MXPA05012754A - Vacunas virales atenuadas vivas para virus de encefalitis equina oriental. - Google Patents

Abstract

Se describen vacunas atenuadas vivas de virus de encefalitis equina oriental, EEE, que sobrepasan a la vacuna de PE-6 en ratones desafiados con aerosol con > 1,000x la LD50; los candidatos incluyen cuatro mutantes de delecion del sitio de digestion por furina, y un mutante de delecion de E3; cada vacuna brindo proteccion en aves contra cepas del virus de EEE de Norteamerica y Sudamerica antigenicamente distintas; la vacuna de PE-6 no brinda proteccion contra los virus de EEE de Sudamerica; los animales inoculados con cada una de las vacunas de la invencion, desarrollaron anticuerpos neutralizantes para el virus de EEE.

Description

VACUNAS VIRALES ATENUADAS VIVAS PARA VIRUS DE ENCEFALITIS EQUINA ORIENTAL INTERES GUBERNAMENTAL La invención descrita en la presente puede ser fabricada, usada y autorizada por el gobierno de los Estados Unidos, o para el mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente solicitud reclama prioridad bajo 35 U.S.C. § 119 de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/474,752, presentada en mayo 29 de 2003, incorporada en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una vacuna contra virus de encefalitis equina oriental (EEE). Más específicamente, la invención se refiere a la síntesis de un alfavirus, clon de EEE, que es útil como una vacuna para EEE. Se describen moléculas de ADNc que codifican para un virus de encefalitis equina oriental infeccioso. Se describen mutaciones atenuantes novedosas y su uso.

BREVE DESCRIPCION DE LA TECNICA RELACIONADA Los virus de encefalitis equina oriental (EEE), encefalitis equina occidental (WEE) y encefalitis equina venezolana (VEE), son miembros del género Alphavirus de la familia Togavirídae. El género comprende por lo menos 27 virus de ARN diferentes llevados por artrópodos que se encuentran a través de gran parte del mundo. Los virus circulan normalmente entre aves o roedores hospederos a través de las actividades de alimentación de una variedad de mosquitos. Muchas epizootias han ocurrido, y se correlacionan con la actividad incrementada de los mosquitos después de períodos de precipitación incrementada. Con base en comparaciones de sus secuencias genómicas, EEE, WEE y VEE parecen ser alfavirus del Nuevo Mundo estrechamente relacionados. Se sabe que los tres virus causan encefalitis en humanos y equinos en proporciones epidémicas. Sin embargo, el virus de EEE causa la más severa de las encefalitis arbovirales en humanos, con 50 a 75% de mortalidad, y secuelas neurológicas severas en los sobrevivientes (Fields Virology, cuarta edición, capítulo 30 Alphaviruses

[2002] 917-962). Los índices de fatalidad de casos más altos, ocurren en niños y ancianos. En equinos, el índice de mortalidad es sustancialmente mayor, variando de 80 a 90%, teniendo la mayoría de los sobrevivientes secuelas neurológicas importantes (Weaver et al.

[1989] Adv Virus Res. 37: 277-328). Se han observado también brotes de EEE en cerdos (Elvinger et al.

[1996] J Vet Diagn Invest 8: 481-484), así como en aves de caza tales como faisanes (Sussman et al.

[1958] Ann NY Acad Sci 70: 328-341) y emúes (Tully er a/.

[1992] Avian Dis 36: 808-812). En epidemias de EEE, se piensa que las especies de mosquitos Aedes y Coquillettidia cubren la brecha entre aves y humanos o equinos infectados. Los avances recientes del mosquito Aedes albopictus en Norteamérica, y su competencia conocida como un vector de EEE, han incrementado el potencial para epidemias y endemias más frecuentes y extendidas (Mitchell eí al.

[1992] Science 257: 526-527). Otro problema de salud pública significativo, incluye aves migratorias infectadas que llevan el virus hacia nuevas áreas. Los estudios han mostrado que esto ocurre. Dos cepas de virus de EEE de Sudamérica se aislaron de aves migratorias capturadas en Mississippi a principios de la década de los setenta (Calisher et al.

[1971] Am J Epidemiol 94: 172-178). En 1996, ocurrió una epidemia de EEE en equinos en el estado de Tamaulipas, en México. Esta área tiene varios cientos de kilómetros fuera de la escala geográfica del vector de EEE natural, y los epidemiólogos piensan que fue causada por aves migratorias infectadas (Brault er a/. [ 999] Am J Trop Med Hyg. 61 : 579-586). La EEE fue reconocida primero como una enfermedad equina en el nordeste de los Estados Unidos. El virus responsable de la EEE se aisló originalmente del cerebro de caballos infectados incluidos en el brote de 1933 en Virginia y New Jersey (Ten Broeck, C. ef al.

[1993] Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 31 : 217-220). El virus de EEE ha causado brotes localizados en equinos, cerdos, faisanes, emúes y humanos durante los meses de verano en Norteamérica. El virus es conocido por ser focalmente endémico a lo largo de gran parte de las costas del Atlántico y Golfo de Norteamérica. Se ha encontrado también en el sur de Canadá, el Caribe, Centroamérica, la parte oriental de México, y en grandes secciones de Sudamérica (figura 2). Existen focos tierra adentro en la región de los Grandes Lagos y en Dakota del Sur en los Estados Unidos, así como la cuenca del Amazonas. La vacuna de EEE actual para uso humano y aplicaciones veterinarias en los Estados Unidos, es una preparación de virus enteros ¡nactivados con formalina derivada de la cepa PE-6 (Bartelloni, et al.

[1970] Am J Trop Med Hyg. 19: 123-126; Marie, et al.

[1970] Am J Trop Med Hyg. 19: 19-122). Esta preparación está actualmente autorizada para uso veterinario. Para humanos, es un nuevo fármaco de investigación (IND), y se destina para personas en riesgo de infección (por ejemplo, personal de investigación de campo y de laboratorio). Esta vacuna inactivada es poco inmunógena, requiere inoculaciones múltiples con refuerzos frecuentes, y resulta en general en inmunidad de corta duración (Pittman et al., en Vaccines, cuarta edición (eds. Plotkin, S. A. y Orenstein, W. A.)

[2004] págs. 991-992). Otra deficiencia importante, es que esta vacuna de EEE inactiva brinda protección inadecuada contra las cepas de EEE de Sudamérica antigénicamente distintas [Strizki et al.

[1995] Am J Trop Med Hyg. 53: 564-570; Dietz ef al.

[1980] Am J Trop Med Hyg. 29: 133-140]. Por ultimo, existen consecuencias terribles si la preparación de vacuna de PE-6 no es totalmente inactivada. Recientemente, se sospecha que una preparación de PE-6 inactivada inadecuadamente, es la causa de la EEE fatal en un equino de California (Franklin et al.

[2002] Emerging Infectious Diseases 8: 283-288). La comunidad científica considera que el virus de la EEE, es un virus que podría usarse potencialmente como un arma biológica. Los Centres for Disease Control (CDC) han clasificado a la EEE como un agente de selección clase B. Científicos dentro de la ex Unión Soviética, han llevado a cabo la investigación de "vacunas" en el virus (Volchkov et al.

[1991] Molekulyarnaya Genetika 5: 8-15), a pesar del hecho de que el virus es sólo endémico en el hemisferio occidental. Las deficiencias de la única vacuna de EEE disponible, indican la necesidad del desarrollo de una nueva formulación. Una vacuna atenuada viva podría ofrecer ventajas significativas para uso humano y veterinario sobre la preparación de PE-6 ¡nactivada. Estos beneficios incluyen administración que se limita a una sola dosis, y producción más eficiente de inmunidad humoral. Una vacuna atenuada viva podría producirse también a partir de menos material de partida de lo que es posible con productos inactivados existentes. Por último, puede brindar inmunidad a la EEE que puede durar varios años o incluso la vida y brindar protección contra todas las cepas de EEE. La deleción del sitio de digestión por la proteasa furina de virus de VEE y WEE, ha resultado en la producción exitosa de candidatos de vacunas atenuadas vivas. Cada una de estas alternativas ha sido patentada previamente por otros (véase patente de E.U.A. Nos. 6,261 ,570 y 5,505,947).

La investigación del virus de EEE ha quedado significativamente atrás de la VEE y WEE, a pesar de ser el más peligroso de estos virus. Hasta la fecha, no existe vacuna de EEE viable conocida que contenga una deleción parcial o completa del sitio de digestión porfurina. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención producir una vacuna de EEE atenuada viva formada de un mutante de deleción del sitio de digestión por furina. Esta vacuna se derivará de un clon molecular del virus de EEE construido a partir de moléculas de ADNc que abarcan el genoma completo del virus de EEE. Esta construcción contendrá una deleción parcial o completa del sitio de digestión por furina y/u otras deleciones dentro del genoma del virus de EEE. El método clásico para derivar vacunas atenuadas vivas, implica el paso oculto del virus en cultivos de células. Este procedimiento se usó exitosamente para producir vacunas de alfavirus para VEE (TC83) y chikungunya (Vaccines, cuarta edición, capítulo 35 Miscellaneous limited-use vaccines

[2004] 991-992). Una desventaja de este procedimiento, es que resulta con frecuencia en productos heterogéneos. Los presentes inventores han usado este método clásico en el desarrollo de varios candidatos de vacuna de EEE. Para consignar toda ambigüedad, los virus atenuados fueron siempre secuenciados, y se produjeron subsecuentemente clones moleculares definidos que se comportaron en forma comparable al virus precursor. El genoma de alfavirus es un ARN sentido positivo de cadena sencilla, de aproximadamente 11,700 nucleótidos de longitud. Las dos terceras partes 5' del genoma consisten de una región no codificante de aproximadamente 46 nucleótidos, seguida de un marco de lectura abierto individual de aproximadamente 7,500 nucleótidos, que codifica para la transcriptasa/replicasa viral. Una tercera parte 3' del genoma codifica para las proteínas estructurales virales en el orden cápside-E3-E2-6K-E1, cada una de las cuales se deriva mediante digestión proteolítica del producto de un marco de lectura abierto individual de aproximadamente 3,700 nucleótidos. Las secuencias que codifican para las proteínas estructurales, son transcritas como un ARN mensajero 26S de un promotor interno en el complemento sentido negativo del genoma viral. La proteína de la nucleocápside (C) posee actividad autoproteolítica que digiere la proteína C de la proteína precursora, poco después de que el ribosoma transita la unión entre la secuencia que codifica para la proteína C y E3. Después, las glucoproteínas de cubierta E2 y E1 se derivan mediante digestión proteolítica en asociación con membranas intracelulares, y forman heterodímeros. E2 aparece inicialmente en la célula infectada como la proteína precursora PE2, que consiste de E3 y E2. Después de glucosilación extensiva y tránsito a través del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, E3 es digerida a partir de E2 por la proteasa furina en un sitio de digestión que tiene una secuencia consenso de RXK/RR, siendo X uno de los muchos aminoácidos presentes en los virus diferentes, y ocurriendo la digestión después del último residuo de arginina (R). Después, el complejo E2/E1 es transportado hacia la superficie celular, en donde es incorporado en virus que "brotan" de la membrana plasmática (Strauss y Strauss

[1994] Microbiological Rev. 58: 491-562). Todos los documentos citados en la presente se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Un diagrama del genoma del virus de EEE se muestra en las figuras 3 y 4. Debido a que el genoma de los alfavirus es ARN de cadena positiva, e infecciosos tras la transfección de células en cultivo, una alternativa de "clon infeccioso" al desarrollo de la vacuna, es particularmente adecuada. En esta alternativa, un clon de ADNc de longitud completa del genoma viral se construye hacia el extremo 3' a partir de un promotor de ARN polimerasa, de modo que el ARN que es equivalente al genoma viral pueda ser transcrito a partir del clon de ADN in vitro. Esto permite llevar a cabo mutagénesis dirigida a sitio para insertar mutaciones específicas en el clon de ADN, las cuales se reflejan entonces en el virus que se recupera mediante transfección del ARN. El trabajo previo con clones infecciosos de otros alfavirus, ha demostrado que la disolución del sitio de digestión por furina, resulta en un virus que incorpora una proteína precursora E2 (PE2) en el virus maduro. Davis et al. (1995, citado anteriormente) encontraron que la disolución del sitio de digestión por furina en un clon infeccioso de VEE, es una mutación letal. La transfección de células BHK con ARN transcrito de este clon mutante, resultó en la liberación de partículas no infecciosas. Sin embargo, se produjo un bajo nivel de virus infecciosos que contenían mutaciones supresoras secundarias tales que el virus que poseía a PE2 era totalmente de replicación competente.

Se mostró después que era avirulento, pero capaz de inducir inmunidad ai desafío con el virus letal en una variedad de especies animales. La base genética para la atenuación de la vacuna de TC-83 de VEE y ciertas cepas de laboratorio de virus de VEE (por ejemplo, V3526) se ha estudiado extensamente, y ha llevado al desarrollo de candidatos de vacuna atenuada viva mejorados (Davis et al. 1995, citado anteriormente; Pratt et al.

[2003] Vaccine 21 : 3854-3862). Sin embargo, la alternativa usada en esta solicitud es similar a la usada para VEE, después de que el ejemplo del VEE no resultó en una vacuna adecuada para EEE. Se requirieron cambios en el procedimiento usado para la VEE para producir el virus de EEE vivo atenuado de la presente invención, ninguno de los cuales pudo haber sido predicho a partir de investigaciones previas en alfavirus. Con base en una comparación de las secuencias génicas de proteínas estructurales del virus de EEE y otros alfavirus, el sitio de digestión por furina probable del virus de la cepa FL91-4697 del virus de EEE, es RRTRR (SEQ ID NO: 2). La presencia de la arginina extra cuando se comparó con la secuencia consenso de la furina (RX(R/K)R), indica que la digestión en este sitio podría ser más compleja que la observada para el virus de VEE. Por lo tanto, fue necesario preparar un muíante de deleción en el sitio de digestión de E3-E2 del clon de longitud completa, que careciera de cinco aminoácidos para producir un virus atenuado. La arginina residual en el clon de longitud completa fue de interés debido a la posibilidad de que otras mutaciones pudieran surgir debido a la presencia de la arginina extra, resultando en digestión por proteasas celulares en ese sitio, y produciendo un virus aparentemente de tipo silvestre con respecto a la digestión de PE2. La transfección de células cultivadas con ARN transcrito de un clon infeccioso de EEE que carece de una deleción parcial o completa del sitio de digestión por furina, dio virus que contenían la PE2 de EEE en el virus maduro, pero que no eran de replicación competente. Durante la replicación intracelular del ARN, surgen mutaciones a baja frecuencia, resultando en un pequeño número de virus de replicación competente. El análisis de secuencias de estos virus, ha mostrado que el efecto letal de las mutaciones por deleción mejoró por la aparición de mutaciones de segundo sitio en las glucoproteínas E3, E2 y/o E1. Estos virus son atenuados en ratones cuando se administran mediante inoculación subcutánea o intranasal. Los ratones inoculados produjeron un alto título de anticuerpo neutralizante de suero específico para EEE, y fueron protegidos contra un desafío letal con aerosol del virus de EEE virulento precursor (>1000x LD50). Se observaron resultados similares en pollos jóvenes cuando se administraron mediante inoculación subcutánea virus de EEE mutantes. Las aves produjeron anticuerpo neutralizante, y fueron protegidas contra un desafío subcutáneo (s.c.) de con el virus FL91 de EEE precursor, así como la cepa PE-0155 de EEE de Sudamérica. Por lo tanto, en un aspecto de la invención, la invención pertenece al aislamiento de una secuencia de ADNc que codifica para transcritos de ARN de virus de encefalitis equina oriental (EEE) infeccioso de tipo silvestre. Se preparó mediante reacción en cadena de polimerasa ADN que representa el genoma de FL91-4679 completo, no disponible previamente, usando una serie de pares de iniciadores basados en la secuencia genómica de la cepa PE-6 del virus de EEE. Para determinar la secuencia correcta en los extremos 5' y 3' del genoma, se usó un protocolo denominado amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE). El clon de longitud completa es útil en la producción de virus de EEE virulentos, y como una plataforma para introducir y poner a prueba mutaciones atenuantes. La producción de virus virulentos es esencial para una medición formal del grado de atenuación logrado con mutaciones atenuantes candidatas y una determinación formal de la velocidad a la cual podría ocurrir reversión a la virulencia. Porciones de las secuencias de ADNc del virus de EEE descritas anteriormente, son también útiles como sondas para diagnosticar la presencia de virus en muestras, y para definir variantes del virus de ocurrencia natural. Estas moléculas de ADNc hacen también disponibles secuencias de polipéptidos de antígenos del virus de EEE codificados dentro del genoma del virus de EEE, y permiten la producción de polipéptidos, los cuales son útiles como estándares o reactivos en pruebas de diagnóstico y/o como componentes de vacunas. Anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, dirigidos contra epítopes del virus de EEE contenidos dentro de esta secuencia de polipéptidos, serían también útiles para pruebas de diagnóstico, como agentes terapéuticos, y para la selección de agentes antivirales. Por consiguiente, con respecto a polinucleótidos, algunos aspectos de la invención son: un polinucleótido del virus de EEE purificado, un polinucleótido del virus de EEE recombinante que incluya virus quiméricos; un polinucleótido recombinante que comprenda una secuencia derivada del genoma del virus de EEE o de ADNc del virus de EEE que incluya un virus quimérico; un polinucleótido recombinante que codifique para un epítope del virus de EEE, un vector recombinante que contenga alguno de los polinucleótidos recombinantes anteriores, y una célula hospedera transfectada con cualquiera de estos vectores. Otro aspecto de la invención es una secuencia de ADN de cadena sencilla que comprenda un clon de ADNc que codifique para un virus de EEE infeccioso, el clon de ADNc incluyendo por lo menos una mutación atenuante en el mismo, el ARN producido a partir de la transcripción del ADNc y las partículas virales producidas a partir del ARN en una célula hospedera, para su uso como una vacuna. En otro aspecto de la invención, se provee un clon de ADNc de virus de EEE de longitud completa que contiene una mutación por deleción definida útil para atenuar al virus, para la identificación de mutaciones supresoras en el virus. Los virus atenuados con la deleción por digestión y mutaciones supresoras, son útiles como medios para generar una vacuna de virus de EEE viva atenuada para uso veterinario y humano. En otro aspecto de la invención, se provee un virus quimérico que contiene secuencias génicas de proteínas no estructurales y/o estructurales derivadas del virus de EEE, y secuencias génicas de proteínas de cualquier alfavirus que Incluye, pero no está limitado a, Aura, Bosque Barman, Bebaru, Cabassou, Chikungunya, Evergiades, Fort Morgan, Getah, Highlands J, Kyzylagach, Mayaro, Middelburg, Mucambo, Ndumu, O'nyong-nyong, Pixuna, Río Ross, Sagiyama, Bosque Semliki, SAAR87, Sindbis, Tonate, Una, encefalitis equina venezolana, encefalitis equina occidental y Whataroa, los cuales podrían usarse como medio para atenuar alfavirus virulentos. Dependiendo de las secuencias diferentes del virus de EEE sustituidas por virus de EEE, otro aspecto de la invención incluye medios para expresar antígenos de otros alfavirus como alfavirus quiméricos como vacunas potenciales para uso humano y veterinario. En otro aspecto de la invención, se provee una vacuna que brinda protección contra EEE, la vacuna comprendiendo virus de EEE atenuados vivos en una cantidad efectiva para inducir anticuerpos protectores en un animal a la EEE, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto de la invención, se provee una vacuna inactivada producida a partir del virus atenuado vivo descrito anteriormente. El virus atenuado de la presente invención, ya sea virus entero o virus quimérico, puede usarse para producir vacunas de virus inactivadas. Mediante el uso de una cepa de virus de EEE atenuada, existe un margen de seguridad mucho mayor en caso de que el producto sea inactivado incompletamente. Partir con una cepa atenuada es también mucho más seguro durante la fase de fabricación, y permite la producción bajo menores niveles de biocontención. Los candidatos de la vacuna de EEE atenuada viva que se describen después, se predicen principalmente tras la deleción del sitio de digestión por furina. La presente invención se ha desarrollado a través de una alternativa de tres niveles para producir los candidatos descritos y reclamados en la presente. Estos y otros objetivos llegarán a ser evidentes después de leer esta descripción. En esta solicitud, se describen vacunas atenuadas vivas para EEE, las cuales pueden proveer inmunidad de mayor nivel en humanos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención satisface la necesidad mencionada anteriormente. En esta solicitud, se describen vacunas atenuadas vivas para EEE, las cuales pueden proveer inmunidad de mayor nivel en humanos y equinos por muchos años, y posiblemente para la vida. Además, pueden producirse números muy grandes de dosis de vacuna a partir de significativamente menos materiales de partida de lo que es posible con los productos inactivados existentes. Las preparaciones de vacuna de la presente invención comprenden copias de ADNc de longitud completa del genoma del virus de EEE, las cuales han sido alteradas de modo que el ARN producido a partir del ADNc, y el virus producido del mismo, es atenuado y útil como una vacuna viva para uso humano y veterinario. Las preparaciones de vacuna para EEE son virus novedosos que incluyen deleciones en la región que codifica para proteínas estructurales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1A. Ensamble del clon de ADNc de longitud completa del virus de encefalitis equina oriental. Se prepararon productos de reacción en cadena de polimerasa que representan el genoma completo del virus de EEE, indicándose los pares de iniciadores. Cada uno de los productos fue clonado en pBluescript KS+. Se llevó a cabo el ensamble del clon de longitud completa, pEE2002 en pBluescript, como se indica en la figura y como se describe más adelante. Los clones no están trazados a escala. En cada uno de los plásmidos, se indican los iniciadores usados para generar los productos de PCR, ya que son los sitios de endonucleasa de restricción usados para el ensamble. Figura 1B. Derivación de los clones de ADNc de longitud completa de la segunda generación para el virus de encefalitis equina oriental. Se generó un producto de PCR usando el ADNc de FL91 de tipo silvestre y los iniciadores E8275F y E3'Not l. Este producto de PCR fue digerido con Eco Rl y Not I, y el fragmento de ADN resultante fue subclonado en pEE2002. Esto resultó en la producción de un nuevo plásmido infeccioso, pEE4002. Las mutaciones puntuales de cisteína deletéreas (*) faltaron en el clon de longitud completa final, pEE4002. Un fragmento Neo I/Eco Rl de pEE2202 fue subclonado en pEE4002 para obtener el nuevo muíante de deleción del sitio de digestión por furina, pEE4202. Figura 1C. Perfiles de polipéptidos de virus de encefalitis equina oriental. Se analizaron muestras de virus purificados mediante electroforesis sobre geles de poliacrilamida a 10%, y se tiñeron con azul brillante de Coomassie. El campo 1 contiene virus recombinante pEE4002 (es decir, el clon molecular FL91 de tipo silvestre), el campo 2 contiene un marcador de peso molecular (pesos moleculares de arriba hacia abajo de 200.0, 6.3, 97.4, 66.3, 55.4, 36.5, 31.0, 21.5 y 14.4 kilodaltons), el campo 3 representa el virus FL91-4679 de tipo silvestre no clonado, y los campos 4 a 7 contienen mutantes virales de deleción del sitio de digestión por la proteasa furina pEE4202 que contienen la proteína PE2 y carecen de E2. La figura 2 es un mapa que muestra la geografía de EEE. La figura 3 es un diagrama de la organización y expresión del genoma del virus de EEE (el péptido RRTRR mostrado en SEQ ID NO: 2). La figura 4 es un diagrama del genoma de FL91 del virus de EEE. La figura 5 es un diagrama de flujo de la estrategia para la construcción de una vacuna de EEE diseñada genéticamente. La figura 6 es un diagrama de las mutaciones del virus de EEE del ejemplo 2. La figura 7 es un diagrama de las mutaciones del virus de EEE del ejemplo 3. La figura 8 es un diagrama de la digestión por furina en el procesamiento de glucoproteínas de la cubierta del virus de EEE (véase SEQ ID NOS: 18-19). La figura 9 es un diagrama de virus de EEE mutantes del ejemplo 4 (péptido RRTRR mostrado en SEQ ID NO: 2). La figura 10 es un diagrama de virus de EEE mutantes del ejemplo 4 (péptido RRTRR mostrado en SEQ ID NO: 2) DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En una modalidad, la presente invención se refiere a un clon de ADNc de longitud completa de virus de EEE totalmente virulento (pEE 4002) especificado en SEQ ID NO: 1. Se aisló la cepa FL91-4679 de EEE, de mosquitos Aedes albopictus infectados, aislada en 1991 del Condado Polk, Florida (Mitchell et al.

[1992] Science 257 (5069): 526-527). Este virus se usó como una cepa precursora en la presente invención. Puede seleccionarse cualquier aislado que se sepa cause enfermedad en el hombre o animales. De preferencia, puede usarse una cepa que consistentemente cause la muerte de 100% de ratones jóvenes cuando se inocula subcutáneamente. Además, es útil la capacidad de una cepa que tenga un fenotipo fácilmente identificable tal como, por ejemplo, la capacidad para formar grandes placas en cultivo de tejidos sobre monocapas de células indicadoras. El clon de ADNc puede generarse mediante cualquiera de una variedad de métodos estándar conocidos en la técnica. De preferencia, puede prepararse ADN que represente el genoma completo mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando una serie de pares de iniciadores basados en algunas de las secuencias del genoma de EEE de Norteamérica depositado previamente en el GenBank. La secuencia terminal 5' del virus puede determinarse mediante 5'-RACE, básicamente como se describe en Frohman et al. (

[1988] Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8998-9002). El ensamble del clon de longitud completa puede ser un vector de transcripción adecuado tal como, por ejemplo, pBluescript KS+, usando sitios de endonucleasa de restricción convenientes, o el genoma completo podría ser insertado en algún plásmido que contenga sitios de digestión por endonucleasa de restricción adecuados para clonación, un origen de replicación de modo que el plásmido pueda propagarse en un hospedero bacteriano, y un gen marcador seleccionable que mantenga al plásmido en la célula bacteriana durante el crecimiento. La secuencia de ADN tiene de preferencia una secuencia de ADN complementaria unida a la misma, de modo que la secuencia de doble cadena servirá como un molde activo para la ARN polimerasa. Por consiguiente, el vector de transcripción comprende de preferencia un plásmido. Cuando la secuencia de ADN comprende un plásmido, se prefiere que un sitio de restricción único sea provisto 3' (con respecto a la secuencia de ARN del virión) o ("hacia el extremo 3' ") del clon de ADNc. Esto provee medios para linealizar la secuencia de ADN para mejorar la eficiencia de la transcripción del ARN de longitud completa del genoma in vitro. El clon completo está de preferencia asociado operativamente con una región de promotor tal que el promotor hace que el clon de ADNc sea transcrito en presencia de una ARN poiimerasa que se une al promotor. El promotor está posicionado en el extremo 5' (con respecto a la secuencia de ARN del virión), o hacia el extremo 5', del clon de ADNc. Un número excesivo de nucleótidos entre la secuencia de promotor y el clon de ADNc, resultará en la inoperabilidad de la construcción. Por consiguiente, el número de nucleótidos entre la secuencia de promotor y el clon de ADNc, es de preferencia no mayor de ocho, más preferiblemente no mayor de 5, aún más preferiblemente no mayor de 3, y muy preferiblemente no mayor de 1. Ejemplos de promotores útiles en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, promotores T3, promotores T7 y promotores SP6. Se prefiere que el extremo 5' del transcrito in vitro no tenga nucleótido adicional alguno que preceda al primer nucleótido de la secuencia viral. En el extremo 3', pueden tolerarse nucleótidos adicionales en el transcrito in vitro, pero se pierden quizá cuando el virus se replica. En la mayoría de los casos, se requiere el tracto de poli-A en el extremo 3' para la viabilidad del virus. La selección del clon de longitud completa virulento puede lograrse comparando la LD50 del virus codificado por el ADNc clonado, con la LD50 del virus precursor usado, en el presente ejemplo, FL91-4679 de EEE.

La capacidad para producir virus virulentos es importante; permite la introducción y la realización de pruebas de mutaciones atenuantes y el fenotipo atenuado contra un estándar: el precursor virulento. La transfección de células con el transcrito de ARN codificado por el ADNc genómico de longitud completa puede lograrse mediante cualquier medio adecuado tal como, por ejemplo, tratando las células con DEAE dextrán, tratando las células con liposomas, y mediante electroporación. Células tolerantes de togavirus, células tolerantes de alfavirus y células tolerantes del virus de EEE son células que, tras la transfección con el transcrito de ARN viral, son capaces de producir partículas virales. Los togavirus tienen un amplio rango de hospederos. Ejemplos de dichas células incluyen, pero no están limitados a, células Vero, células de riñon de cría de hámster, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon de mono verde africano (COS-7), células L de ratón, células RC-5, y células de mosquito tales como células C6-36, por nombrar unas cuantas. Para determinar la virulencia del genoma viral clonado, puede inocularse a los ratones intranasalmente o subcutáneamente con 105 unidades formadoras de placas (pfu) del virus clonado. Se considera que el clon es virulento si todos los ratones mueren, y no totalmente virulento si todos los ratones no mueren. La LD50 de la cepa precursora FL91-4679 del virus de EEE usando aerosol, es de aproximadamente 50 pfu. Por lo tanto, si la inoculación de 1000 veces no causó enfermedad letal en todos los ratones, se considera como atenuada. Secuencias de ADN o de polinucieótidos a las cuales la invención se refiere también, incluyen secuencias de por lo menos aproximadamente 6 nucleótidos, de preferencia por lo menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 10 a 12 nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 15 a 20 nucleótidos que corresponden, es decir, que son homologas o complementarias a, una región de la secuencia de nucleótidos del virus de EEE. De preferencia, la secuencia de la región de la cual el polinucleótido se deriva, es homologa o complementaria a, una secuencia que es única para el virus. Si una secuencia es única o no al virus, puede determinarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la secuencia puede compararse con secuencias en bancos de datos, por ejemplo, GenBank. Las regiones de las cuales pueden derivarse secuencias de ADN típicas incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo, regiones que codifican para epítopes específicos, así como regiones no traducidas. El polinucleótido derivado no necesariamente se deriva físicamente de la secuencia de nucleótidos de los alfavirus, sino puede generarse en cualquier forma incluyendo, por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción inversa o transcripción, las cuales se basan en la información provista por la secuencia de bases en las regiones de las cuales el polinucleótido se deriva. Además, combinaciones de regiones que corresponden a las de la secuencia diseñada, pueden modificarse en formas conocidas en la técnica que sean consistentes con el uso deseado. Las secuencias de la presente invención pueden usarse en pruebas de diagnóstico tales como pruebas de hibridación y pruebas de reacción en cadena de polimerasa, y para el descubrimiento de otras secuencias de alfavirus. Una secuencia de polipéptidos o aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de alfavirus, se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un poiipéptido codificado en la secuencia, o una porción de la misma, en donde la porción consiste de por lo menos 2 a 5 aminoácidos, y más preferiblemente por lo menos 8 a 10 aminoácidos, y aún más preferiblemente por lo menos 1 a 15 aminoácidos, o el cual sea inmunológicamente identificable como un polipéptido codificado en la secuencia. Un polipéptido recombínante o derivado no se traduce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico diseñada; puede generarse de cualquier forma incluyendo, por ejemplo, síntesis química, o expresión de un sistema de expresión recombinante. Una vez que un ADNc genómico viral completo es clonado, la atenuación del virus es posible. Una mutación atenuante se refiere a una mutación de nucleótidos o aminoácidos codificados en vista de dicha mutación, que resulta en una probabilidad disminuida de que cause enfermedad en su hospedero (es decir, una pérdida de virulencia) de acuerdo con la terminología estándar en la técnica. La mutación atenuante puede ser una mutación por sustitución o una mutación por deleción en el marco de lectura. Pueden descubrirse mutaciones atenuantes novedosas en el genoma del virus de EEE, introduciendo mutaciones que no puedan repararse mediante el proceso de replicación del ARN viral. Una mutación preferible es la deleción del sitio de digestión por la proteasa furina de cinco aminoácidos entre las proteínas E3 y E2. La transfección del genoma viral muíante en células, puede resultar en la supresión del efecto letal de la mutación por deleción debido al proceso sujeto a error de la replicación del alfavirus. Una vez que se genera la progenie viral de replicación eficiente, pueden detectarse mediante pruebas en placa, y pueden analizarse para la presencia de la proteína PE2 que indica que el virus contiene la mutación por deleción. Virus atenuados pero sin embargo inmunógenos con una mutación por deleción del sitio de digestión y mutaciones supresoras, podrían ponerse a prueba para su capacidad para proteger a animales del desafío con el virus de EEE virulento. Pueden introducirse mutaciones atenuantes en moléculas de ADNc que codifiquen para virus de EEE vivo, mediante cualquier medio adecuado, tal como mutagénesis dirigida a sitio (véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), o DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985), o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M et ai. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., para métodos de clonación en general). En otra modalidad, los virus atenuados de la presente invención pueden usarse para preparar sistemas de expresión de replicones. Un sistema de expresión de replicones consiste de tres componentes (Pushko et al.

[1997] Virology 239: 389-401). El primero es un replicón que sea equivalente a un clon infeccioso de longitud completa del cual se hayan eliminado todas las proteínas estructurales virales. Puede clonarse un sitio de clonación múltiple en el sitio ocupado previamente por los genes de proteínas estructurales. Virtualmente cualquier gen heterólogo puede ser clonado en este sitio de clonación. La transcripción de ARN a partir del replicón da ARN capaz de iniciar la infección de las células, idénticamente a como se ve con el clon de virus infeccioso de longitud completa. Sin embargo, en lugar de las proteínas estructurales virales, el antígeno heterólogo es expresado. Este sistema no produce partícula viral alguna de la progenie debido a que no existen proteínas estructurales virales disponibles para empacar el ARN en partículas. Pueden producirse partículas que sean estructuralmente idénticas a las partículas virales, suministrando proteínas estructurales para el empacamiento del ARN del replicón en la transcripción. Esto se hace típicamente con dos auxiliares. Un auxiliar consiste de un clon infeccioso de longitud completa del cual se eliminan los genes de proteínas no estructurales y los genes de glucoproteínas. El auxiliar retiene sólo las secuencias de nucleótidos terminales, el promotor para la transcripción del ARN mensajero subgenómico y la secuencia para la proteína de la nucleocápside viral. El segundo auxiliar es idéntico al primero, salvo que el gen de la nucleocápside es eliminado, y sólo se retienen los genes de glucoproteínas. Las moléculas de ARN auxiliares son transcritas in vitro y co-transfectadas con ARN del replicón. Debido a que el ARN del replicón retiene las secuencias para el empacamiento por las proteínas de la nucleocápside, y debido a que los auxiliares carecen de estas secuencias, sólo el ARN del replicón es empacado por las proteínas estructurales virales, y liberado de la célula. Las partículas pueden inocularse entonces en animales en forma similar al virus precursor. Las partículas del replicón iniciarán sólo una ronda de replicación individual debido a que los auxiliares están ausentes, no produjeron partículas virales de la progenie, y expresan sólo las proteínas no estructurales virales y el producto del gen heterólogo clonado en lugar de las proteínas estructurales. El producto del gen heterólogo es detectado entonces por el sistema inmune del hospedero, y se genera entonces una respuesta inmune adecuada. El replicón del virus de EEE puede usarse para expresar genes heterólogos de interés, y puede usarse como medio para la expresión de antígenos o proteínas y péptidos inmunógenos de interés, in vitro o in vivo. La proteína o péptido inmunógeno, o "inmunógeno", puede ser cualquier inmunógeno adecuado para inducir una respuesta inmune que brinde protección contra un patógeno del cual el inmunógeno se deriva incluyendo, pero no limitado a, microbio, bacteria, protozoario, parásito y virus patógenos. Por ejemplo, el inmunógeno puede ser el producto de expresión de algún gen heterólogo de interés, incluyendo hemaglutinina de influenza, nucleocápside y glucoproteínas de la fiebre de Lassa, porciones de genes de toxinas bacterianas, glucoproteínas del virus del VIH, glucoproteínas del virus Ebola, por nombrar unos cuantos. En otra modalidad, la presente invención provee vacunas de virus inactivados producidas a partir de preparaciones de virus atenuados vivos, como virus con mutaciones atenuantes como ya se ha descrito, o como virus quiméricos. La inactivación de virus vivos es bien conocida en la técnica y puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el uso de formalina. La vacuna de virus atenuados inactivados tiene un mayor margen de seguridad como una vacuna final en el caso de inactivación incompleta, y durante el procedimiento de fabricación que permite la producción bajo menores niveles de biocontención. Los sujetos a los que pueden administrarse los virus atenuados inactivados o los virus atenuados vivos y las formulaciones de vacuna que se describen en la presente, incluyen humanos, mamíferos y aves (por ejemplo, caballo, asno, cerdo, ratones, hámster, mono, aves, etc.). Las formulaciones de vacuna de la presente invención comprenden una cantidad inmunógena de un virus atenuado vivo, o una combinación de virus atenuados vivos como una vacuna multivalente, como se describe en la presente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una "cantidad inmunógena", es una cantidad del virus atenuado suficiente para evocar una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune a la proteína o péptido codificado por el ARN heterólogp llevado por el virus, en el sujeto al cual el virus se administra. Es adecuada una cantidad de aproximadamente 1 x 101 a 1 x 10B unidades formadoras de placas del virus vivo por dosis, dependiendo de la edad y especie del sujeto que se esté tratando. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua libre de pirógenos estéril y solución salina fisiológica libre de pirógenos estéril. La administración de los virus atenuados vivos descritos en la presente puede llevarse a cabo mediante cualquier medio adecuado, incluyendo inyección parenteral (tal como inyección intraperitoneal, subcutánea o intramuscular), mediante inyección in ovo en aves, y mediante aplicación tópica del virus (típicamente llevada a cabo en la formulación farmacéutica) a una superficie de las vías respiratorias. La aplicación tópica del virus a una superficie de las vías respiratorias puede llevarse a cabo mediante administración intranasal (por ejemplo, mediante el uso de gotero, hisopo o inhalador que deposite intranasalmente una formulación farmacéutica). La aplicación tópica del virus a la superficie de las vías respiratorias puede llevarse a cabo también mediante administración por inhalación, tal como creando partículas respirables de una formulación farmacéutica (incluyendo partículas sólidas y partículas líquidas) que contenga al virus como una suspensión en aerosol, y haciendo entonces que el sujeto inhale las partículas respirables. Métodos y aparatos para administrar partículas respirables de formulaciones farmacéuticas son bien conocidos, y puede usarse cualquier técnica convencional. En otra modalidad, la presente invención se refiere a anticuerpos específicos para los virus descritos anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser enfrentado con algunas de las proteínas virales o contra una porción de las mismas. Los expertos en la técnica, usando metodología estándar, pueden enfrentar anticuerpos monoclonales y policlonales con un polipéptido de la presente invención. Materiales y métodos para producir anticuerpos, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Goding, en Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, capítulo 4, 1986). Los anticuerpos pueden usarse para monitorear la presencia o actividad de alfavirus, y potencialmente como un agente terapéutico. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de infección por el virus de EEE o anticuerpo contra este virus, si está presente, en una muestra. Mediante el uso de metodología estándar bien conocida en la técnica, puede construirse una prueba de diagnóstico recubriendo sobre una superficie (es decir, un soporte sólido), por ejemplo, una placa de microtítulo o una membrana (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa), el virus de EEE completo, o una porción única del mismo, descritos anteriormente, y poniéndolo en contacto con el suero de una persona que se sospecha tiene una infección viral. La presencia de un complejo resultante formado entre el virus y anticuerpos específicos por lo tanto en el suero, puede detectarse mediante algunos de los métodos conocidos comunes en la técnica, tales como colorimetría o microscopía. Este método de detección puede usarse, por ejemplo, para el diagnóstico de infecciones virales de EEE.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de virus de EEE en una muestra. Mediante el uso de metodología estándar bien conocida en la técnica, puede construirse una prueba de diagnóstico recubriendo sobre una superficie (es decir, soporte sólido), por ejemplo, una placa de microtítulo o una membrana (por ejemplo, membrana de nitrocelulosa), anticuerpos específicos para virus de EEE, y poniéndolos en contacto con una muestra de tejido o suero de una persona que se sospecha tiene infección viral de EEE. La presencia de un complejo resultante formado entre el virus en el suero y anticuerpos específicos, puede detectarse por lo tanto mediante alguno de los métodos conocidos comunes en la técnica, tales como espectroscopia de anticuerpos fluorescente o colorimetría. Este método de detección puede usarse, por ejemplo, para el diagnóstico de infección viral de EEE. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico que contiene virus de EEE y reactivos auxiliares que son bien conocidos en la técnica y que son adecuados para su uso en la detección de la presencia de anticuerpos para virus de EEE en una muestra de tejido o suero. Las muestras de tejido contempladas pueden obtenerse de aves, cerdos, equinos, monos, humanos u otros mamíferos. En otra modalidad, la presente invención se refiere a secuencias de ADN o de nucleótidos para su uso en la detección de la presencia o ausencia de virus de EEE, usando la técnica de transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR). La secuencia de ADN de la presente invención puede usarse para diseñar iniciadores que se unen específicamente al ARN viral con el propósito de detectar la presencia, ausencia o cuantificación de la cantidad de virus. Los iniciadores pueden ser de cualquier longitud que varíe de 7 a 40 nucleótidos, de preferencia de 10 a 15 nucleótidos, más preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos. Reactivos y controles necesarios para las reacciones de PCR, son bien conocidos en la técnica. Los productos amplificados pueden analizarse entonces para la presencia o ausencia de secuencias virales, por ejemplo, mediante fraccionamiento en gel, con o sin hibridación, mediante radioquímica, y técnicas inmunoquímicas. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico que contiene iniciadores de PCR específicos para virus de EEE y reactivos auxiliares que son bien conocidos en la técnica, y que son adecuados para su uso en la detección de la presencia o ausencia de EEE en una muestra usando PCR. Las muestras contempladas pueden obtenerse de aves, equinos, humanos u otros mamíferos. Aunque teóricamente cualquier región en el genoma puede usarse para obtener iniciadores del virus de EEE, algunos ejemplos no limitativos de iniciadores específicos se muestran en la figura 1A. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para reducir los síntomas de infección viral de EEE en un paciente, administrando a dicho paciente una cantidad efectiva de anticuerpos anti-EEE, o suero protector de un animal inmunizado. Cuando se provee a un paciente con anticuerpos, la dosificación del agente administrado variará, dependiendo de factores tales como la edad, peso, estatura, sexo, condición médica general, historia médica previa, etc., del paciente. En general, es deseable proveer al receptor con una dosificación de los compuestos anteriores, que esté en la escala de aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal del paciente, aunque puede administrarse una dosificación menor o mayor. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para superar la interferencia de la vacuna en individuos inmunes a alfavirus. Se ha documentado la interferencia de alfavirus en animales y personas desde la década de los sesenta. Este fenómeno ocurre cuando una vacuna atenuada viva se administra a animales o personas con inmunidad existente a alfavirus heterólogos. Puede adquirirse inmunidad preexistente mediante vacunación o infección. Esto presenta una limitación significativa a la utilidad de las vacunas de alfavirus atenuadas vivas actuales, especialmente puesto que la inmunidad de reacción cruzada no protege adecuadamente contra el desafío con alfavirus heterólogos virulentos. Las vacunas de alfavirus inactivadas con formalina no son una alternativa aceptable, puesto que tienen limitaciones significativas con respecto a la calidad y duración de la inmunidad protectora, y requieren inoculaciones múltiples y refuerzos periódicos. La vacuna de virus de EEE atenuada de la presente invención contiene mutaciones en las secuencias de glucoproteína virales que pueden alterar la secuencia, conformación y/o accesibilidad de epítopes de reacción cruzada. Las alteraciones en epítopes que previenen la unión mediante anticuerpos de reacción cruzada, pueden evitar también la interferencia en individuos inmunes a alfavirus. La eliminación del problema de interferencia permitiría que la vacuna de virus de EEE atenuado se use en animales o personas inmunes a alfavirus para inducir inmunidad protectora a virus de EEE. Se esperaría inmunidad protectora de larga duración en desafío parenteral y con aerosol después de la vacunación con las vacunas atenuadas vivas de la presente invención, y proveen una ventaja adicional sobre el uso de vacunas inactivadas que inducen respuestas efímeras que no brindan protección contra el desafío en mucosas. Habiendo descrito ahora la invención, se proveen los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención, y no deben considerarse como limitativos de la misma. A la luz de la presente descripción, numerosas modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Las mutaciones atenuantes del virus de EEE novedosas descritas en la presente que pueden usarse para llevar a cabo la presente invención, incluyen deleción de cinco aminoácidos en el sitio de digestión por furina (RRTRR) (SEQ ID NO: 2) en combinación con una mutación de sitio adicional (véase el cuadro 1). Dichas mutaciones de sitio incluyen una sustitución de arginina por histidina en el codón 82 de E2, y/o deleción del codón de histidina 167 en E2. Otras mutaciones incluyen deleción de los cinco aminoácidos en el sitio de digestión por furina en combinación con una sustitución de arginina por histidina en el codón 82 de E2 y/o asparagina por serina en el codón 230 de E2, y/o prolina por glutamina en el codón 303 de E2, y/o sustitución de asparagina por ¡soleucina en el codón 116 de E1. Otras mutaciones incluyen deleción de los cinco aminoácidos en el sitio de digestión por furina en combinación con una sustitución de ácido aspártico por alanina en el codón 174 de E2, y/o asparagina por lisina en el codón 186 de E2 y/o treonina por isoleucina en el codón 1 6 de E1.

CUADRO A Candidato de vacuna de Mutaciones Eficacia ¡n vivo EEE pEE4240 (ejemplo 4) RRTRR eliminados (SEQ ID Inmunidad estéril en NO: 2); D174A (E2); K186N pollos contra FL91 de tipo (E2) e l116T silvestre y PE-0155 de Sudamérica de tipo Resultado de: silvestre; Deleción de los nucieótldos (nt) 8552-8566 de SEQ ID NO: 1 Ratones desafiados con (AGGAGAACCAGGAGA); aerosol con > 000 x la GAC^GCC (nt 9087); LD50 de FL91 de tipo AAA?AAT (nt 9124); silvestre ATC-»ACC (nt 10344) Vacunación subcutánea: 100% de protección Vacunación intranasal: 100% de protección P4202RPE.40P6 (es decir, RRTRR eliminados (SEQ ID Inmunidad estéril en paso 6 de RPE.40) NO: 2); H82R (E2); N230S pollos contra FL91 de tipo (E2); P303Q (E2) e I116N (E1) silvestre y PE-0155 de (Ejemplo 4) Sudamérica de tipo Resultado de: silvestre; Clon 74E2; pEE4260 Deleción de los nucieótldos (nt) 8552-8566 de SEQ ID NO: 1 Ratones desafiados con (AGGAGAACCAGGAGA); aerosol con >1000 x la CAT-CGT (nt 8811); LD50 de FL91 de tipo AAC- AGC (nt 9255); silvestre CCA?CAA (nt 9474); Vacunación subcutánea: ATC?AAT (nts 10344-5) 100% de protección Vacunación intranasal: 100% de protección CUADRO A (CONTINUACION) p4202BHKP6 (es decir, RRTRR eliminados (SEQ ID Inmunidad estéril en paso 6 de BH ) NO: 2); H82R (E2) y H167 (E2) pollos contra FL91 de tipo silvestre y PE-0155 de (Ejemplo 4) Resultado de: Sudamérica de tipo Deleción de los nucleótidos silvestre; Clon 1 E2deltaFurina; 8552-8566 de SEQ ID NO: 1 pEE4230 (AGGAGAACCAGGAGA); Ratones desafiados con CAT?CGT (nt 8811); aerosol con >1000 x la Deleción: nts 9065-9067 LD50 de FL91 de tipo silvestre Vacunación subcutánea: 90% de protección Vacunación intranasal: 20% de protección p4202RPE.40P3 (es decir, RRTRR eliminados (SEQ ID Inmunidad estéril en paso 3 de RPE.40) NO: 2); P303Q (E2) e I116N pollos contra FL91 de tipo (E1) silvestre y PE-0155 de (Ejemplo 4) Sudamérica de tipo Resultado de: silvestre; Clon 1B7; pEE4250 Deleción de los nucleótidos 8552-8566 de SEQ ID NO: 1 Ratones desafiados con (AGGAGAACCAGGAGA); aerosol con >1000 x la CCA?CAA (nt 9474); LD50 de FL91 de tipo ATC?AAT (ntsl 0344-45) silvestre Vacunación subcutánea: 100% de protección E3Delta3 CMPC (E3) eliminado Inmunidad estéril en pollos contra FL91 de tipo (Ejemplo 5) Resultado de: silvestre y PE-0155 de Deleción de los nucleótidos Sudamérica de tipo pEE2021 8438-8449 silvestre; Sitio de digestión por furina Ratones desafiados con intacto aerosol con >1000 x la LD50 de FL91 de tipo silvestre Vacunación subcutánea: 100% de protección CUADRO A (CONTINUACION) Vacuna humana de PE-6 Preparación de virus enteros Ratones desafiados con (control positivo, dosis de inactivada con formalina de la aerosol con >1000 x la 0.5 mi administrada en los cepa PE-6 de EEE de LD50 de FL91 de tipo días 0 y 28; es decir, Norteamérica silvestre régimen de vacuna Vacunación subcutánea: humana) 80% de protección Muíante derivado de TRR (E3) eliminados; H82R Inmunidad estéril en RPE.40 de placa pequeña (E2) y H167 (E2) pollos contra FL91 de tipo (SP) silvestre y PE-0155 de Resultado de: Sudamérica de tipo (Ejemplo 2) Deleción de los nucleótidos silvestre; 8558-8566 (ACCAGGAGA); Ratones desafiados CAT?CGT (ní 8811); subcutáneamente o Deleción: nts 9065-9067 ¡ntranasalmenle con >1000 x la LD50 de FL91 de lipo silvestre; 0% de prolección con vacunación subcutánea Muíante derivado de TRR eliminado; R59S (E3); Inmunidad estéril en RPE.40 de placa grande N80D (E2); H82R (E2) y H167 pollos contra FL91 de tipo (LP) (E2) silvestre y PE-0155 de Sudamérica de tipo (Ejemplo 3) Resultado de: silvestre; Deleción de los nucleótidos 8558-8566 Ratones desafiados (ACCAGGAGA); ¡ntranasalmenle con AGG?AGT (nt 8554) >1000 x la LD50 de FL91 AAC?GAC (nt 8804); de tipo silvestre CAT?CGT (nt 8811); Vacunación intranasal: Deleción: nts 9065-9067 30% de protección Vacunación subcutánea: 20% de protección CUADRO A (CONTINUACION) Diluyente de EME Sin virus, control negativo Pollos sin inmunidad contra FL91 de tipo silvestre y PE-0155 de Sudamérica de tipo silvestre (niveles de viremia a 105-106 pfu/ml de sangre) Ratones desafiados con aerosol con >1000 x la LD50 de FL91 de tipo silvestre Vacunación subcutánea: 0% de protección Vacunación intranasal: 0% de protección Nota: nt: nucleótido nts: nucleótidos Explicaciones: "RRTRR eliminados" (SEQ ID NO: 2) = sitio de digestión por furina eliminado; "p4202 RPE P6" = pEE4202 es el plásmido precursor, RPE es el tipo de célula, P6 es el paso No.

Otras mutaciones atenuantes del virus de EEE novedosas descritas en la presente que pueden usarse para llevar a cabo la presente invención, incluyen deleción de los tres aminoácidos finales en el sitio de digestión por furina (TRR) en combinación con una sustitución de arginina por histidina en el codón 82 de E2, y/o deleción del codón de histidina 167 en E2. Otras mutaciones incluyen deleción de los tres aminoácidos finales en el sitio de digestión por furina en combinación con una sustitución de serina por arginina en el codón 59 de E3, y/o sustitución de ácido aspártico por asparagina en el codón 80 de E2, y/o sustitución de arginina por histidina en el codón 82 de E2, y/o una deleción del codón de histidina 67 en E2. Otras mutaciones atenuantes del virus de EEE novedosas descritas en la presente que pueden usarse para llevar a cabo la presente invención, incluyen deleción de los cuatro aminoácidos CMPC en la posición 20-23 en E3. Estas mutaciones atenuantes novedosas pueden insertarse conjuntamente en un clon de ADNc que codifique para el virus de EEE, resultando en un virus de EEE atenuado que se refleja en 100% de supervivencia de ratones inoculados mediante la vía subcutánea e intranasal. Dicho virus vivo atenuado es inmunógeno, seguro y capaz de inducir un efecto protector contra un desafío con virus letal.

Virus de EEE atenuado Se usaron los siguientes materiales y métodos en los ejemplos siguientes: 1. Virus y células Se desarrolló el virus de encefalitis equina oriental, cepa FL91-4679 (Mitchell et al., citado anteriormente), en células de riñon de cría de hámster (BHK) o células Vero en medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) conteniendo suero de bovino fetal a 10%, 200 U/ml de penicilina G, 0.2 mg/ml de estreptomicina y 0.05 mg/ml de gentamicina. Las células se incubaron a 37°C y C02 a 5%. 2. Clonación de ADNc Se preparó ARN genómico a partir de virus purificado mediante extracción con trizol, siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. Inicialmente, se preparó ADNc mediante el método de Gubler y Hoffman (

[1983]) Proc Nati Acad Sci U.S.A. 85: 5997-6001). Después, el ADN que representa el genoma completo, se preparó mediante reacción en cadena de polimerasa usando una serie de pares de iniciadores (figura 1A) basados en la secuencia del genoma de PE-6. Cada producto de PCR fue clonado en pCRIl (Invitrogen). La secuencia terminal 5' se determinó mediante 5' RACE, básicamente como se describe en Frohman et al. (

[1988]) Proc Nati Acad Sci U.S.A. 85: 8998-9002). El oligonucleótido ET7C consistía de un sitio EcoRI, el promotor para la ARN polimerasa del bacteriófago T7, seguido de 18 nucleótidos del extremo 5' de FL091-4697. ET7C fue apareado con E1645R, y se usó para amplificar el extremo de .6 kb del genoma del virus de EEE. El oligonucleótido E3'Not I consistía de una secuencia del virus de EEE corta, poli (A)21 y un sitio Not I. El clon pEE2002 que representa el genoma completo, fue ensamblado en pBluescript KS+ mediante el uso de sitios de endonucleasa convenientes. Para facilitar la mutagénesis dirigida a sitio subsiguiente de los genes de proteínas estructurales, se prepararon dos cassettes que representan el extremo 5' de 7.6 kb, plásmido ERep2182, y el extremo 3' de 4.2 kb, plásmido EE.26S.F191 del genoma. Se ensamblaron clones de longitud completa mediante digestión del ERep2 82 con Cía I y Not I e inserción de un fragmento Cía l/Not I de 4.1 kb preparado a partir del plásmido pEE.26S.F191 o sus derivados mutagenizados. 3. Mutaqénesis del sitio de digestión por furina Dos oligonucleótidos, FL d5R de EEE y FL d5F de EEE, que agrupan el sitio de digestión por furina posible [RRTRR] (SEQ ID NO: 2) localizado entre las glucoproteínas E3 y E2, se usaron para eliminar ios 5 codones. Se usó el plásmido pEE.26S.F191 como el molde para la mutagénesis. Los oligonucleótidos FL d5R de EEE y FL d5F de EEE fueron apareados con los iniciadores E6956F y E3'Not I, respectivamente, por 25 ciclos mediante el uso de PCR que usa a pEE.26S.F191 como molde. Estos dos productos de PCR se purificaron y añadieron sntonces en una nueva reacción de PCR que contenía los iniciadores E6956F y E3'Not I por 30 ciclos. Este producto de PCR fue digerido entonces con Cía I y Not I y ligado en el plásmido ERep2182, el cual había sido digerido con Cía I y Not I. Se identificaron clones de plásmido que contenían la mutación por deleción del sitio de digestión por furina mediante digestión con la endonucleasa de restricción Xcm I debido a la pérdida de un sitio consenso en la secuencia muíante. Las secuencias de las mutaciones se confirmaron también mediante secuenciación. Esto dio el clon pEE2202 del plásmido como el muíante de deleción del sitio de digestión por furina de longitud completa original generado para EEE. 4. Identificación de mutaciones secundarias en virus derivados de PEE2002 v pEE4202 Se usaron virus liberados de células electroporadas con ARN transcrito a partir de pEE2002 y pEE4202, como preparaciones existentes iniciales. Los sobrenadantes de células transfectadas con pEE2002 se diluyeron 1 :30, y se reintrodujeron en un nuevo paso de células de ovario de hámster chino (RPE.40) deficientes en furina. Se recogió el sobrenadante cuando se observó efecto citopático (CPE) extensivo, típicamente de 3 a 6 días post-infección. Este paso oculto se continuó en células RPE.40 más allá del paso 30. Se concentraron virus de EEE derivados de los pasos 9 y 23 de RPE.40, así como aislados de placas a través de un cojín de sacarosa a 20%, y se aisló ARN de la preparación viral usando Trizol LS (Invitrogen). Los genes estructurales de cada muíante se amplificaron mediante amplificación por transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa. Los productos de PCR se purificaron (Qiagen Prep) y se secuenciaron en un analizador genético ABI-3100 usando terminadores de didesoxinucleótidos marcados con fluoresceína. El sobrenadante de transfección existente derivado de pEE4202, se hizo pasar asimismo en células RPE.40 y BHK. Los aislados virales que representan el paso 6 de BHK y los pasos 3 y 6 de RPE.40, se secuenciaron como se describió anteriormente. 5. Transcripción y transfección ADN de plásmido de clones de longitud completa fue digerido con Not l, extraído con fenol y precipitado con etanol. Típicamente, se transcribieron in vitro de 0.5 a 1 g de ADN linealizado mediante ARN polimerasa del bacteriófago T7 (Ribomax, Promega, Madison, Wl) en presencia de m7GpppGp a 3 mM (Pharmacia, Piscataway, NJ). La electroporación de células BHK con 0.4 µg de ARN se llevó a cabo según se describe (véase Pushko ef al.

[1995] Virology 239: 389-401). Las células se sembraron entonces asépticamente en matraces de cultivo de tejidos T-75 estériles con 20 mi de medio, y se observaron continuamente para CPE empezando a 24 horas post-electroporación. Se cosecharon los virus cuando las células exhibieron efecto citopático (CPE) significativo, y se separó aproximadamente 50% del plástico. Los títulos del virus se determinaron mediante prueba en placa en células Vero.

EJEMPLO 1 Preparación de un clon infeccioso de la cepa FL91-4679 de EEE El primer propósito de este estudio, fue crear un clon de ADNc de longitud completa de virus de EEE totalmente virulento tal, que las mutaciones que llevan a un fenotipo atenuado pudieran identificarse. Se seleccionó originalmente como el molde la cepa FL91-4679 de EEE. Se aisló de mosquitos Aedes albopictus colectados en Florida en 1991 (Mitchell et al., 1992). Se ha hecho pasar el virus una vez en ratones mamantones, tres veces en células Vero, y dos veces en células BHK-21 , antes de la secuenciación del genoma completo por los presentes inventores. Se eligió como el virus precursor, ya que consistentemente causa la muerte de 100% de ratones C57BL6 cuando se inoculan 4 valores logarítmicos de virus subcutáneamente o intranasalmente. Puesto que la cepa PE-6 de EEE sólo causaba la muerte de 80% de los ratones cuando se administraron intraperitonealmente 8 valores logarítmicos, la cepa PE-6 fue atenuada excesivamente para los propósitos de los presentes inventores. El uso de FL91 permitió desarrollar un modelo en animales para evaluar los efectos relativos sobre la virulencia de las mutaciones atenuantes. La secuencia de la cepa PE-6 de la vacuna de EEE se había determinado previamente, y se usó como base para los iniciadores para preparar productos de amplificación por PCR que representaran el genoma de FL91 completo que fuese clonado en pCRII. Se ensamblaron clones de longitud completa en pBluescript KS+ usando sitios de restricción convenientes, como se muestra en la figura 1A. El primer clon infeccioso de longitud completa, pEE2002, fue transcrito ¡n vitro usando ARN polimerasa T7 de plásmido linealizado con Not I, y el ARN transfectado en células BHK-21. El fenotipo de placa grande del virus pEE2002 recombinante resultante, fue acoplado con el fenotipo del virus FL-91-4679 precursor. Además, el análisis de las proteínas mediante SDS-PAGE que constituyen la cepa FL91 de tipo silvestre recombinante (es decir, pEE2002), fue acoplado a las proteínas del virus FL91 precursor no clonado.

Esto se muestra en la figura 1B, campos 1 y 3. Se inoculó a ratones con el virus precursor FL91-4679 o el virus recombinante pE2002, para determinar las patogenicidades relativas. Estos estudios indicaron que el virus recombinante derivado de pEE2002 tenía una patogenicidad similar a la de su precursor FL91-4679. Específicamente, 3 valores logarítmicos de pEE2002 o FL91 cuando se administraron intranasalmente (i.n.), resultaron en 50% y 40% de supervivencia, respectivamente, de ratones C57Black6. Cuando se administraron intranasalmente 4 valores logarítmicos de los virus, 100% de los ratones murieron en ambos grupos. Cuando se administraron subcutáneamente (s.c.) 3 valores logarítmicos de pEE2002 o FL91 , 70% y 0% de los ratones desafiados sobrevivieron. Cuando se administraron subcutáneamente 4 valores logarítmicos de los virus, 0% de los ratones desafiados sobrevivieron en los grupos.

EJEMPLO 2 Preparación inicial de un mutante digerido precursor de FL91 Davis et al. (

[1995]) Virology 212: 102-110), han demostrado que la deleción del sitio de digestión por f urina entre las glucoproteínas E3 y E2 del virus de encefalitis equina venezolana (VEE), es una mutación letal. Sin embargo, la incubación prolongada de células que habían sido transfectadas con ARN derivado de clones de longitud completa que contenían la deleción, resultó en la aparición final del virus, el cual era de replicación competente y atenuado en ratones (Davis et al., 1995, citado anteriormente). Con base en una comparación de las secuencias predichas de proteínas estructurales de los virus de EEE y VEE, el sitio de digestión probable de FL91-4679 es RRTRR (SEQ ID NO: 2). La presencia de la arginina extra cuando se comparó con el sitio de digestión de alfavirus (RX(R/K)R) consenso, indicó que el sitio de digestión del virus de EEE podría ser más complejo que el observado con el virus de VEE. Por lo tanto, los presentes inventores prepararon un mutante de deleción en el sitio de digestión de E3-E2 del clon pEE2002 que careciera de los cinco aminoácidos RRTRR (SEQ ID NO: 2). Se observó efecto citopático (CPE) limitado en células después de la electroporación de ARN transcrito a partir de pEE2002; sin embargo, como se ha observado con mutantes de deleción del sitio de digestión por furina de los virus de VEE y WEE, el CPE no fue completo. Cuando se pusieron a prueba para virus mediante formación en placa en células Vero, los sobrenadantes de pEE2002 no dieron placas aún después de incubación extensiva a 37°C. El análisis de inmunofluorescencia reveló que las proteínas estructurales del virus de EEE estaban siendo expresadas dentro de las células transfectadas y sobre la superficie de las células. Sin embargo, el análisis de los sobrenadantes mediante SDS-PAGE, reveló consistentemente la ausencia de proteínas virales. Además, el paso subsiguiente del medio de transfección en monocapas sanas, no resultó en CPE alguno, indicando que las monocapas de células no fueron infectadas. Por razones hasta ahora desconocidas por los presentes inventores, el virus derivado de pEE2002 no pudo "brotar" de las células transfectadas. De esta manera, para identificar mutaciones supresoras de segundo sitio necesarias para resucitar un mutante de deleción del sitio de digestión por furina, los presentes inventores diseñaron un procedimiento alternativo. Formularon la hipótesis de que mediante el paso repetido del virus de EEE a través de células deficientes en furina, podrían identificar mutaciones supresoras. En efecto, formularon la hipótesis de que podrían crear un ambiente transitorio in vitro en el cual el virus de EEE se comportaría como si el sitio de la furina no estuviera presente. Se pensó que se desarrollarían entonces mutaciones que se identificarían mediante secuenciación de ADN y que podrían incorporarse en la estructura de base de pEE2002. Esto podría resultar finalmente en la producción de los primeros mutantes de deleción del sitio de digestión por furina del virus de EEE resucitados. La línea de células RPE.40 de ovario de hámster chino (CHO-K1) deficientes en furina, se usó en este procedimiento experimental (Moehring y Moehring

[1983] J. Biol. Chem 268: 2590-2594). Inicialmente, se usaron 1 x 107 unidades formadoras de placas (pfu) de virus de tipo silvestre derivado del clon infeccioso pEE2002 para infectar a las células RPE.40. Cuando fue evidente el CPE extensivo, típicamente de 3-6 días post-infección (p.i.), se cosechó el virus. Se diluyó entonces el virus 1 :30 con medio fresco, y se añadió a un matraz de tejido sano. El virus propagado disminuyó rápidamente hasta bajos niveles, y el título en el paso cuatro fue de 5.0 x 102 unidades formadoras de placas por mi (pfu/ml) de sobrenadante de cultivo (véase cuadro 1). En el paso seis, las placas llegaron a ser evidentes en la monocapa de células. Alrededor del paso 9, se habían recuperado títulos virales de EEE a altos niveles, y habían alcanzado una meseta alrededor de 2 x 107 pfu/ml. Durante este período, los presentes inventores observaron un cambio completo del fenotipo silvestre de placa grande, a un fenotipo de placa significativamente menor. Este cambio es usualmente indicativo de un alfavirus atenuado. La secuenciación del virus muíante del paso 9 de RPE.40, reveló que se eliminaron 9 nucleótidos (8558-8566) que codificaban para el extremo carboxilo de E3, y el sitio de digestión por furina del virus de EEE (véase el cuadro A, muíante derivado de RPE.40 de placa pequeña). En efecto, el sitio de digestión por furina había mutado de RRTRR (SEQ ID NO: 2) a RR— , en donde — representa una deleción. Geles de poliacrilamida teñidos con azul de Coomassie, revelaron que el virus muíante estaba formado solamente de profeína PE2, y que la banda de proíeína E2 normal esíaba ausente. Esto se esperaría si la digestión por furina normal fuese interrumpida. Se identificaron oirás dos mutaciones de segundo sitio en el gen estrucíural que codifica para la glucoproteína E2. La primera incluyó un cambio de un sólo nucleótido que resultó en una sustitución de arginina por histidina en el aminoácido 82 de E2. La otra mutación derivada de RPE.40 resultó en una deleción de íres nucleóíidos que resultó en la pérdida del codón de histidina en el aminoácido 167 de E2 (para un resumen, véase el virus mutaníe de EEE derivado de RPE.40 de placa pequeña enlistado en el cuadro A). Estas muíaciones fueron también evidentes en dos aislados de placa separados del paso 9 de RPE.40 y el paso 23 de RPE.40. Este último resultado sugiere que el genoma mutante derivado mediante el paso gradual de RPE.40, es estable. Puesto que este virus mutante de EEE derivado del paso de RPE.40 carecía de un sitio de digestión por furina funcional, los presentes inventores eligieron poner a prueba el virus para eficacia in vivo. El virus mutante de EEE derivado del paso 9 de RPE.40 se puso a prueba primero para efecto de atenuación y protector en aves. Específicamente, se inoculó subcutáneamente (s.c.) a pollos Leghorn de un día con el virus mutante, y un grupo control recibió el virus FL91 de tipo silvestre. El grupo control positivo llegó a estar moribundo dentro de 24 horas post-infección (p.i.). Además, los animales desarrollaron una viremia significativa antes de ser sometidos a eutanasia. El virus de EEE fue titulado a 1 x 109 - 1 x 1010 unidades formadoras de placas (pfu) por mi de sangre (en lo sucesivo abreviado como pfu/ml). Los pollos inoculados con los virus de EEE mutantes desarrollaron también una viremia, aunque su nivel máximo en el día 3 fue de sólo 1 x 104 pfu/ml. Todas las aves que recibieron el virus mutante de EEE sobrevivieron, y no hubo signos de enfermedad, indicando que el virus mutante fue totalmente atenuado in vivo. Catorce días post-vacunación, las aves fueron desafiadas subcutáneamente con el virus FL91 de tipo silvestre precursor. Todas las aves previamente inoculadas con el virus mutante de EEE no exhibieron viremia (0 pfu/ml, inmunidad estéril), mientras que las aves no afectadas no vacunadas desarrollaron una viremia de 1 x 05 - 1 x 106 pfu/ml. Este resultado es indicativo de que el virus mutante de EEE derivado de RPE.40 brindó protección contra un virus de EEE de Norteamérica. Para un resumen de los resultados de eficacia, véase el virus mutante de EEE derivado de RPE.40 de placa pequeña (SP), enlistado en el cuadro A. La protección que los presentes inventores observaron ante el virus de EEE de Norteamérica, no se consideró como una indicación de que el virus mutante de EEE podría brindar protección contra el virus de EEE de Sudamérica. Trabajos previos por otros (Strizki et al.

[1995] Am. J. Trop. Med. Hyg. 53: 564-570), han mostrado que la vacuna de EEE como el nuevo fármaco de investigación (IND) PE-6, brinda protección inadecuada contra cepas del virus de EEE de Sudamérica antigénicamente distintas. Estas cepas del virus de EEE antigénicamente distintas, exhiben diferencias serológicas y moleculares indicativas de sus contrapartes de Norteamérica (Brault ef al.

[1999] Am. J. Trop. Med. Hyg. 61 : 579-586; Weaver et al.

[1994] J. Virology 68: 158-169). Estando al tanto de esta deficiencia, los presentes inventores examinaron si el virus mutante de EEE derivado de RPE.40 podría brindar protección contra una cepa del virus de EEE de Sudamérica. Se llevaron a cabo experimentos idénticos en aves a los descritos anteriormente, salvo que las aves fueron desafiadas con la cepa PE-0155 del virus de EEE de Sudamérica (Turell, USAMRIID, datos no publicados; aislada de un mosquito Culex pedroi infectado en 1996 en Puerto Almendras, Departamento de Loreto, Perú). Se obtuvieron resultados de eficacia similares, y se observó claramente protección contra este virus de EEE de Sudamérica. Aves no vacunadas en el día 3 post-desafío habían desarrollado una viremia de 1 x 105 -1 x 106 pfu/ml, mientras que no fue evidente viremia alguna (0 pfu/ml, inmunidad estéril) en una sola de las aves preinoculadas con el virus de EEE muíante. Esta protección ante una cepa del virus de EEE de Sudamérica, es un bono agregado al desarrollo de virus atenuados vivos como la vacuna de EEE de la siguiente generación. La vacuna inactiva de PE-6 no brinda protección contra los virus de EEE de Sudamérica (Strizki et al., citado anteriormente). Se obtuvo un clon molecular de longitud completa que representaba este muíante (el mutante derivado de RPE.40 de placa pequeña contenía la mutación por deleción del sitio de digestión por furina parcial (pérdida de TRR), H82R y el codón de histidina 167 eliminado. El virus recombinante derivado de esíe clon, se comportó en forma similar al aislado biológico de placa pequeña (SP) derivado de RPE.40 precursor. Estos datos de eficacia se resumen en el cuadro A. Los presentes inventores examinaron después la eficacia en un modelo de animales mamíferos. Se inoculó subcutáneamente a ratones Balb/c y, como en las aves, todos sobrevivieron, indicando que el virus mutante fue totalmente atenuado. Cuando los ratones recibieron un desafío letal subcutáneo en el día 42 post-vacunación, no se observó protección alguna. Los ratones inmunizados murieron en tiempos similares al grupo control que recibió sólo medio EMEM. El análisis de muestras de suero de los ratones inoculados, indicó que estaban ausentes anticuerpos neutralizantes específicos del virus de EEE. Por lo tanto, para el último propósito de los presentes inventores, el virus mutante de EEE derivado de RPE.40 de placa pequeña, fue atenuado excesivamente. Para estudiar un mutante más vigoroso, los presentes inventores volvieron a revisar los primeros estudios realizados en aves.

EJEMPLO 3 Preparación de un mutante de FL91 de digestión por furina parcial más vigoroso Puesto que el virus mutante de EEE derivado de RPE.40 original fue atenuado excesivamente, los presentes inventores generaron un virus mutante más vigoroso. Los presentes inventores habían observado previamente que la sangre de aves virémicas post-inmunizadas en el día 3 contenía placas pequeñas (SP) similares al virus de EEE derivado de RPE.40 precursor, así como un fenotipo de placa más grande (LP). Parecía concebible que estos mutantes de LP pudieran ser menos atenuados que el precursor con base en datos previamente publicados en mutantes de alfavirus Sindbis (Byrnes et al.

[2000] J. Virology 74: 644-651). Observaron que cuando se inoculaban en ratones mutantes de Sindbis de placa pequeña atenuados, se desarrollaban mutantes de placa más grande. Lo más importante por destacar, la reintroducción de los mutantes de Sindbis de LP de nuevo en los ratones, reveló que ios mutantes de LP tenían una vida media en la circulación significativamente más larga que el mutante de SP precursor. Esta propiedad sería de valor para un candidato de vacuna de EEE, ya que podría permitir que el organismo asuma una respuesta inmune más vigorosa. En consecuencia, se aislaron y expandieron varios mutantes de EEE de placa grande en células BHK. Los títulos virales determinados en células Vero, fueron consistentemente 5 a 15 veces mayores que en el mutante de SP precursor. Se caracterizó además el aislado de LP con el título más alto. Se aisló ARN viral, se produjo ADNc, y se generaron productos de PCR que permitieron la secuenciación completa de la región de los genes estructurales. Todas las mutaciones originales estuvieron presentes, además de otras dos. Se modificó el extremo carboxilo de E3 de CNARR — (SEQ ID NO: 3) a CNASR — (SEQ ID NO: 4), debido a la mutación de un solo nucleótido. Esto resultó en un nuevo sitio de glucosilación adyacente a en donde el sitio de digestión por furina se localizaba originalmente. Un cambio a PE2 de peso molecular mayor en geles de poliacrilamida teñidos, implica que se usa el nuevo sitio de glucosilación. La otra mutación se debió al cambio de un sólo nucleótido que alteró el aminoácido en la posición 80 de E2 de asparagina a un ácido aspártico (AAC a GAC). No se observaron mutaciones en la cápside, 6K, E1 o la UTR 3'. Este fenotipo de LP se debe solamente a estas mutaciones en E3 y E2, puesto que un virus recombinante producido a partir de un clon molecular que sólo contiene estas mutaciones, se comportó en forma similar a su precursor de LP. Este se identifica como el mutante derivado de RPE.40 de placa grande en el cuadro A.

Este virus mutante de EEE de LP se puso a prueba para eficacia en ratones, siguiendo los procedimientos descritos anteriormente. Todos los ratones sobrevivieron a la inoculación subcutánea (s.c.) e intranasal (i.n.) del candidato de vacuna de LP. No hubo signos de enfermedad, indicando que el virus fue totalmente atenuado. Sin embargo, a diferencia de su precursor de SP, el virus mutante de EEE de LP brindó protección parcial en el modelo de ratones Balb/c ante un desafío intranasal letal (30%) y un desafío subcutáneo (20%). Una dosis intranasal similar (1 x 104 unidades formadoras de placas) del virus mutante de EEE de SP precursor, no brindó protección. Este resultado de SP en conjunto con los ratones inoculados de LP sobrevivientes que tienen respuestas de anticuerpo neutralizantes significativas [>1:40], indicó que las dos mutaciones genómicas adicionales hicieron que el virus mutante de LP fuese menos atenuado. Se llevaron a cabo también estudios en pollos Leghorn de 1 a 3 días, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 2. El virus mutante de EEE de LP fue totalmente atenuado cuando se inoculó subcutáneamente en aves. Además, este mutante de LP brindó protección completa (0 pfu/ml) contra el virus de EEE de Norteamérica FL91 y el virus de EEE de Sudamérica PE-0155. Las aves desafiadas no afectadas desarrollaron una viremia de 1 x 105 - 1 x 106 pfu/ml.

EJEMPLO 4 Mulantes de deleción de FL91 del sitio de digestión por furina de longitud completa, derivados molecularmente El nivel final del experimento se enfocó en la producción de virus infecciosos viables a partir del muíante de deleción del sitio de digestión por furina. Este procedimiento se ha usado exitosamente para producir candidatos de vacuna para VEE (Hart ef al.

[2000] Vaccine 18: 3067-3075; Pratt et al.,

[2003] Vaccine 21 : 3584-3862) y WEE (Turell er al.

[2003] Am J Trop ed Hyg 68: 218-221). Un candidato de vacuna de VEE, V3526, ha sido aprobado por la FDA para pruebas clínicas de fase I. Para consignar por qué el clon de deleción pEE2202 del sitio de digestión por furina de longitud completa era capaz de producir virus, los presentes inventores decidieron secuenciar el genoma completo de FL91-4679. Sospechaban que el clon contenía mutaciones deletéreas derivadas del procedimiento de PCR original usado para obtener el clon. Se secuenció el genoma completo de FL91-4679 de 11 ,681 nucleótidos (SEQ ID NO: 1 anexa a la secuencia). La comparación de la secuencia viral naciente con la del clon pEE2002 de longitud completa resecuenciado, reveló 2 mutaciones de un solo nucleótido dentro de la región estructural que resultaron en cambios no conservativos de aminoácidos. Específicamente, estos cambios resultaron en una mutación de tirosina153cisteína (E2; TAC- TGC, nucleótido 9024) y de arginina 204cisteína (E1 ; CGC?TGC, nucleótido 10616). Se pensó que estas dos mutaciones tenían un impacto negativo sobre la producción de virus mutantes de deleción del sitio de digestión por furina. Varias otras mutaciones se identificaron también en la región no estructural, pero no se consideraron como deletéreas como las mutaciones puntuales de cisteína presentes en E1 y E2. Por consiguiente, estas dos mutaciones deletéreas fueron reemplazadas con la secuencia de FL91 naciente. Se generó un producto de PCR usando los iniciadores E8275F (véase la figura 1A) y E3'Not I y el virus FL91 de tipo silvestre como molde. El producto de amplificación fue digerido con Eco Rl/Not I y subclonado en el plásmido pEE2002. Esto resultó en la producción del clon infeccioso de EEE de la segunda generación, denominado pEE4002. Este nuevo plásmido fue totalmente secuenciado, lo cual garantizó la ausencia de alguna otra mutación. Se obtuvo un nuevo clon muíante de deleción del sitio de digestión por furina, pEE4202, usando este nuevo clon infeccioso como plataforma. Específicamente, un fragmento Neo l/Eco Rl de pEE2202 fue subclonado en pEE4002 para producir el nuevo plásmido de deleción pEE4202 del sitio de digestión por furina. Se generó ARN infeccioso a partir de pEE4202 linealizado con Not I, y transfectado en células BHK mediante electroporación. Se observó efecto citopático (CPE) extensivo varios días post-transfección, ilustrando que pEE4202 podía producir virus infecciosos que carecían de un sitio de digestión por furina (véase la figura 1 B). Este virus de EEE recombinante se desarrolló en placas con un tamaño significativamente menor que el precursor de tipo silvestre que se observó con el mutante de deleción del sitio de digestión por furina V3526. Además, el virus de la transfección de pEE4202 tuvo un título muy bajo en células Vero, de alrededor de 1 x 104 pfu/ml (véase cuadro 1). Un título aceptable para la producción de vacunas del virus, es aproximadamente 1 x 106 pfu/ml, tomando en cuenta los desafíos del aumento a escala para producción. CUADRO 1 Paso gradual del virus mutante de EEE PEE4202 De esta manera, para obtener virus existentes de pEE4202 de título mayor, el sobrenadante de transfección se hizo pasar gradualmente a través de dos líneas de células separadas, RPE.40 (células CHO-K1 deficientes en la proteasa furina; Moehring y Moehring

[1983], citado anteriormente) y células de riñon de cría de hámster (BHK) (que contienen una proteasa furina funcional). Esto resultó en la generación de virus mutantes de deleción del sitio de digestión por furina del virus de EEE a títulos significativamente mayores (>1 x 07 pfu/ml), y permitió realizar estudios de eficacia ¡n vivo. Además, la presión selectiva impuesta por las dos diferentes líneas de células, resultó en dos diferentes series de mutaciones del segundo sitio. Virus derivados de pEE4202 pasados seis veces a través de células BHK (es decir, p4202BHKP6, cuadro A), contenían la deleción del sitio de digestión por furina además de las dos mutaciones de E2 derivadas previamente del cultivo de células. Específicamente, las mutaciones presentes en p4202BHKP6 incluyeron H82R, y la deleción del aminoácido histidina 167. Los virus del paso 3 de RPE.40 contenían la deleción del sitio de digestión por furina además de una mutación de glutamina por prolina en el aminoácido 303 de E2, y un cambio de isoleucina por asparagina en el aminoácido 116 de la glucoproteína E1 (denominado p4202RPE.40P3, cuadro A). El análisis de secuencias del virus del paso 6 de RPE.40, reveló las mismas mutaciones observadas en el paso 3 de RPE.40 además de un H82R y una sustitución de asparagina por serina en el aminoácido 230 en E2 (denominado p4202RPE.40P6, cuadro A). Estos tres mutantes de deleción del sitio de digestión por furina se pusieron a prueba para eficacia en aves y ratones. Además de estos tres mutantes, el clon pEE4240 se puso a prueba también para eficacia in vivo. Este muíante de deleción del sitio de digestión por furina del virus de EEE contenía tres mutaciones del segundo sitio identificadas por el paso gradual repetido del virus FL91 de tipo silvestre no clonado a través de células RPE.40 (véase cuadro A). Estas mutaciones incluyeron un cambio de ácido aspártico por alanina en la posición 174 de E2, una sustitución de lisina por asparagina en la posición 186 de E2, y un cambio de isoleucina por treonina en la posición 116 de E1. La mutación de lisina por asparagina resultó en la generación de un sitio de glucosilación N-enlazado putativo en E2. El análisis del virus purificado mediante SDS-PAGE, indica que el carbohidrato está presente en este sitio. Tres de estas mutaciones únicas del segundo sitio se incorporaron en el muíante de deleción del sitio de digestión por furina, pEE4202, para obtener pEE4240. Véanse los datos del cuadro A para un resumen de estos candidatos de vacuna. Estos cuatro virus de deleción del sitio de digestión por furina del virus de EEE, se pusieron a prueba in vivo para determinar si podían inducir una respuesta inmune protectora contra el FL91 precursor letal. Cada virus se inoculó subcutáneamente en un grupo de pollos Leghorn de 1 día. Simultáneamente, otro grupo recibió el control de FL91 de tipo silvestre precursor. Las aves que recibieron los candidatos de vacuna, desarrollaron una viremia corta limitada no mayor de 1 x 104 pfu/ml. Las aves no afectadas que recibieron el precursor virulento, desarrollaron una viremia significativa (>1 x 109 pfu/ml), y alrededor de 24 horas post-infección, llegaron a estar moribundas o habían perecido. Todas las aves que recibieron los candidatos de vacuna de EEE sobrevivieron, pero ninguna exhibió signo alguno de enfermedad. Esto indicó claramente que cada uno de los cuatro candidatos virales fue atenuado in vivo. Catorce días post-vacunación, las aves fueron desafiadas subcutáneamente con el precursor FL91 virulento junto con un grupo control de aves no afectadas. Todas las aves control desarrollaron una viremia moderada (1 x 105 - 1 x 10s pfu/ml), mientras que todas las aves previamente vacunadas no mostraron signos de viremia (0 pfu/ml). Esto es indicativo de que los candidatos de vacuna brindaron protección completa contra el virus FL91 de Norteamérica precursor. Además, el suero de las aves vacunadas antes del desafío, contenía anticuerpos neutralizantes específicos del virus de EEE. Los virus atenuados habían inducido la producción de una respuesta inmune humoral significativa que es una correlación conocida con la inmunidad a alfavirus. No se consideró que el efecto protector que los presentes inventores observaron contra un virus de EEE de Norteamérica para estos candidatos de vacuna, implicara que habría protección contra virus de EEE de Sudamérica antagónicamente distintos. Para determinar si estos cuatro candidatos de vacuna eran capaces de esta amplia protección, se repitieron experimentos similares en aves a los descritos anteriormente, pero el desafío fue con la cepa PE-0155 de Sudamérica (Turell, datos no publicados; aislada de un mosquito Culex pedroi infectado en 1996 en Puerto Almendras, Departamento de Loreto, Perú). Similar al resultado previo, cada uno de los candidatos de vacuna brindó inmunidad completa (0 pfu/ml) a esta cepa de Sudamérica, mientras que las aves control desarrollaron una viremia de 1 x 105 - 1 x 106 pfu/ml. Esta protección contra los virus de EEE de Norteamérica y Sudamérica, se atribuyó directamente a los candidatos de vacuna atenuados vivos. El trabajo por otros (Strizki, ef al.

[1995], citado anteriormente), ha mostrado que la vacuna inactiva de EEE PE-6 brinda protección inadecuada contra las cepas del virus de EEE de Sudamérica antigénicamente distintas. De esta manera, el hecho de que estos mutantes atenuados vivos fueron capaces de proteger a las aves contra el virus de EEE de Sudamérica, es una propiedad crucial en el desarrollo de una nueva vacuna de EEE. Estos candidatos de vacuna pueden usarse potencialmente para proteger a animales y humanos contra la gama de virus de EEE que existen en Sudamérica, y que son transportados con frecuencia a los Estados Unidos por aves migratorias. CUADRO B Resumen de datos de los ejemplos 4 y 5 en ratones/desafío con aerosol de virus de EEE Vacuna subcutánea x1 en ratones Balb/c de 4 a 8 semanas Vacuna inactiva de PE-6 (IND) administrada subcutáneamente en los días 0 y 28 Pre-sangrías en el día 35, desafío con aerosol con FL91 de tipo silvestre (>1 OOOx la LD50) en el día 42 Después, los presentes inventores pusieron a prueba cada uno de estos cuatro candidatos de vacuna en ratones para determinar si podían inducir un efecto protector en mamíferos. Cada uno de los candidatos fue inoculado subcutáneamente en ratones Balb/c de 4 a 8 semanas. Los ratones del grupo control positivo recibieron el régimen de vacuna de IND humana de la formulación de PE-6 en el día 0 y en el día 28 (es decir, 0.5 mi x 2 inoculaciones subcutáneas). Los ratones del grupo control negativo recibieron diluyente de medio de EMEM estéril. Todos los ratones que recibieron los candidatos de vacuna no exhibieron signos de enfermedad, indicando que los virus fueron atenuados ¡n vivo. En el día 35 post-vacunación, se obtuvo un volumen limitado de suero de los ratones para el análisis de los anticuerpos. En el día 42 post-vacunación, los ratones recibieron un desafío con aerosol letal del precursor virulento, FL91 de tipo silvestre, que fue mayor de 1000x la LD50. Todos los ratones que recibieron los candidatos de vacuna viral pEE4240, p4202RPE.40P3 o p4202RPE.40P6, sobrevivieron. Nueve de los diez ratones que recibieron el virus p4202BHKP6, sobrevivieron. Ocho de los diez ratones que recibieron el régimen de vacuna humana de PE-6, sobrevivieron. Ninguno de los ratones del control negativo no afectados, sobrevivió (cuadro B). Cada uno de los cuatro candidatos de vacuna atenuada viva puestos a prueba, brindó mejor protección que la vacuna de PE-6 usada actualmente. Claramente, los candidatos de vacuna atenuada viva brindaron mejor protección que la preparación de vacuna inactiva. Esto es bastante remarcable, considerando que los ratones recibieron dos dosis de 0.5 mi de la vacuna PE-6 (es decir, régimen de dosis de vacuna humana), en comparación con una inoculación subcutánea de 0.2 mi diluida de los candidatos. Todos los ratones sobrevivientes exhibieron una respuesta de anticuerpo neutralizante significativa específica para el virus de EEE.

CUADRO C Resumen de datos de seguridad de la inoculación intranasal de los ejemplos 4 y 5 en ratones Vacuna intranasal x1 en ratones Balb/c de 4 a 8 semanas Pre-sangrías en el día 35 *T¡empo medio retardado de muerte respecto a ratones control CUADRO D Resumen de datos de la inoculación intranasal del ejemplo 4 en ratones/desafío con aerosol de virus de EEE Vacuna intranasal x1 en ratones Balb/c de 4 a 8 semanas Pre-sangrías en el día 35 Desafío con aerosol con virus de EEE FL91 de tipo silvestre (>1000x la LD5o) en el día 42 Después, los presentes inventores buscaron determinar si los candidatos de vacuna eran seguros (es decir, carecían de neurovirulencia). Los candidatos de vacuna de virus de EEE pEE4240, p4202.RPE.40P6 y P4202.BHKP6, se administraron ¡ntranasalmente (i.n.) en ratones Balb/c de 4 a 8 semanas. Todos los ratones que recibieron los candidatos de vacuna sobrevivieron sin signos de enfermedad, indicando que los virus mutantes carecían de neurovirulencia (cuadro C). Ninguno de los diez ratones control que recibieron ¡ntranasalmente el virus FL91 de tipo silvestre sobrevivió, y el día medio de muerte fue de 5.2 días. Después, los presentes inventores pusieron a prueba si esta inoculación intranasal individual de los candidatos de vacuna era suficiente para brindar protección. Cuarenta y dos días postvacunación intranasal, se sometió a los ratones a un desafío con aerosol letal >1 ,000x la LD50 con el virus FL91 de tipo silvestre precursor. Todos los ratones que recibieron pEE4240 o p4202.RPE.40P6 sobrevivieron, indicando que estos candidatos pueden brindar inmunidad aún cuando se administren ¡ntranasalmente 0.02 mi (cuadro D). Sólo dos de diez ratones que recibieron el virus muíante p4202.BHKP6, sobrevivieron al desafío con aerosol. Este candidato es aparentemente menos eficaz que p4EE4240 y p4202.RPE.40P6. Todos los ratones no afectados que recibieron medio EMEM perecieron poco después del desafío con aerosol. Se han generado clones moleculares de deleción del sitio de digestión por furina, que representan los virus mutantes derivados del paso 6 de BHK de pEE4202 y los pasos 3 y 6 de RPE.40. Se denominaron pEE4230, pEE4250 y pEE4260, respectivamente. Cada uno de estos virus recombinantes se comportó en forma similar a su aislado biológico precursor. Pueden ocurrir variaciones en la región no estructural, pero no impactarán significativamente la eficacia del candidato de vacuna. Este estudio representa la primera vez que se han producido virus de EEE mutantes atenuados vivos que son capaces de brindar 100% de protección contra desafíos con aerosol letales. Además, los presentes inventores han obtenidos clones moleculares definidos para cada candidato de vacuna, que permiten producir fácilmente cantidades significativas de los virus recombinantes.

EJEMPLO 5 Mutante atenuado derivado molecularmente con un sitio de digestión por furina intacto Se examinó también un procedimiento de deleción alternativo para crear candidatos de vacuna de EEE. Específicamente, más que eliminar el sitio de digestión por la proteasa furina, una pequeña región de E3 se removió mediante mutagénesis dirigida a sitio. Se eliminaron doce nucieótidos, y se mantuvo intacto el sitio de digestión por furina (véase cuadro A, E3Delta3). Estos nucieótidos eliminados codifican para residuos de E3 21 a 24 que representan cisteína-metionina-prolina-cisteína. Esta secuencia corta es única para el virus de EEE respecto a los otros alfavirus del Nuevo Mundo de VEE y WEE. Este clon molecular denominado E3Delta3 (llamado también pEE2021), se obtuvo mediante mutagénesis dirigida a sitio-PCR de dos etapas, usando los procedimientos descritos anteriormente para obtener clones moleculares de virus de EEE. Se produjeron dos iniciadores para crear la mutación. Fueron E3Delta3 5F y E3Delta3 6R. La secuencia para cada uno 5' a 3', se da a continuación: E3D3 5F 5' TTTCCATGTGATCAACACCCTGTTATGAAAAGAATCCACACGA 3' (SEQ ID NO: 5) E3D3 6R 5' TCGTGTGGATTCTTTTCATAACAGGGTGGTTGATCACATGGAAA 3' (SEQ ID NO: 6) La construcción del plásmido final tiene un sitio de furina intacto, y usó el plásmido pEE2002 como la estructura de base precursora. Geies de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie, revelaron que el virión E3Delta3 purificado contenía E2 y no PE2, indicando que ocurre digestión por furina. El análisis de geles similares con tinción con plata, reveló que el muíante E3Delta3 carecía de la proteína E3, que se encuentra normalmente en el virión FL91 de tipo silvestre (resultados no publicados). Cuando el muíante E3Delta3 se administró subcutáneameníe en aves o ratones, todos sobrevivieron sin signos de enfermedad, indicando que el muíante fue alíamente atenuado. Como se observó anteriormeníe, las aves inoculadas con E3Delta3 (denominado íambién pEE2021) fueron protegidas contra una cepa de virus de EEE de Norteamérica y Sudamérica. No fue evidente viremia alguna en el suero de las aves vacunadas (0 pfu/ml), mientras que el suero de las aves control exhibió una viremia de 1 x 105 - 1 x 106 pfu/ml. Todos los ratones inoculados subcutáneamente con este candidato, sobrevivieron a un desafío con aerosol letal 42 días post-vacunación (véase cuadro A). Cuando el muíante se administró intranasalmente, todos los ratones Balb/c perecieron. Infortunadamente, este muíante contiene aún cierto nivel de neurovirulencia, aunque el tiempo promedio de muerte (8.9 días) fue retardado sustancialmente respecto a FL91 de tipo silvestre (5.2 días). Esta es la primera vez que se muestra que un muíanle de alfavirus por deieción del sitio de digestión por furina del Nuevo Mundo, no es completamente eficaz contra un desafío letal con aerosol. Este experimento muestra claramente que podría usarse posiblemente una variedad de otros procedimientos de deieción del genoma para producir virus aíenuados que tengan el potencial de desarrollarse en vacunas.

Preparación de una vacuna Puede prepararse una vacuna que contenga una muíación supresora o mutaciones supresoras múltiples. Además, puede prepararse una vacuna que contenga un candidato o candidatos múltiples en una sola vacuna. Se prefiere suministrar la vacuna subcutáneamente; sin embargo, muchas otras vías son también aceptables (intranasal, intradérmica, etc.). Los vehículos incluyen, pero no están limitados a, solución salina, PBS, agua estéril y atomización de aerosol. Se han contemplado también adyuvantes tales como, por ejemplo, adyuvante de Freund u otros adyuvantes conocidos en la técnica. La secuencia de pEE4002 es igual a FL91 de tipo silvestre, salvo por las varias mutaciones en la región no estructural.

Secuencia para FL-91 (SEQ. ID. NO: 1)

Claims (55)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un ADN que comprende un fragmento de ADNc de virus de encefalitis equina oriental (EEE) aislado y purificado, que codifica para genoma de virus de encefalitis equina oriental infeccioso.

2.- Un ADN que comprende un ADN de virus de encefalitis equina oriental aislado y purificado, que codifica para FL91-4679.

3.- Un clon molecular de dicho ADN que codifica para FL91-4679 de conformidad con la reivindicación 2, en donde el ADNc de dicho clon contiene la secuencia de FL91-4679 completa, o una parte de la misma.

4. - El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una o varias mutaciones supresoras.

5. - El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc contiene una deleción parcial del sitio de digestión por furina y una o varias mutaciones supresoras.

6. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha deleción parcial del sitio de digestión por furina es una deleción de TRR.

7. - El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc contiene una deleción de cuatro aminoácidos de los codones 21 a 24 en el gen de E3.

8.- El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de ácido aspártico en el codón 174 de E2 por una alanina.

9.- El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de lisina en el codón 186 de E2 por una asparagina.

10. - El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de isoleucina en el codón 16 de E1 por una treonina.

11. - El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de histidina en el codón 82 de E2 por una arginina.

12. - El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de una asparagina en el codón 230 de E2 por una serina.

13. - El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de prolina en el codón 303 de E2 por una glutamina.

14.- El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de una isoleucina en el codón 16 de E1 por una asparagina.

15.- El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una deieción de la histidina en el codón 167 de E2.

16. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de histidina en el codón 82 de E2 por una arginina.

17. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una deieción de la histidina en el codón 167 de E2.

18. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de arginina en el codón 59 de E3 por una serina.

19. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha mutación supresora es una sustitución de asparaginas en el codón 80 de E2 por un ácido aspártico.

20.- El ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

21. - El ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

22. - El ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

23. - El ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

24. - El ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

25. - El ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho fragmento de ADNc del virus de EEE está enlazado operablemente a un promotor, de modo que dicho ADNc es transcrito.

26. - Un transcrito de ARN de virus de EEE atenuado codificado por el fragmento de ADNc de conformidad con la reivindicación 4.

27. - Un transcrito de ARN de virus de EEE atenuado codificado por el fragmento de ADNc de conformidad con la reivindicación 5.

28.- Un transcrito de ARN de virus de EEE atenuado codificado por el fragmento de ADNc de conformidad con la reivindicación 7.

29.- Partículas de virus de EEE atenuadas que contienen un transcrito de ARN de conformidad con la reivindicación 4.

30. - Partículas de virus de EEE atenuadas que contienen un transcrito de ARN de conformidad con la reivindicación 5.

31. - Partículas de virus de EEE atenuadas que contienen un transcrito de ARN de conformidad con la reivindicación 7.

32.- Una vacuna atenuada viva de virus de encefalitis equina oriental (EEE), que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 29.

33. - Una vacuna atenuada viva de virus de encefalitis equina oriental (EEE), que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 30.

34. - Una vacuna atenuada viva de virus de encefalitis equina oriental (EEE), que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 31.

35. - Una formulación farmacéutica que comprende partículas de virus de EEE atenuadas de conformidad con la reivindicación 29, en una cantidad inmunógena efectiva en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

36. - Una formulación farmacéutica que comprende partículas de virus de EEE atenuadas de conformidad con la reivindicación 30, en una cantidad inmunógena efectiva en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37.- Una formulación farmacéutica que comprende partículas de virus de EEE atenuadas de conformidad con la reivindicación 31 , en una cantidad inmunógena efectiva en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

38.- Una vacuna de EEE inactivada que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicho virus de EEE atenuado es inactivado.

39. - Una vacuna de EEE inactivada que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 30, en donde dicho virus de EEE atenuado es inactivado.

40. - Una vacuna de EEE inactivada que comprende virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 31 , en donde dicho virus de EEE atenuado es inactivado.

41. - El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho ADNc contiene una o más mutaciones en una región no estructural del ADN.

42. - Una vacuna atenuada viva de virus de encefalitis equina oriental, que comprende uno o más de los candidatos seleccionados del grupo que consiste de (1) un ADN que comprende un fragmento de ADNc de virus de encefalitis equina oriental aislado y purificado que codifica para genoma de virus de encefalitis equina oriental infeccioso, en donde dicho fragmento de ADNc contiene una deleción en ei sitio de digestión por furina y una o más mutaciones supresoras, (2) un ADN que comprende un fragmento de ADNc de virus de encefalitis equina oriental aislado y purificado que codifica para genoma de virus de encefalitis equina oriental infeccioso, en donde dicho fragmento de ADNc contiene una deleción parcial del sitio de digestión por furina y una o más mutaciones supresoras, y (3) un ADN que comprende un fragmento de ADNc de virus de encefalitis equina oriental aislado y purificado que codifica para genoma de virus de encefalitis equina oriental infeccioso, en donde dicho fragmento de ADNc contiene una deleción de cuatro aminoácidos de los codones 21 a 24 del gen de E3.

43.- Una vacuna atenuada viva de virus de encefalitis equina oriental que comprende una o más moléculas de ADN que comprenden un fragmento de ADNc de virus de encefalitis equina oriental aislado y purificado que codifica para genoma de virus de encefalitis equina oriental infeccioso, en donde dichas una o más moléculas de ADN se seleccionan del grupo que consiste de: (1) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de un ácido aspártico en el codón 174 del gen de E2 por una alanina, (2) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una lisina en el codón 186 del gen de E2 por una asparagina, (3) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una isoleucina en el codón 116 del gen de E1 por una treonina, (4) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una histidina en el codón 82 del gen de E2 por una arginina, (5) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una asparagina en el codón 230 del gen de E2 por una serina, (6) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una deleción del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una prolina en el codón 303 del gen de E2 por una glutamina, (7) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una delecion del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una isoleucina en el codón 1 16 del gen de E1 por una asparagina, (8) dicho ADN, en donde dicho ADNc contiene una delecion del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una delecion de una histidina en el codón 167 del gen de E2, (9) en donde dicho fragmento de ADNc contiene una delecion parcial del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una histidina en el codón 82 del gen de E2 por una arginina, (10) en donde dicho fragmento de ADNc contiene una delecion parcial del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una delecion de una histidina en el codón 167 del gen de E2, (11) en donde dicho fragmento de ADNc contiene una delecion parcial del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una arginina en el codón 59 del gen de E3 por una serina, (12) en donde dicho fragmento de ADNc contiene una delecion parcial del sitio de digestión por furina y una mutación supresora de una sustitución de una asparagina en el codón 80 del gen de E2 por un ácido aspártico, y (13) en donde dicho fragmento de ADNc contiene una delecion de cuatro aminoácidos de los codones 21 a 24 en un gen de E3.

44.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

45.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

46. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

47. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

48. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

49. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

50.- El uso de virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 29, para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica.

51. - El uso que se reclama en la reivindicación 50, en donde dicho paciente es un mamífero o ave.

52. - El uso que se reclama en la reivindicación 50, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal.

53. - El uso de virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 30, para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica.

54. - El uso que se reclama en la reivindicación 53, en donde dicho paciente es un mamífero o ave.

55. - El uso que se reclama en la reivindicación 53, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal. 56 - El uso de virus de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 31 , para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica. 57. - El uso que se reclama en la reivindicación 56, en donde dicho paciente es un mamífero o ave. 58. - El uso que se reclama en la reivindicación 56, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal. 59. - El uso de un EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicho EEE atenuado es ¡nactivado para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica. 60. - El uso que se reclama en la reivindicación 59, en donde dicho paciente es un mamífero o ave. 61. - El uso que se reclama en la reivindicación 59, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal. 62. - El uso de un EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 30, en donde dicho EEE atenuado es inactivado para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica. 63. - El uso que se reclama en la reivindicación 62, en donde dicho paciente es un mamífero o ave. 64. - El uso que se reclama en la reivindicación 62, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal. 65. - El uso de EEE atenuado de conformidad con la reivindicación 31 , en donde dicho EEE atenuado es inactivado para preparar una vacuna para inocular a un paciente para virus de encefalitis equina oriental de Norteamérica y/o virus de encefalitis equina oriental de Sudamérica. 66. - El uso que se reclama en la reivindicación 65, en donde dicho paciente es un mamífero o ave. 67. - El uso que se reclama en la reivindicación 65, en donde dicha vacuna está formulada para administración parenteral, tópica o nasal. 68.- Un anticuerpo específico para el virus de conformidad con la reivindicación . 69.- Un método para detectar la presencia de virus de encefalitis equina oriental en una muestra, que comprende: recubrir una superficie con los anticuerpos de conformidad con la reivindicación 68, someter dicha superficie recubierta a suero de una muestra, determinar si se forman complejos entre dichos anticuerpos y dicho virus, y si se forman dichos complejos, entonces dicha muestra contiene a dicho virus. 70.- Un método para determinar la presencia de anticuerpos de encefalitis equina oriental en un sujeto, que comprende: (a) recubrir una superficie con el ADN de conformidad con la reivindicación 1; (2) poner en contacto dicha superficie recubierta con una muestra de suero de un sujeto que se sospecha tiene una infección por virus de encefalitis equina oriental; (3) detectar la presencia o ausencia de complejos formados entre dicho ADN y anticuerpos en dicha muestra específica para dicho ADN; y si existe la presencia de dichos complejos, entonces dicho sujeto tiene anticuerpos para encefalitis equina oriental. 71. - Un equipo de diagnóstico, que comprende: un substrato recubierto con los anticuerpos de conformidad con la reivindicación 68. 72. - Una secuencia de iniciador, que comprende: un fragmento del ADNc de conformidad con la reivindicación 1. 73. - Un equipo de diagnóstico, que comprende: una secuencia de iniciador de conformidad con la reivindicación 72. 74.- El uso de los anticuerpos de la reivindicación 68, para preparar una composición farmacéutica para tratar síntomas en un paciente que es infectado con virus de encefalitis equina oriental.