KR102181258B1 - 바이러스 유사 입자 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 입자, 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

바이러스 유사 입자 조성물{VIRUS LIKE PARTICLE COMPOSITION}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 본원에 그 전문이 참조로서 포함되어 있는 2012년 2월 16일자 출원된 미국 가출원 제 61/599,746 호를 우선권 청구한다.
기술분야
본 발명은 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 입자, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바이러스-유사 입자 (VLP) 는 기관을 모방하는 다중단백질 구조를 갖고 잠재적으로 더 안전하고 더 저렴한 백신 후보자인 바이러스성 게놈을 갖지 않는 진정한 천연 바이러스 형태를 갖는다. 현재, 몇 안되는 예방적인 VLP-기반 백신이 세계적으로 시판되고 있다: GlaxoSmithKline's Engerix® (B형 간염 바이러스) 및 Cervarix® (인유두종바이러스), 및 Merck and Co., Inc.'s Recombivax HB® (B형 간염 바이러스) 및 Gardasil® (인유두종바이러스) 이 그 예이다. 다른 VLP-기반 백신 후보는 임상 시험 중에 있거나 임상 전 평가 단계에 있으며, 예를 들면 인플루엔자 바이러스, 파보바이러스, Norwalk 및 다양한 키메라 VLP 가 있다. 많은 다른 것들이 이들의 임상전 시험에서의 성공에도 불구하고, 소규모 기본 연구에 여전히 제한된다. 대규모 VLP 생산의 영향은 공정 제어, 모니터링화 및 최적화 맥락에서 논의되고 있다. 주요 업- 및 다운-스트림 도전이 확인되며 이에 따라 논의되고 있다. 성공적인 VLP-기반 백신 블록버스터는 임상 시험으로부터의 최근 결과를 수반하여 간략하게 나타내고 있으며 치료적인 또는 예방적인 백신화에 대한 키메라 VLP-기반 기술에 있어서 최근 개발이 이루어지고 있다 (Expert Rev. 백신 9(10), 1149-1176, 2010).
치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 는 2004년 케냐에서 알파바이러스가 재출현한 이래 아프리카, 유럽 및 아시아에서 수백만명의 사람들을 감염시키고 있다. 질환의 중증도 및 이러한 유행성 바이러스가 퍼지는 것은 백신 또는 항바이러스 요법의 부재 하에서 공중 보건에 큰 위협이 되고 있다. 유행성 치쿤구니야 바이러스에 대한 VLP 백신은 감염에 대항하여 비-인간 영장류를 보호하는 것으로 보고되어 있다 (Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338).　　 US 특허 출원 제 2012/0003266 호는 감염 또는 하나 이상의 이의 증상에 대한 면역력을 유도하는 치쿤구니야에 대한 백신 또는 항원성 조성물을 제형화하는데 유용한 하나 이상의 치쿤구니야 바이러스 구조적 폴리펩티드를 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP) 를 개시하고 있다. WO2012/106356 는 변형된 알파바이러스 또는 플라비바이러스 바이러스-유사 입자 (VLP) 및 알파바이러스 및 플라비바이러스-매개 질환의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 변형 VLP 생산을 증강시키는 방법을 개시하고 있다. (이들 인용 문헌은 본원에 참조로서 포함되어 있음).
발명의 개요
제 1 양태에 있어서, 본 발명은 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원를 포함하는 자가-조립 가능한 입자를 제공하며, 이때 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 제 1 부착 부위를 포함하고, 상기 하나 이상의 항원은 하나 이상의 제 2 부착 부위를 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드 및 상기 항원은 상기 하나 이상의 제 1 및 상기 하나 이상의 제 2 부착 부위를 통해 연결된다.
제 2 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
제 3 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
제 4 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포유동물에 접촉시키는 것을 포함하는, 항체 생산 방법을 제공한다.
제 5 양태에 있어서, 본 발명은 면역조정 방법, 자가면역 질환 치료 방법, 포유동물에서 항원에 대항하는 면역 반응 유도 방법 및/또는 증강 방법, 및 본 발명의 제 3 양태에서 제공되는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
제 6 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 4 양태에서 제공되는 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 수동 면역화 방법을 제공한다.
제 7 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포상에 항원을 제시하는 방법을 제공한다.
제 8 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 제조하는것; 상기 유전자로 트랜스펙션시켜 상기 입자를 발현하는 세포를 배양하는 것; 및 상기 입자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자의 생산 방법을 제공한다.
도 1 은 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (Venezuelan Equine Encephalitis; VEEV) 구조의 폴리펩티드에 삽입되는 TNF 알파 서열의 변형을 나타낸다.
도 2 는 TNF 알파 접합된 VLP 가 발현됐음을 나타내는 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 3 은 VLP_CHI 512 벡터를 나타낸다.
도 4 는 VLP_CHI 532 벡터를 나타낸다.
도 5 는 VLP_CHI 520 벡터를 나타낸다.
도 6 은 VLP_VEEV VLP 518 벡터를 나타낸다.
도 7 은 VLP_VEEV VLP 519 벡터를 나타낸다.
도 8 은 VLP_VEEV VLP 538 벡터를 나타낸다.
도 9 는 TNF 알파 유래 펩티드-접합된 바이러스 유사 입자에 의해 유도되는 항-TNF 알파 항체의 검출을 나타낸다.
도 10 은 CD20 유래 펩티드-접합된 바이러스 유사 입자에 의해 유도되는 항-인간 CD20 항체의 검출을 나타낸다.
도 11 은 CD20 유래 펩티드-접합된 바이러스 유사 입자에 의해 유도되는 항-마우스 CD20 항체의 검출을 나타낸다.
(1) 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 입자
제 1 양태에 있어서, 본 발명은 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 자가-조립 가능한 입자를 제공하며, 이때 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 제 1 부착 부위를 포함하고 상기 하나 이상의 항원은 하나 이상의 제 2 부착 부위를 포함하고, 이때 상기 폴리펩티드 및 상기 항원은 상기 하나 이상의 제 1 및 상기 하나 이상의 제 2 부착 부위를 통해 연결된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자가-조립 가능한 입자" 는 자발적으로 조립되는 하나 이상의 구성성분에 의해 형성된 입자를 지칭한다. 구성성분은 폴리펩티드 또는 비-펩티드의 화학적인 화합물일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, "자가-조립 가능한 입자" 는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 이들로 구성되는 입자일 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드는 1종 이상의 펩티드로 구성된다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 입자는 10nm 이상, 예를 들어, 20nm 이상, 바람직하게는 50nm 이상의 직경을 갖는다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 입자의 분자량은 100 kDa 내지 100,000 kDa, 바람직하게는 400kDa 내지 30,000kDa 이다.
본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 자발적으로 조립되는 한 한정되지 않는다. 폴리펩티드는 바이러스 구조의 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 입자는 바이러스 유사 입자일 수 있다.
바이러스 구조의 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스의 폴리펩티드 또는 이의 변형된 폴리펩티드일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 캡시드 및 외막 단백질을 포함하는 자연 발생 바이러스의 구조적 폴리펩티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 10% 이하의 아미노산이 캡시드 및 외막 단백질을 포함하는 자연 발생 바이러스 구조의 폴리펩티드에서 결손되고/결손되거나, 치환되고/치환되거나 이에 첨가되는 돌연변이체이다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 사용되는 바이러스 구조의 폴리펩티드는 캡시드 및/또는 외막 단백질 또는 이의 단편으로 이루어지거나 이들을 포함한다. 예를 들어, 외막 단백질은 E3, E2, 6K 및 E1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 하나 이상 포함한다. 본 발명에 사용되는 바이러스 구조의 폴리펩티드는 알파바이러스 또는 플라비바이러스로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 입자는 알파바이러스 또는 플라비바이러스로부터 유래되는 바이러스 유사 입자일 수 있다. 알파바이러스 및 플라비바이러스의 예는 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다: 아우라 (Aura) 바이러스, 바반키 (Babanki) 바이러스, 바마 포레스트 바이러스 (Barmah Forest Virus; BFV), 베바루 (Bebaru) 바이러스, 카바쑤 (Cabassou) 바이러스, 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV), 동부형마 뇌막염 바이러스 (Eastern equine encephalitis virus; EEEV), 에일럿 (Eilat) 바이러스, 에버글라데스 (Everglades) 바이러스, 포트 모간 (Fort Morgan) 바이러스, 게타 (Getah) 바이러스, 하이랜드 제이 (Highlands J) 바이러스, 키질라가치 (Kyzylagach) 바이러스, 마야로 (Mayaro) 바이러스, 메 트리 (Me Tri) 바이러스, 미들버그 (Middelburg) 바이러스, 모쏘 다스 페드라스 (Mosso das Pedras) 바이러스, 무캄보 (Mucambo) 바이러스, 엔두무 (Ndumu) 바이러스, 오녕녕(O'nyong-nyong) 바이러스, 픽수나 (Pixuna) 바이러스, 리오 네그로 (Rio Negro) 바이러스, 로스 리버 (Ross River) 바이러스 (RRV), 연어 이자 질환 바이러스, 셈리키 포레스트 (Semliki Forest) 바이러스, 신드비스 (Sindbis) 바이러스, 남방코끼리물범 바이러스, 토나트 (Tonate) 바이러스, 트로카라 (Trocara) 바이러스, 우나 (Una) 바이러스, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV), 서부형 마뇌염 바이러스 (Western equine encephalitis; WEEV), 와타로아 (Whataroa) 바이러스, 웨스트 닐 (West Nile) 바이러스, 덴구에 (dengue) 바이러스, 진드기매개뇌염 (tick-borne encephalitis) 바이러스 및 황열 바이러스.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 은 MHC 분자에 의해 제시되는 경우 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR) 에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항원" 은 또한 T-세포 에피토프를 포함한다. T-세포 에피토프는 MHC 클래스 I (적혈구를 제외한 모든 세포 바디 상에 존재함), 또는 클래스 II (면역 세포 및 특히 항원 제시 세포 상에 존재함) 맥락에서 T-세포 수용체에 의해 인식된다. 이러한 인식 사건은 T-세포의 활성화를 야기하고 이어서 효과기 기전 예컨대 T-세포 증식, 사이토카인 분비, 퍼포린 분비 등을 야기한다. 또한, 항원은 면역계에 의해 인식될 수 있고/있거나 B- 및/또는 T-림프구의 활성화를 야기하는 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 이는 적어도 특정 경우에서 항원이 TH 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결되고 아쥬반트 내에서 제공되는 것을 요구한다. 항원은 하나 이상의 에피토프 (B- 및 T- 에피토프) 를 가질 수 있다. 상기를 참조로 하여 특이 반응은, 항원이 전형적으로는 매우 선택적인 방식으로, 이의 상응하는 항체 또는 TCR 과는 반응하고, 다수의 다른 항체 또는 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 TCR 과는 반응하지 않는 것을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같은 항원은 수 개의 개별 항원의 혼합물일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 항원에는, 알레르겐, 자가 항원, 합텐, 암 항원 (즉, 종양 항원) 및 감염성 질환 항원 및 유기 분자 예컨대 약물 남용 (예를 들어, 니코틴) 및 이의 단편 및 유도체가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명에 사용되는 항원은 펩티드, 단백질, 도메인, 카보히드레이트, 알카로이드, 리피드 또는 소분자 예컨대, 예를 들어, 스테로이드 호르몬 및 이의 단편 및 유도체, 자가항체 및 사이토카인 그자체일 수 있다.
사이토카인의 예는 하기의 것을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 30 개가 넘는 유형의 인터루킨 (IL) 예컨대 IL-1α, IL-1β, IL-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11 내지 -37; 인터페론 (IFN) 예컨대 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ; 종양 괴사 인자 (TNF) 예컨대 TNF-α 및 TNF-β; 형질전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 과립구-콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극 인자 (M-CSF), 에리트로포이에틴 (EPO), 줄기 세포 인자 (SCF) 및 단핵구 화학주성 및 활성화 인자 (MCAF); 성장 인자 (GF) 예컨대 상피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양적 인자 (BDNF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 케라틴세포 성장 인자 (KGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 및 뼈형성 단백질 (BMP); 및 다른 폴리펩티드 인자 예컨대 LIF, 키트 리간드 (KL), MPO (미엘로퍼옥시다아제) 및 CRP（C-반응성 단백질); COX (시클로옥시게나아제) 예컨대 COX-1, COX-2 및 COX-3, NOS (니트릭 옥시드 신타아제) 예컨대 NOS-1, NOS-2 및 NOS-3; 등.
또한, 사이토카인은 주화성을 유도하는 사이토카인인 케모카인을 포함한다. 케모카인의 2가지 주요 클래스가 존재한다: CXC 및 CC. CXC 케모카인, 예컨대 호중구-활성화 단백질-2 (NAP-2) 및 흑색종 성장 촉진성 활성 단백질 (MGSA) 은 주로 호중구 및 T 림프구에 대한 화학주성이 있는 반면, CC 케모카인, 예컨대 RANTES, 대식세포 염증성 단백질 (MIP) (MIP-lα 및 MIP-lβ 포함) 은, 케라틴세포-유래 케모카인 (KC), 단핵구 화학주성 단백질 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 및 MCP-5) 및 이오탁신 (-1 및 -2) 은 다른 세포 유형 중에서, 대식세포, T 림프구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 및 호염기성 세포에 대한 화학주성이 있다. 또한, 주요 케모카인 서브패밀리중 하나에 속하지 않는 케모카인 림포탁틴-1, 림포탁틴-2 (둘 모두 C 케모카인), 및 프랙탈킨 (CX3C 케모카인) 이 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원 결정기" 란 B- 또는 T-림프구 중 하나에 의해 특이적으로 인식되는 항원의 일부를 지칭한다. B-림프구는 항체 생산을 통해 외래 항원 결정기에 반응하는 반면, T-림프구는 세포성 면역력의 매개제이다. 따라서, 항원 결정성 또는 에피토프는 MHC 맥락에서 T-세포 수용체에 의해 또는 항체에 의해 인식되는 항원의 일부이다. 항원 결정기는 하나 이상의 에피토프를 함유한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 는 에피토프 또는 항원 결정기에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 단일 사슬 항체를 비롯한 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 항체는 인간 항원 결합 항체 단편을 포함하고, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 항체, 디술피드-연결된Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 갖는 단편을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 항체는 조류 및 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는 항체는 포유동물, 예를 들어 인간, 쥣과, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 등, 또는 다른 적합한 동물 예를 들어 닭이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않으면서 하나 이상의 인간 면역글로불린을 위한 트랜스제닉 동물로부터 단리된 항체를 포함한다 (예를 들어, 본원에 그 전문이 참조로서 혼입되어 있는 미국 특허 제 5,939,598 호에서 기술된 바와 같음).
항원은 바이러스 (예를 들어 치쿤구니야 바이러스, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스) 로부터 유래되지 않는 물질 (예를 들어 단백질) 일 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 사용되는 항원은 표 1 에 나타낸 바와 같이 하나 이상의 표적 또는 이로부터의 폴리펩티드이다.
[표 1]
Figure 112014085528591-pct00001
Figure 112014085528591-pct00002
Figure 112014085528591-pct00003
Figure 112014085528591-pct00004
Figure 112014085528591-pct00005
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 사용되는 항원은 CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 및 HVEM 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이로부터의 폴리펩티드이다. CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA 및 LAG-3 은 T-세포 자극을 위한 저해성 수용체이고, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27 및 HVEM 은 T-세포 자극을 위한 활성화 수용체이다 (Mellman et al., Nature 480, 480-489 (2011) 참조).
본 발명에 사용되는 항원은 자연 발생 단백질로부터 유래하는 변형 폴리펩티드일 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 단백질의 단편일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 단백질로부터 유래하는 폴리펩티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에 있어서, 유래된 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 단백질 유래 폴리펩티드를 기초로 하여 10% 이하의 아미노산이 결손되고/되거나, 치환되고/되거나 이에 첨가되는 돌연변이체이다.
본 발명에 의해 제공되는 바와 같은 입자에서, 폴리펩티드 및 항원은 폴리펩티드에서 존재하는 하나 이상의 제 1 부착 부위 및 항원에서 존재하는 하나 이상의 제 2 부착 부위를 통해 연결될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "제 1 부착 부위" 및 "제 2 부착 부위" 각각은 하나 초과의 물질이 서로 연결되는 부위를 지칭한다.
하나의 구현예에 있어서, 폴리펩티드 및 항원은 직접 융합된다. 대안적으로는, 1개 또는 2개의 링커는 항원의 N-말단 잔기와 폴리펩티드 사이에서 및/또는 항원의 C-말단 잔기와 폴리펩티드 사이에서 개입될 수 있다.
항원 또는 폴리펩티드는 말단이 잘리고 짧은 링커에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 항원 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 전형적으로, 링커는 2 내지 25 개의 아미노산으로 이루어진다. 통상적으로는, 이는 2 내지 15 개의 아미노산 길이이고, 특정 상황에서 이는 오직 하나, 예컨대 단일 글리신 잔기일 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 핵산 분자 (이때, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 유전적으로 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합됨) 는, 제 1 부착 부위 및 제 2 부착 부위가 펩티드 결합을 통해 연결되도록 숙주 세포에서 발현된다. 이 경우, 폴리펩티드 및 항원은 펩티드 결합을 통해 연결된다. 이러한 구현예와 관련하여, 제 1 부착 부위 및/또는 제 2 부착 부위는 본래의 폴리펩티드 또는 항원으로부터 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 제 1 부착 부위는 폴리펩티드로부터 변형되어, SG, GS, SGG, GGS 및 SGSG 를 포함하는 링커 펩티드를 통해, 폴리펩티드가 항원과 접합된다.
폴리펩티드가 항원과 화학적으로 접합되는 경우, 제 1 부착 부위 및 제 2 부착 부위는 화학적으로 화합물인 화학적 가교-링커를 통해 연결될 수 있다.
가교-링커의 예에는 SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 및 다른 가교-링커 (Pierce Chemical Company 사제) 이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 입자는 항원에 연결되는 폴리펩티드를 포함하고, 이때 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는 30Å 이하 (항원의 결정으로 측정될 때 또는 항원을 함유하는 자연 발생 단백질 또는 이로부터 변형된 단백질로 측정될 때) 이다.
본 발명에 사용되는 항원은 당업자에 의해 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 항원은 자연 발생 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 대안적으로는, 본 발명에 사용되는 항원은 자연 발생 단백질로부터 변형된 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 당업자는 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리가 30Å 이하 (거리는 항원의 결정으로 측정되거나 항원을 함유하는 자연 발생 단백질 또는 이로부터 변형된 단백질로부터 측정됨) 가 되도록 항원을 설계할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공되는 입자에 사용되는 항원은 PyMOL (예를 들어 PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org) 를 비롯한 프리 소프트웨어를 사용하여 설계될 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는 30Å (옹스트롬) 이하, 20Å 이하, 또는 10Å 이하 (예를 들어 5 Å 내지 15 Å, 5 Å 내지 12 Å, 5 Å 내지 11 Å, 5 Å 내지 10 Å, 5 Å 내지 8 Å, 8 Å 내지 15 Å, 8 Å 내지 13 Å, 8 Å 내지 12 Å, 8 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 12 Å, 9 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 10 Å 또는 10 Å 내지 11 Å) 이다.
치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 제공하며, 이때 상기 치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드 또는 상기 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드는 하나 이상의 제 1 부착 부위를 포함하고 상기 하나 이상의 항원은 하나 이상의 제 2 부착 부위를 포함하고, 이때 상기 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 상기 하나 이상의 항원은 상기 하나 이상의 제 1 및 상기 하나 이상의 제 2 부착 부위를 통해 연결된다.
하나의 구현예에 있어서, 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는 30 Å 이하; 25 Å 이하; 20 Å 이하; 15 Å 이하; 14 Å 이하; 13 Å 이하; 12 Å 이하; 11 Å 이하; 10 Å 이하; 9 Å 이하; 또는 8 Å 이하 (예를 들어 5 Å 내지 15 Å, 5 Å 내지 12 Å, 5 Å 내지 11 Å, 5 Å 내지 10 Å, 5 Å 내지 8 Å, 8 Å 내지 15 Å, 8 Å 내지 13 Å, 8 Å 내지 12 Å, 8 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 12 Å, 9 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 11 Å 또는 10 Å 내지 11 Å)(거리가 항원의 결정으로 측정되거나 항원을 함유하는 자연 발생 단백질 또는 이로부터 변형된 단백질로 측정될 때) 일 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 항원은 유전적 엔지니어링에 의해 제조되는 융합 단백질로서 또는 화학적 가교 결합에 의해 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드에 연결된다.
본 발명에 사용되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 외막 단백질 및/또는 캡시드를 포함할 수 있다.
치쿤구니야 바이러스의 예는 37997 및 LR2006 OPY-1 균주를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
베네스웰라형 마뇌염 바이러스의 예는 TC-83 를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 사용되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스 구조의 폴리펩티드 또는 이의 변형된 폴리펩티드일 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스 구조의 폴리펩티드의 단편일 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스의 캡시드 및/또는 외막 단백질에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스의 캡시드 및/또는 외막 단백질을 기초로 하여 10% 이하의 아미노산이 결손되고/결손되거나, 치환되고/치환되거나, 첨가되는 돌연변이체이다. 예를 들어, K64A 또는 K64N 돌연변이가 본 발명에 사용되는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드의 캡시드로 도입될 수 있다.
치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 외막 단백질은 E3, E2, 6K 및 El 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 하나 이상 포함할 수 있다.
치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드의 예에는, 치쿤구니야 바이러스 균주 37997 의 E3-E2-6K-E1, 치쿤구니야 바이러스 균주 37997 의 캡시드-E3-E2-6K-E1, 치쿤구니야 바이러스 균주 LR2006 OPY-1 의 E3-E2-6K-E1 및 치쿤구니야 바이러스 LR2006 OPY-1 의 캡시드-E3-E2-6K-E1 가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드의 예에는, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 균주 TC-83 의 E3-E2-6K-E1 및 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 균주 TC-83 의 캡시드-E3-E2-6K-E1 가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드 서열의 예는 Genbank Accession No. ABX40006.1 에서 제공되며, 이는 하기 기술되어 있다 (SEQ ID No. 1):
Figure 112014085528591-pct00006
치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드 서열의 또다른 예는 Genbank Accession No. ABX40011.1 에서 제공되며, 이는 하기 기술되어 있다 (SEQ ID No. 2):
Figure 112014085528591-pct00007
베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드의 예는 하기 기술되어 있다 (SEQ ID No. 3):
Figure 112014085528591-pct00008
하나의 구현예에 있어서, 제 1 부착 부위는 아미노 기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노 기를 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 제 2 부착 부위는 술프히드릴 기, 바람직하게는 시스테인의 술프히드릴 기를 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 제 1 부착 부위 또는 제 2 부착 부위를 통한 둘 이상의 물질 (예를 들어 항원 및 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드) 의 접합은 화학적 가교 링커를 사용하여 달성된다. 가교-링커의 예에는, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 및 다른 가교-링커 (Pierce Chemical Company 사제) 가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따르면, 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 항원을 포함하는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 (이때, 상기 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 상기 항원이 융합 단백질로서 발현됨) 가 제공될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 항원은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드의 임의의 부위와 융합될 수 있다. 예를 들어, 항원은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 (예를 들어 캡시드, E3, E2, 6K 또는 E1) 의 N- 또는 C- 말단에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있거나, 항원은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 단백질 (예를 들어 캡시드, E3, E2, 6K, 또는 E1) 로 삽입될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 하나 이상의 항원은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 단백질의 E2 로 삽입된다. 예를 들어, 치쿤구니야 바이러스 구조의 단백질에 대해, 하나 이상의 항원은 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 519 및 520 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 519-위치에서 G 및 520-위치에서 Q 사이); SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 530 및 531 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 530-위치 에서 G 및 531-위치에서 S 사이); SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 531 및 532 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 531-위치에서 S 및 532-위치에서 N 사이); SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 529 및 530 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 529-위치에서 G 및 530-위치에서 G 사이); 또는 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 510 및 511 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 510-위치에서 S 및 511-위치에서 G); 또는 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 511 및 512 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 511-위치에서 G 및 512-위치에서 N 사이); 또는 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 509 및 510 사이 (즉, SEQ ID No. 1 또는 2 의 509-위치에서 Q 및 510-위치에서 S 사이) 에서 삽입된다.
예를 들어, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 단백질에 관해, 하나 이상의 항원은 SEQ ID No. 3 의 잔기 517 및 518 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 517-위치에서 G 및 518-위치에서 S 사이); SEQ ID No. 3 의 잔기 518 및 519 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 518-위치에서 S 및 519-위치에서 S); SEQ ID No. 3 의 잔기 519 및 520 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 519-위치에서 S 및 520-위치에서 V); SEQ ID No. 3 의 잔기 515 및 516 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 515-위치에서 L 및 516-위치에서 S 사이); SEQ ID No. 3 의 잔기 516 및 517 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 516-위치에서 S 및 517-위치에서 G 사이; SEQ ID No. 3 의 잔기 536 및 537 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 536-위치에서 C 및 537-위치에서 G 사이); SEQ ID No. 3 의 잔기 537 및 538 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 537-위치에서 G 및 538-위치에서 G 사이); SEQ ID No. 3 의 잔기 538 및 539 사이 (즉, SEQ ID No. 3 의 538-위치에서 G 및 539-위치에서 T 사이) 에서 삽입된다.
융합 단백질은 당업계에서 통상적인 기술을 사용하여 발현될 수 있다. 다양한 발현 시스템이 융합 단백질 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 293 세포, Sf9 세포 또는 E.coli 에서 발현될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 항원은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유래가 아닌 물질 (예를 들어 단백질) 이다. 항원은 하나 이상의, 자가 항원 및 암 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 항원은 TNF-α, CD20 또는 CTLA4 유래의 폴리펩티드이다. 따라서, 본 발명에 사용되는 항원 및 폴리펩티드의 조합의 예에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다:
i) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드;
ii) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드;
iii) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드; 또는
iv) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드
v) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CTLA4 유래 폴리펩티드.
치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 는 자연 발생 바이러스의 폴리펩티드 또는 이의 변형된 폴리펩티드일 수 있다. 또한, TNF-α 유래 폴리펩티드, CD20 또는 CTLA4 는 자연 발생 폴리펩티드 또는 자연 발생 폴리펩티드의 변형된 폴리펩티드 또는 자연 발생 폴리펩티드 또는 변형된 펩티드의 단편일 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 바이러스 구조의 폴리펩티드의 단편일 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, TNF-α, CD20 또는 CTLA4 유래 변형된 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에 있어서, TNF-α, CD20 또는 CTLA4 유래 변형된 펩티드는, TNF-α ,CD20 또는 CTLA4 유래 자연 발생 폴리펩티드를 기초로 하여 10% 이하의 아미노산이 결손되고/결손되거나, 치환되고/치환되거나 첨가된 돌연변이체이다.
바이러스 유래 폴리펩티드가 항원 유래 폴리펩티드와 접합되는 경우, SG, GS, SGG, GGS SGSG 및 TRGGS 를 포함하는 링커 펩티드가 사용될 수 있다. 항원 유래 폴리펩티드 (하기에서 "PFA" 로 지칭) 와 바이러스 유래 폴리펩티드 (하기에서 "PFV" 로 지칭) 의 접합의 예에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: PFV-SG-PFA-GS-PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV-SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; 및 PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공한다:
i) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드의 융합 단백질 (이는 SEQ ID No. 4 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어짐);
ii) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드의 융합 단백질 (이는 SEQ ID No. 5 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어짐);
iii) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드의 융합 단백질 (이는 SEQ ID No. 6 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어짐); 또는
iv) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드의 융합 단백질 (이는 SEQ ID No. 7 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어짐);
v) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CTLA4 유래 폴리펩티드의 융합 단백질 (이는 SEQ ID No. 8 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어짐).
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 SEQ ID No. 4-8 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질로부터 변형된 융합 단백질을 포함하는 바이러스 유사 입자를 제공한다. 변형된 융합 단백질은 SEQ ID No. 4-8 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 변형된 융합 단백질은 SEQ ID No. 4-8 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 기초로 하여 10% 이하의 아미노산이 결손되고/결손되거나, 치환되고/치환되거나 첨가된 돌연변이체일 수 있다.
(2) 뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포
제 2 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 바와 같은 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예에는 하기가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: 치쿤구니야 바이러스 균주 37997 의 E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 치쿤구니야 바이러스 균주 37997 의 캡시드-E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 치쿤구니야 바이러스 균주 LR2006 OPY-1 의 E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 치쿤구니야 바이러스 LR2006 OPY-1 의 캡시드-E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 균주 TC-83 의 E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 TC-83 의 캡시드-E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.
치쿤구니야 바이러스에 관해서, E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열이 하기에 기재된다 (SEQ ID No. 9):
Figure 112014085528591-pct00009
.
치쿤구니야 바이러스에 관해서, E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 또다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 하기에 기재된다 (SEQ ID No. 10):
Figure 112014085528591-pct00010
.
치쿤구니야 바이러스에 관해서, 캡시드-E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열이 하기에 기재된다 (SEQ ID No. 11):
Figure 112014085528591-pct00011
Figure 112014085528591-pct00012
치쿤구니야 바이러스에 관해서, 캡시드-E3-E2-6K-E1 를 인코딩하는 또다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 하기에 기재된다 (SEQ ID No. 12):
Figure 112014085528591-pct00013
Figure 112014085528591-pct00014
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 이때 벡터는 핵산 분자에 작동가능하게 연결되는 발현 조절 서열을 임의 포함한다.
발현 조절 서열의 예에는 프로모터 예컨대 CMV 프로모터, 파지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, phoA 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 및 레트로바이러스의 LTR 의 프로모터가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
발현 벡터는 본원에 그 전문이 참조인용되는 WO/2012/006180 를 기초로 하여 당업자에 의해 제조될 수 있다.
항원의 폴리펩티드 및 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 벡터의 예에는 CHIKV VLP 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID No. 28; SEQ ID No. 29 로 나타내는 아미노산 서열에 상응함) 를 함유하는 VLP_CHI 512 벡터 (SEQ ID No. 23); 및 CHIKV VLP 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID No. 30; SEQ ID No. 31 로 나타내는 아미노산 서열에 상응함) 를 함유하는 VLP_CHI 532 벡터 (SEQ ID No. 24) 에서 보여지는 벡터가 포함된다.
발현 벡터는 본원에 그 전문이 참조인용되는 US2012/0003266 를 기초로 하여 당업자에 의해 제조될 수 있다.
베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 항원의 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 벡터의 예는 VEEV VLP 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID No. 32; SEQ ID No. 33 에 의해 나타내는 아미노산 서열에 상응함) 를 함유하는 VLP_VEEV VLP 518 벡터 (SEQ ID No. 25); VEEV VLP 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID No. 34; SEQ ID No. 35 로 나타내는 아미노산 서열에 상응함) 를 함유하는 VLP_VEEV VLP 519 벡터 (SEQ ID No. 26); 및 VEEV VLP 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID No. 36; SEQ ID No. 37 로 나타내는 아미노산 서열에 사응함) 를 함유하는 VLP_VEEV VLP 538 벡터 (SEQ ID No. 27) 에서 보여지는 벡터이다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 하기를 제공한다:
i) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (이는 SEQ ID No. 13 로 나타내는 뉴클레오티드 서열으로 이루어짐);
ii) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (이는 SEQ ID No. 14 로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어짐);
iii) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 유래 폴리펩티드의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (이는 SEQ ID No. 15 로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어짐);
iv) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 유래 폴리펩티드의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (이는 SEQ ID No. 16 로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어짐); 또는
v) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CTLA4 유래 폴리펩티드의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 (이는 SEQ ID No. 17 로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어짐).
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 SEQ ID No. 13-17 중 임의의 하나의 서열로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자로부터 변형된 핵산 분자를 제공한다. 변형된 핵산 분자는 SEQ ID No. 13-17 중 임의의 하나의 서열로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 대해서 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 또한, 변형된 핵산 분자는 SEQ ID No. 13-17 중 임의의 하나의 서열로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 기초로 하여 10% 이하의 아미노산이 결손되고/결손되거나, 치환되고/치환되거나, 첨가되는 돌연변이체일 수 있다.
(3) 조성물
제 3 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자 또는 상기 기술된 바와 같은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 아쥬반트를 포함할 수 있다. 아쥬반트의 예에는 Ribi 용액 (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich) 이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물은, 본 발명의 목적에 반대되지 않는 한 단일 활성 성분 또는 둘 이상의 활성 성분의 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어, 케모카인을 비롯한 사이토카인, 사이토카인의 항체 예컨대 항TNF 항체 (예를 들어 안플릭시마브, 아달리무마브), 항-VEGF 항체 (예를 들어 베바시주마브 및 라니비주마브), 사이토카인 수용체 한타고니스트 예컨대 항HER2 항체 (예를 들어 트라스투주마브), 항EGF 수용체 항체 (예를 들어 세툭시마브), 항VEGF 압타머 (예를 들어 페갑타니브) 및 면역조절제 예컨대 시클로스포린, 타크로리무스, 우베니멕스가 병용 요볍에 사용될 수 있다.
복수의 활성 성분의 조합에서, 이들의 각 내용물은 이의 치료 효과 및 안전성을 고려하여 적합하게 증가되거나 감소될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "조합" 은 둘 이상의 활성 성분이 단일 독립체 또는 투여량 형태로 동시에 환자에게 투여되거나, 둘 모두가 동시에 또는 특정 시간 제한 없이 순차적으로 개별 독립체로서 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 이때 이러한 투여는 신체 내에서 두 성분의 치료학적 유효 수준을 제공한다 (바람직하게는 동시에).
하나의 구현예에 있어서, 조성물은 DNA 백신을 포함하는 백신 조성물이다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 DNA 백신은 올리고뉴클레오티드를 함유하는 CpG 를 포함한다.
(4) 항체 제조 방법, 면역 조정 방법, 자가면역 질환의 치료 방법, 포유동물에서 항원에 대항하는 면역 반응을 유도하고/유도하거나 증강시키는 방법, 암 치료 방법, 수동 면역화 방법, 대식세포 상에 항원을 제시하는 방법, 및 입자 제조 방법
제 4 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 항체 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 제 4 양태에서 제조되는 항체는 통상적인 기술을 사용하여 인간화될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 제 4 양태에서 제공되는 방법은 비-인간 포유동물 생산된 항체를 인간화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자는, 환자에게 발병 기관에 또는 전신적으로 직접 투여되거나, 환자 유래 세포에 생체 외에서 적용되거나 환자에게 후속 투여되는 인간 세포주에 적용되거나, 또는 환자에서 유래하는 면역 세포 예컨대 B-세포 및 T-세포로부터 부분모집단을 선별하고 이어서 이를 환자에게 재투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 바이러스 유사 입자는 면역 요법에 적용될 수 있다.
제 5 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 3 양태에서 제공되는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 면역조정 방법, 자가면역 질환 치료 방법, 포유동물에서 항원에 대항하는 면역 반응을 유도하고/유도하거나 증강시키는 방법, 및 암 치료 방법을 제공한다.
제 6 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 4 양태에서 제공되는 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 수동 면역화 방법을 제공한다.
제 7 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자 및/또는 본 발명의 제 2 양태에서 제공되는 핵산 분자를 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포 상에 항원을 제시하는 방법을 제공한다.
제 8 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 입자를 제공하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 제조하는 것; 상기 유전자로 트랜스펙션된 세포를 배양하여 상기 입자를 발현시키는 것; 및 상기 입자를 회수하는 것을 포함한다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 및/또는 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 항체 제조 방법을 제공한다. 제조되는 항체는, 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자에 포함되는 항원 또는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 항체를 제조하는 방법은 항원 (예를 들어 TNFα, CD20 및 CLTA4) 에 대항하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제조하기 위한 유용한 방법일 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체를 제조하는 방법에 의해 수득되는 항체는 수동 면역화에 사용된다. 수동 면역화 방법은 수득된 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 면역조정에 유용하다. 특히, 상기 면역조정은, 자가면역 질환, 신경 질환, 염증성 질환 예컨대 염증성 폐 질환 예컨대 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환 및 천식, 혈관신생 관련 질환 예컨대 신생물의 치료에 대한 것이다.
하나의 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 면역조정은 포유동물에서 항원에 대항하여 면역 반응을 유도하고/유도하거나 증강시키는 것이다. 따라서, 하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 항원에 대항하는 면역 반응을 유도하고/유도하거나 증강시키는 방법을 제공한다. 포유동물의 예로는 인간이 포함되며, 이에 한정되지는 않는다.
많은 항체가 질병 치료에 유용하기 때문에, 본 발명에 제공되는 조성물 및 방법은 질병 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 표 1 에 나열된 바와 같은 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 표 1 에 나열된 바와 같은 표적 상의 에피토프에 결합하는 항체는, 표 1 에 나열된 바와 같은 질병 치료에 유용하다.
하나의 구현예에 있어서, 하나 이상의 본 발명에 사용되는 항원은 표 1 에 나열된 바와 같은 하나 이상의 표적이다. 하나 이상의 본 발명에 사용되는 항원이 표 1 에 나열된 바와 같은 하나 이상의 표적인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 입자, 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 표 1 에 나열된 바와 같은 질병 또는 병태의 치료에 유용할 수 있다 (표 1 의 "용도" 참조).
예를 들어, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원이 하나 이상의 암 항원인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 입자, 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 암 치료에 유용할 수 있다.
암 항원의 예에는 VEGF, 상피 성장 인자 수용체, CD33, CD20 및 ErbB2 가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 둘 이상의 암 항원을 포함하는 본 발명의 조성물이 포유동물에게 투여되는 경우, 둘 이상의 암 항원으로 향하는 항체가 암을 공격할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원이 아밀로이드 β 인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 알츠하이머 질병의 치료에 유용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원이 TNF 알파인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 염증; 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염; 건선, 크론병; 궤양성 대장염 등의 치료에 유용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원이 CD20 인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 자가면역 질환 예컨대 류마티스 관절염 및 SLE; 암 예컨대 비-호지킨 림프종 등의 치료에 유용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용되는 하나 이상의 항원이 CTLA4 인 경우, 본 발명에 의해 제공되는 단리된 핵산, 벡터, 조성물 및 방법은 암 예컨대 흑색종의 치료에 유용할 수 있고; T 세포 등의 활성화에 유용할 수 있다.
치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염의 통상적인 대형 분자와 함께 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염으로 감염된 환자의 증상을 고려하면, 이러한 VLP 는 효과적으로 그리고 효율적으로 표적 대식세포 및 이의 조성물 예컨대 사이토카인 및 면역조절 화합물에 작용할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 및/또는 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 대식세포 상에 항원을 제시하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자는 대식세포를 표적으로 하기에 좋다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명에 의해 제공되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자는 하나 이상의 항원 (이는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 내에 포함됨) 의 대식세포로의 전달 시스템의 한 종류이다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명은 상기 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 제조하는 것; 상기 유전자로 트랜스펙션된 세포를 배양하여 상기 입자를 발현하는 것; 및 상기 입자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 제 1 양태에서 제공되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 구현예에 있어서, 트랜스펙션은 통상적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 트랜스펙션에 사용되는 세포는 293 세포일 수 있다. VLP 를 회수하는 것은 세포가 유전자를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된 이후 조건화 배지를 회수하는 것을 포함할 수 있으며, 또한 초원심분리를 사용하여 조건화된 배지로부터 VLP 를 정제하는 것을 추가 포함할 수 있다. 하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 8번째 양태에서 제공되는 치쿤구니야 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법에 추가 단계가 포함될 수 있으며, 이때 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리가 30Å 이하 (예를 들어 5 Å 내지 15 Å, 5 Å 내지 12 Å, 5 Å 내지 11 Å, 5 Å 내지 10 Å, 5 Å 내지 8 Å, 8 Å 내지 15 Å, 8 Å 내지 13 Å, 8 Å 내지 12 Å, 8 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 12 Å, 9 Å 내지 11 Å, 9 Å 내지 10 Å, 또는 10 Å 내지 11 Å) (거리가 항원의 결정으로 측정되거나 항원을 함유하는 자연 발생 단백질 또는 이로부터 변형된 단백질로 측정될 때) 가 되도록 설계된다.
면역계는 바이러스 또는 박테리아와 같은 병원체를 죽이기 위해 외래 항원을 인식하는 것으로 발달한다. 이는 또한 자가 단백질을 보호하기 위해 자가 단백질은 인식하는 않는 것으로 발달한다. 이는 면역 내성 시스템으로 지칭된다. 따라서, 통상적인 면역화 방법에 의해 자가 항원에 대항하는 항체를 유도하는 것은 어렵다. 면역 내성을 극복하기 위해, 본 발명자들은 자가 항원을 함유하는 자가-조립 서브유닛을 이용하는 신규한 백신 방법을 개발하였다. 자가 조립 서브유닛은 자발적으로 조립되고 표면 상에서 매우 반복적인 항원을 제시하는 적합한 조직화된 유닛을 형성한다. 매우 반복적인 항원 면역원은 B 세포에서 신호 경로를 강화하고 통상적인 면역화 방법과 같은 단일 항원 면역원보다 항체 반응을 자극한다. 이러한 기전을 백신 개발에 적용하는 것은 표적 면역원에 대한 항체 반응을 증가시킬뿐 아니라 자가 항원 내성을 극복한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 상세히 기술되나, 이는 본 발명을 제한하고자 함이 아니다.
실시예
(1) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 TNF 알파의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자의 제조
치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합된 TNF 알파 폴리펩티드의 단량체는 안정적으로 발현되기에 어려운데, 왜냐하면 TNF 알파가 자연 조건 하에서 삼량체로서 발견되기 때문인 것으로 예상된다. 그러나, 융합 단백질의 사용으로 (이때 TNF 알파 단량체 펩티드 (TNF 알파 단량체 펩티드의 단편) 는 TNF 알파-유래 펩티드를 치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드에 부착하기 위해 TNF 알파-유래 펩티드의 N- 및 C-말단에서 링커를 통해 치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합됨), 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 TNF 알파 단량체-유래 펩티드를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자의 적합한 발현을 초래한다.
구체적으로, 본래의 인간 TNF 알파를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 변형된 TNF 알파-유래 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 변형된 것이고, 이때 본래 TNF 알파-유래 펩티드의 N-말단 서열인 RTPSD 가 SGG 로 대체되고 TRGGS 는 TNF 알파의 C-말단에 부착된다 (도 1 에 나타낸 바와 같은 SEQ ID No. 18-20 참조). 생성된 폴리뉴클레오티드는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 발현하기 위한 플라스미드 (이하 본원에서 CHIKV-TNFa4 로서 지칭됨) 를 구축하기 위해 SEQ ID No. 2 의 519-위치에서 G 및 520-위치에서 Q 를 인코딩하는 코톤 사이에서 삽입되었으며, 이때 변형된 TNF 알파-유래 펩티드는 치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드 (C-E3-E2-6K-E1) 의 E2 로 삽입된다. 이어서, 293F 세포 (1.5x106 세포/ml) 는 CHIKV-TNFa4 의 250㎍ 로 트랜스펙션되었다. 4일 동안 배양한 후, 상청액을 수집하였다. 수득된 상청액을 Opti Prep (Sigma D1556) 상에서 오버레이하고 이어서 SW28 로터를 이용하여 초원심분리하여 VLP (즉 바이러스 유사 입자) 를 농축시켰다. 농축된 VLP 를 Opti Prep 과 혼합하여 밀도 구배를 형성하고 이어서 NVT100 로터를 이용하여 초원심분리하였다 (75000rpm, 4시간). 초원심분리 후, 정제된 VLP 를 수집하였다. 치쿤구니야 바이러스 구조의 폴리펩티드와 접합된 TNF 알파를 포함하는 VLP 의 발현을, CHIVK 에 특이적인 항체 (ATCC: VR-1241AF) 및 TNF 알파에 특이적인 항체 (Cell Signal: #6945) 를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
TNF 알파-유래 펩티드의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이에서 공간적 거리는 8.27Å 이다 (거리가 TNF 알파의 결정으로 측정됨).
(2) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 TNF 알파-유래 펩티드 ("VEEV-TNFa VLP" 로서 지칭됨) 를 포함하는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자의 제조
상기 기술된 (1) 에 따르면, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 융합된 변형된 TNF 알파-유래 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하여 (SEQ ID No. 15 참조) 발현 벡터를 구축하고 이어서 293F 세포에서 트랜스펙션하였다.
VEEV-TNFa VLP 를 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 레인 4 에서 보여지는 바와 같이, TNF 알파-유래 펩티드 및 VEEV 발현을, 각각 TNFa 모노클로날 항체 (상부 패널) 및 VEEV 폴리클로날 항체 (하부 패널) 을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다 (도 2 참조).
TNF 알파-유래 펩티드의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이에서 공간적 거리는 8.27Å 이다 (거리는 TNF 알파의 결정으로 측정됨).
(3) 면역화 마우스에서 항-인간 TNF 알파 항체의 검출
마우스를 3 개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹에 대해서 n=5). 상기 기술된 (1) 에 따라 제조된 인간 TNF 알파-유래 폴리펩티드 및 바이러스 구조의 폴리펩티드를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 (하기에서 "CHIKV-TNF 알파" 로서 지칭됨), 인간 TNF 알파-유래 폴리펩티드를 포함하지 않는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 (하기에서 "CHIKV-VLP" 로서 지칭됨), 상기 기술된 (2) 에 따라 제조된 인간 TNF 알파-유래 폴리펩티드 및 바이러스 구조의 폴리펩티드를 포함하는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 (하기에서 "VEEV-TNF 알파" 로서 지칭됨), 인간 TNF 알파-유래 폴리펩티드를 포함하지 않는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자 (하기에서 "VEEV-VLP" 로서 지칭됨) 또는 비히클 (즉 PBS) 를 마우스의 각 그룹에게 근육내 투여하였다. 실험 초기에 (하기에서 "0 주" 로 지칭됨) 및 제 1 투여 3 주 후에 (하기에서 "3 주" 로 지칭됨) 하기 기술되는 바와 같이 마우스에 투여하였다: 그룹 1: VEEV-TNF 알파 (0 주), CHIKV-TNF 알파 (3 주); 그룹 2: VEEV-VLP (0 주), CHIKV-VLP (3 주); 및 그룹 3: PBS (0 주), PBS (3 주).
실험 시작 6 주 후, 혈액 샘플을 각각의 마우스로부터 수득하고 혈청을 제조하였다. 제조된 항-인간 TNF 알파 항체를 ELISA 로 검출하였다 (이때 TNF 알파 단백질은 ELISA 플레이트 상에서 코팅되었음). 결과는, 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 TNF 알파-유래 폴리펩티드를 포함하는 바이러스 유사 입자가 마우스에서 항-인간 TNF 알파 항체를 유도함을 보여준다 (도 9 참조).
(4) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 CD20 의 단편을 포함하는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자의 제조
상기 기술된 (1) 및 (2) 에 따르면, VEEV-CD20 VLP 를 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하고, CD20 의 단편 및 VEEV 발현을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. IYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ (SEQ ID No. 21) (이는 CD20 의 단편임) 를 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합된 항원으로서 이용하였다.
CD20 단편의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는 10.07Å 이다 (거리가 CD20 의 결정으로 측정될 때).
(5) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 CTLA4 의 단편을 포함하는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자의 제조
CTLA4 의 단편: CKVELMYPPPYYLGIG(SEQ ID No. 22) 를, 단편 (이는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드 E2로 융합됨) 의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리가 약 5.6Å 이 되도록 (거리가 CLTA4 의 결정으로 측정될 때), 전장 CTLA4 아미노산 서열을 기초로 하여 선택하였다.
CTLA4 의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 VLP_VEEV VLP 518 벡터에 도입되어, SEQ ID No. 8 의 아미노산 서열로 이루어지는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합되는 CTLA4 의 단편의 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다.
(6) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 전장 인간 CTLA4 를 포함하는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 유사 입자의 제조
전장 인간 CTLA4 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 VLP_VEEV VLP 518 벡터에 도입하여, 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합된 CTLA4 의 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다.
전장 인간 CTLA4 의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이에서 공간적 거리는 약 39.6Å 이다 (거리가 CLTA4 의 결정으로 측정될 때).
베네스웰라형 마뇌염 바이러스 구조의 폴리펩티드와 융합된 CTLA4 의 발현은, 293 세포를 제조된 플라스미드로 트랜스펙션시킨 후 ELISA 에 의해 검출될 수 없었다.
(7) 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 또는 마우스 CD20 의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자의 제조 및 항-인간 또는 마우스 CD20 항체의 검출
바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 또는 마우스 CD20 의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 VLP_CHI 532 벡터 및 인간 또는 마우스 TNF 알파 항체의 단편을 이용하여 제조하였다. 인간 및 마우스 TNF 알파 항체 의 단편은 하기 기술된 바와 같다: CD20 인간 iyncepanpseknspstqycysiq (SEQ ID No. 21); CD20 마우스 ydcepsnsseknspstqycnsi (SEQ ID No. 41).
링커 (예를 들어 SGG, SG, GS 또는 GGS) 를 사용하여 SEQ ID No. 2 의 519-위치에서 G 및 520-위치에서 Q 사이에서 하기 기술된 바와 같이 CD20 의 단편을 도입하였다:
CD20 인간: SGGiyncepanpseknspstqycysiqGS (SEQ ID No. 42),
CD20 마우스 버젼2: SGydcepsnsseknspstqycnsiGGS (SEQ ID No. 43),
CD20 마우스 버젼3: SGGydcepsnsseknspstqycnsiGS (SEQ ID No. 44).
플라스미드: VLP_CHI VLP 532 CD20H, VLP_CHI VLP 532 CD20-2 마우스 및 VLP_CHI VLP 532 CD20-3 마우스를 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 인간 또는 마우스 CD20 의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자의 발현을 위해 사용하였다 (SEQ ID No. 45 (SEQ ID No. 46 로 나타내는 발현 폴리펩티드의 아미노산 서열), SEQ ID No. 47 (발현된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 48 로 나타냄) 및 SEQ ID No. 49 (발현된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 50 로 나타냄).
바이러스 유사 입자를 상기 (1) 에 기술된 바와 같은 방법에 따라 정제하였다. 마우스를 정제된 VLP 의 100㎍; 인간 또는 마우스 CD20 의 단편의 100㎍; 또는 PBS (대조군) 으로 1회 면역화하였다. 면역화 10일 후, 마우스로부터 혈액 샘플을 수득하고 혈청을 제조하였다. 면역화에 의해 유도되는 항-인간 CD20 항체를 인간 CD20 의 단편으로 코팅된 ELISA 에 의해 검출하고, 면역화에 의해 유도된 항-마우스 CD20 항체를 마우스 CD20 의 단편으로 코팅된 ELISA 에 의해 검출하였다. 결과는, 항-인간 CD20 항체 및 항-마우스 CD20 항체가 바이러스 구조의 폴리펩티드로 융합된 인간 또는 마우스 CD20의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자의 투여에 의해 적절하게 유도되었음을 보여준다. 또한, 결과는 자가 항원에 특이적인 항체가 바이러스 구조의 폴리펩티드로 융합된 자가 항원의 단편을 포함하는 치쿤구니야 바이러스 유사 입자를 투여하는 것에 의해 적절하게 유도될 수 있음을 보여준다 (도 10 및 도 11 참조).
SEQUENCE LISTING <110> VLP THERAPEUTICS, LLC <120> VIRUS LIKE PARTICLE COMPOSITION <130> 671358 <150> US61/599,746 <151> 2012-02-16 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1248 <212> PRT <213> virus <400> 1 Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Trp Thr Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val 35 40 45 Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn 50 55 60 Arg Lys Asn Lys Lys Gln Lys Gln Lys Gln Gln Ala Pro Gln Asn Asn 65 70 75 80 Thr Asn Gln Lys Lys Gln Pro Pro Lys Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp 100 105 110 Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Thr Gly Tyr Ala Cys 115 120 125 Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser 165 170 175 Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly 180 185 190 Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val 210 215 220 Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu 225 230 235 240 Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu 245 250 255 Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Ile Pro Val Met Cys Leu Leu Ala 260 265 270 Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr 275 280 285 Glu Lys Glu Pro Glu Glu Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met 290 295 300 Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Gln Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro 305 310 315 320 His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala 325 330 335 Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser 340 345 350 Cys His Ser Pro Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp 370 375 380 Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro 385 390 395 400 Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys 405 410 415 Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys 420 425 430 Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His 435 440 445 Ser Cys Thr His Pro Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu 450 455 460 Lys Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr 465 470 475 480 Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Thr Glu Glu Ile Glu Val His Met 485 490 495 Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn 500 505 510 Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys 515 520 525 Gly Gly Ser Asn Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn 530 535 540 Cys Lys Val Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp 545 550 555 560 Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg 565 570 575 Lys Gly Lys Ile His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg 580 585 590 Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val 595 600 605 Ile Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn 610 615 620 Met Gly Glu Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Met His Lys Lys 625 630 635 640 Glu Val Val Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly 645 650 655 Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr 660 665 670 Ala His Gly His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr 675 680 685 Pro Thr Met Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Thr Phe Ile Leu Leu 690 695 700 Ser Met Val Gly Met Ala Ala Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg 705 710 715 720 Cys Ile Thr Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu 725 730 735 Leu Ser Leu Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Ala Thr Tyr Gln 740 745 750 Glu Ala Ala Ile Tyr Leu Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu 755 760 765 Gln Ala Leu Ile Pro Leu Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu 770 775 780 Arg Leu Leu Pro Cys Cys Cys Lys Thr Leu 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180 ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 240 atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 300 gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 360 gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 420 tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 480 atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 540 gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac 600 tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 660 gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat 720 agaagacacc gggaccgatc cagcctccgt taacggtgga gggcagtgta gtctgagcag 780 tactcgttgc tgccgcgcgc gccaccagac ataatagctg acagactaac agactgttcc 840 tttccatggg tcttttctgc agtcaccgtc gtcgacacgt gtgatcagat atcgcggccg 900 ccaccatgga gttcatcccg acgcaaactt tctataacag aaggtaccaa ccccgaccct 960 gggccccacg ccctacaatt caagtaatta gacctagacc acgtccacag aggcaggctg 1020 ggcaactcgc 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gctgcaaata tccttctcaa cagccctggc aagcgccgag tttcgcgtgc 4440 aagtgtgctc cacacaagta cactgcgcag ccgcatgcca ccctccaaag gaccacatag 4500 tcaattaccc agcatcacac accacccttg gggtccagga tatatccaca acggcaatgt 4560 cttgggtgca gaagattacg ggaggagtag gattaattgt tgctgttgct gccttaattt 4620 taattgtggt gctatgcgtg tcgtttagca ggcactaagg atctagatct gctgtgcctt 4680 ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 4740 ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 4800 gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 4860 atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatgggtac ccaggtgctg aagaattgac 4920 ccggttcctc ctgggccaga aagaagcagg cacatcccct tctctgtgac acaccctgtc 4980 cacgcccctg gttcttagtt ccagccccac tcataggaca ctcatagctc aggagggctc 5040 cgccttcaat cccacccgct aaagtacttg gagcggtctc tccctccctc atcagcccac 5100 caaaccaaac ctagcctcca agagtgggaa gaaattaaag caagataggc tattaagtgc 5160 agagggagag aaaatgcctc caacatgtga ggaagtaatg agagaaatca tagaatttta 5220 aggccatgat ttaaggccat catggcctaa gcttgaaagg agataggatc aaagcttggc 5280 gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 5340 catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 5400 attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 5460 ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 5520 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 5580 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 5640 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 5700 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 5760 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 5820 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 5880 ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 5940 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 6000 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 6060 tagcagagcg 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agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc 7800 aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt 7860 aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact 7920 acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg 7980 gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag 8040 aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac 8100 gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg 8160 ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 8220 aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 8280 tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 8340 ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcca tggtctcaac 8400 tttc 8404 <210> 24 <211> 8410 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VLP_CHI 532 vector <400> 24 gaattcccat tgcatacgtt gtatccatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt 60 ccaacattac cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 120 gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 180 ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc 240 atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact 300 gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat 360 gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact 420 tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac 480 atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac 540 gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac 600 tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga 660 gctcgtttag tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat 720 agaagacacc gggaccgatc cagcctccgt taacggtgga gggcagtgta gtctgagcag 780 tactcgttgc tgccgcgcgc gccaccagac ataatagctg acagactaac agactgttcc 840 tttccatggg tcttttctgc agtcaccgtc gtcgacacgt gtgatcagat atcgcggccg 900 ccaccatgga gttcatcccg acgcaaactt tctataacag aaggtaccaa ccccgaccct 960 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ttgaggacaa cgtgatgaga cccggatact accagctact aaaagcatcg ctgacttgct 1860 ctccccaccg ccaaagacgc agtactaagg acaattttaa tgtctataaa gccacaagac 1920 catatctagc tcattgtcct gactgcggag aagggcattc gtgccacagc cctatcgcat 1980 tggagcgcat cagaaatgaa gcaacggacg gaacgctgaa aatccaggtc tctttgcaga 2040 tcgggataaa gacagatgac agccacgatt ggaccaagct gcgctatatg gatagccata 2100 cgccagcgga cgcggagcga gccggattgc ttgtaaggac ttcagcaccg tgcacgatca 2160 ccgggaccat gggacacttt attctcgccc gatgcccgaa aggagagacg ctgacagtgg 2220 gatttacgga cagcagaaag atcagccaca catgcacaca cccgttccat catgaaccac 2280 ctgtgatagg tagggagagg ttccactctc gaccacaaca tggtaaagag ttaccttgca 2340 gcacgtacgt gcagagcacc gctgccactg ctgaggagat agaggtgcat atgcccccag 2400 atactcctga ccgcacgctg atgacgcagc agtctggcaa cgtgaagatc acagttaatg 2460 ggcagacggt gcggtacaag tgcaactgcg gtggctccgg aagtggatcc aacgagggac 2520 tgacaaccac agacaaagtg atcaataact gcaaaattga tcagtgccat gctgcagtca 2580 ctaatcacaa gaattggcaa tacaactccc ctttagtccc gcgcaacgct gaactcgggg 2640 accgtaaagg aaagatccac atcccattcc cattggcaaa cgtgacttgc agagtgccaa 2700 aagcaagaaa ccctacagta acttacggaa aaaaccaagt caccatgctg ctgtatcctg 2760 accatccgac actcttgtct taccgtaaca tgggacagga accaaattac cacgaggagt 2820 gggtgacaca caagaaggag gttaccttga ccgtgcctac tgagggtctg gaggtcactt 2880 ggggcaacaa cgaaccatac aagtactggc cgcagatgtc tacgaacggt actgctcatg 2940 gtcacccaca tgagataatc ttgtactatt atgagctgta ccccactatg actgtagtca 3000 ttgtgtcggt ggcctcgttc gtgcttctgt cgatggtggg cacagcagtg ggaatgtgtg 3060 tgtgcgcacg gcgcagatgc attacaccat atgaattaac accaggagcc actgttccct 3120 tcctgctcag cctgctatgc tgcgtcagaa cgaccaaggc ggccacatat tacgaggctg 3180 cggcatatct atggaacgaa cagcagcccc tgttctggtt gcaggctctt atcccgctgg 3240 ccgccttgat cgtcctgtgc aactgtctga aactcttgcc atgctgctgt aagaccctgg 3300 cttttttagc cgtaatgagc atcggtgccc acactgtgag cgcgtacgaa cacgtaacag 3360 tgatcccgaa cacggtggga gtaccgtata agactcttgt caacagaccg ggttacagcc 3420 ccatggtgtt ggagatggag ctacaatcag tcaccttgga accaacactg tcacttgact 3480 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Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Thr Met Leu Leu Tyr Pro 625 630 635 640 Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Gln Glu Pro Asn 645 650 655 Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Thr Leu Thr Val 660 665 670 Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr Lys 675 680 685 Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro His 690 695 700 Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val Val 705 710 715 720 Ile Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu Ser Met Val Gly Thr Ala 725 730 735 Val Gly Met Cys Val Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr Glu 740 745 750 Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Leu Cys Cys 755 760 765 Val Arg Thr Thr Lys Ala Ala Thr Tyr Tyr Glu Ala Ala Ala Tyr Leu 770 775 780 Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu Gln Ala Leu Ile Pro Leu 785 790 795 800 Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu Lys Leu Leu Pro Cys Cys 805 810 815 Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met Ser Ile Gly Ala His Thr 820 825 830 Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val 835 840 845 Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu 850 855 860 Glu Met Glu Leu Gln Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp 865 870 875 880 Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys 885 890 895 Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Tyr Ser 900 905 910 Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr 915 920 925 Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu 930 935 940 Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His 945 950 955 960 Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn 965 970 975 Ile Thr Val Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys 980 985 990 Asp Ala Lys Phe Val Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe 995 1000 1005 Asp Asn Lys Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp 1010 1015 1020 Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile 1025 1030 1035 Gln Ser Arg Thr Pro Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln 1040 1045 1050 Leu Val Leu Gln Arg Pro Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr 1055 1060 1065 Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly 1070 1075 1080 Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr 1085 1090 1095 Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala Val Gly Asn Ile Pro Ile 1100 1105 1110 Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr Arg Val Val Asp Ala 1115 1120 1125 Pro Ser Val Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro Ala Cys Thr His 1130 1135 1140 Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Ala Ser 1145 1150 1155 Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala Val Thr 1160 1165 1170 Ile Arg Glu Ala Asp Val Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu Gln 1175 1180 1185 Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln 1190 1195 1200 Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Ala Cys His Pro Pro 1205 1210 1215 Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly 1220 1225 1230 Val Gln Asp Ile Ser Thr Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile 1235 1240 1245 Thr Gly Gly Val Gly Leu Ile Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu 1250 1255 1260 Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His 1265 1270 <210> 49 <211> 3822 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VLP_CHI VLP 532 CD20-3 mouse <400> 49 atggagttca tcccgacgca aactttctat aacagaaggt accaaccccg accctgggcc 60 ccacgcccta caattcaagt aattagacct agaccacgtc cacagaggca ggctgggcaa 120 ctcgcccagc tgatctccgc agtcaacaaa ttgaccatgc gcgcggtacc tcaacagaag 180 cctcgcagaa atcggaaaaa caagaagcaa aggcagaaga agcaggcgcc gcaaaacgac 240 ccaaagcaaa agaagcaacc accacaaaag aagccggctc aaaagaagaa gaaaccaggc 300 cgtagggaga gaatgtgcat gaaaattgaa aatgattgca tcttcgaagt caagcatgaa 360 ggcaaagtga tgggctacgc atgcctggtg ggggataaag taatgaaacc agcacatgtg 420 aagggaacta tcgacaatgc cgatctggct aaactggcct ttaagcggtc gtctaaatac 480 gatcttgaat gtgcacagat accggtgcac atgaagtctg atgcctcgaa gtttacccac 540 gagaaacccg aggggtacta taactggcat cacggagcag tgcagtattc aggaggccgg 600 ttcactatcc cgacgggtgc aggcaagccg ggagacagcg gcagaccgat cttcgacaac 660 aaaggacggg tggtggccat cgtcctagga ggggccaacg aaggtgcccg cacggccctc 720 tccgtggtga cgtggaacaa agacatcgtc acaaaaatta cccctgaggg agccgaagag 780 tggagcctcg ccctcccggt cttgtgcctg ttggcaaaca ctacattccc ctgctctcag 840 ccgccttgca caccctgctg ctacgaaaag gaaccggaaa gcaccttgcg catgcttgag 900 gacaacgtga tgagacccgg atactaccag ctactaaaag catcgctgac ttgctctccc 960 caccgccaaa gacgcagtac taaggacaat tttaatgtct ataaagccac aagaccatat 1020 ctagctcatt gtcctgactg cggagaaggg cattcgtgcc acagccctat cgcattggag 1080 cgcatcagaa atgaagcaac ggacggaacg ctgaaaatcc aggtctcttt gcagatcggg 1140 ataaagacag atgacagcca cgattggacc aagctgcgct atatggatag ccatacgcca 1200 gcggacgcgg agcgagccgg attgcttgta aggacttcag caccgtgcac gatcaccggg 1260 accatgggac actttattct cgcccgatgc ccgaaaggag agacgctgac agtgggattt 1320 acggacagca gaaagatcag ccacacatgc acacacccgt tccatcatga accacctgtg 1380 ataggtaggg agaggttcca ctctcgacca caacatggta aagagttacc ttgcagcacg 1440 tacgtgcaga gcaccgctgc cactgctgag gagatagagg tgcatatgcc cccagatact 1500 cctgaccgca cgctgatgac gcagcagtct ggcaacgtga agatcacagt taatgggcag 1560 acggtgcggt acaagtgcaa ctgcggtggc tccggaggat acgactgtga accatctaat 1620 tcctcagaga aaaactcccc atctacacag tactgtaaca gcattggatc caacgaggga 1680 ctgacaacca cagacaaagt gatcaataac tgcaaaattg atcagtgcca tgctgcagtc 1740 actaatcaca agaattggca atacaactcc cctttagtcc cgcgcaacgc tgaactcggg 1800 gaccgtaaag gaaagatcca catcccattc ccattggcaa acgtgacttg cagagtgcca 1860 aaagcaagaa accctacagt aacttacgga aaaaaccaag tcaccatgct gctgtatcct 1920 gaccatccga cactcttgtc ttaccgtaac atgggacagg aaccaaatta ccacgaggag 1980 tgggtgacac acaagaagga ggttaccttg accgtgccta ctgagggtct ggaggtcact 2040 tggggcaaca acgaaccata caagtactgg ccgcagatgt ctacgaacgg tactgctcat 2100 ggtcacccac atgagataat cttgtactat tatgagctgt accccactat gactgtagtc 2160 attgtgtcgg tggcctcgtt cgtgcttctg tcgatggtgg gcacagcagt gggaatgtgt 2220 gtgtgcgcac ggcgcagatg cattacacca tatgaattaa caccaggagc cactgttccc 2280 ttcctgctca gcctgctatg ctgcgtcaga acgaccaagg cggccacata ttacgaggct 2340 gcggcatatc tatggaacga acagcagccc ctgttctggt tgcaggctct tatcccgctg 2400 gccgccttga tcgtcctgtg caactgtctg aaactcttgc catgctgctg taagaccctg 2460 gcttttttag ccgtaatgag catcggtgcc cacactgtga gcgcgtacga acacgtaaca 2520 gtgatcccga acacggtggg agtaccgtat aagactcttg tcaacagacc gggttacagc 2580 cccatggtgt tggagatgga gctacaatca gtcaccttgg aaccaacact gtcacttgac 2640 tacatcacgt gcgagtacaa aactgtcatc ccctccccgt acgtgaagtg ctgtggtaca 2700 gcagagtgca aggacaagag cctaccagac tacagctgca aggtctttac tggagtctac 2760 ccatttatgt ggggcggcgc ctactgcttt tgcgacgccg aaaatacgca attgagcgag 2820 gcacatgtag agaaatctga atcttgcaaa acagagtttg catcggccta cagagcccac 2880 accgcatcgg cgtcggcgaa gctccgcgtc ctttaccaag gaaacaacat taccgtagct 2940 gcctacgcta acggtgacca tgccgtcaca gtaaaggacg ccaagtttgt cgtgggccca 3000 atgtcctccg cctggacacc ttttgacaac aaaatcgtgg tgtacaaagg cgacgtctac 3060 aacatggact acccaccttt tggcgcagga agaccaggac aatttggtga cattcaaagt 3120 cgtacaccgg aaagtaaaga cgtttatgcc aacactcagt tggtactaca gaggccagca 3180 gcaggcacgg tacatgtacc atactctcag gcaccatctg gcttcaagta ttggctgaag 3240 gaacgaggag catcgctaca gcacacggca ccgttcggtt gccagattgc gacaaacccg 3300 gtaagagctg taaattgcgc tgtggggaac ataccaattt ccatcgacat accggatgcg 3360 gcctttacta gggttgtcga tgcaccctct gtaacggaca tgtcatgcga agtaccagcc 3420 tgcactcact cctccgactt tgggggcgtc gccatcatca aatacacagc tagcaagaaa 3480 ggtaaatgtg cagtacattc gatgaccaac gccgttacca ttcgagaagc cgacgtagaa 3540 gtagagggga actcccagct gcaaatatcc ttctcaacag ccctggcaag cgccgagttt 3600 cgcgtgcaag tgtgctccac acaagtacac tgcgcagccg catgccaccc tccaaaggac 3660 cacatagtca attacccagc atcacacacc acccttgggg tccaggatat atccacaacg 3720 gcaatgtctt gggtgcagaa gattacggga ggagtaggat taattgttgc tgttgctgcc 3780 ttaattttaa ttgtggtgct atgcgtgtcg tttagcaggc ac 3822 <210> 50 <211> 1274 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VLP_CHI VLP 532 CD20-3 mouse <400> 50 Met Glu Phe Ile Pro Thr Gln Thr Phe Tyr Asn Arg Arg Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Arg Pro Trp Ala Pro Arg Pro Thr Ile Gln Val Ile Arg Pro Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Gln Arg Gln Ala Gly Gln Leu Ala Gln Leu Ile Ser Ala Val 35 40 45 Asn Lys Leu Thr Met Arg Ala Val Pro Gln Gln Lys Pro Arg Arg Asn 50 55 60 Arg Lys Asn Lys Lys Gln Arg Gln Lys Lys Gln Ala Pro Gln Asn Asp 65 70 75 80 Pro Lys Gln Lys Lys Gln Pro Pro Gln Lys Lys Pro Ala Gln Lys Lys 85 90 95 Lys Lys Pro Gly Arg Arg Glu Arg Met Cys Met Lys Ile Glu Asn Asp 100 105 110 Cys Ile Phe Glu Val Lys His Glu Gly Lys Val Met Gly Tyr Ala Cys 115 120 125 Leu Val Gly Asp Lys Val Met Lys Pro Ala His Val Lys Gly Thr Ile 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Leu Ala Lys Leu Ala Phe Lys Arg Ser Ser Lys Tyr 145 150 155 160 Asp Leu Glu Cys Ala Gln Ile Pro Val His Met Lys Ser Asp Ala Ser 165 170 175 Lys Phe Thr His Glu Lys Pro Glu Gly Tyr Tyr Asn Trp His His Gly 180 185 190 Ala Val Gln Tyr Ser Gly Gly Arg Phe Thr Ile Pro Thr Gly Ala Gly 195 200 205 Lys Pro Gly Asp Ser Gly Arg Pro Ile Phe Asp Asn Lys Gly Arg Val 210 215 220 Val Ala Ile Val Leu Gly Gly Ala Asn Glu Gly Ala Arg Thr Ala Leu 225 230 235 240 Ser Val Val Thr Trp Asn Lys Asp Ile Val Thr Lys Ile Thr Pro Glu 245 250 255 Gly Ala Glu Glu Trp Ser Leu Ala Leu Pro Val Leu Cys Leu Leu Ala 260 265 270 Asn Thr Thr Phe Pro Cys Ser Gln Pro Pro Cys Thr Pro Cys Cys Tyr 275 280 285 Glu Lys Glu Pro Glu Ser Thr Leu Arg Met Leu Glu Asp Asn Val Met 290 295 300 Arg Pro Gly Tyr Tyr Gln Leu Leu Lys Ala Ser Leu Thr Cys Ser Pro 305 310 315 320 His Arg Gln Arg Arg Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala 325 330 335 Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser 340 345 350 Cys His Ser Pro Ile Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp 370 375 380 Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Ser His Thr Pro 385 390 395 400 Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Leu Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys 405 410 415 Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys 420 425 430 Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Ser Arg Lys Ile Ser His 435 440 445 Thr Cys Thr His Pro Phe His His Glu Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu 450 455 460 Arg Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly Lys Glu Leu Pro Cys Ser Thr 465 470 475 480 Tyr Val Gln Ser Thr Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met 485 490 495 Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Thr Gln Gln Ser Gly Asn 500 505 510 Val Lys Ile Thr Val Asn Gly Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys 515 520 525 Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Asp Cys Glu Pro Ser Asn Ser Ser Glu Lys 530 535 540 Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Asn Ser Ile Gly Ser Asn Glu Gly 545 550 555 560 Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Ile Asp Gln Cys 565 570 575 His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Asn Trp Gln Tyr Asn Ser Pro Leu 580 585 590 Val Pro Arg Asn Ala Glu Leu Gly Asp Arg Lys Gly Lys Ile His Ile 595 600 605 Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg Asn 610 615 620 Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Thr Met Leu Leu Tyr Pro 625 630 635 640 Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Gln Glu Pro Asn 645 650 655 Tyr His Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Val Thr Leu Thr Val 660 665 670 Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr Lys 675 680 685 Tyr Trp Pro Gln Met Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly His Pro His 690 695 700 Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met Thr Val Val 705 710 715 720 Ile Val Ser Val Ala Ser Phe Val Leu Leu Ser Met Val Gly Thr Ala 725 730 735 Val Gly Met Cys Val Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr Pro Tyr Glu 740 745 750 Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu Leu Cys Cys 755 760 765 Val Arg Thr Thr Lys Ala Ala Thr Tyr Tyr Glu Ala Ala Ala Tyr Leu 770 775 780 Trp Asn Glu Gln Gln Pro Leu Phe Trp Leu Gln Ala Leu Ile Pro Leu 785 790 795 800 Ala Ala Leu Ile Val Leu Cys Asn Cys Leu Lys Leu Leu Pro Cys Cys 805 810 815 Cys Lys Thr Leu Ala Phe Leu Ala Val Met Ser Ile Gly Ala His Thr 820 825 830 Val Ser Ala Tyr Glu His Val Thr Val Ile Pro Asn Thr Val Gly Val 835 840 845 Pro Tyr Lys Thr Leu Val Asn Arg Pro Gly Tyr Ser Pro Met Val Leu 850 855 860 Glu Met Glu Leu Gln Ser Val Thr Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Asp 865 870 875 880 Tyr Ile Thr Cys Glu Tyr Lys Thr Val Ile Pro Ser Pro Tyr Val Lys 885 890 895 Cys Cys Gly Thr Ala Glu Cys Lys Asp Lys Ser Leu Pro Asp Tyr Ser 900 905 910 Cys Lys Val Phe Thr Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Tyr 915 920 925 Cys Phe Cys Asp Ala Glu Asn Thr Gln Leu Ser Glu Ala His Val Glu 930 935 940 Lys Ser Glu Ser Cys Lys Thr Glu Phe Ala Ser Ala Tyr Arg Ala His 945 950 955 960 Thr Ala Ser Ala Ser Ala Lys Leu Arg Val Leu Tyr Gln Gly Asn Asn 965 970 975 Ile Thr Val Ala Ala Tyr Ala Asn Gly Asp His Ala Val Thr Val Lys 980 985 990 Asp Ala Lys Phe Val Val Gly Pro Met Ser Ser Ala Trp Thr Pro Phe 995 1000 1005 Asp Asn Lys Ile Val Val Tyr Lys Gly Asp Val Tyr Asn Met Asp 1010 1015 1020 Tyr Pro Pro Phe Gly Ala Gly Arg Pro Gly Gln Phe Gly Asp Ile 1025 1030 1035 Gln Ser Arg Thr Pro Glu Ser Lys Asp Val Tyr Ala Asn Thr Gln 1040 1045 1050 Leu Val Leu Gln Arg Pro Ala Ala Gly Thr Val His Val Pro Tyr 1055 1060 1065 Ser Gln Ala Pro Ser Gly Phe Lys Tyr Trp Leu Lys Glu Arg Gly 1070 1075 1080 Ala Ser Leu Gln His Thr Ala Pro Phe Gly Cys Gln Ile Ala Thr 1085 1090 1095 Asn Pro Val Arg Ala Val Asn Cys Ala Val Gly Asn Ile Pro Ile 1100 1105 1110 Ser Ile Asp Ile Pro Asp Ala Ala Phe Thr Arg Val Val Asp Ala 1115 1120 1125 Pro Ser Val Thr Asp Met Ser Cys Glu Val Pro Ala Cys Thr His 1130 1135 1140 Ser Ser Asp Phe Gly Gly Val Ala Ile Ile Lys Tyr Thr Ala Ser 1145 1150 1155 Lys Lys Gly Lys Cys Ala Val His Ser Met Thr Asn Ala Val Thr 1160 1165 1170 Ile Arg Glu Ala Asp Val Glu Val Glu Gly Asn Ser Gln Leu Gln 1175 1180 1185 Ile Ser Phe Ser Thr Ala Leu Ala Ser Ala Glu Phe Arg Val Gln 1190 1195 1200 Val Cys Ser Thr Gln Val His Cys Ala Ala Ala Cys His Pro Pro 1205 1210 1215 Lys Asp His Ile Val Asn Tyr Pro Ala Ser His Thr Thr Leu Gly 1220 1225 1230 Val Gln Asp Ile Ser Thr Thr Ala Met Ser Trp Val Gln Lys Ile 1235 1240 1245 Thr Gly Gly Val Gly Leu Ile Val Ala Val Ala Ala Leu Ile Leu 1250 1255 1260 Ile Val Val Leu Cys Val Ser Phe Ser Arg His 1265 1270

Claims (40)

  1. 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원을 포함하는 바이러스 유사입자로서, 상기 바이러스 구조의 폴리펩티드는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 또는 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하고, 하나 이상의 제 1 부착 부위를 포함하며, 상기 하나 이상의 항원은 하나 이상의 제 2 부착 부위를 포함하고, 상기 바이러스 구조의 폴리펩티드 및 상기 항원은 상기 하나 이상의 제 1 및 상기 하나 이상의 제 2 부착 부위를 통해 연결되는, 바이러스 유사 입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 항원의 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기 사이의 공간적 거리는, 상기 거리가 상기 항원 또는 상기 항원을 함유하는 자연 발생 단백질 또는 이로부터 변형된 단백질의 결정체에서 측정될 때 30 Å 이하인, 바이러스 유사 입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 바이러스 구조의 폴리펩티드는 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는, 바이러스 유사 입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 외막 단백질을 포함하는 바이러스 구조의 폴리펩티드인, 바이러스 유사 입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 캡시드 및/또는 외막 단백질 E3, E2, 6K 및 E1 을 포함하는 바이러스 구조의 폴리펩티드인, 바이러스 유사 입자.
  6. 제 5 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 외막 단백질의 E2 내에 삽입되는, 바이러스 유사 입자.
  7. 제 1 항에 있어서, 항원이 자가 항원 및 암 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 바이러스 유사 입자.
  8. 제 1 항에 있어서, 항원이 TNF-α, CD20 또는 CTLA4 로부터 유래하는 폴리펩티드인, 바이러스 유사 입자.
  9. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원이 하기의 것인, 바이러스 유사 입자:
    i) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 의 폴리펩티드;
    ii) 치쿤구니야 바이러스 (CHIKV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 의 폴리펩티드;
    iii) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 TNF-α 의 폴리펩티드; 또는
    iv) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CD20 의 폴리펩티드;
    v) 베네스웰라형 마뇌염 바이러스 (VEEV) 로부터 유래하는 폴리펩티드 및 CTLA4 의 폴리펩티드.
  10. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 항원 및 폴리펩티드가 융합 단백질로서 발현되는, 바이러스 유사 입자.
  11. 제 10 항에 있어서, 폴리펩티드 및 하나 이상의 항원이 직접 융합되는, 바이러스 유사 입자.
  12. 제 10 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 폴리펩티드와 융합되고, 이때 1개 또는 2개의 링커가 상기 항원 및 상기 폴리펩티드의 N-말단 잔기 및/또는 상기 항원 및 상기 폴리펩티드의 C-말단 잔기 사이에서 개입되는, 바이러스 유사 입자.
  13. 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 519 및 520 사이, SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 530 및 531 사이, 또는 SEQ ID No. 1 또는 2 의 잔기 531 및 532 사이에서 삽입되는, 바이러스 유사 입자.
  14. 제 10 항에 있어서, 융합 단백질이 SEQ ID No. 4, 5, 6, 7 또는 8 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 단백질인, 바이러스 유사 입자.
  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 화학적 교차 결합에 의해 폴리펩티드에 연결되는, 바이러스 유사 입자.
  17. 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  18. SEQ ID No. 13, 14, 15, 16 또는 17 로 나타내는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  19. 삭제
  20. 제 17 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되는 발현 조절 서열을 임의 포함하는 벡터.
  21. 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  22. (a) 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 포함하는 백신 조성물.
  24. 제 17 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 DNA 백신 조성물.
  25. 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 인간을 제외한 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 항체 생산 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인, 항체 생산 방법.
  27. 제 21 항에 있어서, 상기 조성물의 면역학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 면역조정 방법에서 사용되는, 조성물.
  28. 제 21 항에 있어서, 상기 조성물의 면역학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환의 치료 방법에서 사용되는, 조성물.
  29. 제 21 항에 있어서, 상기 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 항원에 대항하는 면역 반응을 유도하고/유도하거나 증강시키는 방법에서 사용되는, 조성물.
  30. 제 21 항에 있어서, 상기 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에서 사용되는, 조성물.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 제 30 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 암 항원인, 조성물.
  34. 제 30 항에 있어서, 하나 이상의 항원이 하나 이상의 암 항원인, 조성물.
  35. 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자 및/또는 제 1 항에 따른 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 인간을 제외한 포유동물에게 접촉시키는 것을 포함하는, 대식세포 상에 항원을 제시하는 방법.
  36. 제 10 항에 따른 바이러스 유사 입자를 제조하는 방법으로서, 상기 바이러스 유사 입자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 제조하는 것; 상기 유전자로 트랜스펙션된 세포를 배양하여 상기 입자를 발현시키는 것; 및 상기 입자를 회수하는 것을 포함하는 방법.
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