MX2014009916A - Composicion de particula tipo virus. - Google Patents

Composicion de particula tipo virus.

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Abstract

La presente invención provee una partícula que comprende un polipéptido y por lo menos un antígeno, y una composición que comprende los mismos.

Description

COMPOSICIÓN DE PARTÍCULA TIPO VIRUS REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos No.: 61/599,746, presentada en Febrero 16 de 2012, cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia.
CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una partícula que comprende un polipeptido y por lo menos un antígeno, y una composición que comprende los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las partículas tipo virus (VLPs) son estructuras de proteínas múltiples que imitan la organización y conformación de los virus nativos auténticos pero carecen del genoma viral, dando potencialmente candidatos de vacuna más seguros y más económicos. Un puñado de vacunas profilácticas basadas en VLPs se comercializa actualmente a nivel global: Engerix® de GlaxoSmithKIine (virus de la hepatitis B) y Cervarix® (virus del papiloma humano), y Recombivax HB® de Merck and Co., Inc. (virus de la hepatitis B) y Gardasil® (virus del papiloma humano), son algunos ejemplos. Otros candidatos de vacuna basados en VLPs están en pruebas clínicas o están sufriendo evaluación preclínica, tales como el virus de la influenza, parvovirus, Norwalk y varias VLPs quimericas. Muchos otros están restringidos aún a investigación fundamental a pequeña escala, a pesar de su éxito en pruebas preclínicas. Las implicaciones de la producción de VLPs a gran escala se discuten en el contexto del control, monitorización y optimización del procedimiento. Los principales retos téenicos, corriente arriba y corriente abajo, se identifican y se discuten en consecuencia. Toneladas exitosas de vacunas basadas en VLPs se presentan brevemente concomitantemente con los últimos resultados de las pruebas clínicas y los desarrollos recientes en la tecnología basada en VLPs quiméricas para la vacunación terapéutica o profiláctica (Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010).
El virus Chikungunya (CHIKV) ha infectado a millones de personas en África, Europa y Asia desde que este alfavirus volvió a emerger de Kenia en 2004. La severidad de la enfermedad y la diseminación de este virus epidémico presentan una amenaza seria para la salud pública en ausencia de vacunas o terapias antivirales. Se reporta que una vacuna de VLPs para el virus Chikungunya epidémico protege a primates no humanos contra la infección (Nat Med., Marzo de 2010; 16(3): 334-338). La publicación de la patente de los Estados Unidos No. 2012/0003266, describe una partícula tipo virus (VLP) que comprende uno o más polipéptidos estructurales del virus Chikungunya que es útil para formular una vacuna o composición antigénica para el virus Chikungunya que induce inmunidad a una infección o por lo menos un síntoma de la misma. El documento WO2012/106356 describe partículas tipo virus (VLPs) de alfavirus o flavivirus modificadas, y métodos para mejorar la producción de VLPs modificadas para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades mediadas por alfavirus y flavivirus (estas referencias citadas se incorporan en la presente como referencia).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En el primer aspecto, la presente invención provee una partícula que es capaz de ser auto-ensamblada, que comprende un polipéptido y por lo menos un antígeno, en donde dicho polipéptido comprende por lo menos un primer sitio de unión y dicho antígeno (por lo menos uno) comprende por lo menos un segundo sitio de unión, y en donde dicho polipéptido y dicho antígeno son enlazados a través de dicho primer sitio de unión (por lo menos uno) y dicho segundo sitio de unión (por lo menos uno).
En el segundo aspecto, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una partícula provista en el primer aspecto de la presente invención.
En el tercer aspecto, la presente invención provee una composición que comprende la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención.
En el cuarto aspecto, la presente invención provee un método de producción de un anticuerpo, que comprende poner en contacto la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención con un mamífero.
En el quinto aspecto, la presente invención provee un método de inmunomodulación, un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune, un método de inducción y/o mejora de la respuesta inmune contra un antígeno en un mamífero, y un método de tratamiento de cáncer, que comprende administrar la composición provista en el tercer aspecto de la presente invención a un mamífero.
En el sexto aspecto, la presente invención provee un método de inmunización pasiva, que comprende administrar el anticuerpo provisto en el cuarto aspecto de la presente invención a un mamífero.
En el séptimo aspecto, la presente invención provee un método de presentación de un antígeno en un macrófago, que comprende poner en contacto la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención con un mamífero.
En el octavo aspecto, la presente invención provee un método para producir la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención, que comprende preparar un gen que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique para dicha partícula; cultivar una celula que sea transfectada con dicho gen para expresar dicha partícula; y recuperar dicha partícula.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la modificación de la secuencia del FNT-alfa que va a ser insertada en el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV).
La figura 2 muestra los resultados del Western Blot que indican que la VLP conjugada con el FNT-alfa fue expresada.
La figura 3 muestra el vector VLP_CHI 512.
La figura 4 muestra el vector VLP_CHI 532.
La figura 5 muestra el vector VLP_CHI 520.
La figura 6 muestra el vector VLP_VEEV VLP 518.
La figura 7 muestra el vector VLP_VEEV VLP 519.
La figura 8 muestra el vector VLP VEEV VLP 538.
La figura 9 muestra la detección de anticuerpos anti-FNT-alfa inducidos por la partícula tipo virus conjugada con el péptido derivado del FNT-alfa.
La figura 10 muestra la detección de anticuerpos anti-CD20 de humano inducidos por la partícula tipo virus conjugada con el péptido derivado del CD20.
La figura 11 muestra la detección de anticuerpos anti-CD20 de ratón inducidos por la partícula tipo virus conjugada con el peptido derivado de CD20.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN (1) Una partícula que comprende un polipéptido y por lo menos un antígeno En el primer aspecto, la presente invención provee una partícula que es capaz de ser auto-ensamblada, que comprende un polipéptido y por lo menos un antígeno, en donde dicho polipéptido comprende por lo menos un primer sitio de unión y dicho antígeno (por lo menos uno) comprende por lo menos un segundo sitio de unión, y en donde dicho polipéptido y dicho antígeno son enlazados a través de dicho primer sitio de unión (por lo menos uno) y dicho segundo sitio de unión (por lo menos uno).
Como se usa en la presente, “una partícula que es capaz de ser auto-ensamblada” se refiere a una partícula formada por cuando menos un constituyente que es ensamblado espontáneamente. El constituyente puede ser un polipéptido o compuesto químico no peptídico. En una modalidad, “una partícula que es capaz de ser auto-ensamblada” puede ser una partícula que comprenda o que consista de por lo menos un polipéptido. El polipéptido (por lo menos uno) consiste de uno o más tipos de péptido. En una modalidad, dicha partícula tiene un diámetro de por lo menos 10 nm, por ejemplo, por lo menos 20 nm, de preferencia por lo menos 50 nm. En una modalidad, el peso molecular de dicha partícula es de 100 kDa a 100,000 kDa, de preferencia de 400 kDa a 30,000 kDa.
Un polipeptido usado para la presente invención no es limitado, en tanto sea ensamblado espontáneamente. El polipéptido puede ser un polipéptido estructural viral. De esta manera, la partícula provista por la presente invención puede ser una partícula tipo virus.
Un polipéptido estructural viral puede ser un polipéptido viral de ocurrencia natural o polipéptido modificado del mismo. En una modalidad, el polipéptido modificado tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido estructural viral de ocurrencia natural que incluye cápside y proteína de la cubierta. En una modalidad, el polipéptido modificado es un mutante en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos y/o añadidos a un polipéptido estructural viral de ocurrencia natural que incluye cápside y proteína de la cubierta.
En una modalidad, el polipéptido estructural viral usado para la presente invención consiste de o comprende cápside y/o proteína de la cubierta, o fragmento de la misma. Por ejemplo, una proteína de la cubierta comprende por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de E3, E2, 6K y E1. El polipéptido estructural viral usado para la presente invención puede derivarse de alfavirus o flavivirus. De esta manera, la partícula provista por la presente invención puede ser una partícula tipo virus derivada de alfavirus o flavivirus. Ejemplos de alfavirus y flavivirus incluyen, pero no están limitados a, virus Aura, virus Babanki, virus Barmah Forest (BFV), virus Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya (CHIKV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus Eilat, virus de los Everglades, virus del Fuerte Morgan, virus Getah, virus J de las tierras altas, virus Kyzylagach, virus Mayaro, virus Me Tri, virus Middelburg, virus Mosso das Pedras, virus Mucambo, virus Ndumu, virus O'nyong-nyong, virus Pixuna, virus del Río Negro, virus del Río Ross (RRV), virus de la enfermedad pancreática del salmón, virus Semliki Forest, virus de Sindbls, virus del elefante marino meridional, virus Tonate, virus Trocara, virus Una, virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus Whataroa, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la encefalitis llevada por ácaros y virus de la fiebre amarilla.
Como se usa en la presente, el termino “antígeno” se refiere a una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo o un receptor de células T (TCR) si es presentado por moléculas de cadena de miosina pesada (MHC). El término “antígeno”, como se usa en la presente, abarca también epítopes de células T. Un epítope de células T es reconocido por un receptor de células T en el contexto de una MHC clase I, presente en todas las células del cuerpo, salvo eritrocitos, o clase II, presente en células inmunes y en particular células que presentan antígeno. Este evento de reconocimiento lleva a la activación de las células T y mecanismos efectores subsiguientes tales como proliferación de las células T, secreción de citocinas, secreción de perforina, etc. Un antígeno es adicionalmente capaz de ser reconocido por el sistema inmune y/o de ser capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que lleva a la activación de los linfocitos B y/o T. Sin embargo, esto puede requerir que, por lo menos en ciertos casos, el antígeno contenga o esté enlazado a un epítope de células TH y se dé en adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopes (epítopes B y T). La reacción específica referida anteriormente se usa para indicar que el antígeno reaccionará de preferencia, típicamente en una manera altamente selectiva, con su anticuerpo o TCR correspondiente, y no con la multitud de otros anticuerpos o TCRs que puedan ser evocados por otros antígenos. Los antígenos, como se usan en la presente, pueden ser también mezclas de varios antígenos individuales. Los antígenos, como se usan en la presente incluyen, pero no están limitados a, alérgenos, auto-antígenos, haptenos, antígenos de cáncer (es decir, antígenos tumorales) y antígenos de enfermedades infecciosas, así como pequeñas moléculas orgánicas tales como fármacos de abuso (tales como la nicotina) y fragmentos y derivados de los mismos. Además, los antígenos usados para la presente invención pueden ser péptidos, proteínas, dominios, carbohidratos, alcaloides, lípidos o pequeñas moléculas tales como, por ejemplo, hormonas esteroides y fragmentos y derivados de las mismas, auto-anticuerpos y las mismas citosina.
Ejemplos de citocinas incluyen, pero no están limitados a, interleucina (IL) que incluye más de 30 tipos tales como IL-1a, IL-1 b, IL-2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11 a -37; ¡nterferón (IFN) tal como IFN-a, IFN-b e IFN-g; factor de necrosis tumoral (FNT) tal como FNT-a y FNT-b; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-a y TGF-b; factor estimulador de colonias (CSF) tal como factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), eritropoyetina (EPO), factor de células madre (SCF) y factor activador y quimiotáctico de monocitos (MCAF); factor de crecimiento (GF) tal como factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), trombopoyetina (TPO) y proteína morfogénica ósea (BMP); y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF, ligando kit (KL), MPO (mieloperoxidasa) y CRP (proteína C reactiva); COX (ciclooxigenasa) tal como COX-1, COX-2 y COX-3, y NOS (óxido nítrico sintasa) tal como NOS-1, NOS-2 y NOS-3; etc.
Las citocinas incluyen también quimiocinas que son citocinas que inducen quimiotaxis. Existen dos clases principales de quimiocinas, CXC y CC. Las quimiocinas CXC, tales como la proteína 2 activadora de neutrófílos (NAP-2) y la proteína de actividad estimuladora del crecimiento de melanoma (MGSA), son quimiotácticas principalmente para neutrófilos y linfocitos T, mientras que las quimiocinas CC, tales como RANTES, la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP) que incluye MIP-1a y MIR-1b, la quimiocina derivada de queratinocitos (KC), las proteínas quimiotácticas de monocitos (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y MCP-5) y las eotaxinas (-1 y -2) son quimiotácticas para, entre otros tipos de células, macrófagos, linfocitos T, eosinófilos, neutrófilos, células dendríticas y basófilos. Existen también las quimiocinas linfotactina-1 , linfotactina-2 (ambas quimiocinas C) y fractalcina (una quimiocina CX3C) que no pertenecen a ninguna de las subfamilias de quimiocinas principales.
Como se usa en la presente, el término “determinante antigénico” se usa para referirse a aquella porción de un antígeno que es reconocido específicamente por los linfocitos B o T. Los linfocitos B responden a los determinantes antigénicos extraños por medio de la producción de anticuerpos, mientras que los linfocitos T son el mediador de la inmunidad celular. De esta manera, los determinantes antigénicos o epítopes son aquellas partes de un antígeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de una MHC, por los receptores de células T. Un determinante antigénico contiene uno o más epítopes.
Como se usa en la presente, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas que son capaces de unirse a un epítope o determinante antigénico. El término se usa para incluir anticuerpos enteros y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que incluyen anticuerpos de cadena sencilla. Dichos anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de humano e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fvs enlazados por puentes disulfuro (sdFv), y fragmentos que comprenden o un dominio VH o VL. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal que incluyen aves y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son de mamífero, por ejemplo, humano, murino, conejo, cabra, conejillo de Indias, camello, caballo y similares, u otros animales adecuados, por ejemplo, pollo. Como se usa en la presente, los anticuerpos “humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de colecciones de inmunoglobulina humana o de animales transgenicos para una o más inmunoglobulinas humanas, y que no expresan inmunoglobulinas endógenas como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,939,598, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.
El antígeno puede ser una sustancia (por ejemplo, proteína) que no se derive de virus (por ejemplo, virus Chikungunya, virus de la encefalitis equina venezolana).
En una modalidad, el antígeno que se usa para la presente invención es por lo menos un objetivo o un polipéptido del mismo como se enlista en el cuadro 1.
CUADRO 1 CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) CUADRO 1 (CONTINUACIÓN) En una modalidad, el antígeno que se usa para la presente invención es por lo menos una proteína o un polipéptido del mismo seleccionado del grupo que consiste de CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, 0X40, GITR, CD137, CD27 y HVEM. CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA y LAG-3 son receptores inhibidores para la estimulación de celulas T, y CD28, 0X40, GITR, CD137, CD27 y HVEM son receptores activadores para la estimulación de células T (véase Mellman et al., Nature 480, 480-489 (2011)).
El antígeno usado para la presente invención puede ser un polipéptido modificado derivado de una protema de ocurrencia natural. El polipéptido modificado puede ser un fragmento de la proteína de ocurrencia natural. En una modalidad, el polipéptido modificado tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido derivado de una proteína de ocurrencia natural. En una modalidad, el polipéptido modificado derivado es un mutante en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos, y/o añadidos con base en un polipéptido derivado de la proteína de ocurrencia natural.
En la partícula como es provista por la presente invención, un polipéptido y un antígeno pueden ser enlazados a través de por lo menos un primer sitio de unión que está presente en el polipéptido y por lo menos un segundo sitio de unión que está presente en el antígeno.
Como se usa en la presente, cada uno de “un primer sitio de unión” y “un segundo sitio de unión” se refiere a un sitio en donde más de una sustancia se enlaza con alguna otra.
En una modalidad, el polipéptido y el antígeno se fusionan directamente. En forma alternativa, uno o dos enlazadores pueden interponerse entre el residuo N-terminal del antígeno y el polipéptido y/o entre el residuo C-terminal del antígeno y el polipéptido.
El antígeno o el polipéptido pueden ser truncados y reemplazados por enlazadores cortos. En algunas modalidades, el antígeno o el polipéptido incluyen uno o más enlazadores peptídicos. Típicamente, un enlazador consiste de 2 a 25 aminoácidos. Usualmente, es de 2 a 15 aminoácidos de longitud, aunque en ciertas circunstancias, puede ser de sólo uno, tal como un residuo de glicina individual.
En una modalidad, una molécula de ácido nucleico, en la cual el polinucleótido que codifica para el polipéptido se fusiona genéticamente con el polinucleótido que codifica para el antígeno, es expresada en una célula huésped, de modo que el primer sitio de unión y el segundo sitio de unión son enlazados a través de un enlace peptídico. En este caso, el polipéptido y el antígeno son enlazados a través de un enlace peptídico. Con relación a esta modalidad, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión pueden ser modificados genéticamente del polipéptido o antígeno original. Por ejemplo, el primer sitio de unión es modificado del polipéptido, de modo que a través de un péptido enlazador que incluye SG, GS, SGG, GGS y SGSG, el polipéptido es conjugado con el antígeno.
Cuando el polipéptido es conjugado químicamente con el antígeno, el primer sitio de unión y el segundo sitio de unión pueden ser enlazados a través de un entrelazador químico que es un compuesto químico.
Ejemplos del entrelazador incluyen, pero no están limitados a, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros entrelazadores disponibles de Pierce Chemical Company.
En una modalidad, la partícula provista por la presente invención comprende un polipéptido enlazado a un antígeno, en donde la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno es de 30 Á o menos, cuando la distancia se determina en un cristal del antígeno o una proteína de ocurrencia natural que contiene al antígeno o la proteína modificada del mismo.
El antígeno usado para la presente invención puede ser diseñado por el experto en la téenica. Por ejemplo, el antígeno usado para la presente invención puede ser una proteína de ocurrencia natural o un fragmento de la misma. En forma alternativa, el antígeno usado para la presente invención puede ser una proteína modificada de una proteína de ocurrencia natural o un fragmento de la misma. El experto en la técnica puede diseñar el antígeno, de modo que la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno sea de 30 Á o menos, cuando la distancia se determina en un cristal del antígeno o una proteína de ocurrencia natural que contiene al antígeno o proteína modificada del mismo. Por ejemplo, el antígeno usado para la partícula provista por la presente invención puede diseñarse usando un software gratuito que incluye a PyMOL (por ejemplo, PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org). En una modalidad, la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno es de 30 Á (Angstroms) o menos, 20 Á o menos o 10 h o menos (por ejemplo, de 5 Á a 15 Á, de 5 Á a 12 Á, de 5 Á a 11 Á, de 5 Á a 10 Á, de 5 Á a 8 Á, de 8 Á a 15Á,de 8Á a 13Á,de8Á a 12Á,de8Á a 11Á,de9Á a 12Á,de9Á a11 Á,de9 Á a10Á ode 10Á a 11Á).
Partícula tipo virus Chikunqunva o una partícula tipo virus de la encefalitis equma venezolana En una modalidad, la presente invención provee una partícula tipo virus Chikungunya o una partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipeptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana y por lo menos un antígeno, en donde dicho polipéptido estructural del virus Chikungunya o dicho polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana comprende por lo menos un primer sitio de unión y dicho antígeno (por lo menos uno) comprende por lo menos un segundo sitio de unión, y en donde dicho polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana y dicho antígeno (por lo menos uno) son enlazados a través de dicho primer sitio de unión (por lo menos uno) y dicho segundo sitio de unión (por lo menos uno).
En una modalidad, una distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno puede ser de 30 Á o menos; 25 Á o menos; 20 Á o menos; 15 Á o menos; 14 Á o menos; 13 Á o menos; 12 Á o menos; 11 Á o menos; 10 Á o menos; 9 Á o menos; u 8 Á o menos (por ejemplo, de 5 Á a 15 Á, de 5 Á a 12 Á, de 5 h a 11 Á, de 5 Á a 10 Á, de 5 Á a 8 Á, de 8 Á a 15 Á, de 8Á a 13 Á, de 8 Á a 12 Á, de 8 Á a 11 Á, de 9 Á a 12 Á, de 9 Á a 11 Á, de 9 Á a 10 Á o de 10 Á a 11 Á), cuando la distancia se determina en un cristal del antígeno o una proteína de ocurrencia natural que contiene al antígeno o proteína modificada del mismo.
En una modalidad, el antígeno es enlazado al polipeptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana por medio de entrelazamiento químico o como una proteína de fusión producida por medio de ingeniería genética.
Un polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana usado en la presente invención, puede comprender una proteína de la cubierta y/o una cápside del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana.
Ejemplos del virus Chikungunya incluyen, pero no están limitados a, las cepas de 37997 y LR2006 OPY-1.
Ejemplos del virus de la encefalitis equina venezolana incluyen, pero no están limitados a, TC-83.
El polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana usado en la presente invención, puede ser un polipéptido estructural viral de ocurrencia natural o polipéptido modificado del mismo. El polipéptido modificado puede ser un fragmento del polipéptido estructural viral de ocurrencia natural. En una modalidad, el polipéptido modificado tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con una cápside y/o proteína de la cubierta viral de ocurrencia natural. En una modalidad, el polipéptido modificado es un muíante en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos y/o añadidos con base en un cápside y/o proteína de la cubierta viral de ocurrencia natural. Por ejemplo, puede introducirse la mutación K64A o K64N en una cápside del polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana usado en la presente invención.
La proteína de la cubierta del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana puede comprender por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de E3, E2, 6K y E1.
Ejemplos del polipéptido estructural del virus Chikungunya incluyen, pero no están limitados a, E3-E2-6K-E1 de la cepa 37997 del virus Chikungunya, cápside-E3-E2-6K-E1 de la cepa 37997 del virus Chikungunya, E3-E2-6K-E1 de la cepa LR2006 OPY-1 del virus Chikungunya, y cápside-E3-E2-6K-E1 de la cepa LR2006 OPY-1 del virus Chikungunya.
Ejemplos del polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana incluyen, pero no están limitados a, E3-E2-6K-E1 de la cepa TC-83 del virus de la encefalitis equina venezolana, y cápside-E3-E2-6K-E1 de la cepa TC-83 del virus de la encefalitis equina venezolana.
Un ejemplo de secuencia del polipéptido estructural del virus Chikungunya se provee en el No. de acceso del Genbank ABX40006.1, que se describe a continuación (SEQ ID No.: 1): mefiptqtfynrryqprpwtprptíqvirprprpqrqagqlaglisavnklttnravpqq kprrnrknkkqkqkqqapqnntnqkkqppkkkpaqkkkkpgrrermcmkíendeifevk hegkvtgyaclvgdkvtnkpahvkgtidnadlaklafkrsskydlecaqipvhmksdask fthekpegyynwhhgavqysggrftiptgagkpgdsgrpifdnkgrwaivlgganega rtalsvvtwnkdivtkitpegaeewslaipvmcllanttfpcsqppctpccyekepeet irmlédnvmrpgyyqllqasltcsphrqrrstkdnfnvykatrpylafrcpdcgeghsch spvalerirneatdgtlkiqvslqigiktddshdwt 1ryradnhmpadaeragífvrts apctitgtmghfilarcpkgetltvgftdsrkishscthpfhhdppvigrekfhsrpqh gkelpcstyvqstaatteeievhmppdtpdrtlmsqqsgnvkitvngqtvrykencggs negl111dkvinnckvdqchaavtnhkkwqynsplvprnaelgdrkg ihipfplanvt crvpkarnptvtygknqvimllypdhptllsyrnmgeepnyqeewvmhkkévvltvpte g1evtwgnnepykywpq1stngtahghpheii1yyyely tmtvwvsvatfi11sinvg maagmccarrrcitpye1tpgatvpf11s1iceirtakaatyqeaaiylwneqqplfw lqaliplaalivlcnclrllpcccktlaflavmavgahtvsayehvfcvipntvgvpykt lvnrpgyspmvlemellsvtleptlslditccyktvipspyvkccgtaeckdknipdy sckvftgvypfmwggaycfcdaentqlseahveksescktefasayrahtasasaklrv lyqgnnitvtayangdhavtvkdakfivgpmssawtpfdhkiwykgdvynmdyppfga grpgqfgdiqsrtpeskdvyanfcqlvlqrpavgtvhvpysqapsgfkywlkergaslqh tapfgcqiatnpvravncavgnmpisidipeaaftrwdapsltdscevpacthssdf ggvaiikyaaskkgkcavhsmtnavtireaeievegnsqlqísfstalasaefrvqvcs tqvhcaaechppkdhivnypashttIgvqdisatamswvqkitggvglvvavaali1iv vlcvsfsrh Otro ejemplo de secuencia del polipéptido estructural del virus Chikungunya se provee en el No. de acceso del Genbank ABX40011.1, que se describe a continuación (SEQ ID No.: 2): mefiptqtfynrryqprpwaprptiqvirprprpqrqagqlaqlisavnkltmravpqq kprrnrknkkqrqkkqapqndpkqkkqppqkkpaqk kpgrrermcmkiendei£ev hegkvmgyaclvgdkvmkpahvkgtidnadlaklafkrsskydlecaqipvhmksdask fthekpegyynwhhgavqysggrftiptgagkpgdsgrpifdnkgrw aivlgganega rtalsw twnkdivtkitpegaee slalpvlcllanttfpcsqppctpccyekepest lrralednvmrpgyyqllkasltcsphrqrrstkdnfnvykatrpylahcpdcgeghsch spialerirneatdgtlkiqvslqigiktddshdwtklryrndshtpadaeragllvrts apctitgtmghfilarcpkgetltvgftdsrkishtcthpfhheppvigrerfhsrpqh gkelpcstyvqstaataeeievhmppdtpdrtlmtqgsgnvkitvngqtvrykencggs negltttdkvinnckidqchaavtnhknwqynsplvprnaelgdrkgkihipfplanvt crvpkarnptvtygknqvtmllypdhptllsyrn gqepnyheevthkkevtltvpte glevtwgrmepykywpqmstngtahghpheiilyyyelyptmtw ivsvasfvllsmvg tavgmevcarrrcitpyeltpgatvpfllsllccvrttkaatyyeaaaylwneqqplfw lqaliplaalivlcnclkllpcccktlaflavrnsigahtvsayehvtylpntvgvpykt. lvnrpgyspmvlemelqsvtleptlsldyitccyktvipspyvkccgtaeckdkslpdy sckvftgvypfmwggaycfcdaentqlseahveksescktefasayrahtasasaklrv lyqgnnitvaayangdhavtykdakfw gprassawtpfdnkiwykgdvynmdyppfga grpgqfgdiqsrtpeskdvyantqlvlqrpaagtvhvpysqapsgfkywlkergaslqh tapfgcqiatnpvravncavgnipisidipdaaftrw dapsvtdmscevpacthssdf ggvaiikytaskkgkcavhsnitnavtireadveveghsqlqisfstalasaefrvqvcs tqvhcaaachppkdhivnypashttlgvq is11amswvqkitggvglivavaali1iv vlcvsfsrh.
Un ejemplo del pollpéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana se provee en el No. de acceso del Genbank L01443.1 (http:bwww.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/L01443.1), que se describe a continuación (SEQ ID No.: 3): mfpfqpmypmqppyrnpfaaprrpwfprtdpflamqvqeltrsrnanltfkqrrdappe gpsaakpkkeasqkqkgggqgkkkknqgkkkaktgppnpkaqngnkkktnkkpgkrqrm vmklesdktfpimlegkingyacw ggklfrpmhvegkidndvlaalktkkaskydlcy advpqnmradtfkythekpqgyyswhhgavqyengrftvpkgvgakgdsgrpiXdnqgr waiv1ggvnegsrta1swnvnekgvtvkytpenceqwslvttmcllanvtfpcaqpp icydrkpaetlamlsvnvdnpgydelleaavkcpgrkrrsteelfneykltrpyrnarci rcavgschspiaieavksdghdgyvrlqtssqygldssgnlkgrtmrydmhgtikeipl hqvs1ytsrpehivdghgy£11arepagdsítmeEkkdsvrhscsvpyevkfnpvgrel ythppehgveqacqvyahdaqnrgayverahlpgsevdss1vslsgssvtvtppdgtsa1 vececggtkisetinktkqfsqctkkeqcray IqndkvynsdklpkaagafcIkgklh vpflladgkctvplapepmitfgfrsvslklhpknptylitrgladephythelisepa vrnftvtekgwefvwgnhppkrfwaqetapgnphglpheviChyyhrypmstilglsic aaiatvsvaastwlfcrsrvacltpyrltpnaripfclavlccartaraettesldhl wnnnqqmfwiqlliplaalivvtrllEcvccwpflvmagaagagayehattmpsqagi syntivnragyapIpisitptk1k1iptvn1eyvtchyktgmdspaikccgsqectpty rpdeqckvftgvypfmwggaycfcdtentqvskayvraksddcladhaeaykahtasvqa flnitvgehsivttvyvngetpvnfngvkitagplstawtpfdrkivqyageíynydfp eygagqpgafgdiqsrtvsssdlyantnlvlqrpkagaihvpytqapsgfeqwkkdkap slkftapfgceiytnpiraencavgsiplafdipdalftrvsetptlsaaectlnecvy ssdfggiatykysasksgkcavhvpsgtatlkeaavelteqgBatihfstanllipefrl qictsyvtckgdchppkdhlvthpqyhaqtftaavsktawtv/ltsllggsaviiiiglv 1ativamyv1tnqkhn.
En una modalidad, un primer sitio de unión comprende un grupo amino, de preferencia un grupo amino de un residuo de lisina. En una modalidad, el segundo sitio de unión comprende un grupo sulfhidrilo, de preferencia un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
En una modalidad, una conjugación de más de dos sustancias (por ejemplo, antígeno y polipeptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana) a través de un primer sitio de unión o un segundo sitio de unión, se logra usando un entrelazador químico. Ejemplos del entrelazador incluyen, pero no están limitados a, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA, y otros entrelazadores disponibles de Pierce Chemical Company.
De conformidad con la presente invención, puede proveerse una partícula tipo virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana y un antígeno, en donde dicho polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de lá encefalitis equina venezolana y dicho antígeno, son expresados como una proteína de fusión.
En una modalidad, el antígeno puede ser fusionado con cualquier sitio del polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana. Por ejemplo, el antígeno puede ser enlazado directamente o indirectamente al extremo N-terminal o extremo C-terminal del polipéptido estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana (por ejemplo cápside, E3, E2, 6K o E1), o el antígeno puede ser insertado en la proteína estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana (por ejemplo cápside, E3, E2, 6K o E1).
En una modalidad, por lo menos un antígeno es insertado en E2 de la proteína estructural del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana. Por ejemplo, con respecto a la proteína estructural del virus Chikungunya, por lo menos un antígeno es insertado entre los residuos 519 y 520 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre G en la posición 519 y Q en la posición 520 de SEQ ID Nos. 1 o 2); entre los residuos 530 y 531 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre G en la posición 530 y S en la posición 531 de SEQ ID Nos. 1 o 2); entre los residuos 531 y 532 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre S en la posición 531 y N en la posición 532 de SEQ ID Nos. 1 o 2); entre los residuos 529 y 530 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre G en la posición 529 y G en la posición 530 de SEQ ID Nos. 1 o 2); o entre los residuos 510 y 511 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre S en la posición 510 y G en la posición 511 de SEQ ID Nos. 1 o 2); o entre los residuos 511 y 512 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre G en la posición 511 y N en la posición 512 de SEQ ID Nos. 1 o 2); o entre los residuos 509 y 510 de SEQ ID Nos. 1 o 2 (es decir, entre Q en la posición 509 y S en la posición 510 de SEQ ID Nos. 1 o 2).
Por ejemplo, con respecto a la proteína estructural del virus de la encefalitis equina venezolana, por lo menos un antígeno es insertado entre los residuos 517 y 518 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre G en la posición 517 y S en la posición 518 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 518 y 519 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre S en la posición 518 y S en la posición 519 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 519 y 520 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre S en la posición 519 y V en la posición 520 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 515 y 516 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre L en la posición 515 y S en la posición 516 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 516 y 517 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre S en la posición 516 y G en la posición 517 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 536 y 537 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre C en la posición 536 y G en la posición 537 de SEQ ID No. 3); entre los residuos 537 y 538 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre G en la posición 537 y G en la posición 538 de SEQ ID No. 3); o entre los residuos 538 y 539 de SEQ ID No. 3 (es decir, entre G en la posición 538 y T en la posición 539 de SEQ ID No. 3).
La proteína de fusión puede ser expresada usando una teenica convencional en la téenica. Una variedad de sistemas de expresión puede usarse para la expresión de la proteína de fusión. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser expresada en células 293, células Sf9 o E. coli.
En una modalidad, el antígeno es una sustancia (por ejemplo, proteína) que no se deriva del virus Chikungunya o del virus de la encefalitis equina venezolana. El antígeno puede ser por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de auto-antígenos y antígenos de cáncer. Por ejemplo, el antígeno es un polipéptido derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4. De esta manera, ejemplos de combinaciones del polipéptido y el antígeno usados para la presente invención incluyen, pero no están limitados a, i) un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido derivado del FNT-a; ¡i) un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CFIIKV) y un polipéptido derivado de CD20; iii) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado del FNT-a; o iv) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CD20; v) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CTLA4.
Un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) o del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), puede ser un polipéptido viral de ocurrencia natural o polipéptido modificado del mismo. Además, un polipéptido derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4 puede ser un polipéptido de ocurrencia natural o polipéptido modificado del polipéptido de ocurrencia natural o un fragmento del polipéptido de ocurrencia natural o el péptido modificado. El polipéptido modificado puede ser un fragmento del polipéptido estructural viral de ocurrencia natural.
En una modalidad, el polipéptido modificado derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4 tiene por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido de ocurrencia natural. En una modalidad, el péptido modificado derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4 es un muíante, en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos y/o añadidos con base en un polipéptido de ocurrencia natural derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4.
Cuando un polipéptido derivado de un virus es conjugado con un polipéptido derivado de un antígeno, puede usarse un péptido enlazador que incluya SG, GS, SGG, GGS SGSG y TRGGS. Ejemplos de conjugación del polipéptido derivado de un virus (referido como “PFV” a continuación) con el polipéptido derivado del antígeno (referido como “PFA” a continuación) incluyen, pero no están limitados a: PFV-SG-PFA-GS-PFV;PFV-SG-PFA-GGS-PFV;PFV-SSG-PFA-GS-PFV;PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; y PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV.
En una modalidad, la presente invención provee una partícula tipo virus que comprende: i) una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido derivado del FNT-a, que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 4; ii) una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido derivado de CD20, que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 5; iii) una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado del FNT-a, que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 6; o iv) una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de 4 la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CD20, que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 7; v) una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CTLA4, que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No. 8.
En una modalidad, la presente invención provee una partícula tipo virus que comprende una proteína de fusión que es modificada a partir de la proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos. 4 a 8. La proteína de fusión modificada puede tener por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos. 4 a 8. Asimismo, la proteína de fusión modificada puede ser un muíante, en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos y/o añadidos con base en la proteína de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos.4 a 8. (2) Nucleótido, vector v celula huésped En el segundo aspecto, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una partícula como se provee en el primer aspecto de la presente invención.
En una modalidad, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana como se describió anteriormente.
Ejemplos de la secuencia de nucleótidos que codifica para la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana incluyen, pero no están limitados a, una secuencia de nucleótidos que codifica para E3-E2-6K-E1 de la cepa 37997 del virus Chikungunya, una secuencia de nucleótidos que codifica para cápside-E3-E2-6K-E1 de la cepa 37997 del virus Chikungunya, una secuencia de nucleótidos que codifica para E3-E2-6K-E1 de la cepa LR2006 OPY-1 del virus Chikungunya, una secuencia de nucleótidos que codifica para cáps¡de-E3-E2-6K-E1 de la cepa LR2006 OPY-1 del virus Chikungunya, una secuencia de nucleótidos que codifica para E3-E2-6K-E1 de la cepa TC-83 del virus de la encefalitis equina venezolana, y una secuencia de nucleótidos que codifica para cápside-E3-E2-6K-E1 de la cepa TC-83 del virus de la encefalitis equina venezolana.
Con respecto al virus Chikungunya, un ejemplo de secuencia de nucleótidos que codifica para E3-E2-6K-E1 se describe a continuación (SEQ ID No.: 9): Atgagccícgccctcccggtcttgtgcctgtíggcaaacactacattcccctgctctcagccgccttgcaenccc(gclgctacgaaaaggaadcgg aaagcaccítgcgca(gcUBaggacaacgtgatgagaccdggatactaccagciaclaaaagcatcgctgacttgctctccccaccgccaaagac gcaglactaaggacaattnaatgtctataaagccacaagaccatatctagclcattgtccigacigcggagaagggcaitcgtgccacagccctatc gcattggagcgcatcagaaaigaagcaacggacggaacgctgaaaaiccflggtc«ctttgcagolcgggataaagacagatgacagccacgaUg gaccaogctgcgclatatggntagccoiacgccagcggacgcggagcgogccggaUgcttgtaaggaclIcagcflCcgtgcíicgotcaccggg accalgggaeacuinitctcgcccgalgcccgaflaggagagacgetgQcagtgggatuacggacagcagaaagatcagccacacatgcacaca cccguccatcatgnnccacclgtgatoggtngggagaggttccactctcgaccacaacatggtaangeguaccugcagcacgtacgtgcagag caccgctgccaclgctgaggagatagagglgcatatgcccccagatactcctgaccgcacgctgatgecgcagcagielggcaacgtgaagatca 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Con respecto al virus Chikungunya, otro ejemplo de secuencia de nucleótidos que codifica para cápside-E3-E2-6K-E1 se describe a continuación (SEQ ID No.: 12): atggagttcatcccaacccaaactttttacaataggaggtaccagcctcgaccctggac tccgcgccctactatccaagtcatcaggcccagaccgcgccctcagaggcaagctgggc aacttgcccagctgatctcagcagttaataaactgacaatgcgcgcggtaccacaacag aagccacgcaggaatcggaagaataagaagcaaaagcaaaaacaácaggcgccacaaaa caacacaaatcaaaagaagcagccacctaaaaagaaaccggctcaaaagaaaaagaagc cgggccgcagagagaggatgtgcatgaaaatcgaaaatgattgtattttcgaagtcaag cacgaaggfcaaggtaacaggttacgcgtgcctggtgggggacaaagtaatgaaaccagc acacgtaaaggggaccatcgataacgcggacctggccaaactggcctttaagcggtcat ctaagtatgaccttgaatgcgcgcagatacccgtgcacatgaagtccgacgcttcgaag ttcacccatgagaaaccggaggggtactacaactggcaccacggagca:gtacagtactc aggaggccggttcaccatccctacaggtgctggcaaaccaggggacagcggcagaccga tcttcgacaacaagggacgcgtggtggccatagtcttaggaggagctaatgaaggagcc cgtacagccctctcggtggtgacctggaataaagacattgtcactaaaatcacccccga gggggccgaagagtggagtcttgccatccc:agttatgtgcctgttggcaaacaccacgt tcccctgctcccagcccccttgcacgccctgctgctacgaaaaggaaccggaggaaacc ctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatc cttaacatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctata aagccacaagaccatacttagctcactgtcccgactgtggagaagggcactcgtgccat agtcccgtagcactagaacgcatcagaaatgaagcgacagacgggacgctgaaaatcca ggtctccttgcaaatcggaataaagacggatgacagccacgattggaccaagctgcgtt atatggacaaccaeatgccagcagacgcagagagggcggggctatttgtaagaacatca gcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcatcctggcccgatgtccaaaagg ggaaactctgacggtgggatcactgacagtaggaagattagtcactcatgtacgcacc catttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcac ggtaaagagctaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgccgcaactaccgaggagat agaggtacacatgcccccagacacccctgatcgcacattaatgtcacaacagtccggca acgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctca aatgaaggactaacaactacagacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtca tgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataactcooctctggtcccgcgtaatg ctgaacttggggaccgaaaaggaaaaáttcaca cccgtttccgctggcaaatgtaaca tgcagggtgcctaaagcaaggaaccccaccgtgacgtacgggaaaaaccaagtcatcat gctactgtatcctgaccacccaacactcctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaa actatcaagaagagtgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtgccgactgaa gggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtafctggccgcagttatctac aaacggtacagcccatggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtacc ccactatgactgtagtagttgtgtcagtggccacgttcatactcctgtcgatggtgggt atggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgac accaggagctaccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaag cggccacataccaagaggctgcgatatacctgtggaacgagcagcaacctttgttttgg ctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtctgagactctt accatgctgctgtaaaacgttggcttttttagccgtaatgagcgtcggtgcccacactg tgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagact ctagtcaatagacctggctacagccccatggtattggagatggaactactgtcagtcac tttggagccaacactatcgcttgattacatcacgtgcgagtacaaaaccgtcatcccgt ctccgtacgtgaagtgctgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactac agctgtaaggtcttcaccggcgtctacccatttatgtggggcggcgcctactgcttctg cgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaa cagaatttgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtc ctttaccaaggaaataacatcactgtaactgcctatgcaaacggcgaccatgccgtcac agttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcttcagcctggacacctttcgaca acaaaattgtggtgtacaaaggtgacgtctataacatggactacccgccctttggcgca qqaaqaccaqqacaatttqqcqatatccaaaqtcacacacctqaqaqtaaaqacqtcta tgctaatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggtacggtacacgtgccatact ctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaacgcggggcgtcgctgcagcac acagcaccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgt agggaacatgcccatctccatcgacataccggaagcggccttcactagggtcgtcgacg cgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctcagacttt gsgsgcgtcgccattattaaatatgcagccagcaagaaaggcaagtgtgcggtgcattc gatgactaacgccgtcactattcgggaagctgagatagaagttgaagggaattctcagc tgcaaatctctttctcgacggccttagccagcgccgaattccgcgtacaagtctgttct acacaagtacactgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactaccc ggcgtcacataccaccctcggggtccaggacatctccgctacggcgatgtcatgggtgc agaagatcacgggaggtgtgggactggttgttgctgttgccgcactgattctaatcgtg gtgcttgcgtgtcgttcagcaggcactaa. .
En una modalidad, la presente invención provee un vector que comprende la molecula de ácido nucleico como se describió anteriormente, en donde el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a la molécula de ácido nucleico.
Ejemplos de una secuencia de control de la expresión incluyen, pero no están limitados a, promotor tal como el promotor CMV, promotor PL del fago lambda, los promotores lac, phoA y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40, y promotores de LTRs retrovirales.
Los vectores de expresión pueden ser preparados por el experto en la teenica con base en el documento WO/2012/006180, cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia. Ejemplos de vectores que pueden usarse para la expresión de una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido de antígeno, incluyen un vector mostrado en el vector VLP_CHI 512 (SEQ ID No.: 23) que contiene al polinucleótido CHIKV VLP (SEQ ID No. 28; que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 29); y el vector VLP_CHI 532 (SEQ ID No.: 24) que contiene al polinucleótido CHIKV VLP (SEQ ID No. 30; que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 31).
Los vectores de expresión pueden ser preparados por el experto en la técnica con base en el documento US2012/0003266, cuyo contenido entero se incorpora en la presente como referencia. Ejemplos de vectores que pueden usarse para la expresión de una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido de antígeno, incluyen un vector mostrado en el vector VLP_VEEV VLP 518 (SEQ ID No.: 25) que contiene al polinucleótido VEEV VLP (SEQ ID No. 32; que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 33); el vector VLP_VEEV VLP 519 (SEQ ID No. 26) que contiene al polinucleótido VEEV VLP (SEQ ID No. 34; que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 35); y el vector VLP_VEEV VLP 538 (SEQ ID No.: 27) que contiene al polinucleótido VEEV VLP (SEQ ID No. 36; que corresponde a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No.: 37).
En una modalidad, la presente invención provee: i) una molecula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido derivado de FNT-a, que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID No. 13; ii) una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido derivado de CD20, que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID No. 14; ¡ii) una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado del FNT-a, que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID No. 15; iv) una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CD20, que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID No. 16; o v) una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido derivado de CTLA4, que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID No. 17.
En una modalidad, la presente invención provee una molécula de ácido nucleico que es modificada de la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos. 13 a 17. La molécula de ácido nucleico modificada puede tener por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia de nucleótidos con la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos. 13 a 17. Asimismo, la molécula de ácido nucleico modificada puede ser mutante en donde cuando mucho 10% de los aminoácidos son deletados, sustituidos y/o añadidos con base en la molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos representada por cualquiera de SEQ ID Nos. 13 a 17. (3) Composición En el tercer aspecto, la presente invención provee una composición que comprende la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención.
En una modalidad, la presente invención provee una composición que comprende la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana como se describió anteriormente, o la molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente.
La composición puede comprender además un vehículo y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de adyuvante incluyen, pero no están limitados a, solución de Ribi (sistema adyuvante de Sigma, Sigma-Aldrich).
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener un ingrediente activo individual o una combinación de dos o más ingredientes activos, en tanto no sean contrarios a los objetivos de la presente invención. Por ejemplo, citocinas que incluyen quimiocinas, anticuerpos de citocinas tales como anticuerpo anti-FNT (por ejemplo, infliximab, adalimumab), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab y ranibizumab), antagonista del receptor de citocinas tal como anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, Trastuzumab), anticuerpo del receptor anti-EGF (por ejemplo, Cetuximab), aptámero anti-VEGF (por ejemplo, Pegaptanib) e immunomodulator tal como ciclosporina, tacrolimus o ubenimex, pueden usarse para la terapia de combinación.
En una combinación de ingredientes activos plurales, su contenido respectivo puede incrementarse o disminuirse convenientemente considerando sus efectos terapéuticos y su seguridad.
El término “combinación”, como se usa en la presente, significa dos o más ingredientes activos que se administran a un paciente simultáneamente en la forma de una entidad o dosificación individual, o ambos se administran a un paciente como entidades separadas ya sea simultáneamente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos, en donde dicha administración provee niveles terapéuticamente efectivos de los dos componentes en el cuerpo, de preferencia al mismo tiempo.
En una modalidad, la composición es una composición de vacuna que incluye una vacuna de ADN. En una modalidad, la vacuna de ADN provista por la presente invención comprende CpG que contiene oligonucleótido. (4) Metodo de producción de un anticuerpo, método de inmunomodulación, método de tratamiento de una enfermedad autommune, método de inducción v/o mejora de la respuesta inmune contra un antíqeno en un mamífero, método de tratamiento de cáncer, método de inmunización pasiva, método de presentación de un antíqeno en un macrófaqo, v método de producción de una partícula En el cuarto aspecto, la presente invención provee un método de producción de un anticuerpo, que comprende poner en contacto la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención, con un mamífero.
El anticuerpo producido en el cuarto aspecto de la presente invención puede ser humanizado usando una téenica convencional. De esta manera, en una modalidad, el método provisto en el cuarto aspecto de la invención comprende además un paso de humanización del anticuerpo producido por el mamífero no humano.
La partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención pueden administrarse directamente en el paciente, en el órgano afectado o sistemicamente, o pueden aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o una línea de células humanas que se administran posteriormente al paciente, o pueden usarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes tales como células B y células T derivadas del paciente, las cuales se vuelven administrar entonces al paciente.
De conformidad con la presente invención, la partícula tipo virus puede aplicarse para inmunoterapia.
En el quinto aspecto, la presente invención provee un método de inmunomodulación, un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune, un método de inducción y/o mejora de la respuesta inmune contra un antígeno en un mamífero, y un método de tratamiento de cáncer, que comprende administrar la composición provista en el tercer aspecto de la presente invención a un mamífero.
En el sexto aspecto, la presente invención provee un método de inmunización pasiva, que comprende administrar el anticuerpo provisto en el cuarto aspecto de la presente invención a un mamífero.
En el séptimo aspecto, la presente invención provee un método de presentación de un antígeno en un macrófago, que comprende poner en contacto la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención y/o la molécula de ácido nucleico provista en el segundo aspecto de la presente invención con un mamífero.
En el octavo aspecto, la presente invención provee un método para producir la partícula provista en el primer aspecto de la presente invención, que comprende preparar un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha partícula; cultivar una célula que es transfectada con dicho gen para expresar dicha partícula; y recuperar dicha partícula.
En una modalidad, la presente invención provee un método de producción de un anticuerpo, que comprende poner en contacto la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana como se describió anteriormente y/o la molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente con un mamífero. El anticuerpo producido puede ser un anticuerpo que puede unirse específicamente al antígeno comprendido en la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana o el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico. El método de producción de un anticuerpo provisto por la presente invención, puede ser un método útil para producir un anticuerpo monoclonal o policlonal contra un antígeno (por ejemplo, FNT-a, CD20 y CLTA4).
En una modalidad, el anticuerpo obtenido mediante el método de producción de un anticuerpo de conformidad con la presente invención, se usa para inmunización pasiva. El método de inmunización pasiva puede comprender administrar el anticuerpo obtenido a un mamífero.
De conformidad con la presente invención, la composición de la presente invención es útil para inmunomodulación. Especialmente, dicha inmunomodulación es para el tratamiento de enfermedad autoinmune, enfermedad neural, enfermedad inflamatoria tal como enfermedad pulmonar inflamatoria, que incluye el síndrome de sufrimiento respiratorio agudo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma, enfermedades asociadas con angiogenesis que incluyen neoplasma.
En una modalidad preferida, la inmunomodulación provista por la presente invención es para inducir y/o mejorar la respuesta inmune contra un antígeno en un mamífero. De esta manera, en una modalidad, la presente invención provee un método de inducción y/o mejora de la respuesta inmune contra un antígeno en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición como se describió anteriormente al mamífero. Ejemplos de mamífero incluyen, pero no están limitados a, un humano.
Puesto que muchos anticuerpos son útiles para el tratamiento de enfermedad, el método y la composición que son provistos por la presente invención pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, el anticuerpo que se une específicamente al objetivo como se enlista en el cuadro 1 o un anticuerpo que se une a un epítope en el objetivo como se enlista en el cuadro 1, es útil para el tratamiento de la enfermedad como se enlista en el cuadro 1.
En una modalidad, por lo menos un antígeno que se usa para la presente invención es por lo menos un objetivo como se enlista en el cuadro 1. Cuando por lo menos un antígeno que se usa para la presente invención es por lo menos un objetivo como se enlista en el cuadro 1, la partícula, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el método provistos por la presente invención, pueden ser útiles para tratamiento de la enfermedad o la condición como se enlista en el cuadro 1 (vease el “uso” en el cuadro 1).
Por ejemplo, cuando por lo menos un antígeno usado para la presente invención es uno o más antígenos de cáncer, la partícula, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el método provistos por la presente invención, pueden ser útiles para tratamiento de cáncer.
Ejemplos de antígeno de cáncer incluyen, pero no están limitados a, VEGF, receptor del factor de crecimiento epidérmico, CD33, CD20 y ErbB2. Cuando la composición de la presente invención que comprende dos o más antígenos de cáncer se administra a un mamífero, los anticuerpos dirigidos hacia los dos o más antígenos de cáncer pueden atacar al cáncer.
Por ejemplo, cuando por lo menos un antígeno usado para la presente invención es amiloide b, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el método provistos por la presente invención, pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.
Por ejemplo, cuando por lo menos un antígeno usado para la presente invención es FNT-alfa, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el método provistos por la presente invención, pueden ser útiles para el tratamiento de inflamación; enfermedad autoinmune que incluye artritis reumatoide; psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, etc.
Por ejemplo, cuando por lo menos un antígeno usado para la presente invención es CD20, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el método provistos por la presente invención, pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedad autoinmune que incluye artritis reumatoide y SLE; cáncer que incluye linfoma no de Hodgkin, etc.
Por ejemplo, cuando por lo menos un antígeno usado para la presente invención es CTLA4, el ácido nucleico aislado, el vector, la composición y el metodo provistos por la presente invención, pueden ser útiles para el tratamiento de cáncer que incluye melanoma; y útil para la activación de células T, etc.
Dado el síntoma de los pacientes infectados con el virus Chikungunya o el virus de la encefalitis equina venezolana junto con la gran molécula inusual del virus Chikungunya o el virus de la encefalitis equina venezolana, esta VLP puede actuar efectivamente y eficientemente para elegir como objetivo macrófagos y su composición tal como citocinas y compuestos inmunomoduladores.
En un aspecto, la presente invención provee un método de presentación de un antígeno en un macrófago, que comprende administrar la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana como se describió anteriormente y/o la molécula de ácido nucleico como se describió anteriormente, a un mamífero. La partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana provista por la presente invención, es buena para elegir como objetivo a macrófagos. En una modalidad, la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana provista por la presente invención, es un tipo de sistema de suministro del antígeno (por lo menos uno), el cual está comprendido en la partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana, a un macrófago.
En una modalidad, la presente invención provee un método para producir una partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana provista en el primer aspecto de la presente invención, que comprende preparar un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha partícula; cultivar una célula que es transfectada con dicho gen para expresar dicha partícula; y recuperar dicha partícula. En esta modalidad, la transfección puede llevarse a cabo usando un método convencional. Células útiles para la transfección pueden ser células 293. La recuperación de la VLP puede incluir colectar un medio acondicionado después de que las células son transfectadas con un plásmido que comprende un gen, y puede incluir además purificar la VLP del medio acondicionado usando ultracentrifugación. En una modalidad, puede incluirse otro paso en el método para producir una partícula tipo virus Chikungunya o virus de la encefalitis equina venezolana provista en el octavo aspecto de la presente invención, en donde un polinucleótido que codifica para un antígeno es diseñado, de modo que la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno es de 30 Á o menos (por ejemplo, de 5 Á a 15 Á, de 5 Á a 12 Á, de 5 Á a 11 Á, de 5 Á a 10 Á, de 5 Á a 8 Á, de 8 Á a 15 Á, de 8 Á a 13 Á, de 8 Á a 12 Á, de 8 Á a 11 Á, de 9 Á a 12 Á, de 9 Á a 11 Á, de 9 Á a 10 Á o de 10 Á a 11 Á), cuando la distancia se determina en un cristal del antígeno o una proteína de ocurrencia natural que contiene al antígeno o proteína modificada del mismo.
El sistema inmune se desarrolla para reconocer antígenos extraños para destruir patógenos tales como virus o bacterias. Se desarrolla también no para reconocer auto-proteínas para proteger auto-proteínas. Se denomina sistema de inmunotolerancia. Por lo tanto, es difícil inducir anticuerpos contra auto-antígenos mediante los métodos de inmunización tradicionales. Para superar la inmunotolerancia, los presentes inventores desarrollaron un método de vacuna novedoso que usa una subunidad de auto-ensamble que contiene un auto-antígeno. La subunidad de auto-ensamble se ensambla espontáneamente y forma una unidad organizada estable que presenta antígenos altamente repetitivos sobre la superficie. Los antígenos inmunógenos altamente repetitivos refuerzan las vías de señales en las células B, y dan como resultado la estimulación de respuestas de anticuerpos en comparación con el antígeno inmunógeno individual mediante métodos tales como los métodos de inmunización tradicionales. La aplicación de este mecanismo al desarrollo de vacunas no sólo incrementa las respuestas de los anticuerpos contra los inmunógenos objetivo, sino supera también la tolerancia de los auto-antígenos.
La presente invención se describirá en detalle con relación al siguiente ejemplo el cual, sin embargo, no se pretende que limite el alcance de la presente invención.
EJEMPLOS (1) Preparación de la partícula tipo virus Chikunqunva que comprende un polipeptido estructural viral v un fragmento de FNT-alfa humano Se esperó que un monómero de polipéptido de FNT-alfa fusionado con el polipéptido estructural del virus Chikungunya sea difícil de ser expresado establemente, debido a que el FNT-alfa se encuentra como un trímero bajo condiciones naturales. Sin embargo, el uso de una proteína de fusión en la cual el péptido monomérico de FNT-alfa (un fragmento del péptido monomérico de FNT-alfa) es fusionado con el polipéptido estructural del virus Chikungunya a través de enlazadores en el extremo N-terminal y el extremo C-terminal del polipéptido derivado del FNT-alfa para la unión del péptido derivado del FNT-alfa al polipéptido estructural del virus Chikungunya, dio como resultado la expresión estable de una partícula tipo virus Chikungunya que comprende un polipéptido estructural viral y el péptido derivado del monómero de FNT-alfa.
En detalle, el polinucleótido que codifica para el FNT-alfa humano original fue modificado para preparar un polinucleótido que codifica para el péptido derivado del FNT-alfa modificado, en donde RTPSD que es la secuencia N-terminal del péptido derivado del FNT-alfa original es reemplazada con SGG, y TRGGS se une al extremo C-terminal del FNT-alfa (véase SEQ ID Nos. 18 a 20 como se muestra en la figura 1). El polinucleótido resultante fue insertado entre los codones que codifican para G en la posición 519 y Q en la posición 520 de SEQ ID No. 2 para construir un plásmido (referido en lo sucesivo como CHIKV-FNTa4) para expresar la partícula tipo virus Chikungunya, en donde el peptido derivado del FNT-alfa modificado es insertado en E2 del polipéptido estructural del virus Chikungunya (C-E3-E2-6K-E1). Posteriormente, células 293F (1.5x106 células/ml) fueron transfectadas con 250 mg de CHIKV-FNTa4. Después de cultivo por 4 dias, se recogió el sobrenadante. El sobrenadante obtenido se extendió sobre Opti Prep (Sigma D1556) después de ser ultracentrifugado (20000 rpm, 120 min) usando el rotor SW28 para concentrar la VLP (es decir, la partícula tipo virus). La VLP concentrada se mezcló con Opti Prep para formar un gradiente de densidad seguido de ultracentrifugación (75000 rpm, 4 horas) usando el rotor NVT100. Después de la ultracentrifugación, la VLP purificada se recogió. La expresión de la VLP que comprende el FNT-alfa conjugado con el polipéptido estructural del virus Chikungunya se confirmó mediante Western Blot usando un anticuerpo específico para CHIVK (ATCC: VR-1241AF) y un anticuerpo específico para FNT-alfa (Cell Signal: #6945).
La distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del péptido derivado del FNT-alfa es de 8.27 Á cuando la distancia se determina en un cristal de FNT-alfa. (2) Preparación de una partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipeptido estructural viral v un péptido derivado de FNT-alfa humano (referida como “VLPs de VEEV-FNTa”) De conformidad con el inciso (1) descrito anteriormente, se preparó el polinucleótido que codifica para el péptido derivado del FNT-alfa modificado fusionado con el polinucleótido que codifica para el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana (véase SEQ ID No.15) para construir un vector de expresión, seguido de transfección en células 293F.
Se purificaron VLPs de VEEV-FNTa usando una centrífuga de gradiente de densidad. Como se observa en el campo 4, la expresión del VEEV y el péptido derivado del FNT-alfa se confirmó mediante Western blot usando un anticuerpo monoclonal de FNTa (panel superior) y anticuerpos policlonales del VEEV (panel inferior), respectivamente (véase la figura 2).
La distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del péptido derivado del FNT-alfa es de 8.27 Á cuando la distancia se determina en un cristal de FNT-alfa. (3) Detección del anticuerpo anti-FNT-alfa humano en ratones inmunizados Se dividió a ratones en tres grupos (n = 5 para cada grupo). La partícula tipo virus Chikungunya que comprende un polipéptido estructural viral y el polipéptido derivado del FNT-alfa humano preparado de acuerdo con el inciso (1) descrito anteriormente (referida como “CHIKV-FNT-alfa” siguiente), la partícula tipo virus Chikungunya que carece del polipéptido derivado del FNT-alfa humano (referida como “CFIIKV-VLP” siguiente), la partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipéptido estructural viral y el polipéptido derivado del FNT-alfa humano preparada de acuerdo con el inciso (2) descrito anteriormente (referida como “VEEV-FNT-alfa” siguiente), la partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que carece del polipéptido derivado del FNT-alfa humano (referida como “VEEV-VLP” siguiente) o vehículo (es decir, PBS), se administraron intramuscularmente a cada grupo de ratones. Se administró a los ratones al inicio del experimento (referido como “semana 0” siguiente) y tres semanas después de la primera administración (referida como “semana 3” siguiente), como se describe a continuación: grupo 1: VEEV-FNT-alfa (semana 0), CFIIKV-FNT-alfa (semana 3); grupo 2: VEEV-VLP (semana 0), CFIIKV-VLP (semana 3); y grupo 3: PBS (semana 0), PBS (semana 3). 6 semanas después del inicio del experimento, se obtuvo una muestra de sangre de cada ratón, y se preparó suero. Se detectó el anticuerpo anti-FNT-alfa humano producido usando ELISA, en donde la proteína del FNT-alfa fue recubierta en una placa de ELISA. Los resultados muestran que la partícula tipo virus que comprende un polipéptido estructural viral y el polipéptido derivado del FNT-alfa humano indujo anticuerpos anti-FNT-alfa humano en el ratón (véase la figura 9). (4) Preparación de una partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipeptido estructural viral v un fragmento de CD20 de humano De conformidad con los incisos (1) y (2) descritos anteriormente, se purificaron VLPs de VEEV-CD20 usando una centrífuga de gradiente de densidad, y se confirmó un fragmento de la expresión de CD20 y el VEEV mediante Western blot. IYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ (SEQ ID No.: 21), que es un fragmento de CD20, se usó como un antígeno fusionado con el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana.
La distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del fragmento CD20 es de 10.07 Á cuando la distancia se determina en un cristal de CD20. (5) Preparación de una partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipéptido estructural viral y un fragmento de CTLA4 de humano Se seleccionó un fragmento de CTLA4: CKVELMYPPPYYLGIG (SEQ ID No.: 22) con base en la secuencia de aminoácidos de CTLA4 de longitud completa, de modo que la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del fragmento, el cual es fusionado en el polipéptido estructural E2 del virus de la encefalitis equina venezolana sea de aproximadamente 5.6 Á, cuando la distancia se determina en un cristal de CLTA4.
Un polinucleótido que codifica para el fragmento de CTLA4 se introdujo en el vector VLP_VEEV VLP 518 para construir un plásmido para la expresión del fragmento de CTLA4 fusionado con el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 8. (6) Preparación de una partícula tipo virus de la encefalitis equina venezolana que comprende un polipéptido estructural viral y CTLA4 de longitud completa de humano Un polinucleótido que codifica para CTLA4 de longitud completa de humano se introdujo en el vector VLP_VEEV VLP 518 para construir un plásmido para la expresión de CTLA4 fusionado con el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana.
La distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal de CTLA4 de longitud completa de humano es de aproximadamente 39.6 Á, cuando la distancia se determina en un cristal de CLTA4.
La expresión de CTLA4 fusionado con el polipéptido estructural del virus de la encefalitis equina venezolana no pudo detectarse mediante ELISA después de la transfección de células 293 con el plásmido preparado. (7) Preparación de una partícula tipo virus Chikunqunva que comprende un polipeptido estructural viral v un fragmento de CD20 de humano o de ratón, v detección del anticuerpo anti-CD20 de humano o de ratón Partículas tipo virus Chikungunya que comprenden un polipéptido estructural viral y un fragmento de CD20 de humano o de ratón se prepararon usando el vector VLP CHI 532 y un fragmento de anticuerpo de FNT-alfa de humano o de ratón. El fragmento de anticuerpo de FNT-alfa de humano y de ratón se describe a continuación: CD20 de humano iyncepanpseknspstqycysiq (SEQ ID No.: 21); CD20 de ratón ydcepsnsseknspstqyensi (SEQ ID No.: 41).
Se usaron enlazadores (por ejemplo, SGG, SG, GS o GGS) para insertar el fragmento de CD20 como se describe a continuación entre G en la posición 519 y Q en la posición 520 de SEQ ID No. 2: CD20 de humano: SGGiyncepanpseknspstqycysiqGS (SEQ ID No.: 42) CD20 de ratón versión 2: SGydcepsnsseknspstqycnsiGGS (SEQ ID No.: 43) CD20 de ratón versión 3: SGGydcepsnsseknspstqycnsiGS (SEQ ID No.: 44).
Se usaron los plásmidos: VLP_CHI VLP 532 CD20H, VLP_CHI VLP 532 CD20-2 de ratón y VLP_CHI VLP 532 CD20-3 de ratón para la expresión de las partículas tipo virus Chikungunya que comprenden un polipéptido estructural viral y un fragmento de CD20 de humano o de ratón (SEQ ID No.: 45 (la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado se representa mediante SEQ ID No.: 46), SEQ ID No.: 47 (la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado se representa mediante SEQ ID No.: 48) y SEQ ID No.: 49 (la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado se representa mediante SEQ ID No.: 50).
Se purificaron partículas tipo virus de acuerdo con el método como se describe en el inciso (1). Se inmunizó una vez a los ratones con 100 pg de las VLPs purificadas; 100 mg del fragmento de CD20 de humano o de ratón; o PBS (control). Diez días después de la inmunización, se obtuvo una muestra de sangre de los ratones y se preparó suero. El anticuerpo anti-CD20 de humano inducido por la inmunización se detectó mediante ELISA recubierto con el fragmento de CD20 de humano, y el anticuerpo anti-CD20 de ratón inducido por la inmunización se detectó mediante ELISA recubierto con el fragmento de CD20 de ratón. Los resultados mostraron que los anticuerpos anti-CD20 de humano y los anticuerpos anti-CD20 de ratón fueron inducidos adecuadamente por la administración de la partícula tipo virus Chikungunya que comprende el fragmento de CD20 de humano de ratón fusionado con el polipéptido estructural viral. Asimismo, los resultados mostraron que el anticuerpo específico para un auto-antígeno puede ser inducido adecuadamente administrando la partícula tipo virus Chikungunya que comprende un fragmento del auto-antígeno fusionado con el polipéptido estructural viral (véase la figura 10 y la figura 11).

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una partícula que es capaz de ser auto-ensamblada, que comprende un polipéptido y por lo menos un antígeno, en donde dicho polipéptido comprende por lo menos un primer sitio de unión y dicho antígeno (por lo menos uno) comprende por lo menos un segundo sitio de unión, y en donde dicho polipéptido y dicho antígeno son enlazados través de dicho primer sitio de unión (por lo menos uno) y dicho segundo sitio de unión (por lo menos uno), y en donde la distancia espacial entre el residuo N-terminal y el residuo C-terminal del antígeno es de 30 Á o menos cuando la distancia se determina en un cristal del antígeno o una proteína de ocurrencia natural que contiene al antígeno o proteína modificada del mismo.
2.- La partícula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque dicha partícula es una partícula tipo virus.
3.- Una partícula que comprende un polipéptido estructural viral y por lo menos un antígeno, en donde dicho polipéptido estructural viral comprende por lo menos un primer sitio de unión y dicho antígeno (por lo menos uno) comprende por lo menos un segundo sitio de unión, y en donde dicho polipéptido estructural viral y dicho antígeno son enlazados a través de dicho primer sitio de unión (por lo menos uno) y dicho segundo sitio de unión (por lo menos uno), y en donde dicha partícula es una partícula tipo virus.
4.- La partícula de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha partícula tipo virus se deriva de alfavirus o flavivirus.
5.- La partícula de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho alfavirus o flavivirus se selecciona del grupo que consiste de virus Aura, virus Babanki, virus Barmah Forest (BFV), virus Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya (CF1IKV), virus de la encefalitis equina oriental (EEEV), virus Eilat, virus de los Everglades, virus del Fuerte Morgan, virus Getah, virus J de las tierras altas, virus Kyzylagach, virus Mayaro, virus Me Tri, virus Middelburg, virus Mosso das Pedras, virus Mucambo, virus Ndumu, virus O'nyong-nyong, virus Pixuna, virus del Río Negro, virus del Río Ross (RRV), virus de la enfermedad pancreática del salmón, virus Semliki Forest, virus de Sindbis, virus del elefante marino meridional, virus Tonate, virus Trocara, virus Una, virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), virus de la encefalitis equina occidental (WEEV), virus Whataroa, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la encefalitis llevada por ácaros y virus de la fiebre amarilla.
6.- La partícula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho alfavirus es el virus Chikungunya (CHIKV) o el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV).
7.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada además porque dicho polipeptido es un polipéptido estructural viral que comprende una proteína de la cubierta.
8.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada además porque dicho polipeptido es un polipéptido estructural viral que comprende la cápside y/o las proteínas de la cubierta E3, E2, 6K y E1.
9.- La partícula de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es insertado en la proteína de la cubierta E2.
10.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque dicho antígeno es por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de auto-antígenos y antígenos de cáncer.
11.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada además porque dicho antígeno es un polipéptido derivado de FNT-a, CD20 o CTLA4.
12.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada además porque dicho polipéptido es un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) o el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV).
13.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque dicho polipéptido y dicho antígeno (por lo menos uno) es i) un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido de FNT-a; ii) un polipéptido derivado del virus Chikungunya (CHIKV) y un polipéptido de CD20; iii) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipeptido de FNT-a; o iv) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido de CD20; v) un polipéptido derivado del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) y un polipéptido de CTLA4.
14.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque dicho antígeno (por lo menos uno) y dicho polipéptido son expresados como una proteína de fusión.
15.- La partícula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicho polipéptido y dicho antígeno (por lo menos uno) son fusionados directamente.
16.- La partícula de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es fusionado con dicho polipéptido, en donde uno o dos enlazadores se interponen entre el residuo N-terminal de dicho antígeno y dicho polipéptido y/o entre el residuo C-terminal de dicho antígeno y dicho polipéptido.
17.- La partícula de conformidad con las reivindicaciones 15 o 16, caracterizada además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es insertado entre los residuos 519 y 520 de SEQ ID Nos. 1 o 2, entre los residuos 530 y 531 de SEQ ID Nos. 1 o 2, entre los residuos 531 y 532 de SEQ ID Nos. 1 o 2 o entre los residuos 532 y 533 de SEQ ID Nos. 1 o 2.
18.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada además porque dicha proteína de fusión es una proteína que consiste de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7 u 8.
19.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizada además porque dicha proteína de fusión se deriva de una proteína que consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de 90% o más con una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7 u 8.
20.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es enlazado a dicho polipeptido por medio de entrelazamiento químico.
21.- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
22.- Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID Nos. 13, 14, 15, 16 o 17.
23.- Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de 90% o más con una secuencia de nucleótidos codificante representada por SEQ ID Nos. 13, 14, 15, 16 o 17.
24.- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23, en donde el vector comprende opcionalmente una secuencia de control de la expresión enlazada operablemente a la molécula de ácido nucleico.
25.- Una composición que comprende la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y/o la molecula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24.
26.- Una composición farmacéutica, que comprende: (a) la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y/o la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24; y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
27.- Una composición de vacuna que comprende la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
28.- Una composición de vacuna de ADN que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24.
29.- Un método de producción de un anticuerpo, que comprende poner en contacto la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y/o la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 con un mamífero.
30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
31.- Un método de inmunomodulación, que comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 a un mamífero.
32.- Un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune, que comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 a un mamífero.
33.- Un método de inducción y/o de mejora de la respuesta inmune contra un antígeno en un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 al mamífero.
34.- Un método de tratamiento de cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28 a un mamífero.
35.- Un método de inmunización pasiva, que comprende administrar el anticuerpo obtenido mediante el método de conformidad con la reivindicación 29 o la reivindicación 30 a un mamífero.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque es para el tratamiento de cáncer.
37.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es un antígeno de cáncer.
38.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado además porque dicho antígeno (por lo menos uno) es uno o más antígenos de cáncer.
39.- Un método de presentación de un antígeno en un macrófago, que comprende poner en contacto la partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y/o la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 con un mamífero.
40.- Un metodo para producir la partícula de conformidad con las reivindicaciones 14 a 19, que comprende preparar un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para dicha partícula; cultivar una célula que es transfectada con dicho gpn para expresar dicha partícula; y recuperar dicha partícula.
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