醇和乙醛（三種標準品分別含有40 μm乙醇和4 μm乙醛、20 μm乙醇和2 μm乙醛、以及10 μm乙醇和1 μm乙醛）。
2)     血清中酒精和乙醛含量的檢測（頂空氣相色譜法） (1)     檢測條件：在FID檢測器中，當樣品注入器和檢測器加熱至140℃，柱烘箱由35℃逐漸加熱至70℃，並且載氣（N2）、H2和空氣的流速分別為20、50和500 Ml/min時，對0.2 ml頂空樣品進行檢測。 (2)     樣品分析：將如上所述製備的100 μl實驗動物血清樣品或100 μl乙醇/乙醛標準品加入相應的頂空瓶中，然後在70℃的培育箱中培育20分鐘，提取0.2 ml頂空氣體並注入色譜儀進行分析。 (3)     檢測結果：圖5顯示，用乙醇餵養後一小時，用改造細菌餵養的大鼠體內剩餘乙醇含量和乙醛含量不到用對照細菌餵養的大鼠的一半。趨勢線表明，用改造細菌餵養的大鼠體內乙醇和乙醛的代謝速率明顯快於用對照細菌餵養的大鼠。
乙醇含量的變化：用乙醇餵養後1小時，對照細菌組和改造細菌組血液中的乙醇含量分別為53.65±17.88 μM和20.76±8.39 μM。用乙醇餵養後2.5小時，上述各組血液中的乙醇含量分別為25.86±17.19 μM和18.03±5.01 μM。5小時後，兩組血液中的酒精含量恢復到正常含量。
乙醛含量的變化：用乙醇餵養後1小時，對照細菌組和改造細菌組血液中的乙醛含量分別為8.12±1.20 μM和4.23±1.39 μM。用乙醇餵養後2.5小時，上述各組血液中的乙醛含量分別為3.34±0.19 μM和2.12±0.81 μM。5小時後，兩組血液中的乙醛恢復到正常含量。。
無
圖1示出了gRNA質體ZL-003_kefB的質體圖譜。
圖2示出了kefB-J23119-AcoD、kefB-J23101-AcoD和kefB-J23108-AcoD的PCR電泳圖。
圖3A示出了對照細菌、改造細菌119和改造細菌101的耐受性試驗結果。
圖3B示出了改造細菌119、改造細菌101和改造細菌108中AcoD的相對表達含量。
圖4示出了對照細菌、改造細菌119、改造細菌101和改造細菌108體外去除乙醛的能力。
圖5示出了對照細菌和改造細菌119體內去除乙醛的能力。
圖6示出了對照細菌、改造細菌119、表達Gro的改造細菌119和表達KJE的改造細菌119體外去除乙醛的能力。
圖7示出了對照細菌（EcN）、改造細菌119-AcoD（119-AcoD）、J23119啟動子過表達大腸桿菌內源119-AldB基因的改造菌株AldB（119-aldB）體外去除乙醛的能力。
圖8 示出了對照細菌（EcN）、改造細菌AcoD（AcoD）、AcoD開放性閱讀框架前添加BCD2順反子的改造細菌BCD2（BCD2）去除乙醛的能力。
無
 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  大陸商和度生物醫藥(上海)有限公司(COMMBIO THERAPEUTICS CO., LTD.)]]>
          <![CDATA[<120>  用於預防和/或治療宿醉和肝病的基因工程細菌]]>
          <![CDATA[<140>  TW111104590]]>
          <![CDATA[<141>  2022-02-08]]>
          <![CDATA[<150>  PCT/CN2021/076102]]>
          <![CDATA[<151>  2021-02-08]]>
          <![CDATA[<160>  115   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  506]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  鉤蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Asn Met Ala Glu Ile Ala Gln Leu Gly Val Ser Asn Pro Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Gln Tyr Glu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Trp Val Pro Pro Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Glu Tyr Phe Glu Ser Thr Thr Pro Ile Thr Gly Lys Pro Phe Thr 
                  35                  40                  45              
          Arg Val Pro Arg Ser Gly Gln Gln Asp Val Asp Ala Ala Leu Asp Ala 
              50                  55                  60                  
          Ala His Ala Ala Lys Ala Ala Trp Ala Arg Thr Ser Thr Thr Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Asn Ile Leu Asn Arg Ile Ala Asp Arg Ile Glu Ala Asn Leu Lys 
                          85                  90                  95      
          Leu Leu Ala Val Ala Glu Ser Ile Asp Asn Gly Lys Pro Val Arg Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Thr Ala Ala Asp Leu Pro Leu Ala Val Asp His Phe Arg Tyr Phe 
                  115                 120                 125             
          Ala Gly Cys Ile Arg Ala Gln Glu Gly Gly Ile Ser Glu Ile Asp Ala 
              130                 135                 140                 
          Asp Thr Ile Ala Tyr His Phe His Glu Pro Leu Gly Val Val Gly Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Ala Thr Trp Lys Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Cys Val Val Leu Lys Pro Ala Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Thr Pro Ala Ser Ile Leu Val Leu Met Glu Val Ile Gly Asp Leu Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Pro Gly Val Val Asn Val Ile Asn Gly Phe Gly Leu Glu Ala Gly 
              210                 215                 220                 
          Lys Pro Leu Ala Ser Ser Pro Arg Ile Ser Lys Val Ala Phe Thr Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Thr Thr Thr Gly Arg Leu Ile Met Gln Tyr Ala Ser Gln Asn Leu 
                          245                 250                 255     
          Ile Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Asn Ile Phe Phe 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Val Leu Ala Ala Asp Asp Ala Phe Phe Asp Lys Ala Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Ala Met Phe Ala Leu Asn Gln Gly Glu Val Cys Thr Cys Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Arg Ala Leu Ile Gln Glu Ser Ile Tyr Asp Arg Phe Met Glu Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Leu Lys Arg Val Ala Ala Ile Arg Gln Gly His Pro Leu Asp Thr 
                          325                 330                 335     
          Gly Thr Met Ile Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Gln Leu Glu Lys Ile 
                      340                 345                 350         
          Leu Ser Tyr Ile Asp Leu Gly Arg Lys Glu Gly Ala Gln Cys Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Gly Gly Glu Arg Asn Val Leu Asp Gly Asp Leu Ala Gly Gly Tyr Tyr 
              370                 375                 380                 
          Val Lys Pro Thr Val Phe Ala Gly His Asn Lys Met Arg Ile Phe Gln 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Val Ser Val Thr Thr Phe Lys Asp Glu 
                          405                 410                 415     
          Glu Glu Ala Leu Ala Ile Ala Asn Asp Thr Leu Tyr Gly Leu Gly Ala 
                      420                 425                 430         
          Gly Val Trp Thr Arg Asp Gly Ala Arg Ala Phe Arg Met Gly Arg Gly 
                  435                 440                 445             
          Ile Gln Ala Gly Arg Val Trp Thr Asn Cys Tyr His Ala Tyr Pro Ala 
              450                 455                 460                 
          His Ala Ala Phe Gly Gly Tyr Lys Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu Asn 
          465                 470                 475                 480 
          His Arg Met Met Leu Asp His Tyr Gln Gln Thr Lys Asn Leu Leu Val 
                          485                 490                 495     
          Ser Tyr Ser Pro Asn Ala Leu Gly Phe Phe 
                      500                 505     
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  4228]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca       60
          cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg      120
          ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc      180
          accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc      240
          attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat      300
          tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt      360
          tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa      420
          tgcatctaga tatgaatatg gcagaaattg cccagctggg tgtgagtaat ccgtataaac      480
          agcagtatga aaattatatt ggtggtgcat gggttccgcc agctggcggt gaatattttg      540
          aatcaaccac cccgattacc ggcaaaccgt ttacccgtgt tccgcgtagc ggtcagcagg      600
          atgtggatgc cgcactggat gcagcacatg cagccaaagc cgcatgggca cgtacctcta      660
          ccaccgaacg tgccaatatt ctgaatcgca ttgccgatcg cattgaagcc aatctgaaac      720
          tgctggcagt tgccgaatct attgataatg gtaaaccggt tcgtgaaacc accgccgccg      780
          atctgccgtt agcagtggat cattttcgct attttgcagg ttgtattcgc gcccaggaag      840
          gcggcattag cgaaattgat gcagatacca ttgcatatca ttttcatgaa ccgttaggcg      900
          ttgtgggcca gattattccg tggaattttc cgctgttaat ggcaacctgg aaactggccc      960
          cggccttagc agcaggtaat tgtgttgtgc tgaaacccgc cgaacagacc ccggcctcaa     1020
          ttctggtgtt aatggaagtg attggcgatt tactgccgcc gggcgttgtt aatgtgatta     1080
          atggctttgg cttagaagca ggtaaaccgc tggcaagctc tccgcgcatt tctaaagttg     1140
          cctttaccgg cgaaaccacc accggtcgtc tgattatgca gtatgcaagt cagaatctga     1200
          ttccggtgac cttagaactg ggtggtaaaa gtccgaatat tttttttgaa gatgtgctgg     1260
          ccgccgatga tgcctttttt gataaagccc tggaaggctt tgccatgttt gcactgaatc     1320
          agggcgaagt ttgtacctgt ccgtcacgcg cactgattca ggaatcaatt tatgatcgct     1380
          ttatggaacg cgccttaaaa cgggttgcag caattcgtca gggccatccg ttagataccg     1440
          gtaccatgat tggcgcacag gcctctgccg aacagttaga aaaaattctg agctatattg     1500
          atctgggtcg caaagaaggc gcccagtgtc tgaccggcgg tgaacgtaat gtgctggatg     1560
          gcgatttagc cggtggctat tatgttaaac cgaccgtgtt tgcaggtcat aataaaatgc     1620
          gcatttttca ggaagaaatt tttggtccgg ttgtgagcgt gaccaccttt aaagatgaag     1680
          aagaagcctt agccattgcc aatgataccc tgtatggttt aggtgcaggc gtgtggaccc     1740
          gcgatggtgc acgcgccttt cgtatgggtc gtggtattca ggcaggtcgc gtttggacca     1800
          attgttatca tgcctatccg gcacatgcag cctttggcgg ctataaacag agcggtattg     1860
          gtcgcgaaaa tcatcgtatg atgttagatc attatcagca gaccaaaaat ctgttagtgt     1920
          cttatagtcc gaatgccctg ggcttttttt aaggatcccg ggcccgtcga ctgcagaggc     1980
          ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg     2040
          ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa     2100
          tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac     2160
          ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt     2220
          gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga     2280
          gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca     2340
          ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg     2400
          ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt     2460
          cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc     2520
          ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct     2580
          tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc     2640
          gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta     2700
          tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca     2760
          gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag     2820
          tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag     2880
          ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt     2940
          agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa     3000
          gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg     3060
          attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga     3120
          agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta     3180
          atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc     3240
          cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg     3300
          ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga     3360
          agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt     3420
          tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt     3480
          gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc     3540
          caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc     3600
          ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca     3660
          gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag     3720
          tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg     3780
          tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa     3840
          cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa     3900
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          gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga     4020
          atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg     4080
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          ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc       60
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          tctggttgaa gaattcaaga aagatcaggg cattgacctg cgcaacgatc cgctggcaat     1440
          gcagcgcctg aaagaagcgg cagaaaaagc gaaaatcgaa ctgtcttccg ctcagcagac     1500
          cgacgttaac ctgccataca tcactgcaga cgcgaccggt ccgaaacaca tgaacatcaa     1560
          agtgactcgt gcgaaactgg aaagcctggt tgaagatctg gtaaaccgtt ccattgagcc     1620
          gctgaaagtt gcactgcagg acgctggcct gtccgtatct gatatcgacg acgttatcct     1680
          cgttggtggt cagactcgta tgccaatggt tcagaagaaa gttgctgagt tctttggtaa     1740
          agagccgcgt aaagacgtta acccggacga agctgtagca atcggtgctg ctgttcaggg     1800
          tggtgttctg actggtgacg taaaagacgt actgctgctg gacgttaccc cgctgtctct     1860
          gggtatcgaa accatgggcg gtgtgatgac gacgctgatc gcgaaaaaca ccactatccc     1920
          gaccaagcac agccaggtgt tctctaccgc tgaagacaac cagtctgcgg taaccatcca     1980
          tgtgctgcag ggtgaacgta aacgtgcggc tgataacaaa tctctgggtc agttcaacct     2040
          agatggtatc aacccggcac cgcgcggcat gccgcagatc gaagttacct tcgatatcga     2100
          tgctgacggt atcctgcacg tttccgcgaa agataaaaac agcggtaaag agcagaagat     2160
          caccatcaag gcttcttctg gtctgaacga agatgaaatc cagaaaatgg tacgcgacgc     2220
          agaagctaac gccgaagctg accgtaagtt tgaagagctg gtacagactc gcaaccaggg     2280
          cgaccatctg ctgcacagca cccgtaagca ggttgaagaa gcaggcgaca aactgccggc     2340
          tgacgacaaa actgctatcg agtctgcgct gactgcactg gaaactgctc tgaaaggtga     2400
          agacaaagcc gctatcgaag cgaaaatgca ggaactggca caggtttccc agaaactgat     2460
          ggaaatcgcc cagcagcaac atgcccagca gcagactgcc ggtgctgatg cttctgcaaa     2520
          caacgcgaaa gatgacgatg ttgtcgacgc tgaatttgaa gaagtcaaag acaaaaaata     2580
          atcgccctat aaacgggtaa ttatactgac acgggcgaag gggaatttcc tccccgcccg     2640
          tgcattcatc taggggcaat ttaaaaaaga tggctaagca agattattac gagattttag     2700
          gcgtttccaa aacagcggaa gagcgtgaaa tcagaaaggc ctacaaacgc ctggccatga     2760
          aataccaccc ggaccgtaac cagggtgaca aagaggccga ggcgaaattt aaagagatca     2820
          aggaagctta tgaagttctg accgactcgc aaaaacgtgc ggcatacgat cagtatggtc     2880
          atgctgcgtt tgagcaaggt ggcatgggcg gcggcggttc tggcggcggc gcagacttca     2940
          gcgatatttt tggtgacgtt ttcggcgata tttttggcgg cggacgtggt cgtcaacgtg     3000
          cggcgcgcgg tgctgattta cgctataaca tggagctcac cctcgaagaa gctgtacgtg     3060
          gcgtgaccaa agagatccgc attccgactc tggaagagtg tgacgtttgc cacggtagcg     3120
          gtgcaaaacc aggtacacag ccgcagactt gtccgacctg tcatggttct ggtcaggtgc     3180
          agatgcgcca gggattcttc gctgtacagc agacctgtcc acactgtcag ggccgcggta     3240
          cgctgatcaa agatccgtgc aacaaatgtc atggtcatgg tcgtgttgag cgcagcaaaa     3300
          cgctgtccgt taaaatcccg gcaggggtgg acactggaga ccgcatccgt cttgcgggcg     3360
          aaggtgaagc gggcgagcat ggcgcaccgg caggcgatct gtacgttcag gttcaggtta     3420
          aacagcaccc gattttcgag cgtgaaggca acaacctgta ttgcgaagtc ccgatcaact     3480
          tcgctatggc ggcgctgggt ggcgaaatcg aagtaccgac ccttgatggt cgcgtcaaac     3540
          tgaaagtgcc tggcgaaacc cagaccggta agctattccg tatgcgcggt aaaggcgtca     3600
          agtctgtccg cggtggcgcg cagggtgatt tgctgtgccg cgttgtcgtc gaaacaccgg     3660
          taggcctgaa cgaaaggcag aaacagctgc tgcaagagct gcaagaaagc ttcggtggcc     3720
          caaccggcga gcacaacagc ccgcgctcaa agagcttctt tgatggtgtg aagaagtttt     3780
          ttgacgacct gacccgctaa cctcgcggag aaattcatga gtagtaaaga acagaaaacg     3840
          cctgaggggc aagccccgga agaaattatc atggatcagc acgaagagat tgaggcagtt     3900
          gagccagaag cttctgctga gcaggtggat ccgcgcgatg aaaaagttgc gaatctcgaa     3960
          gctcagctgg ctgaagccca gacccgtgaa cgtgacggca ttttgcgtgt aaaagccgaa     4020
          atggaaaacc tgcgtcgtcg tactgaactg gatattgaaa aagcccacaa attcgcgctg     4080
          gagaaattca tcaacgaatt gctgccggtg attgatagcc tggatcgtgc gctggaagtg     4140
          gctgataaag ctaacccgga tatgtctgcg atggttgaag gcattgagct gacgctgaag     4200
          tcgatgctgg atgttgtgcg taagtttggc gttgaagtga tcgccgaaac taacgtccca     4260
          ctggacccga atgtgcatca ggccatcgca atggtggaat ctgatgacgt tgcgccaggt     4320
          aacgtactgg gcattatgca gaagggttat acgctgaatg gtcgtacgat tcgtgcggcg     4380
          atggttactg tagcgaaagc aaaagcttaa taacgctgat agtgctagtg tagatcgcta     4440
          ctagagccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta     4500
          tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc     4560
          ctttctgcgt ttatatacta gaagcggccg ctgcagatcc gcgatttctg ggatggcccg     4620
          atggtgatca aagggatcct cgatccggaa gatgcgcgcg atgcagtacg ttttggtgct     4680
          gatggaattg tggtttctaa ccacggtggc cgccagttag atggcgtact ctcttctgct     4740
          cgtgcactgc ctgctattgc ggatgcggtg aaaggtgata tcgccattct ggcggatagc     4800
          ggaatacgta acgggcttga tgtcgtgcgt atgattgcgc tcggtgccga caccgtactg     4860
          ctgggtcgtg ctttcctgta tgcactggca acagcgggcc aggcgggtgt agctaatctg     4920
          ctaaatctga tcgaaaaaga gatgaaagtg gcgatgacgc tgactggcgc gaaatcgatt     4980
          agcgaaatta cgcaagattc gctggtgcag gggctgggta aagagttgcc tgcggcatgc     5040
          aggaattcaa aaaaagcacc gactcggtgc cactttttca agttgataac ggactagcct     5100
          tattttaact tgctatttct agctctaaaa cagaatgcgc atcacgataa cactagtatt     5160
          atacctagga ctgagctagc tgtcaaggat ccagcatatg cggtgtgaaa taccgcacag     5220
          atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct     5280
          gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt     5340
          atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc     5400
          caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga     5460
          gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata     5520
          ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac     5580
          cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg     5640
          taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc     5700
          cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag     5760
          acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt     5820
          aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt     5880
          atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg     5940
          atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac     6000
          gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca     6060
          gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac     6120
          ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac     6180
          ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt     6240
          tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt     6300
          accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgtgaccca cgctcaccgg ctccagattt     6360
          atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc     6420
          cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa     6480
          tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg     6540
          tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt     6600
          gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc     6660
          agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt     6720
          aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg     6780
          gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac     6840
          tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc     6900
          gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt     6960
          tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg     7020
          aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag     7080
          catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa     7140
          acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtg                              7177
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  6725]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc       60
          acgaggcaga atttcagata aaaaaaatcc ttagctttcg ctaaggatga tttctggaat      120
          tcgcggccgc atctgctgat gcacacacca accgtattaa cagaaaccgt cgccgatacg      180
          ctgatggcgc tggtgttgtc taccgctcgt cgggttgtgg aggtagcaga acgggtaaaa      240
          gcaggcgaat ggaccgcgag cataggcccg gactggtacg gcactgacgt tcaccataaa      300
          acactgggca ttgtcgggat gggacggatc ggcatggcgc tggcacaacg tgcgcacttt      360
          ggcttcaaca tgcccatcct ctataacgcg cgtcgccacc ataaagaagc agaagaacgc      420
          ttcaacgccc gctactgcaa tttggatact ctgttacaag agtcagattt cgtttgcctg      480
          atcctgccgt taacggatga gacgcatcat ctgtttggcg cagaacaatt cgccaaaatg      540
          aaatcctccg ccattttcat taatgccgga cgtggcccgg tggttgatga aaatgcactg      600
          attgctgcat tgcagaaagg ggaaattcac gccgtctaga gtctcgagtt tatagctagc      660
          tcagcccttg gtacaatgct agcctcgagg aaagaggaga aaggtctcaa tgaatattcg      720
          tccattgcat gatcgcgtga tcgtcaagcg taaagaagtt gaaactaaat ctgctggcgg      780
          catcgttctg accggctctg cagcggctaa atccacccgc ggcgaagtgc tggctgtcgg      840
          caatggccgt atccttgaaa atggcgaagt gaagccgctg gatgtgaaag ttggcgacat      900
          cgttattttc aacgatggct acggtgtgaa atctgagaag atcgacaatg aagaagtgtt      960
          gatcatgtcc gaaagcgaca ttctggcaat tgttgaagcg taatccgcgc acgacactga     1020
          acatacgaat ttaaggaata aagataatgg cagctaaaga cgtaaaattc ggtaacgacg     1080
          ctcgtgtgaa aatgctgcgc ggcgtaaacg tactggcaga tgcagtgaaa gttaccctcg     1140
          gtccaaaagg ccgtaacgta gttctggata aatctttcgg tgcaccgacc atcaccaaag     1200
          atggtgtttc cgttgctcgt gaaatcgaac tggaagacaa gttcgaaaat atgggtgcgc     1260
          agatggtgaa agaagttgcc tctaaagcaa acgacgctgc aggcgacggt accaccactg     1320
          caaccgtact ggctcaggct atcatcactg aaggtctgaa agctgttgct gcgggcatga     1380
          acccgatgga cctgaaacgt ggtatcgaca aagcggttac cgctgcagtt gaagaactga     1440
          aagcgctgtc cgtaccatgc tctgactcta aagcgattgc tcaggttggt accatctccg     1500
          ctaactccga cgaaaccgta ggtaaactga tcgctgaagc gatggacaaa gtcggtaaag     1560
          aaggcgttat caccgttgaa gacggtaccg gtctgcagga cgaactggac gtggttgaag     1620
          gtatgcagtt cgaccgtggc tacctgtctc cttacttcat caacaagccg gaaactggcg     1680
          cagtagaact ggaaagcccg ttcatcctgc tggctgacaa gaaaatctcc aacatccgcg     1740
          aaatgctgcc ggttctggaa gctgttgcca aagcaggcaa accgctgctg atcatcgctg     1800
          aagatgtaga aggcgaagcg ctggcaactc tggttgttaa caccatgcgt ggcatcgtga     1860
          aagtcgctgc ggttaaagca ccgggcttcg gcgatcgtcg taaagctatg ctgcaggata     1920
          tcgcaaccct gactggcggt accgtgatct ctgaagagat cggtatggag ctggaaaaag     1980
          caaccctgga agacctgggt caggctaaac gtgttgtgat caacaaagac accaccacta     2040
          tcatcgatgg cgtgggtgaa gaagctgcaa tccagggccg tgttgctcag atccgtcagc     2100
          agattgaaga agcaacttct gactacgacc gtgaaaaact gcaggaacgc gtagcgaaac     2160
          tggcaggcgg cgttgcagtt atcaaagtgg gtgctgctac cgaagttgaa atgaaagaga     2220
          aaaaagcacg cgttgaagat gccctgcacg cgacccgtgc tgcggtagaa gaaggcgtgg     2280
          ttgctggtgg tggtgttgcg ctgatccgcg tagcgtctaa actggctgac ctgcgtggtc     2340
          agaacgaaga ccagaacgtg ggtatcaaag ttgcactgcg tgcaatggaa gctccgctgc     2400
          gtcagatcgt attgaactgc ggcgaagaac cgtctgttgt tgctaacacc gttaaaggcg     2460
          gcgacggcaa ctacggttac aacgcagcaa ccgaagaata cggcaacatg atcgacatgg     2520
          gtatcctgga tccaaccaaa gtaactcgtt ctgctctgca gtacgcagct tctgtggctg     2580
          gcctgatgat caccaccgaa tgcatggtta ccgacctgcc gaaaaacgat gcagctgact     2640
          taggcgctgc tggcggtatg ggcggcatgg gtggcatggg cggcatgatg taattgccct     2700
          gcacctcgca gaaataaaca aacccccctg tgattttttg aggtaacaag atgcaagttt     2760
          cagttgaaac cactcaaggc cttggccgcc gtgtaacgat tactatcgct gctgacagca     2820
          tcgagaccgc tgttaaaagc gagctggtca acgttgcgaa aaaagtacgt attgacggct     2880
          tccgcaaagg caaagtgcca atgaatatcg ttgctcagcg ttatggcgcg tctgtacgcc     2940
          aggacgttct gggtgacctg atgagccgta acttcattga cgccatcatt aaagaaaaaa     3000
          tcaatccggc tggcgcaccg acttatgttc cgggcgaata caagctgggt gaagacttca     3060
          cttactctgt agagtttgaa gtttatccgg aagttgaact gcagggtctg gaagcgatcg     3120
          aagttgaaaa accgatcgtt gaagtgaccg acgctgacgt tgacggcatg ctggatactc     3180
          tgcgtaaaca gcaggcgacc tggaaagaaa aagacggcgc tgttgaagca gaagaccgcg     3240
          taaccatcga cttcaccggt tctgtagacg gcgaagagtt cgaaggcggt aaagcgtctg     3300
          atttcgtact ggcgatgggc cagggtcgta tgatcccggg ctttgaagac ggtatcaaag     3360
          gccacaaagc tggcgaagag ttcaccatcg acgtgacctt cccggaagaa taccacgcag     3420
          aaaacctgaa aggtaaagca gcgaaattcg ctatcaacct gaagaaagtt gaagagcgtg     3480
          aactgccgga actgactgca gaattcatca aacgtttcgg cgttgaagat ggttccgtag     3540
          aaggtctgcg cgctgaagtg cgtaaaaaca tggagcgcga gctgaagagc gccatccgta     3600
          accgcgttaa gtctcaggcg atcgaaggtc tggtaaaagc taacgacatc gacgtaccgg     3660
          ctgcgctgat cgacagcgaa atcgacgttc tgcgtcgcca ggctgcacag cgtttcggtg     3720
          gcaacgaaaa acaagctctg gaactgccgc gcgaactgtt cgaagaacag gctaaacgcc     3780
          gcgtagttgt tggcctgctg ctgggcgaag ttatccgcac caacgagctg aaagctgacg     3840
          aagagcgcgt gaaaggcctg atcgaagaga tggcttctgc gtacgaagat ccgaaagaag     3900
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          aagaacaggc tgttgaagct gtactggcga aagcgaaagt gactgaaaaa gaaaccactt     4020
          tcaacgagct gatgaaccag caggcgtaat aacgctgata gtgctagtgt agatcgctac     4080
          tagagccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat     4140
          ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt cgggtgggcc     4200
          tttctgcgtt tatatactag aagcggccgc tgcagtcgaa caagagccac tgtccgtaga     4260
          ttcgccgttg ctctcaatgg ccaacgtcgt cgcagtaccg catattggat ctgccactca     4320
          tgagacgcgt tatggcatgg ccgcctgtgc cgtggataat ttgattgatg cgttacaagg     4380
          aaaggttgag aagaactgtg tgaatccgca cgtcgcggac taagccgcga ctgcgtggag     4440
          taaagcccga taatcgctcg ggcttttact ctttattggg ttgcagtaac tgctgtagtc     4500
          caggcctgat taaacgcctg atgttgtgcc ggtaatggcg caatcagttt gttatattca     4560
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          ctttttcaag ttgataacgg actagcctta ttttaacttg ctatttctag ctctaaaacc     4680
          cgggctggat gtcttcgaaa ctagtattat acctaggact gagctagctg tcaaggatcc     4740
          agcatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct     4800
          cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat     4860
          cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga     4920
          acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt     4980
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          gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa     5160
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          tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat     6660
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          aagtg                                                                 6725
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          aaagtgtttt gtaatcataa agaaatatta aggtggggta ggaatagtat aatatgttta       60
          ttcaaccgaa cttaatg                                                      77
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          ctaattttcc ttgcggaggc ttgtctgaag cggtttccgc gattttcttc tgtaaattgt      120
          cgctgacaaa aaagattaaa cgtaccttat acaagacttt tttttcatat gcctgacgga      180
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          taagccgaag atatcggtag agttaatatt gagcagatcc ccggtgaagg atttaaccgt      300
          gttatctcgt tggagatatt catggcgtat tttggatga                             339
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          <![CDATA[<400>  23]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          agaggttcca actttcacca taatgaaaca                                        30
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          <![CDATA[<400>  35]]>
          caccttcggg tgggcctttc tgcgtttata                                        30
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          ggctagctca gtcctaggta ctatgctagc                                        30
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          aaagtgtgac gccgtgcaaa taatcaatgt                                        30
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          ggctagctca gtcctaggta ttatgctagc                                        30
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          <![CDATA[<400>  39]]>
          taaacaacta acggacaatt ctacctaaca                                        30
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          <![CDATA[<400>  40]]>
          aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa       60
          ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta tcactcatta ggcaccccag      120
          gctttacact ttatgcttcc ggctcgtata atgtgtggtg ctggttagcg cttgctat        178
          <![CDATA[<210>  41]]>
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          aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa       60
          ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc      120
          gcttgataag gtccacgtag ctgctataat tgcttcaaca gaacatattg actatccggt      180
          attacccggc                                                             190
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  42]]>
          catacgccgt tatacgttgt ttacgctttg                                        30
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          taattcctaa tttttgttga cactctatcg ttgatagagt tattttacca ctccctatca       60
          gtgatagaga aaa                                                          73
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          ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgag                        44
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          <![CDATA[<400>  45]]>
          cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattgtg ag               52
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          tgctagctac tagagattaa agaggagaaa                                        30
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          ggctagctca gtcctaggta cagtgctagc                                        30
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          <![CDATA[<211>  30]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          ccccgaaagc ttaagaatat aattgtaagc                                        30
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          atatatatat atatataatg gaagcgtttt                                        30
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          tccctatcag tgatagagat tgacatccct atcagtgata gagatactga gcacatcagc       60
          aggacgcact gacc                                                         74
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          attccactaa tttattccat gtcacacttt tcgcatcttt gttatgctat ggttatttca       60
          taccataa                                                                68
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          <![CDATA[<400>  52]]>
          ataaatgtga gcggataaca attgacattg tgagcggata acaagatact gagcacatca       60
          gcaggacgca ctgacc                                                       76
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          aaaaacgccg caaagtttga gcgaagtcaa taaactctct acccattcag ggcaatatct       60
          ctctt                                                                   65
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          <![CDATA[<400>  54]]>
          atgaagaaaa agatcattag cgcgatcctg atgagcaccg tgattctgag cgcggcggcg       60
          ccgctgagcg gtgtttatgc g                                                 81
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          <![CDATA[<400>  55]]>
          atgaagaaaa ccgcgattgc gattgcggtg gcgctggcgg gtttcgcgac cgttgcgcag       60
          gcg                                                                     63
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          atgaagaaaa tctggctggc gctggcgggt ctggtgctgg cgttcagcgc gagcgcg          57
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          atgaagaaaa tctggctggc gctggcgggt ctggtgctgg cgttcagcgc gagcgcg          57
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          <![CDATA[<400>  58]]>
          atggaaggaa acactcgtga agacaatttt aaacatttat taggtaatga caatgttaaa       60
          cgc                                                                     63
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          atgaataaaa tatactccct taaatatagt gctgccactg gcggactcat tgctgtttct       60
          gaattagcga aaagagtttc tggtaaaaca aaccgaaaac ttgtagcaac aatgttgtct      120
          ctggctgttg ccggtacagt aaatgca                                          147
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          atgagcaact ggatcaccga caacaaaccg gctgcgatgg ttgcgggtgt gggcctgctg       60
          ctgttcctgg gtctgagcgc gaccggctac                                        90
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          atgcgtaaag gcgaagagaa ggaggttaac tga                                    33
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          atgaaagcaa ttttcgtact gaaacatctt aatcatgcta aggaggtttt cta              53
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          atgattatgt ccggttataa ggaggttaac tga                                    33
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          atgaaaatcg aagcaggtaa actggtacag aaggaggtta actga                       45
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          ggaggaaaaa ttaaaaaaga ac                                                22
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          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          aaagaggaga aa                                                           12
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          000
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  68]]>
          cgagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata aaacgaaagg       60
          ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact      120
          agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacta gaagcggccg      180
          ctgcag                                                                 186
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  69]]>
          cgagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata aaacgaaaga       60
          ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg      120
          ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttta tatactagaa gcggccgctg cag             173
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          ggcgagttaa cgacgacaca                                                   20
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          <![CDATA[<400>  71]]>
          cgttgaactg ggtgtggaat                                                   20
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  72]]>
          ctgaaaccgc tgcggcgatg                                                   20
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          <![CDATA[<400>  73]]>
          gttcgcagtg gaagtaccgt                                                   20
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          ctgtgcaaac aagtgtctca                                                   20
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          gccggaagac actatgaagc                                                   20
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          tcgcacagcg tgtaccacag                                                   20
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          gaaggggaag aggcgcgcgt                                                   20
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          cggtttagtt cacagaagcc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  79]]>
          ttgcgtattt tcaaaaagcg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  80]]>
          tcatcagagt aagtcggata                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          ctgaccaacg cttctttacc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          ccgaagtccc tgtgtgcttt                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          ccctgccact cacaccattc                                                   20
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          <![CDATA[<400>  84]]>
          ccttctcctg gcaagcttac                                                   20
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          <![CDATA[<400>  85]]>
          cgacaagaag tacctgcaac                                                   20
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          gttatcgtga tgcgcattct                                                   20
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          <![CDATA[<400>  87]]>
          taacacccag cccgatgccc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  88]]>
          atattactgg aacaacataa                                                   20
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  89]]>
          ccgtgacgtt atccgcacca                                                   20
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          tatcgccttc atccacacga                                                   20
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          ccgggctgga tgtcttcgaa                                                   20
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          <![CDATA[<400>  92]]>
          gagggtgagc cataatgaag                                                   20
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  93]]>
          ggatatgtgg ggtaacgacg                                                   20
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          acgttcaggc tgctaaagat                                                   20
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          cgaggaaaga ggagaaagaa gcttatgaat atggcagaaa ttgcccag                    48
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          <![CDATA[<400>  96]]>
          atctacacta gcactatcga gctcttaaaa aaagcccagg gcattcgg                    48
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          ccgaatgccc tgggcttttt ttaagagctc gatagtgcta gtgtagat                    48
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          <![CDATA[<400>  98]]>
          actcaaattc atcccagccg tccagctg                                          28
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          <![CDATA[<400>  99]]>
          ttgtttatgg atgcgctggg gttgtcgatg g                                      31
          <![CDATA[<210>  100]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  100]]>
          ctgggcaatt tctgccatat tcataagctt ctttctcctc tttcctcg                    48
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          <![CDATA[<400>  101]]>
          gcagacgaac atttcgactg                                                   20
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          <![CDATA[<400>  102]]>
          atcgccattg aatcctgtgc                                                   20
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          actgtagcga aagcaaaagc ttaataacgc tgatagtgct agtgtagatc gc               52
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          <![CDATA[<400>  104]]>
          aggtcgatac caattatttt acccattgag acctttctcc tctttcctcg                  50
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          <![CDATA[<400>  105]]>
          gaaagaggag aaaggtctca atgggtaaaa taattggtat cgacct                      46
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          <![CDATA[<400>  106]]>
          cactagcact atcagcgtta ttaagctttt gctttcgcta cagt                        44
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          ctgatgaacc agcaggcgta ataacgctga tagtgctagt gtagatcgc                   49
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          <![CDATA[<400>  108]]>
          cgatcatgca atggacgaat attcattgag acctttctcc tctttcctc                   49
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          gaaagaggag aaaggtctca atgaatattc gtccattgca tgatcg                      46
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          cactagcact atcagcgtta ttacgcctgc tggttcatca g                           41
          <![CDATA[<210>  111]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          atgaatatgg cagaaattgc ccagctgggt gtgagtaatc cgtataaaca gcagtatgaa       60
          aattatattg gtggtgcatg ggttccgcca gctggcggtg aatattttga atcaaccacc      120
          ccgattaccg gcaaaccgtt tacccgtgtt ccgcgtagcg gtcagcagga tgtggatgcc      180
          gcactggatg cagcacatgc agccaaagcc gcatgggcac gtacctctac caccgaacgt      240
          gccaatattc tgaatcgcat tgccgatcgc attgaagcca atctgaaact gctggcagtt      300
          gccgaatcta ttgataatgg taaaccggtt cgtgaaacca ccgccgccga tctgccgtta      360
          gcagtggatc attttcgcta ttttgcaggt tgtattcgcg cccaggaagg cggcattagc      420
          gaaattgatg cagataccat tgcatatcat tttcatgaac cgttaggcgt tgtgggccag      480
          attattccgt ggaattttcc gctgttaatg gcaacctgga aactggcccc ggccttagca      540
          gcaggtaatt gtgttgtgct gaaacccgcc gaacagaccc cggcctcaat tctggtgtta      600
          atggaagtga ttggcgattt actgccgccg ggcgttgtta atgtgattaa tggctttggc      660
          ttagaagcag gtaaaccgct ggcaagctct ccgcgcattt ctaaagttgc ctttaccggc      720
          gaaaccacca ccggtcgtct gattatgcag tatgcaagtc agaatctgat tccggtgacc      780
          ttagaactgg gtggtaaaag tccgaatatt ttttttgaag atgtgctggc cgccgatgat      840
          gccttttttg ataaagccct ggaaggcttt gccatgtttg cactgaatca gggcgaagtt      900
          tgtacctgtc cgtcacgcgc actgattcag gaatcaattt atgatcgctt tatggaacgc      960
          gccttaaaac gggttgcagc aattcgtcag ggccatccgt tagataccgg taccatgatt     1020
          ggcgcacagg cctctgccga acagttagaa aaaattctga gctatattga tctgggtcgc     1080
          aaagaaggcg cccagtgtct gaccggcggt gaacgtaatg tgctggatgg cgatttagcc     1140
          ggtggctatt atgttaaacc gaccgtgttt gcaggtcata ataaaatgcg catttttcag     1200
          gaagaaattt ttggtccggt tgtgagcgtg accaccttta aagatgaaga agaagcctta     1260
          gccattgcca atgataccct gtatggttta ggtgcaggcg tgtggacccg cgatggtgca     1320
          cgcgcctttc gtatgggtcg tggtattcag gcaggtcgcg tttggaccaa ttgttatcat     1380
          gcctatccgg cacatgcagc ctttggcggc tataaacaga gcggtattgg tcgcgaaaat     1440
          catcgtatga tgttagatca ttatcagcag accaaaaatc tgttagtgtc ttatagtccg     1500
          aatgccctgg gcttttttta a                                               1521
          <![CDATA[<210>  112]]>
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          ctagagtctc gagttgacag ctagctcagt cctaggtata atgctagcct cgaggaaaga       60
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          ctgccgacgg cgagtattac cagaatctga cgccggtgac cgggcagctg ctgtgcgaag      240
          tggcgtcttc gggcaaacga gacatcgatc tggcgctgga tgctgcgcac aaagtgaaag      300
          ataaatgggc gcacacctcg gtgcaggatc gtgcggcgat tctgtttaag attgccgatc      360
          gaatggaaca aaacctcgag ctgttagcga cagctgaaac ctgggataac ggcaaaccca      420
          ttcgcgaaac cagtgctgcg gatgtaccgc tggcgattga ccatttccgc tatttcgcct      480
          cgtgtattcg ggcgcaggaa ggtgggatca gtgaagttga tagcgaaacc gtggcctatc      540
          atttccatga accgttaggc gtggtggggc agattatccc gtggaacttc ccgctgctga      600
          tggcgagctg gaaaatggct cccgcgctgg cggcgggcaa ctgtgtggtg ctgaaacccg      660
          cacgtcttac cccgctttct gtactgctgc taatggaaat tgtcggtgat ttactgccgc      720
          cgggcgtggt gaacgtggtc aatggcgcag gtggggtaat tggcgaatat ctggcgacct      780
          cgaaacgcat cgccaaagtg gcgtttaccg gctcaacgga agtgggccaa caaattatgc      840
          aatacgcaac gcaaaacatt attccggtga cgctggagtt gggcggtaag tcgccaaata      900
          tcttctttgc tgatgtgatg gatgaagaag atgccttttt cgataaagcg ctggaaggct      960
          ttgcactgtt tgcctttaac cagggcgaag tttgcacctg tccgagtcgt gctttagtgc     1020
          aggaatctat ctacgaacgc tttatggaac gcgccatccg ccgtgtcgaa agcattcgta     1080
          gcggtaaccc gctcgacagc gtgacgcaaa tgggcgcgca ggtttctcac gggcaactgg     1140
          aaaccatcct caactacatt gatatcggta aaaaagaggg cgctgacgtg ctcacaggcg     1200
          ggcggcgcaa gctgctggaa ggtgaactga aagacggcta ctacctcgaa ccgacgattc     1260
          tgtttggtca gaacaatatg cgggtgttcc aggaggagat ttttggcccg gtgctggcgg     1320
          tgaccacctt caaaacgatg gaagaagcgc tggagctggc gaacgatacg caatatggcc     1380
          tgggcgcggg cgtctggagc cgcaacggta atctggccta taagatgggg cgcggcatac     1440
          aggctgggcg cgtgtggacc aactgttatc acgcttaccc ggcacatgcg gcgtttggtg     1500
          gctacaaaca atcaggtatc ggtcgcgaaa cccacaagat gatgctggag cattaccagc     1560
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          atagtgctag tgtagatcgc tactagagcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg     1680
          aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcta ctagagtcac     1740
          actggctcac cttcgggtgg gcctttctgc g                                    1771
          <![CDATA[<210>  113]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          ctagagtctc gagttgacag ctagctcagt cctaggtata atgctagcct cgaggaaaga       60
          ggagaaagaa gcttatgaaa gcaattttcg tactgaaaca tcttaatcat gctaaggagg      120
          ttttctaatg aatatggcag aaattgccca gctgggtgtg agtaatccgt ataaacagca      180
          gtatgaaaat tatattggtg gtgcatgggt tccgccagct ggcggtgaat attttgaatc      240
          aaccaccccg attaccggca aaccgtttac ccgtgttccg cgtagcggtc agcaggatgt      300
          ggatgccgca ctggatgcag cacatgcagc caaagccgca tgggcacgta cctctaccac      360
          cgaacgtgcc aatattctga atcgcattgc cgatcgcatt gaagccaatc tgaaactgct      420
          ggcagttgcc gaatctattg ataatggtaa accggttcgt gaaaccaccg ccgccgatct      480
          gccgttagca gtggatcatt ttcgctattt tgcaggttgt attcgcgccc aggaaggcgg      540
          cattagcgaa attgatgcag ataccattgc atatcatttt catgaaccgt taggcgttgt      600
          gggccagatt attccgtgga attttccgct gttaatggca acctggaaac tggccccggc      660
          cttagcagca ggtaattgtg ttgtgctgaa acccgccgaa cagaccccgg cctcaattct      720
          ggtgttaatg gaagtgattg gcgatttact gccgccgggc gttgttaatg tgattaatgg      780
          ctttggctta gaagcaggta aaccgctggc aagctctccg cgcatttcta aagttgcctt      840
          taccggcgaa accaccaccg gtcgtctgat tatgcagtat gcaagtcaga atctgattcc      900
          ggtgacctta gaactgggtg gtaaaagtcc gaatattttt tttgaagatg tgctggccgc      960
          cgatgatgcc ttttttgata aagccctgga aggctttgcc atgtttgcac tgaatcaggg     1020
          cgaagtttgt acctgtccgt cacgcgcact gattcaggaa tcaatttatg atcgctttat     1080
          ggaacgcgcc ttaaaacggg ttgcagcaat tcgtcagggc catccgttag ataccggtac     1140
          catgattggc gcacaggcct ctgccgaaca gttagaaaaa attctgagct atattgatct     1200
          gggtcgcaaa gaaggcgccc agtgtctgac cggcggtgaa cgtaatgtgc tggatggcga     1260
          tttagccggt ggctattatg ttaaaccgac cgtgtttgca ggtcataata aaatgcgcat     1320
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          agccttagcc attgccaatg ataccctgta tggtttaggt gcaggcgtgt ggacccgcga     1440
          tggtgcacgc gcctttcgta tgggtcgtgg tattcaggca ggtcgcgttt ggaccaattg     1500
          ttatcatgcc tatccggcac atgcagcctt tggcggctat aaacagagcg gtattggtcg     1560
          cgaaaatcat cgtatgatgt tagatcatta tcagcagacc aaaaatctgt tagtgtctta     1620
          tagtccgaat gccctgggct ttttttaaga gctcgatagt gctagtgtag atcgctacta     1680
          gagccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct     1740
          gttgtttgtc ggtgaacgct ctctactaga gtcacactgg ctcaccttcg ggtgggcctt     1800
          tctgcg                                                                1806
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  2506]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          ttgtttatgg atgcgctggg gttgtcgatg gcgctcggta cgtttattgc gggtgtgcta       60
          ctggcggaaa gtgaatatcg ccatgaactg gaaacggcta tcgatccctt caaaggcttg      120
          ctgctcggtt tgttctttat ctctgtcggc atgtcgctca acctcggggt gctttatacc      180
          catctgttgt gggtagtgat aagtgtggtt gtgctggtgg cggtgaaaat tctcgtgctg      240
          tatctgctgg cgcgattgta tggcgtgcgc agttctgagc ggatgcagtt tgctggcgtg      300
          ttgagtcagg gcggtgagtt tgcctttgtc ctcttttcta ccgcttcttc acaacgctta      360
          ttccagggcg accagattct agagtctcga gttgacagct agctcagtcc taggtataat      420
          gctagcctcg aggaaagagg agaaagaagc ttatgaccaa taatccccct tcagcacaga      480
          ttaagcccgg cgagtatggt ttccccctca agttaaaagc ccgctatgac aactttattg      540
          gcggcgaatg ggtagcccct gccgacggcg agtattacca gaatctgacg ccggtgaccg      600
          ggcagctgct gtgcgaagtg gcgtcttcgg gcaaacgaga catcgatctg gcgctggatg      660
          ctgcgcacaa agtgaaagat aaatgggcgc acacctcggt gcaggatcgt gcggcgattc      720
          tgtttaagat tgccgatcga atggaacaaa acctcgagct gttagcgaca gctgaaacct      780
          gggataacgg caaacccatt cgcgaaacca gtgctgcgga tgtaccgctg gcgattgacc      840
          atttccgcta tttcgcctcg tgtattcggg cgcaggaagg tgggatcagt gaagttgata      900
          gcgaaaccgt ggcctatcat ttccatgaac cgttaggcgt ggtggggcag attatcccgt      960
          ggaacttccc gctgctgatg gcgagctgga aaatggctcc cgcgctggcg gcgggcaact     1020
          gtgtggtgct gaaacccgca cgtcttaccc cgctttctgt actgctgcta atggaaattg     1080
          tcggtgattt actgccgccg ggcgtggtga acgtggtcaa tggcgcaggt ggggtaattg     1140
          gcgaatatct ggcgacctcg aaacgcatcg ccaaagtggc gtttaccggc tcaacggaag     1200
          tgggccaaca aattatgcaa tacgcaacgc aaaacattat tccggtgacg ctggagttgg     1260
          gcggtaagtc gccaaatatc ttctttgctg atgtgatgga tgaagaagat gcctttttcg     1320
          ataaagcgct ggaaggcttt gcactgtttg cctttaacca gggcgaagtt tgcacctgtc     1380
          cgagtcgtgc tttagtgcag gaatctatct acgaacgctt tatggaacgc gccatccgcc     1440
          gtgtcgaaag cattcgtagc ggtaacccgc tcgacagcgt gacgcaaatg ggcgcgcagg     1500
          tttctcacgg gcaactggaa accatcctca actacattga tatcggtaaa aaagagggcg     1560
          ctgacgtgct cacaggcggg cggcgcaagc tgctggaagg tgaactgaaa gacggctact     1620
          acctcgaacc gacgattctg tttggtcaga acaatatgcg ggtgttccag gaggagattt     1680
          ttggcccggt gctggcggtg accaccttca aaacgatgga agaagcgctg gagctggcga     1740
          acgatacgca atatggcctg ggcgcgggcg tctggagccg caacggtaat ctggcctata     1800
          agatggggcg cggcatacag gctgggcgcg tgtggaccaa ctgttatcac gcttacccgg     1860
          cacatgcggc gtttggtggc tacaaacaat caggtatcgg tcgcgaaacc cacaagatga     1920
          tgctggagca ttaccagcaa accaagtgcc tgctggtgag ctactcggat aaaccgttgg     1980
          ggctgttctg agagctcgat agtgctagtg tagatcgcta ctagagccag gcatcaaata     2040
          aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac     2100
          gctctctact agagtcacac tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacta     2160
          gaagcggccg ctgcagttgc atattcttgc gcgagcgcgc ggacgtgtgg aagcgcatga     2220
          gttattacag gcaggggtga cgcagttttc ccgtgaaaca ttctccagtg cgttagagct     2280
          ggggcgcaag acgctggtca cgcttggcat gcatccgcat caggcgcagc gcgcgcaact     2340
          gcattttcgc cgcctggata tgcgaatgct gcgggagtta atcccgatgc atgctgatac     2400
          cgtacaaatt tctcgcgcca gggaagcccg acgtgaactg gaagagattt tccagcgtga     2460
          aatgcaacaa gaacgacgcc agctggacgg ctgggatgaa tttgag                    2506
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  2542]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          ttgtttatgg atgcgctggg gttgtcgatg gcgctcggta cgtttattgc gggtgtgcta       60
          ctggcggaaa gtgaatatcg ccatgaactg gaaacggcta tcgatccctt caaaggcttg      120
          ctgctcggtt tgttctttat ctctgtcggc atgtcgctca acctcggggt gctttatacc      180
          catctgttgt gggtagtgat aagtgtggtt gtgctggtgg cggtgaaaat tctcgtgctg      240
          tatctgctgg cgcgattgta tggcgtgcgc agttctgagc ggatgcagtt tgctggcgtg      300
          ttgagtcagg gcggtgagtt tgcctttgtc ctcttttcta ccgcttcttc acaacgctta      360
          ttccagggcg accagattct agagtctcga gttgacagct agctcagtcc taggtataat      420
          gctagcctcg aggaaagagg agaaagaagc ttatgaaagc aattttcgta ctgaaacatc      480
          ttaatcatgc taaggaggtt ttctaatgaa tatggcagaa attgcccagc tgggtgtgag      540
          taatccgtat aaacagcagt atgaaaatta tattggtggt gcatgggttc cgccagctgg      600
          cggtgaatat tttgaatcaa ccaccccgat taccggcaaa ccgtttaccc gtgttccgcg      660
          tagcggtcag caggatgtgg atgccgcact ggatgcagca catgcagcca aagccgcatg      720
          ggcacgtacc tctaccaccg aacgtgccaa tattctgaat cgcattgccg atcgcattga      780
          agccaatctg aaactgctgg cagttgccga atctattgat aatggtaaac cggttcgtga      840
          aaccaccgcc gccgatctgc cgttagcagt ggatcatttt cgctattttg caggttgtat      900
          tcgcgcccag gaaggcggca ttagcgaaat tgatgcagat accattgcat atcattttca      960
          tgaaccgtta ggcgttgtgg gccagattat tccgtggaat tttccgctgt taatggcaac     1020
          ctggaaactg gccccggcct tagcagcagg taattgtgtt gtgctgaaac ccgccgaaca     1080
          gaccccggcc tcaattctgg tgttaatgga agtgattggc gatttactgc cgccgggcgt     1140
          tgttaatgtg attaatggct ttggcttaga agcaggtaaa ccgctggcaa gctctccgcg     1200
          catttctaaa gttgccttta ccggcgaaac caccaccggt cgtctgatta tgcagtatgc     1260
          aagtcagaat ctgattccgg tgaccttaga actgggtggt aaaagtccga atattttttt     1320
          tgaagatgtg ctggccgccg atgatgcctt ttttgataaa gccctggaag gctttgccat     1380
          gtttgcactg aatcagggcg aagtttgtac ctgtccgtca cgcgcactga ttcaggaatc     1440
          aatttatgat cgctttatgg aacgcgcctt aaaacgggtt gcagcaattc gtcagggcca     1500
          tccgttagat accggtacca tgattggcgc acaggcctct gccgaacagt tagaaaaaat     1560
          tctgagctat attgatctgg gtcgcaaaga aggcgcccag tgtctgaccg gcggtgaacg     1620
          taatgtgctg gatggcgatt tagccggtgg ctattatgtt aaaccgaccg tgtttgcagg     1680
          tcataataaa atgcgcattt ttcaggaaga aatttttggt ccggttgtga gcgtgaccac     1740
          ctttaaagat gaagaagaag ccttagccat tgccaatgat accctgtatg gtttaggtgc     1800
          aggcgtgtgg acccgcgatg gtgcacgcgc ctttcgtatg ggtcgtggta ttcaggcagg     1860
          tcgcgtttgg accaattgtt atcatgccta tccggcacat gcagcctttg gcggctataa     1920
          acagagcggt attggtcgcg aaaatcatcg tatgatgtta gatcattatc agcagaccaa     1980
          aaatctgtta gtgtcttata gtccgaatgc cctgggcttt ttttaagagc tcgatagtgc     2040
          tagtgtagat cgctactaga gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact     2100
          gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct ctactagagt cacactggct     2160
          caccttcggg tgggcctttc tgcgtttata tactagaagc ggccgctgca gttgcatatt     2220
          cttgcgcgag cgcgcggacg tgtggaagcg catgagttat tacaggcagg ggtgacgcag     2280
          ttttcccgtg aaacattctc cagtgcgtta gagctggggc gcaagacgct ggtcacgctt     2340
          ggcatgcatc cgcatcaggc gcagcgcgcg caactgcatt ttcgccgcct ggatatgcga     2400
          atgctgcggg agttaatccc gatgcatgct gataccgtac aaatttctcg cgccagggaa     2460
          gcccgacgtg aactggaaga gattttccag cgtgaaatgc aacaagaacg acgccagctg     2520
          gacggctggg atgaatttga gt                                              2542
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Claims (54)

  1. 一種基因工程益生菌腸道細菌，其包含外源表達盒，所述外源表達盒包含編碼乙醛脫氫酶的核苷酸序列，其中所述益生菌腸道細菌是大腸桿菌菌株 Nissle 1917 (EcN)。
  2. 根據請求項1所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述乙醛脫氫酶是來自鉤蟲貪銅菌的天然存在的AcoD或其功能等效物。
  3. 根據請求項2所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述功能等效物至少保留氧化醛類的部分活性。
  4. 根據請求項2或3所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述功能等效物包含所述天然存在的AcoD的突變體、片段、融合物、衍生物或其任何組合。
  5. 根據請求項1至4中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述乙醛脫氫酶包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，或其具有至少80%序列同一性但仍保留氧化醛類的基本活性的胺基酸序列。
  6. 根據請求項1至5中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中編碼所述乙醛脫氫酶的所述核苷酸序列已針對在EcN中的表達進行密碼子最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  7. 根據請求項1至6中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述表達盒還包含一個或多個調控元件，所述調控元件包含選自下組的一個或多個元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子、順反子及其任意組合。
  8. 根據請求項7所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子。
  9. 根據請求項8所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述啟動子是內源啟動子或外源啟動子。
  10. 根據請求項8所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述組成型啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-49及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  11. 根據請求項10所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述組成型啟動子包含SEQ ID NO: 10。
  12. 根據請求項8所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述誘導型啟動子包含厭氧誘導型啟動子，任選地為SEQ ID NO: 53的核苷酸序列。
  13. 根據請求項7所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  14. 根據請求項7所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述終止子是T7終止子。
  15. 根據請求項7所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述順反子是BCD2。
  16. 根據請求項7所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述順反子包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列或與其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  17. 根據請求項1至16中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述外源表達盒整合在所述基因工程益生菌腸道細菌的基因組中。
  18. 根據請求項1至17中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其表達至少一種選自下組的分子伴侶蛋白：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。
  19. 根據請求項1至18中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其還包含在營養缺陷體相關基因中的至少一個失活或缺失。
  20. 根據請求項1至19中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述益生菌腸道細菌是針對選自下組的一種或多種物質的營養缺陷體：胸腺嘧啶、脲嘧啶、白胺酸、組胺酸、色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。
  21. 一種重組表達盒，其包含編碼AcoD的核苷酸序列和一個或多個調控元件，其中所述核苷酸序列已針對在EcN中的表達進行最佳化，並且任選地，密碼子最佳化的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 111的序列或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  22. 根據請求項21所述的重組表達盒，其還包含一個或多個選自下組的調控元件：啟動子、核醣體結合位點（RBS）、終止子、順反子及其任意組合。
  23. 根據請求項22所述的重組表達盒，其中所述啟動子是組成型啟動子或誘導型啟動子（例如，厭氧誘導型啟動子）。
  24. 根據請求項23所述的重組表達盒，其中所述啟動子是內源啟動子或外源啟動子。
  25. 根據請求項24所述的重組表達盒，其中所述啟動子包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 10-53及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  26. 根據請求項25所述的重組表達盒，其中所述啟動子包含SEQ ID NO: 10。
  27. 根據請求項22所述的重組表達盒，其中所述RBS包含選自下組的核苷酸序列：SEQ ID NO: 65-67及其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  28. 根據請求項22所述的重組表達盒，其中所述終止子是T7終止子。
  29. 根據請求項22所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述順反子是BCD2。
  30. 根據請求項22所述的基因工程益生菌腸道細菌，其中所述順反子包含SEQ ID NO: 62的核苷酸序列或與其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  31. 一種組合物，其包含根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌，和生理學上可接受的載體。
  32. 根據請求項31所述的組合物，其中所述組合物是可食用的。
  33. 根據請求項31或32所述的組合物，其中所述組合物是食品補充劑。
  34. 根據請求項31至33中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種生理學上可接受的載體，其選自乳酸發酵食品、發酵乳製品、抗性澱粉、膳食纖維、碳水化合物、脂肪、油、芳香劑、調味劑、蛋白質和糖基化蛋白質、水、膠囊填料和膠狀材料。
  35. 根據請求項31至34中任一項所述的組合物，其中所述基因工程益生菌腸道細菌是活細胞。
  36. 根據請求項31至34中任一項所述的組合物，其中所述組合物是成品食品、粉末、顆粒、片劑、膠囊或液體。
  37. 根據請求項31至36中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含約0.01至約99.9重量%的基因工程微生物。
  38. 一種用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精宿醉的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  39. 一種用於降低有需要的受試者體內乙醛含量的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  40. 一種用於預防和/或治療有需要的受試者的亞裔臉潮紅的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37所述的組合物。
  41. 根據請求項38至40中任一項所述的方法，其中所述受試者缺乏一種或多種醇脫氫酶。
  42. 根據請求項41所述的方法，其中所述受試者缺乏一種或多種醛脫氫酶。
  43. 根據請求項38至42中任一項所述的方法，其中所述組合物在飲酒之前、期間或之後施用。
  44. 根據請求項38至43中任一項所述的方法，其包括在開始飲酒前至多24小時向所述受試者施用所述組合物。
  45. 根據請求項38至44中任一項所述的方法，其中所述受試者是 ALDH2變異等位基因的攜帶者。
  46. 一種用於預防和/或治療有需要的受試者的酒精性肝病的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  47. 根據請求項46所述的方法，其中所述酒精性肝病是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎或酒精性肝硬化。
  48. 一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性脂肪肝疾病發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  49. 一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的酒精性肝炎發展為酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化或酒精性肝癌的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  50. 一種用於預防和/或治療有需要的受試者的非酒精性脂肪肝（NAFLD）或非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  51. 一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NAFLD發展為NASH的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  52. 一種用於預防和/或減緩有需要的受試者的NASH發展為肝纖維化的方法，其包括向所述受試者的腸道施用有效量的根據請求項1至20中任一項所述的基因工程益生菌腸道細菌或根據請求項31至37中任一項所述的組合物。
  53. 根據請求項50至52中任一項所述的方法，其中所述受試者具有升高的血液乙醇含量。
  54. 根據請求項50至52中任一項所述的方法，其中所述受試者具有增加的產酒精腸道微生物群的豐度。
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