BR112015030229B1 - Partícula semelhante a vírus compreendendo um polipeptídeo e um antígeno da malária, vetor, composições farmacêutica e de vacina, bem como molécula de ácido nucleico isolado - Google Patents

Partícula semelhante a vírus compreendendo um polipeptídeo e um antígeno da malária, vetor, composições farmacêutica e de vacina, bem como molécula de ácido nucleico isolado Download PDF

Info

Publication number
BR112015030229B1
BR112015030229B1 BR112015030229-7A BR112015030229A BR112015030229B1 BR 112015030229 B1 BR112015030229 B1 BR 112015030229B1 BR 112015030229 A BR112015030229 A BR 112015030229A BR 112015030229 B1 BR112015030229 B1 BR 112015030229B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
virus
particle
antigen
polypeptide
seq
Prior art date
Application number
BR112015030229-7A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112015030229A8 (pt
BR112015030229A2 (pt
Inventor
Ryuji Ueno
Wataru Akahata
Original Assignee
VLP Therapeutics, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by VLP Therapeutics, Inc filed Critical VLP Therapeutics, Inc
Publication of BR112015030229A2 publication Critical patent/BR112015030229A2/pt
Publication of BR112015030229A8 publication Critical patent/BR112015030229A8/pt
Publication of BR112015030229B1 publication Critical patent/BR112015030229B1/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/68—Protozoa, e.g. flagella, amoebas, sporozoans, plasmodium or toxoplasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/193—Equine encephalomyelitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PARTÍCULA SEMELHANTE A VÍRUS COMPREENDENDO UM POLIPEPTÍDEO E UM ANTÍGENO DA MALÁRIA, VETOR, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICA E DE VACINA, BEM COMO MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO. A presente invenção refere-se a uma partícula que compreende um polipeptídeo e pelo menos um antígeno da malária, e uma composição ou vacina que compreende essa partícula, sua utilização em medicina, particularmente na prevenção ou tratamento de infecções por malária.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a uma partícula que compreende um polipeptídeo e pelo menos um antígeno da malária, bem como a uma composição ou vacina que compreende essa partícula e sua utilização em medicina, particularmente na prevenção ou tratamento da malária.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A malária é uma das doenças infecciosas graves mais prevalentes do mundo, com aproximadamente 250 milhões de casos e um milhão de mortes por ano (OMS, 2009). A mortalidade se dá principalmente em crianças menores de cinco anos de idade e em mulheres grávidas. A cada 45 segundos, uma criança africana morre de malária. A doença é transmitida de pessoa para pessoa por mosquitos infectados, de modo que esforços de erradicação passados envolveram campanhas maciças com inseticidas. Esses esforços foram bem sucedidos no Sudeste dos Estados Unidos, por exemplo, mas não nos países tropicais mais pobremente desenvolvidos. Os esforços atuais envolvem distribuição de mosquiteiros, particularmente mosquiteiros impregnados com inseticida, para evitar picadas de mosquitos à noite. No entanto, a resistência a inseticidas e medicamentos contra a malária, tanto para a prevenção quanto para o tratamento, está aumentando rapidamente. Assim, a necessidade de uma vacina contra a malária é imperativo para a proteção de milhões de pessoas contra a doença: (http://www.globalvaccines.org/content/malaria+vaccine+program/1961 4).
[003] Malária causada por Plasmodium falciparum continua a ser uma grande ameaça à saúde pública, especialmente entre crianças e mulheres grávidas na África. Uma vacina eficaz contra a malária seria uma ferramenta valiosa para reduzir a carga da doença e poderia contribuir para a eliminação da malária em algumas regiões do mundo. Atuais candidatos a vacina contra a malária são dirigidos contra estágios do ciclo de vida do parasita em humanos e nos mosquitos, mas, até agora, relativamente poucas proteínas foram estudadas para o desenvolvimento potencial de vacina.
[004] O candidato à vacina mais promissor, RTS, S, conferiu proteção parcial contra a malária em ensaios clínicos de Fase II e está atualmente sendo avaliado em um ensaio de fase III na África (The Journal of Clinical Investigation 120 (12) 4168-4178, 2010).
[005] O CSP é o antígeno de superfície predominante em esporozoítos. CSP é composto de uma região com término N que se liga a proteoglicanos de sulfato de heparina (RI), uma região central que contém uma repetição de quatro aminoácidos (NPNA) e uma região com término C ancorada em GPI que contém um domínio semelhante a tromboespondina (RII). A região do CSP incluída na vacina RTS, S inclui as últimas 16 repetições de NPNA e todo o término C de flanqueamento. Partículas de HBsAg servem como veículo-matriz para RTS, S, 25% das quais fundem-se com o segmento CSP (The Journal of Clinical Investigation 120 (12) 41684178, 2010).
[006] Em uma série de ensaios de fase II para RTS, S, 30%-50% dos adultos virgens à malária imunizados com RTS, S foram protegidos contra o desafio por mosquitos infectados com o clone homólogo de P. falciparum. Em ensaios de campo de fase II na Gâmbia e no Quênia, RTS, S conferiu proteção de curta duração contra a infecção por malária em aproximadamente 35% dos adultos, embora os resultados do ensaio no Quênia não tenham atingido significância estatística. Cerca de 30%-50% das crianças e lactentes imunizados com RTS, S em ensaios de fase II realizados em Moçambique, Tanzânia e Quênia foram protegidos contra malária clínica, no entanto, a proteção foi geralmente de curta duração (The Journal of Clinical Investigation 120 (12) 4168-4178, 2010). Os resultados de um decisivo ensaio em larga escala de Fase III, publicado em 9 de novembro de 2012, online no New England Journal of Medicine (NEJM), mostram que o candidato a vacina contra a malária RTS, S pode ajudar a proteger as crianças da África contra a malária. Quando comparadas com imunização com uma vacina de controle, crianças (com idade entre 6-12 semanas na primeira vacinação) vacinadas com RTS, S tiveram episódios um terço menor tanto de malária clínica quanto de malária grave e apresentaram reações similares à injeção.
[007] Atualmente não há vacinas licenciadas contra a malária. Vacina altamente eficaz contra a malária é fortemente desejada.
[008] Partículas similares a vírus (VLPs em inglês) são estruturas de multiproteínas que imitam a organização e conformação de vírus nativos autênticos, mas lhes falta o genoma viral, produzindo potencialmente candidatos à vacina seguros e mais baratos. Um punhado de vacinas baseadas em VLP profiláticas é atualmente comercializado em todo o mundo: Engerix® (vírus da hepatite B) e Cervarix® (papilomavírus humano) da GlaxoSmithKline e Recombivax HB® (vírus da hepatite B) e Gardasil® (papilomavírus humano) da Merck and Co., Inc. são alguns exemplos. Outros candidatos a vacina à base de VLP estão em ensaios clínicos ou passando por avaliação pré-clínica, tais como vírus da gripe, parvovírus, Norwalk e várias VLPs quiméricas. Muitos outros ainda estão restritos a investigação fundamental em pequena escala, apesar de seu sucesso em testes pré-clínicos. As implicações da produção de VLP em grande escala são discutidas no contexto de controle, monitorização e otimização de processo. Os principais desafios técnicos a montante e a jusante são identificados e discutidos consequentemente. Produtos bem sucedidos de vacinas baseadas em VLP são brevemente apresentados de modo concomitante com os mais recentes resultados de ensaios clínicos e os recentes desenvolvimentos na tecnologia baseada em VLP quimérica para a vacinação terapêutica ou profilática (Expert Rev. Vaccines 9 (10), 1149-1176, 2010).
[009] O vírus Chikungunya (CHIKV) tem infectado milhões de pessoas na África, Europa e Ásia desde que este alfavírus ressurgiu do Quênia em 2004. A gravidade da doença e a propagação desse vírus epidêmico constitui uma grave ameaça à saúde pública na ausência de vacinas ou terapias antivirais. Relata-se que uma vacina de VLP para o vírus Chikungunya epidemia protege primatas não humanos contra a infecção (Nat Med., março de 2010; 16 (3): 334338). A publicação de patente US N° 2012/0003266 descreve uma partícula semelhante a vírus (VLP) que compreende um ou mais polipeptídeos estruturais do vírus Chikungunya que é útil para a formulação de uma vacina ou composição antigênica para Chikungunya que induz imunidade contra uma infecção ou pelo menos um de seus sintomas. WO2012/106356 descreve partículas semelhantes a vírus (VLPs) de alfavírus ou flavivírus modificadas e métodos para aumentar a produção de VLPs modificadas para uso na prevenção ou tratamento de alfavírus e doenças mediadas por flavivírus (essas referências citadas são aqui incorporadas como referência).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] No primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma partícula que é capaz de se automontar, compreendendo um polipeptídeo e pelo menos um antígeno da malária, na qual o polipeptídeo compreende pelo menos um primeiro sítio de ligação e o pelo menos um antígeno da malária compreende pelo menos um segundo sítio de ligação, e na qual o polipeptídeo e o antígeno da malária estão ligados por meio do pelo menos um primeiro e do pelo menos um segundo sítio de ligação.
[0011] No segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que é concebida para expressão de uma partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção.
[0012] No terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição ou vacina que compreende a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[0013] No quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de um anticorpo, compreendendo contatar com um mamífero a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[0014] No quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método de imunomodulação, um método de tratamento da malária, um método para induzir e/ou intensificar a resposta imunológica contra um antígeno de malária em um mamífero, compreendendo administrar a um mamífero a composição fornecida no terceiro aspecto da presente invenção.
[0015] Em sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método de imunização passiva contra um patógeno causador da malária, compreendendo administrar a um mamífero o anticorpo fornecido no quarto aspecto da presente invenção.
[0016] Em sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um método de apresentação de um antígeno sobre macrófago, compreendendo contatar com um mamífero a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[0017] Em oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo preparar um vetor que é concebido para a expressão da partícula; cultivar uma célula que é transfectada com o vetor para expressar a partícula; e recuperar a partícula.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0018] A figura 1 mostra pVLP74_15 (VLP_CHI 532 NPNAx6) do vetor.
[0019] A Fig 2 mostra pVLP78_15 (VLP_CHI 532 NPNAx25) do vetor.
[0020] A Fig 3 mostra pVLP74_25 (VLP_VEEV 519 NPNAx6) do vetor.
[0021] A Figura 4 mostra que o soro de macacos individuais imunizados com VLPs contra a Malária após duas semanas induziram elevado título de anticorpos contra CSP.
[0022] A Figura 5 mostra o valor médio e o DP dos dados apresentados na Figura 4.
[0023] A Figura 6 mostra os efeitos de imunização combinada de CHIKV VLP e VEEV VLP na indução de anticorpos contra CSP. Na figura, Adj indica adjuvante.
[0024] A Figura 7 mostra os efeitos de VLP administrada não fundida com antígeno da malária na indução de anticorpos contra CSP. Na figura, 4w, 6w, 10w e 14w indicam quatro semanas após a imunização, seis semanas após a imunização, dez semanas após a imunização e quatorze semanas após a imunização, respectivamente.
[0025] A Figura 8 mostra os efeitos de VLP administrada não fundida com antígeno da malária na indução de anticorpos contra CSP. Na figura, 4w, 6w, 10w e 14w indicam quatro semanas após a imunização, seis semanas após a imunização, dez semanas após a imunização e quatorze semanas após a imunização, respectivamente.
[0026] A Figura 9 mostra os efeitos de VLP administrada não fundida com antígeno da malária juntamente com adjuvante na indução de anticorpos contra CSP. Na figura, 4w, 6w, 10w e 14w indicam quatro semanas após a imunização, seis semanas após a imunização, dez semanas após a imunização e quatorze semanas após a imunização, respectivamente.
[0027] A Figura 10 mostra cronograma do experimento.
[0028] A Figura 11 mostra a detecção de DNA 18S da malária por meio de PCR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO (1) Uma partícula que compreende um polipeptídeo e pelo menos um antígeno da malária
[0029] No primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma partícula que é capaz de ser automontada, compreendendo um polipeptídeo e pelo menos um antígeno da malária, na qual o polipeptídeo compreende pelo menos um primeiro sítio de ligação e o pelo menos um antígeno compreende pelo menos um segundo sítio de ligação, e na qual o polipeptídeo e o antígeno da malária estão ligados por meio do pelo menos um primeiro e do pelo menos um segundo sítio de ligação.
[0030] Como aqui usado, "uma partícula que é capaz de ser automontada" refere-se a uma partícula formada por pelo menos um constituinte que é montado de forma espontânea. O componente pode ser um composto químico ou polipeptídico ou não peptídico. Em uma modalidade de realização, "uma partícula que é capaz de ser automontada" pode ser uma partícula que compreende ou consiste de pelo menos um polipeptídeo. O pelo menos um polipeptídeo consiste de um ou mais tipos de peptídeos. Em uma modalidade de realização, a partícula tem um diâmetro de pelo menos 10 nm, por exemplo, pelo menos 20 nm, preferencialmente pelo menos 50 nm. Em uma modalidade de realização, o peso molecular da referida partícula é de 100 kDa a 100.000 kDa, preferencialmente de 400 kDa a 30.000 kDa.
[0031] Um polipeptídeo utilizado na presente invenção pode ser montado de forma espontânea. O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo estrutural do vírus. Assim, a partícula proporcionada pela presente invenção pode ser uma partícula similar a vírus.
[0032] Um polipeptídeo estrutural do vírus pode ser um polipeptídeo viral de ocorrência natural ou polipeptídeo modificado do vírus. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo estrutural viral de ocorrência natural que inclui capsídeo e proteína do envelope. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado é um mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados a um polipeptídeo estrutural viral de ocorrência natural que inclui capsídeo e proteína do envelope.
[0033] Em uma modalidade de realização, um polipeptídeo estrutural do vírus utilizado na presente invenção consiste de ou compreende capsídeo e/ou proteína do envelope ou um fragmento seu. Por exemplo, um polipeptídeo estrutural do vírus utilizado na presente invenção consiste de ou compreende capsídeo e E2 e E1. Um antígeno pode ser inserido em E2. Em uma modalidade de realização, uma partícula fornecida pelo primeiro aspecto da presente invenção pode ser formada pela montagem de 240 capsídeos, 240 proteínas E1 e 240 proteínas E2 na qual um antígeno da malária é inserido dentro de cada uma das proteínas E2.
[0034] Polipeptídeo estrutural do vírus usado na presente invenção pode ser derivado de Alfavírus ou Flavivírus. Assim, a partícula proporcionada pela presente invenção pode ser uma partícula semelhante a vírus derivada de Alfavírus ou de Flavivírus. Exemplos de Alfavírus e Flavivírus incluem, mas sem limitação aos mesmos, vírus Aura, vírus Babanki, vírus da Floresta de Barmah (BFV), vírus Bebaru, vírus Cabassou, vírus Chikungunya (CHIKV), vírus da encefalite equina do leste (EEEV), vírus Eilat, vírus Everglades, vírus de Fort Morgan, vírus Getah, vírus Highlands J, vírus Kyzylagach, vírus Mayaro, vírus Me Tri, vírus Middelburg, vírus Mosso das Pedras, vírus Mucambo, vírus Ndumu, vírus O'nyong-nyong, vírus Pixuna, vírus Rio Negro, vírus Rio Ross (RRV), vírus da doença do pâncreas do salmão, vírus da Floresta de Semliki, vírus Sindbis, vírus do elefante- marinho do sul, vírus Tonate, vírus Trocara, vírus Una, vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus da encefalite equina do ocidente (WEEV), vírus Whataroa, vírus do Nilo Ocidental, vírus da dengue, vírus da encefalite transmitida por carrapatos e vírus da febre amarela.
[0035] A malária é uma doença de que sofre humano ou outro animal (por exemplo, camundongo). Exemplos de malária incluem, mas não se limitando às mesmas, doenças causadas por espécies Plasmodium (P.), incluindo P. falciparum, P. malariae, P.ovale, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei, P.chabaudi e P. yoelii.
[0036] Como aqui usado, o termo "antígeno da malária" refere-se a qualquer antígeno ou fragmento deste. O termo antígeno ou um fragmento seu significa qualquer sequência baseada em peptídeo que pode ser reconhecida pelo sistema imunológico e/ou que estimula uma resposta imune mediada por células e/ou que estimula a produção de anticorpos.
[0037] De acordo com Scand. J. Immunol. 56, 327-343, 2002, considerando todo o ciclo de vida do parasita, existem essencialmente seis alvos para uma vacina contra a malária: (1) esporozoítos; (2) estágios no fígado; (3) merozoítos; (4) RBC infectado; (5) toxinas do parasita; (6) estágios sexuais.
[0038] A tabela resume os principais antígenos candidatos de cada estágio identificado Tabela 1. Principais candidatos à vacina das diferentes fases do ciclo de vida do Plasmodium
Figure img0001
Tabela 1. Principais candidatos à vacina das diferentes fases do ciclo de vida do Plasmodium
Figure img0002
(Scand. J. Immunol. 56, 327-343, 2002)
[0039] De acordo com a presente invenção, um ou mais antígenos listados acima podem ser utilizados, desde que sejam formados em uma partícula. Por exemplo, uma proteína de circum-esporozoito e um fragmento seu podem ser usados como antígeno. Exemplos de proteína de circum-esporozoito incluem, mas não se limitando à mesma, proteína de circum-esporozoito de Plasmodium falciparum que consiste da sequência de aminoácidos descrita abaixo (SEQ ID NO: 56): Mmrklailsvssflfvealfqeyqcygsssntrvlnelnydnagtnlynelemnyygkq enwyslkknsrslgenddgnnnngdngregkdedkrdgnnedneklrkpkhkklkqpgd gnpdpnanpnvdpnanpnvdpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpna npnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpn anpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpπanpnanpnanpnanpnanpnknnqgng qghnmpndphrnvdenanannavknnnneepsdkhieqylkkiknsistewspcsvtcg ngiqvrikpgsankpkdeldyendiekkickmekcssvfnwnssiglimvlsf If Int r.
[0040] Em uma modalidade de realização, antígeno da malária é um epítopo de células B em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium falciparum. Exemplo de epítopo de células B em proteína de circum- esporozoíto de Plasmodium falciparum pode ser uma sequência de repetição de NPNA que inclui (NPNA)4-30 (isto é, 4xNPNA, 5xNPNA, 6xNPNA, 7xNPNA, 8xNPNA, 9xNPNA, 10xNPNA, 11xNPNA, 12xNPNA, 13xNPNA 14xNPNA, 15xNPNA, 16xNPNA, 17xNPNA, 18xNPNA, 19xNPNA, 20xNPNA, 21xNPNA, 22xNPNA, 23xNPNA, 24xNPNA, 25xNPNA, 26xNPNA, 27xNPNA, 28xNPNA, 29xNPNA ou 30xNPNA).
[0041] Em uma modalidade de realização, antígeno da malária é um epítopo de células B em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium yoelii que inclui (QGPGAP)3-12.
[0042] Em uma modalidade de realização, o antígeno da malária é um epítopo de células B em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium vivax que inclui (ANGAGNQPG)1-12.
[0043] Em uma modalidade de realização, o antígeno da malária é um epítopo de células B em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium malariae que inclui (NAAG)4-30.
[0044] Em uma modalidade de realização, antígeno da malária é um epítopo de células T em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium falciparum. Exemplo de epítopo de células T em proteína de circum- esporozoíto de Plasmodium falciparum pode ser EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO: 44). (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)1-6 pode também ser usada como antígeno de malária.
[0045] Em uma modalidade de realização, antígeno da malária é um epítopo de células T em proteína de circum-esporozoíto de Plasmodium yoelii que é YNRNIVNRLLGDALNGPEEK (SEQ ID NO: 45). (YNRNIVNRLLGDALNGPEEK)1-6 pode também ser usado como antígeno de malária.
[0046] A presente invenção aborda um ou mais das necessidades acima proporcionando antígenos, vetores que codificam os antígenos e anticorpos (e moléculas semelhantes a anticorpos que incluem aptâmeros e peptídeos) que se ligam especificamente ao antígeno, juntamente com os usos dos mesmos (quer sozinho ou em combinação), na prevenção ou tratamento de infecções de malária. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas que são capazes de se ligar a um epítopo ou determinante antigênico. O termo pretende incluir anticorpos inteiros e fragmentos destes que se ligam antígenos, incluindo anticorpos de cadeia simples. Tais anticorpos incluem fragmentos de anticorpos que se ligam a antígenos humanos e incluem, mas sem limitação aos mesmos, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs (sdFv) ligado por dissulfureto e fragmentos que compreendem um domínio VL ou um domínio VH. Os anticorpos podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De um modo preferido, os anticorpos são originários de mamíferos, por exemplo, humanos, murinos, de coelho, cabra, cobaia, camelo, cavalo e semelhantes, ou outros animais adequados, por exemplo, frango. Como aqui empregados, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, na Patente US N° 5.939.598, cuja descrição é aqui incorporada na íntegra como referência.
[0047] O antígeno utilizado na presente invenção pode ser polipeptídeo modificado derivado de uma proteína que ocorre naturalmente. O polipeptídeo modificado pode ser um fragmento da proteína que ocorre naturalmente. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo derivado de uma proteína que ocorre naturalmente. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado derivado é um mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados com base em um polipeptídeo derivado de proteína que ocorre naturalmente.
[0048] Na partícula, tal como proporcionada pela presente invenção, um polipeptídeo e um antígeno podem ser ligados por pelo menos um primeiro sítio de ligação que está presente no polipeptídeo e pelo menos um segundo sítio de ligação que está presente no antígeno.
[0049] Como aqui utilizado, cada um de "um primeiro sítio de ligação" e "um segundo sítio de ligação" refere-se a um sítio em que mais de uma substância está ligada uma à outra.
[0050] Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo e o antígeno são diretamente fundidos. Alternativamente, um ou dois ligantes podem intervir entre o resíduo com término N do antígeno e o polipeptídeo e/ou entre o resíduo com término C do antígeno e o polipeptídeo.
[0051] O antígeno ou o polipeptídeo podem ser truncados e substituídos por ligantes curtos. Em algumas modalidades de realização, o antígeno ou o polipeptídeo incluem um ou mais ligantes peptídicos. Tipicamente, um ligante consiste de 2 a 25 aminoácidos. Usualmente, ele tem de 2 a 15 aminoácidos de comprimento, embora em certas circunstâncias possa ser apenas um, tal como um único resíduo de glicina.
[0052] Em uma modalidade de realização, uma molécula de ácido nucleico, em que polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo é fundido geneticamente com polinucleotídeo que codifica o antígeno, é expressa em uma célula hospedeira de modo a que o primeiro sítio de ligação e o segundo sítio de ligação sejam ligados por meio de uma ligação peptídica. Nesse caso, o polipeptídeo e o antígeno são ligados por uma ligação peptídica. Em relação a essa modalidade de realização, o primeiro sítio de ligação e/ou o segundo sítio de ligação podem ser geneticamente modificados a partir do polipeptídeo ou antígeno original. Por exemplo, o primeiro sítio de ligação é modificado a partir do polipeptídeo de modo que por meio de um peptídeo ligante que inclui SG, GS, SGG, GGS e SGSG o polipeptídeo seja conjugado com o antígeno.
[0053] Quando o polipeptídeo é quimicamente conjugado com o antígeno, o primeiro sítio de ligação e o segundo sítio de ligação podem ser ligados por meio de um agente de reticulação químico que é um composto químico.
[0054] Exemplos do agente de reticulação incluem, mas sem limitação aos mesmos, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros agentes de reticulação disponíveis a partir da Pierce Chemical Company.
[0055] Em uma modalidade de realização, a partícula fornecida pela presente invenção compreende um polipeptídeo ligado a um antígeno, em que a distância espacial entre o resíduo com término N e o resíduo com término C do antígeno é de 30Â ou menos, quando a distância é determinada em um cristal do antígeno ou uma proteína que ocorre naturalmente contendo o antígeno ou proteína modificada deste.
[0056] O antígeno utilizado na presente invenção pode ser concebido por um perito versado no estado da técnica. Por exemplo, o antígeno usado na presente invenção pode ser uma proteína que ocorre naturalmente ou um fragmento desta. Alternativamente, o antígeno utilizado na presente invenção pode ser uma proteína modificada a partir de uma proteína que ocorre naturalmente ou um fragmento desta. Aquele versado no estado da técnica pode projetar o antígeno de modo que a distância espacial entre o resíduo com término N e o resíduo com término C do antígeno é de 30Â ou menos, quando a distância é determinada em um cristal do antígeno ou uma proteína que ocorre naturalmente contendo o antígeno ou proteína modificada deste. Por exemplo, o antígeno usado na partícula proporcionada pela presente invenção pode ser concebido usando um software livre incluindo PyMOL (por exemplo, PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org). Em uma modalidade de realização, a distância espacial entre o resíduo com término N e o resíduo com término C do antígeno é de 30Â (angstrom) ou menos, 20Â ou menos ou 10Â ou menos (por exemplo, de 5Â a 15Â, de 5Â a 12Â, de 5Â a 11Â, de 5Â a 10Â, de 5Â a 8Â, de 8Â a 15Â, de 8Â a 13Â, de 8Â a 12Â, de 8Â a 11Â, de 9Â a 12Â, de 9Â a 11Â, de 9Â a 10Â ou de 10Â a 11Â).
Partícula similar a vírus Chikungunya ou uma partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana
[0057] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma partícula semelhante a vírus Chikungunya ou uma partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana que compreendem um polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou do vírus da encefalite equina venezuelana e pelo menos um antígeno da malária, em que o polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou o polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana compreende pelo menos um primeiro sítio de ligação e o pelo menos um antígeno da malária compreende pelo menos um segundo sítio de ligação, e em que o polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou o polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana e o pelo menos um antígeno são ligados por meio do pelo menos um primeiro e do pelo menos um segundo sítio de ligação.
[0058] Em uma modalidade de realização, a distância espacial entre o resíduo com término N e o resíduo com término C do antígeno da malária pode ser de 30Â ou menos; 25Â ou menos; 20Â ou menos; 15Â ou menos; 14Â ou menos; 13Â ou menos; 12Â ou menos; 11Â ou menos; 10Â ou menos; 9Â ou menos; ou 8Â ou menos (por exemplo, de 5Â a 15Â, de 5Â a 12Â, de 5Â a 11Â, de 5Â a 10Â, de 5Â a 8Â, de 8Â a 15Â, de 8Â a 13Â, de 8Â a 12Â, de 8Â a 11Â, de 9Â a 12Â, de 9Â a 11Â, de 9Â a 10Â ou de 10Â a 11Â), quando a distância é determinada em um cristal do antígeno da malária ou uma proteína que ocorre naturalmente contendo o antígeno da malária ou proteína modificada deste.
[0059] Em uma modalidade de realização, o antígeno da malária liga se ao polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou ao polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana por meio de reticulação química ou como proteína de fusão produzida por meio de engenharia genética.
[0060] Um polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou do vírus da encefalite equina venezuelana utilizado na presente invenção pode compreender uma proteína do envelope do vírus Chikungunya ou do vírus da encefalite equina venezuelana e/ou um capsídeo.
[0061] Exemplos de vírus Chikungunya incluem, mas sem limitação às mesmas, as cepas 37997 e LR2006 OPY-1.
[0062] Exemplos de vírus da encefalite equina venezuelana incluem, mas sem limitação à mesma, TC-83.
[0063] Polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana usado na presente invenção pode ser polipeptídeo estrutural de vírus que ocorre naturalmente ou polipeptídeo modificado do vírus. O polipeptídeo modificado pode ser um fragmento do polipeptídeo estrutural do vírus que ocorre naturalmente. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com um capsídeo e/ou proteína do envelope viral de ocorrência natural. Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado é um mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados com base em um capsídeo e/ou proteína do envelope viral de ocorrência natural. Por exemplo, mutação K64A ou K64N pode ser introduzida em um capsídeo de polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana utilizado na presente invenção.
[0064] Polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana podem consistir ou compreender um capsídeo, E2 e E1.
[0065] Exemplos de polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya incluem, mas sem limitação aos mesmos, Capsídeo E2-E1 da Cepa 37997 do vírus Chikungunya e Capsídeo E2-E1 do vírus LR2006 OPY-1 de Chikungunya.
[0066] Exemplos do polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana incluem, mas sem limitação ao mesmo, Capsídeo E2- E1 da Cepa TC-83 do vírus da encefalite equina venezuelana.
[0067] Uma sequência de polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya exemplar é proporcionada sob N° de Acesso Genbank ABX40006.1, a qual é descrita a seguir (SEQ ID NO: 1): mef iptqtfynrryqprpwtprptiqvirprprpqrqagqlaqlisavnkltmravpqq kprrnrknkkqkqkqqapqnntnqkkqppkkkpaqkkkkpgrrermcmkiendcifevk hegkvtgyaclvgdkvmkpahvkgtidnadlaklafkrsskydlecaqipvhmksdask f thekpegyynwhhgavqysggrf tiptgagkpgdsgrpif dnkgrwaivlgganega rtalswtwnkdivtkitpegaeewslaipvmcllanttfpcsqppctpccyekepeet lrmlednvπirpgyyqllqasltcsph.rqrrstkdnf nvykatrpylahcpdcgeghsch spvalerirneatdgtlkiqvslqigiktddshdwtklrymdnh.mpadaeraglfvrts apctitgtmghfilarcpkgetltvgftdsrkishscthpfhhdppvigrekfhsrpqh gkelpcstyvqstaatteeievhmppdtpdrtlmsqqsgnvkitvngqtvrykcncggs negltttdkvinnckvdqchaavtnh.kkwqynsplvprnaelgdrkgkihipfplanvt crvpkarnptvtygknqv.iml lypdhptllsyrnmgeepnyqeewvmhkkewltvpte glevtwgnnepykywpqlstngtahghphe i i lyyyelyptmt wwsvat f i 1 Ismvg maagmcmcarrrcitpyeltpgatvpf1Isliccirtakaatyqeaaiylwneqqplfw Iqaliplaalivlcnclrllpcccktlaflavmsvgahtvsayehvtvipntvgvpykt Ivnrpgyspmvlemellsvtleptlsldyitceyktvipspyvkccgtaeckdknlpdy sckvftgvypfmwggaycfcdaentqlseahveksescktefasayrahtasasaklrv lyqgnnitvtayangdhavtvkdakf ivgpmssawtpf dnkiwykgdvyrundyppf ga grpgqfgdiqsrtpeskdvyantqlvlqrpavgtvhvpysqapsgfkywlkergaslqh tapfgcqiatnpvravncavgnmpisidipeaaftrwdapsltdmscevpacthssdf ggvaiikyaaskkgkcavhsmtnavtireaeievegnsqlqisfstalasaefrvqvcs tqvhcaaechppkdhivnypashttlgvqdisatamswvqkitggvglwavaaliliv vlcvsfsrh
[0068] Outra sequência de polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya exemplar é proporcionada sob N° de Acesso Genbank ABX40011.1, a qual é descrita a seguir (SEQ ID NO: 2): mefiptqtfynrryqprpwapiptiqvirpi’prpqrqagqlaqlisavnkltnu’avpqq kprrm-knkkqrqkkqapqndpkqkkqppqkkpaqkkkkpgrrermcmkiendc ifevkhegkvmgyaclvgdkvmkpahvkgtidn.adlaklafkrsskydlecaqipvh mksdaskfthekpegjynwhhgavqysggi’ftiptgagkpgdsgrpifdnkgrwai vlgganegartalsvvtwnkdivtkitpegaeewslalpvlcllanttfpcsqppctpccye kepestlrmlednvnirpgyyqllkasltcsphrqrrstkdnfnvykatrpylahcpdcg eghschspialerirneatdgtlkiqvslqigiktddshdwtklryiiidshtpadaeragll vrtsapctitgtmghfilai’cpkgetltvgftdsrkishtcthpfhheppvigrerfhsrpq hgkelpcstyvqstaataeeievhmppdtpdi’tlmtqqsgnvkitvngqtvrykcncg gsnegltttdkvinnckidqchaavtnhknwqynsplvprnaelgdrkgkihipfplan vtcrvpkarnptvtygknqvtmllypdhptllsyrnmgqepnyheewvthkkexdltv pteglevtwgnnepykywpqnistngtahghpheiilyyyelyptmtwivsvasfvlls mvgtavgmcvcarrrcitpyeltpgatvpfllsllccvrttkaatyyeaaaylwneqqplf wlqaliplaalivlcnclkllpcccktlaflavmsigahtvsayehx’tvipntvgvpyktlvn rpgyspmvlemelqsvtleptlsldyitceyktvipspyvkccgtaeckdkslpdysckvf tgvypfmwggaycfcdaentqlseahveksescktefasayrahtasasaklrvlyqgn nitvaayangdhavtvkdakfvvgpinssawtpfdnkivvykgdvynrndyppfgagr pgqfgdiqs rtpe skd vy ant ql vl qrpa agtvhvpy s q apsgfkywlkergaslqhta pfgcqiatnpvravncavgnipisidipdaaftrvvdapsvtdmscevpacthssdfggv aiikytaskkgkcavhsmtnavtireadvevegnsqlqisfstalasaefrvqvcstqvhc aaachppkdhivnypashttlgvqdisttaniswvqkitggvglivavaalilivvlCT'sfs i’h
[0069] Um polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana exemplar é descrito a seguir (SEQ ID NO: 3): mfpfqpTnypmqpmpyrnpfaaprrpwfprtdpf lamqvqeltrsmanltfkqrrdappe gpsaakpkkeasqkqkgggqgkkkknqgkkkaktgppnpkaqngnkkktnkkpgkrqrm vmklesdkt fpimlegkingyacwggklf rpmhvegkidndvlaalktkkaskydley advpqnmradtfkythekpqgyyswhhgavqyengrftvpkgvgakgdsgrpildnqgr wai vlggvnegs r tai swmwnekgvt vky tpenceqws 1 vt tmc 11 anvt f pcaqpp icydrkpaetlamlsvnvdnpgydelleaavkcpgrkrrsteelfneykltrpymarci rcavgschspiaieavksdghdgyvrlqtssqygldssgnlkgrtmrydmhgtikeipl hqvslytsrpchivdghgyfllarcpagdsitmefkkdsvrhscsvpyevkfnpvgrel ythppehgveqacqvyahdaqnrgayvemhlpgsevdsslvslsgssvtvtppdgtsal vececggtkisetinktkqfsqctkkeqcrayrlqndkwvynsdklpkaagatlkgklh vpflladgkctvplapepmitfgfrsvslklhpknptylitrqladephythelisepa vrnf tvt ekgwe fvwgnhppkr fwaqetapgnphglphevi thyyhrypms tilglsic aaiatvsvaastwlfcrsrvacltpyrltpnaripfclavlccartaraettwesldhl wnnnqqmfwiqlliplaaliwtrllrcvccwpf Ivmagaagagayehattmpsqagi syntivnragyaplpisitptkikliptvnleyvtchyktgmdspaikccgsqectpty rpdeqckvftgvypfmwggaycfcdtentqvskayvmksddcladhaeaykahtasvqa fInitvgehsivttvyvngetpvnfngvkitagplstawtpfdrkivqyageiynydfp eygagqpgafgdiqsrtvsssdlyantnlvlqrpkagaihvpytqapsgfeqwkkdkap slkftapfgeeiytnpiraencavgsiplafdipda1ftrvsetptlsaaectlnecvy ssdfggiatvkysasksgkcavhvpsgtatlkeaavelteqgsatihfstanihpefrl qictsyvtckgdchppkdhivthpqyhaqtftaavsktawtwltsllggsaviiiiglv lativamyvltnqkhn.
[0070] Em uma modalidade de realização, um primeiro sítio de ligação compreende um grupo amino, preferencialmente um grupo amino de um resíduo de lisina. Em uma modalidade de realização, o segundo sítio de ligação compreende grupo sulfidrila, de preferência, um grupo sulfidrila de uma cisteína.
[0071] Em uma modalidade de realização, a conjugação de mais de duas substâncias (por exemplo, antígeno e polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana) por meio de um primeiro sítio de ligação ou um segundo sítio de ligação é obtida usando reticulação química. Exemplos do agente de reticulação incluem, mas sem limitação aos mesmos, SMPH, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros agentes de reticulação disponíveis a partir da Pierce Chemical Company.
[0072] De acordo com a presente invenção, pode ser proporcionada uma partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana a qual compreende um polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana e um antígeno, em que o polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou do vírus da encefalite equina venezuelana e o antígeno são expressos como proteína de fusão.
[0073] Em uma modalidade de realização, o antígeno pode ser fundido com qualquer sítio do polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou do polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana. Por exemplo, o antígeno pode ser direta ou indiretamente ligado a término N ou término C do polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya ou do polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana, ou o antígeno pode ser inserido na proteína estrutural do vírus Chikungunya ou proteína estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana.
[0074] Em uma modalidade de realização, pelo menos um antígeno é inserido em E2 de proteína estrutural do vírus Chikungunya ou proteína estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana. Por exemplo, em relação a proteínas estruturais do vírus Chikungunya, pelo menos um antígeno é inserido entre os resíduos 519 e 520 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre G na posição 519 e Q na posição 520 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); entre os resíduos 530 e 531 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre G na posição 530 e S na posição 531 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); entre os resíduos 531 e 532 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre S na posição 531 e N na posição 532 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); entre os resíduos 529 e 530 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre G na posição 529 e G na posição 530 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); ou entre os resíduos 510 e 511 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre S na posição 510 e G na posição 511 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); ou entre os resíduos 511 e 512 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre G na posição 511 e N na posição 512 de SEQ ID NOs: 1 ou 2); ou entre os resíduos 509 e 510 de SEQ ID NOs: 1 ou 2 (ou seja, entre Q na posição 509 e S na posição 510 de SEQ ID NOs: 1 ou 2).
[0075] Por exemplo, em relação à proteína estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana, pelo menos um antígeno é inserido entre os resíduos 517 e 518 de SEQ ID NO: 3 (isto é, entre G na posição 517 e S na posição 518 de SEQ ID NO: 3); entre os resíduos 518 e 519 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre S na posição 518 e S na posição 519 de SEQ ID NO: 3); entre os resíduos 519 e 520 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre S na posição 519 e V na posição 520 de SEQ ID NO.3); entre os resíduos 515 e 516 de SEQ ID NO: 3 (isto é, entre L na posição 515 e S na posição 516 de SEQ ID NO: 3); entre os resíduos 516 e 517 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre na posição 516 e G na posição 517 de SEQ ID NO: 3); entre os resíduos 536 e 537 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre na posição 536 e G na posição 537 de SEQ-ID No. 3); entre os resíduos 537 e 538 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre G na posição 537 e G na posição 538 de SEQ-ID No. 3); entre os resíduos 538 e 539 de SEQ ID NO: 3 (ou seja, entre G na posição 538 e T na posição 539 de SEQ ID NO: 3).
[0076] A proteína de fusão pode ser expressa utilizando uma técnica convencional no estado da técnica. Uma variedade de sistemas de expressão pode ser usada para a expressão da proteína de fusão. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser expressa em células 293, células Sf9 ou E. coli.
[0077] Um polipeptídeo derivado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) pode ser um polipeptídeo viral de ocorrência natural ou polipeptídeo modificado desse polipeptídeo. Além disso, um polipeptídeo derivado de antígeno da malária pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou polipeptídeo modificado do polipeptídeo que ocorre naturalmente ou um fragmento do polipeptídeo de ocorrência natural ou o peptídeo modificado. O polipeptídeo modificado pode ser um fragmento do polipeptídeo estrutural do vírus que ocorre naturalmente.
[0078] Em uma modalidade de realização, o polipeptídeo modificado derivado de antígeno da malária tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipeptídeo que ocorre naturalmente. Em uma modalidade de realização, o peptídeo modificado derivado de antígeno da malária é mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados com base em um polipeptídeo de ocorrência natural derivado de antígeno da malária.
[0079] Quando um polipeptídeo derivado de um vírus é conjugado com um polipeptídeo derivado de um antígeno, pode ser usado um peptídeo de ligação que inclui SG, GS, SGG, GGS SGSG e TRGGS. Exemplos de conjugação do polipeptídeo derivado de um vírus (referido como "PFV" abaixo) com o polipeptídeo derivado do antígeno (referido como "PFA" abaixo) incluem, mas sem limitação aos mesmos: PFV-PFA-SG-GS PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV- SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV; PFV-PFA-SGSG-GS- PFV; e PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV.
[0080] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma partícula semelhante a vírus que compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo derivado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e um polipeptídeo derivado do antígeno da malária, em que a partícula semelhante a vírus é preparada por transfecção de um vetor de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico que corresponde à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 39, 41 ou 43 para uma célula de mamífero (por exemplo, célula 293F). Relativamente a essa modalidade de realização, proteína de fusão modificada pode também ser empregada para uma partícula semelhante a vírus proporcionada pela presente invenção, a qual pode ser preparada por transfecção de um vetor de expressão que compreende uma molécula de ácido nucleico que corresponde à sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO: 28, 31, 34, 37, 39, 41 ou 43 em uma célula de mamífero (por exemplo, célula 293F).
[0081] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma partícula semelhante a vírus que compreende ou consiste em:
[0082] um ou mais capsídeos do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV);
[0083] um ou mais E1 do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV); e
[0084] um ou mais E2 do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), em que antígeno da malária é inserido em E2 do vírus Chikungunya (CHIKV) ou vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV). Por exemplo, a presente invenção proporciona uma partícula semelhante a vírus que compreende ou consiste em:
[0085] 240 capsídeos do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV);
[0086] 240 E1s do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV); e
[0087] 240 E2s do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), em que antígeno da malária é inserido em cada um dos E2s do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV).
[0088] Nesta modalidade de realização, o E2 em que o antígeno é inserido pode ser constituído de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50; o E1 pode ser constituído de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51; e o capsídeo pode consistir de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52; ou
[0089] o E2 em que o antígeno é inserido pode ser constituído de uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 53; o E1 pode ser constituído de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54; e o capsídeo pode consistir de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55.
[0090] Além disso, em relação a essa modalidade de realização, capsídeo modificado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), E1 modificado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e E2 modificada do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) podem ser utilizados para a partícula semelhante a vírus. Por exemplo, o capsídeo modificado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55; o E1 modificado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 ou a SEQ ID NO: 54; e/ou o E2 modificado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 53.
[0091] Além disso, o capsídeo modificado, E1 ou E2 pode ser um mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados com base no capsídeo que consiste de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52 ou SEQ ID NO: 55; E1 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 ou SEQ ID NO: 54; e/ou E2 consiste de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 ou SEQ ID NO: 53.
(2) Nucleotídeo, Vetor, Célula Hospedeira
[0092] No segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que é concebida para expressão de uma partícula como prevista no primeiro aspecto da presente invenção.
[0093] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica a partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana como descrita acima.
[0094] Exemplos da sequência de nucleotídeos que codifica a partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana incluem, mas sem limitação às mesmas, uma sequência de nucleotídeos que codifica o envelope da cepa 37997 do vírus Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos que codifica o capsídeo-envelope da cepa 37997 do vírus Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos que codifica o envelope da cepa LR2006 OPY-1 do vírus Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos que codifica o capsídeo-envelope do vírus LR2006 OPY-1 Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos que codifica o envelope da cepa TC-83 do vírus da encefalite equina venezuelana e uma sequência de nucleotídeos que codifica o capsídeo-envelope do vírus TC-83 da encefalite equina venezuelana.
[0095] Em relação ao vírus Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica envelope é descrita abaixo (SEQ ID NO: 4): Atgagcctcgccctcccggtcttgtgcctgttggcaaacactacattcccctgctctcagccgccttgcacaccctgctgctacga aaaggaaccggaaagcaccttgcgcatgcttgaggacaacgfgatgagacccggatactaccagctactaaaagcatcgct gacttgct ctccccacegcca aagacgca gtactaa ggacaattttaatgtctataaagccacaagaccatatcta gctcattg tcctgactgcggagaagggcattcgtgccacagccctatcgcattggagcgcatcagaaatgaagcaacggacggaacgctg aaaatccaggtctctttgcagatcgggataaagacagatgacagccacgattggaccaagctgcgctatatggatagccata cgccagcggacgcggagcgagccggattgcttgtaaggacttcagcaccgtgcacgatcaccgggaccatgggacactttatt ctcgcccgatgcccgaaaggagagacgctgacagtgggatttacggacagcagaaagatcagccacacatgcacacacccg ttccatcatgaaccacctgtgataggtagggagaggttccactctcgaccacaacatggtaaagagttaccttgcagcacgta cgtgcagagcaccgctgccactgctgaggagatagaggtgcatatgcccccagaíactcctgaccgcacgctgatgacgcag cagtctggcaacgtgaagatcacagttaatgggcagacggtgcggtacaagtgcaactgcggtggctcaaacgagggactg acaaccacagacaaagtgatcaataactgcaaaattgatcagtgccatgctgcagtcactaatcacaagaattggcaatac aactcccctttagtcccgcgcaacgctgaactcggggaccgtaaaggaaagatccacatcccattcccattggcaaacgtgac ttgcagagtgccaaaagcaagaaaccctacagtaacttacggaaaaaaccaagtcaccatgctgctgtatcctgaccatccg acactcttgtcttaccgtaacatgggaeaggaaccaaattaccacgaggagtgggtgacacacaagaaggaggttaccttg accgtgcctactga gggtctgga ggtcacttggggca acaacga accataca agtactggccgcagatgtctacgaac ggta ctgctcatggtcacccacatgagataatcitgtactattatgagctgtaccccactatgactgtagtcattgtgtcggtggcctcg ttcgtgcttctgtcgatggtgggcacagcagtgggaatgtgtgtgtgcgcacggcgcagatgeattacaccatatgaattaac accaggagccactgttcccttcctgctcagcctgctatgctgcgtcagaacgaccaaggcggccacatattacgaggctgcggc atatctatggaacgaacagcagcccctgttetggttgcaggctcttatcccgctggccgccttgatcgtcctgtgcaactgtctg aaactcttgccatgctgctgtaagaccctggcttttttagccgtaatgagcatcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacac gtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactcttgtcaacagaccgggttacagceccatggtgttggaga tggagctacaatcagtcaccttggaaccaacactgtcacttgactacatcacgtgcgagtacaaaactgtcatcccctccccgt acgtgaagtgctgtggtacagcagagtgcaaggacaagagcctaccagactacagctgcaaggtctttactggagtítaccc atttatgtggggcggcgcetactgcttttgcgacgccgaaaatacgcaattgagcgaggcacatgtagagaaatctgaatctt gcaaaacagagtttgcatcggcctacagagcccacaccgcatcggcgtcggcgaagctccgcgtcctttaccaaggaaacaa cattaccgtagctgcctacgctaacggtgaceatgccgtcacagtaaaggacgccaagtttgtcgtgggcccaatgtcctecgc ctggacaccttttgacaacaaaatcgtggtgtacaaaggcgacgtctacaacatggactacccáccttttggcgcaggaagac caggacaatttggtgacattcaaagtcgtacaccggaaagtaaagacgtttatgccaacactcagttggtactacagaggcc agcagcaggcacggtacatgtaccatactctcaggcaccatctggcttcaagtattggctgaaggaacgaggagcatcgcta cagcacacggcaccgttcggttgccagattgcgacaaacccggtaagagctgtaaattgcgctgtggggaacataccaatttc catcgacataccggatgcggcctttactagggttgtcgatgcaccctctgtaacggacatgtcatgcgaagtaccagcctgcac toactcctccgactttgggggcgtcgccatcatcaaatacacagctagcaagaaaggtaaatgtgcagtacattcgatgaeca acgccgttaccattcgagaagccgacgtagaagtagaggggaaçtcccagctgcaaatatccttetcaacagccctggcaag cgccgagtttcgcgtgcaagtgtgctccacacaagtacaetgcgcagccgcatgccaccctccaaaggaccacatagtcaatt acccagcatcacacaccacccttggggtccaggatatatccacaacggcaatgtettgggtgcagaagartacgggaggagt aggattaattgttgctgttgctgccttaattttaattgtggtgctatgcgtgtcgt.ttagcaggeac
[0096] Em relação ao vírus Chikungunya, outra sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica envelope é descrita abaixo (SEQ ID NO: 5): Atgagtcttgccatcccagttatgtgcctgttggcaaacaccacgttcccctgctcccagcccccttgcacgccctgctgctacga aaaggaaccggaggaaaccctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatcctta ãcatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctataaagccacaagaccatacttagctcactgt cccgact gtgga gaagggcactcgtgccat a gtcccgtagcactagaacgca tcagaaatgaa gcgaca gacgggacgctg aaaatccaggtctccttgcaaatcggaataaagacggatgacagecacgattggaccaagctgcgttatatggacaaccaca tgccagcagacgcagagagggcggggetatttgtaagaacatcagcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcat cctggcccgatgtccaaaaggggaaactctgacggtgggattcactgacagtaggaagattagtcactcatgtacgeacccat ttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcacggtaaagagctaccttgcagcacgtacg tgcagagcaccgccgcaactaccgaggagatagaggtacacatgcccccagacacecctgatcgcacattaatgtcacaaca gtccggcaacgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctcaaatgaaggactaaca actacagacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtcatgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataact cccctct g gtcccgcgt aatgctgaacttggggaccga a aa ggaaaaattcac atcccgtttccgctggcaa atgt a acat gca gggtgcctaaagca aggaacccc accgtga c gtacgggaaa a accaagtcatcatgctactgtatcctgaccaccca acactc ctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaaactatcaagaagagtgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtg ccgactgaagggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtattggccgcagttatctacaaacggtacagccc atggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtaccccactatgactgtagtagttgtgtcagiggccacgttcat actcctgtcgatggtgggtatggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgacaccag gagctaccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaagcggccacataccaagaggctgcgatatacc tgtggaacgagcagcaacctttgttttggctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtetgagactc ttaccatgctget gt a aaac gttgget ttttta geegta atgagcgtcggtgcccacactgtgagcgcgtacgaacacgtaaca gtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagactctagtcaatagacctggctacagccccatggtattggagatggaact actgtcagtcactttggagccaacactatcgcttgattacat-cacgtgcgagtacaaaaccgtcatcccgtctccgtacgtgaag tgctgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactacagetgtaaggtcttcaccggcgtctacccatttatgtgg ggcggcgcctactgcttctgcgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaacag aatttgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtcctttaccaaggaaataacatcactgtaa ctgcctatgcaaacggcgaccatgccgtcacagttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcticagcctggacaccttt cgacaacaaaattgtggtgtacaaaggtgacgtctataacatggaciacccgccctttggcgcaggaagaccaggacaattt ggcgatatccaaagtcgcacacctgagagtaaagacgtctatgctaatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggta cggtacacgtgccatactctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaacgcggggcgtcgctgcagcacacagca ccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgtagggaacatgcccatctccatcgacatacc ggaagcggccttcactagggtcgtcgacgcgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctcagac tttgg gggcgtcgcc attattaa atatgcagcca gcaagaaaggcaa gtgtgcggtgca ttega t ga ctaacgccgtcact at t cgggaagctgagatagaagttgaagggaattctcagctgcaaatctctttctcgacggcctiagccagcgccgaattccgcgta caagtctgttctacacaagtacactgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactacccggcgtcacatacc accctcggggtccaggacatctccgctucggcgatgtcatgggtgcagaagatcacgggaggtgtgggactggttgttgctgtt gccgcaçtgattctaatcgtggtgctatgcgtgtcgttcagcaggcac
[0097] Em relação ao vírus Chikungunya, uma sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica um capsídeo-envelope é descrito a seguir (SEQ ID NO: 6): atggagttcatcccgacgcaaactttctataacagaaggtaccaaccccgaccctgggc cccacgccctacaattcaagtaattagacctagaccacgtccacagaggcaggctgggc aactcgcccagctgatctccgcagtcaacaaattgaccatgcgcgcggtacctcaacag aagcctcgcagaaatcggaaaaacaagaagcaaaggcagaagaagcaggcgccgcaaaa cgacccaaagcaaaagaagcaaccaccacaaaagaagccggctcaaaagaagaagaaac caggccgtagggagagaatgtgcatgaaaattgaaaatgattgcatcttcgaagtcaag catgaaggcaaagtgatgggctacgcatgcctggtgggggataaagtaatgaaaccagc acatgtgaagggaactatcgacaatgccgatctggctaaactggcctttaagcggtcgt ctaaatacgatcttgaatgtgcacagataccggtgcacatgaagtctgatgcctcgaag tttacccacgagaaacccgaggggtactataactggcatcacggagcagtgcagtattc aggaggccggttcactatcccgacgggtgcaggcaagccgggagacagcggcagaccga tcttcgacaacaaaggacgggtggtggccatcgtcctaggaggggccaaogaaggtgcc cgcacggccctctccgtggtgacgtggaacaaagacatcgtcacaaaaattacccctga gggagccgaagagtggagcctcgccctcccggtcttgtgcctgttggcaaacactacat tcccctgctctcagccgccttgcacaccctgctgctacgaaaaggaaccggaaagcacc ttgcgcatgcttgaggacaacgtgatgagacccggatactaccagctactaaaagcatc gctgacttgctctccccaccgccaaagacgcagtactaaggacaattttaatgtctata aagccacaagaccatatctagctcattgtcctgactgcggagaagggcattcgtgccac agccctatcgcattggagcgcatcagaaatgaagcaacggacggaacgctgaaaatcca ggtctctttgcagatcgggataaagacagatgacagccacgattggaccaagctgcgct atatggatagccatacgccagcggacgcggagcgagccggattgcttgtaaggacttca gcaccgtgcacgatcaccgggaccatgggacactttattctcgcccgatgcccgaaagg agagacgctgacagtgggatttacggacagcagaaagatcagccacacatgcacacacc cgttccatcatgaaccacctgtgataggtagggagaggttccactctcgaccacaacat ggtaaagagttaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgctgccactgctgaggagat agaggtgcatatgcccccagatactcctgaccgcacgctgatgacgcagcagtctggca acgtgaagatcacagttaatgggcagacggtgcggtacaagtgcaactgcggtggctca aacgagggactgacaaccacagacaaagtgatcaataactgcaaaattgatcagtgcca tgctgcagtcactaatcacaagaattggcaatacaactcccctttagtcccgcgcaacg ctgaactcggggaccgtaaaggaaagatccacatcccattcccattggcaaacgtgact tgcagagtgccaaaagcaagaaaccctacagtaacttacggaaaaaaccaagtcaccat gctgctgtatcctgaccatccgacactcttgtcttaccgtaacatgggacaggaaccaa attaccacgaggagtgggtgacacacaagaaggaggttaccttgaccgtgcctactgag ggtctggaggtcacttggggcaacaacgaaccatacaagtactggccgcagatgtctac gaacggtactgctcatggtcacccacatgagataatcttgtactattatgagctgtacc ccactatgactgtagtcattgtgtcggtggcctogttcgtgcttctgtcgatggtgggc acagcagtgggaatgtgtgtgtgcgcacggcgcagatgcattacaccatatgaattaac accaggagccactgttcccttcctgctcagcctgctatgctgcgtcagaacgaccaagg cggccacatattacgaggctgcggcatatctatggaacgaacagcagcccctgttctgg ttgcaggctcttatcccgctggccgccttgatcgtcctgtgcaactgtctgaaactctt gccatgctgctgtaagaccctggcttttttagccgtaatgagcatcggtgcccacactg tgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagact cttgtcaacagaccgggttacagccccatggtgttggagatggagctacaatcagtcac cttggaaccaacactgtcacttgactacatcacgtgcgagtacaaaactgtcatcccct ccccgtacgtgaagtgctgtggtacagcagagtgcaaggacaagagcctaccagactac agctgcaaggtctttactggagtctacccatttatgtggggcggcgcctactgcttttg cgacgccgaaaatacgcaattgagcgaggcacatgtagagaaatctgaatcttgcaaaa cagagtttgcatcggcctacagagcccacaacgcatcggcgtcggcgaagctccgcgtc ctttaccaaggaaacaacattaccgtagctgcctacgctaacggtgaccatgccgtcac agtaaaggacgccaagtttgtcgtgggcccaatgtcctccgcctggacaccttttgaca acaaaatcgtggtgtacaaaggcgacgtctacaacatggactacccaccttttggcgca ggaagaccaggacaatttggtgacattcaaagtcgtacaccggaaagtaaagacgttta tgccaacactcagttggtactacagaggccagcagcaggcacggtacatgtaccatact ctcaggcaccatctggcttcaagtattggctgaaggaacgaggagcatcgctacagcac acggcaccgttcggttgccagattgcgacaaacccggtaagagctgtaaattgcgctgt ggggaaGataccaatttccatcgacataccggatgcggcctttactagggttgtcgatg caccctctgtaacggacatgtcatgcgaagtaccagcctgcactcactcctccgacttt gggggcgtcgccatcatcaaatacacagctagcaagaaaggtaaatgtgcagtacattc gatgaccaacgccgttaccattcgagaagccgacgtagaagtagaggggaactcccagc tgcaaatatccttctcaacagccctggcaagcgccgagtttcgcgtgcaagtgtgctcc acacaagtacactgcgcagccgcatgccaccctccaaaggaccacatagtcaattaccc agcatcacacaccacccttggggtccaggatatatccacaacggcaatgtcttgggtgc agaagattacgggaggagtaggattaattgttgctgttgctgccttaattttaattgtg gtgctatgcgtgtcgtttagcaggcactaa.
[0098] Em relação ao vírus Chikungunya, outra sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica um capsídeo-envelope é descrita a seguir (SEQ ID NO: 7): atggagttcatcccaacccaaactttttacaataggaggtaccagcctcgaccctggac tccgcgccctactatccaagtcatcaggcccagaccgcgccctcagaggcaagctgggc aacttgcccagctgatctcagcagttaataaactgacaatgcgcgcggtaccacaacag aagccacgcaggaatcggaagaataagaagcaaaagcaaaaacaacaggcgccacaaaa caacacaaatcaaaagaagcagccacctaaaaagaaaccggctcaaaagaaaaagaagc cgggccgcagagagaggatgtgcatgaaaatcgaaaatgattgtattttcgaagtcaag cacgaaggtaaggtaacaggttacgcgtgcctggtgggggacaaagtaatgaaaccagc acacgtaaaggggaccatcgataacgcggacctggccaaactggcctttaagcggtcat ctaagtatgaccttgaatgcgcgcagatacccgtgcacatgaagtccgacgcttcgaag ttcacccatgagaaaccggaggggtactacaactggcaccacggagcagtacagtactc aggaggccggttcaccatccctacaggtgctggcaaaccaggggacagcggcagaccga tcttcgacaacaagggacgcgtggtggccatagtcttaggaggagctaatgaaggagcc cgtacagccctctcggtggtgacctggaataaagacattgtcactaaaatcacccccga gggggccgaagagtggagtcttgccatcccagttatgtgcctgttggcaaacaccacgt tcccctgctcccagcccccttgcacgccctgctgctacgaaaaggaaccggaggaaacc ctacgcatgcttgaggacaacgtcatgagacctgggtactatcagctgctacaagcatc cttaacatgttctccccaccgccagcgacgcagcaccaaggacaacttcaatgtctata aagccacaagaccatacttagctcactgtcccgactgtggagaagggcactcgtgccat agtcccgtagcactagaacgcatcagaaatgaagcgacagacgggacgctgaaaatcca ggtctccttgcaaatcggaataaagacggatgacagccacgattggaccaagctgcgtt atatggacaaccacatgccagcagacgcagagagggcggggctatttgtaagaacatca gcaccgtgtacgattactggaacaatgggacacttcatcctggcccgatgtccaaaagg ggaaactctgacggtgggattcactgacagtaggaagattagtcactcatgtacgcacc catttcaccacgaccctcctgtgataggtcgggaaaaattccattcccgaccgcagcac ggtaaagagctaccttgcagcacgtacgtgcagagcaccgccgcaactaccgaggagat agaggtacacatgcccccagacacccctgatcgcacattaatgtcacaacagtccggca acgtaaagatcacagtcaatggccagacggtgcggtacaagtgtaattgcggtggctca aatgaaggactaacaactacagacaaagtgattaataactgcaaggttgatcaatgtca tgccgcggtcaccaatcacaaaaagtggcagtataactcccctctggtcccgcgtaatg ctgaacttggggaccgaaaaggaaaaattcacatcccgtttccgctggcaaatgtaaca tgcagggtgcctaaagcaaggaaccccaccgtgacgtacgggaaaaaccaagtcatcat gctactgtatcctgaccacccaacactcctgtcctaccggaatatgggagaagaaccaa actatcaagaagagtgggtgatgcataagaaggaagtcgtgctaaccgtgccgactgaa gggctcgaggtcacgtggggcaacaacgagccgtataagtattggccgcagttatctac aaacggtacagcccatggccacccgcatgagataattctgtattattatgagctgtacc ccactatgactgtagtagttgtgtcagtggccacgttcatactcctgtcgatggtgggt atggcagcggggatgtgcatgtgtgcacgacgcagatgcatcacaccgtatgaactgac accaggagctaccgtccctttcctgcttagcctaatatgctgcatcagaacagctaaag cggccacataccaagaggctgcgatatacctgtggaacgagcagcaacctttgttttgg ctacaagcccttattccgctggcagccctgattgttctatgcaactgtctgagactctt accatgctgctgtaaaacgttggcttttttagccgtaatgagcgtcggtgcccacactg tgagcgcgtacgaacacgtaacagtgatcccgaacacggtgggagtaccgtataagact ctagtcaatagacctggctacagccccatggtattggagatggaactactgtcagtcac tttggagccaacactatcgcttgattacatcacgtgcgagtacaaaaccgtcatcccgt ctccgtacgtgaagtgctgcggtacagcagagtgcaaggacaaaaacctacctgactac agctgtaaggtcttcaccggcgtctacccatttatgtggggcggcgcctactgcttctg cgacgctgaaaacacgcagttgagcgaagcacacgtggagaagtccgaatcatgcaaaa cagaatttgcatcagcatacagggctcataccgcatctgcatcagctaagctccgcgtc ctttaccaaggaaataacatcactgtaactgcctatgcaaacggcgaccatgccgtcac agttaaggacgccaaattcattgtggggccaatgtcttcagcctggacacctttcgaca acaaaattgtggtgtacaaaggtgacgtctataacatggactacccgccctttggcgca ggaagaccaggacaatttggcgatatccaaagtcgcacacctgagagtaaagacgtcta tgctaatacacaactggtactgcagagaccggctgtgggtacggtacacgtgccatact ctcaggcaccatctggctttaagtattggctaaaagaacgcggggcgtcgctgcagcac acagcaccatttggctgccaaatagcaacaaacccggtaagagcggtgaactgcgccgt agggaacatgcccatctccatcgacataccggaagcggccttcactagggtcgtcgacg cgccctctttaacggacatgtcgtgcgaggtaccagcctgcacccattcctcagacttt gggggcgtcgccattattaaatatgcagccagcaagaaaggcaagtgtgcggtgcattc gatgactaacgccgtcactattcgggaagctgagatagaagttgaagggaattctcagc tgcaaatctctttctcgacggccttagccagcgccgaattccgcgtacaagtctgttct acacaagtacactgtgcagccgagtgccaccccccgaaggaccacatagtcaactaccc ggcgtcacataccaccctcggggtccaggacatctccgctacggcgatgtcatgggtgc agaagatcacgggaggtgtgggactggttgttgctgttgccgcactgattctaatcgtg gtgctatgcgtgtcgttcagcaggcactaa.
[0099] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico como descrita acima, em que o vetor compreende opcionalmente uma sequência de controle da expressão ligada operativamente à molécula de ácido nucleico.
[00100] Exemplos de uma sequência de controle de expressão incluem, mas sem limitação aos mesmos, promotores tal como o promotor de CMV, o promotor de fagos lâmbda PL, os promotores de lac, phoA e tac de E. coli, os promotores precoces e tardios de SV40 e os promotores de LTRs retrovirais.
[00101] Nessa modalidade de realização, o vetor que compreende uma sequência de controle de expressão ligada operativamente à molécula de ácido nucleico como descrita acima pode ser utilizado como vetor de expressão para a preparação da partícula fornecida pelo primeiro aspecto da presente invenção.
[00102] Os vetores de expressão podem ser preparados por um perito versado no estado da técnica, com base no documento WO/2012/006180, cujo conteúdo integral é aqui incorporado como referência.
[00103] Exemplos de vetores que podem ser utilizados para expressar uma partícula semelhante a vírus que compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo derivado do vírus Chikungunya (CHIKV) e um polipeptídeo de antígeno incluem um vetor mostrado em vetor VLP_CHI 512 vetor (SEQ ID NO: 8) contendo o polinucleotídeo CHIKV VLP (SEQ ID NO: 13; correspondente à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14); e vetor VLP_CHI 532 (SEQ ID NO: 9) contendo o polinucleotídeo CHIKV VLP (SEQ ID NO: 15; correspondente à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16).
[00104] Os vetores de expressão podem ser preparados por um perito versado no estado da técnica, com base em US2012/0003266, cujo conteúdo integral é aqui incorporado como referência.
[00105] Exemplos de vetores que podem ser utilizados para expressar uma partícula similar a vírus que compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo derivado de vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e um polipeptídeo de antígeno incluem um vetor mostrado em vetor VLP_VEEV VLP 518 (SEQ ID NO: 10) contendo o polinucleotídeo VEEV VLP (SEQ ID NO: 17; correspondente à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18); vetor VLP_VEEV VLP 519 (SEQ ID NO: 11) contendo o polinucleotídeo VEEV VLP (SEQ ID NO: 19; correspondente à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20); e vetor VLP_VEEV VLP 538 (SEQ ID NO: 12) contendo o polinucleotídeo VEEV VLP (SEQ ID NO: 21; correspondente à sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22).
[00106] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que é concebida para a expressão de uma partícula semelhante a vírus que compreende uma proteína de fusão de um polipeptídeo derivado do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e um polipeptídeo derivado de antígeno da malária, que consiste de uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NOs: 26-27, 2930, 32-33, 35-36, 38, 40 ou 42.
[00107] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico que é modificada a partir da molécula de ácido nucleico que possui uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-27, 29-30, 32-33 ou 35-36, 38, 40 ou 42. A molécula de ácido nucleico modificada pode ter pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade de sequência de nucleotídeos com a molécula de ácido nucleico que possui uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 ou 42. Além disso, a molécula de ácido nucleico modificada pode ser um mutante em que no máximo 10% dos aminoácidos são eliminados, substituídos e/ou adicionados com base na molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 ou 42.
(3) Composição ou vacina
[00108] No terceiro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição ou vacina que compreende a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[00109] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona uma composição ou vacina que compreende a partícula semelhante a vírus Alfavírus ou Flavivírus (por exemplo, partícula semelhante a vírus Chikungunya ou partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana) como descrita acima ou a molécula de ácido nucleico como descrita acima. O teor da partícula semelhante a vírus Alfavírus ou Flavivírus e o teor da molécula de ácido nucleico podem ser de 0,00001-1% p/p.
[00110] A quantidade de dosagem da partícula proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção (por exemplo CHIKV VLP ou VEEV VLP) pode ser de 1-500 μg/dia.
[00111] Um ou mais antígenos da malária podem ser usados para uma composição ou uma vacina fornecida pelo terceiro aspecto da presente invenção.
[00112] A composição ou vacina pode ainda compreender um veículo e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de adjuvantes incluem, mas sem limitação aos mesmos, sais de alumínio, hidróxido de sódio, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund e solução de Ribi (Sigma Adjuvant System, Sigma-Aldrich). A composição ou vacina proporcionada no terceiro aspecto da presente invenção pode conter agente de tamponamento tal como fosfato de sódio dibásico hidratado, di-hidrogenofosfato de sódio e cloreto de sódio; e agente de conservação tal como timerossal. Em uma modalidade de realização, a composição ou vacina é uma solução aquosa que contém 0,001-1% p/p da partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção (por exemplo, CHIKV VLP ou VEEV VLP), 1-10% p/p de agente de tamponamento, 0,01-1% p/p de adjuvante e 0,00001-0,001% p/p de agente de conservação.
[00113] Um perito versado no estado da técnica pode preparar a composição farmacêutica e vacina usando técnica convencional. Por exemplo, a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção é misturada com solução tampão apresentando um pH fisiológico (por exemplo, pH 5-9, pH 7) para preparar a composição farmacêutica e vacina fornecida no terceiro aspecto da presente invenção.
[00114] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um único ingrediente ativo ou uma combinação de dois ou mais ingredientes ativos, na medida em que não sejam contrários aos objetivos da presente invenção. Por exemplo, citocinas, incluindo quimiocinas, anticorpos de citocinas, tais como anticorpo anti-TNF (por exemplo infliximab, adalimumab) e anticorpo anti-VEGF (por exemplo, bevacizumab e ranibizumab), antagonista do receptor de citocina, tal como anticorpo anti-HER2 (por exemplo, trastuzumab), anticorpo do receptor anti-EGF (por exemplo, cetuximab), aptâmero anti-VEGF (por exemplo, pegaptanib) e imunomodulador tais como ciclosporina, tacrolimus e ubenimex podem ser utilizados para a terapia de combinação.
[00115] Em uma combinação de ingredientes ativos plurais, os seus respectivos teores podem ser adequadamente aumentados ou diminuídos em consideração de seus efeitos terapêuticos e segurança.
[00116] O termo "combinação" aqui utilizado significa que dois ou mais ingredientes ativos são administrados a um paciente simultaneamente na forma de uma única entidade ou dosagem, ou que são ambos administrados a um paciente como entidades separadas, quer simultânea ou sequencialmente, sem limites de tempo específico, em que tal administração proporciona níveis terapeuticamente eficazes dos dois componentes no corpo, preferencialmente ao mesmo tempo.
[00117] Em uma modalidade de realização, a composição é uma composição de vacina que inclui uma vacina de DNA. Em uma modalidade de realização, a vacina de DNA proporcionada pela presente invenção compreende oligonucleotídeo contendo CpG.
[00118] A composição ou vacina fornecida no terceiro aspecto da presente invenção pode ser administrada uma ou mais vezes. Quando a composição ou vacina proporcionada no terceiro aspecto da presente invenção é administrada mais do que uma vez, partículas diferentes fornecidas no primeiro aspecto da presente invenção (por exemplo, CHIKV VLP ou VEEV VLP) podem ser usadas para cada uma das administrações. Em uma modalidade de realização, é empregada combinação de imunização usando CHIKV VLP proporcionado no primeiro aspecto da invenção e imunização utilizando VEEV VLP proporcionado no primeiro aspecto da invenção. Por exemplo, CHIKV VLP fornecido no primeiro aspecto da presente invenção pode ser usado para a primeira imunização e VEEV VLP fornecido no primeiro aspecto da presente invenção pode ser usado para a segunda imunização, ou VEEV VLP fornecido no primeiro aspecto a presente invenção pode ser usado para a primeira imunização e CHIKV VLP fornecido no primeiro aspecto da presente invenção pode ser utilizado para a segunda imunização.
[00119] Um perito versado no estado da técnica pode determinar o tempo de imunização usando a composição ou vacina fornecida no terceiro aspecto da presente invenção. Por exemplo, segunda imunização é realizada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas após a primeira imunização.
[00120] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um kit que compreende: (a) uma composição de vacina que compreende a partícula proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção; e (b) outra composição de vacina que compreende a partícula proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção, em que a partícula contida em (a) é uma partícula semelhante a vírus que é diferente da partícula contida em (b). Nessa modalidade de realização, a partícula contida em (a) pode ser partícula semelhante a vírus Chikungunya a partícula contida em (b) pode ser partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana.
[00121] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um kit que compreende: (a) uma composição de vacina que compreende a partícula proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção; e (b) outra composição de vacina que compreende a partícula proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção, (c) uma ou mais composições de vacina, cada um das quais compreende a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção, em que (a) é usado para preparar a imunização e (b) e (c) são utilizados para aumentar a imunização; e a partícula contida em (a) é uma partícula semelhante a vírus que é diferente da partícula contida em (b); e a partícula contida em (c) é diferente da partícula contida em (a) e (b), ou a mesma partícula contida em (a) ou (b).
[00122] As respectivas composições de vacina contidas no kit descrito acima podem ser administradas simultaneamente, separadamente ou sequencialmente.
[00123] A partícula similar a vírus Alfavírus ou Flavivírus (por exemplo, vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana) fornecida no primeiro aspecto da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico proporcionada pelo segundo aspecto da invenção pode ser usada para a composição e vacina fornecida no terceiro aspecto da presente invenção.
[00124] Por exemplo, partícula semelhante a vírus Chikungunya ou a vírus da encefalite equina venezuelana compreendendo ou consistindo em:
[00125] um ou mais (por exemplo, 240) capsídeos do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV);
[00126] um ou mais (por exemplo, 240) E1s do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV); e
[00127] um ou mais (por exemplo, 240) E2s do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), em que o antígeno da malária é inserido em E2 do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina (VEEV), pode ser usada para a preparação da composição ou vacina proporcionada no terceiro aspecto da presente invenção. O E2 em que o antígeno é inserido pode ser constituído por uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50; E1 pode ser constituído por uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51; e o capsídeo pode consistir de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52; ou
[00128] E2 em que o antígeno é inserido pode ser constituído por uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53; E1 pode ser constituído por uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54; e o capsídeo pode consistir de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55.
[00129] A composição ou vacina fornecida no terceiro aspecto da presente invenção pode ser administrada a um mamífero (por exemplo, humano) por via intramuscular (i.m.), intracutânea (i.c.), por via subcutânea (s.c.), intradérmica (i.d.) ou intraperitoneal (i.p.) .
[00130] A composição ou vacina proporcionada no terceiro aspecto da presente invenção pode ser utilizada para o tratamento ou prevenção da malária.
[00131] Assim, o uso da partícula similar a vírus Alfavírus ou Flavivírus (por exemplo, vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana) fornecida no primeiro aspecto da presente invenção ou da molécula de ácido nucleico proporcionado pelo segundo aspecto da presente invenção para a fabricação de uma composição farmacêutica ou vacina para o tratamento ou prevenção da malária é também proporcionado pela presente invenção.
(4) Método de produção de um anticorpo, Método de imuno- modulação, Método de tratamento da malária, Método de indução e/ou intensificação da resposta imunológica contra um antígeno da malária em um mamífero, Método de imunização passiva, Método de apresentação de um antígeno em macrófagos e Método para a produção de uma partícula
[00132] No quarto aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de um anticorpo, compreendendo contatar com um mamífero a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[00133] O anticorpo produzido no quarto aspecto da presente invenção pode ser humanizado utilizando uma técnica convencional. Assim, em uma modalidade de realização, o método proporcionado no quarto aspecto da invenção compreende ainda uma etapa de humanização do anticorpo de mamífero não humano produzido.
[00134] A partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção pode ser administrada diretamente ao paciente, ao órgão afetado ou sistemicamente, ou aplicada ex vivo a células derivadas do doente ou uma linha de células humanas que são subsequentemente administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes tais como de células B e células T derivadas do paciente, que são então readministradas ao o paciente.
[00135] De acordo com a presente invenção, a partícula semelhante a vírus pode ser aplicada na imunoterapia.
[00136] No quinto aspecto, a presente invenção proporciona um método de imunomodulação, um método de tratamento da malária, um método para induzir e/ou intensificar a resposta imunitária contra um antígeno da malária em um mamífero, compreendendo administrar a um mamífero a composição proporcionada no terceiro aspecto da presente invenção.
[00137] Em sexto aspecto, a presente invenção proporciona um método de imunização passiva contra um patógeno causador da malária, compreendendo administrar a um mamífero o anticorpo proporcionado no quarto aspecto da presente invenção.
[00138] Em sétimo aspecto, a presente invenção proporciona um método de apresentação de um antígeno da malária sobre macrófagos, compreende contatar com um mamífero a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção e/ou a molécula de ácido nucleico fornecida no segundo aspecto da presente invenção.
[00139] Em oitavo aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir a partícula fornecida no primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo preparar um vetor concebido para a expressão da partícula; cultivar uma célula que é transfectada com o vetor para expressar a partícula; e recuperar a partícula.
[00140] Exemplos de mamíferos incluem, mas sem limitação ao mesmo, um ser humano.
[00141] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um método de produção de um anticorpo contra o antígeno da malária, compreendendo contatar com um mamífero a partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana como descrita acima, e ou a molécula de ácido nucleico como descrita acima. O anticorpo produzido pode ser um anticorpo que pode ligar-se especificamente a um antígeno da malária compreendido na partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana ou um antígeno da malária codificado pela molécula de ácido nucleico. O método de produção de um anticorpo proporcionado pela presente invenção pode ser um instrumento útil para a produção de um anticorpo monoclonal ou policlonal contra um antígeno da malária.
[00142] Em uma modalidade de realização, um anticorpo contra o antígeno da malária obtido pelo método de produção de um anticorpo de acordo com a presente invenção é usado para imunização passiva. O método de imunização passiva pode compreender a administração do anticorpo obtido a um mamífero.
[00143] Em uma modalidade de realização preferida, a imunomodulação proporcionada pela presente invenção consiste em induzir e/ou intensificar a resposta imunitária contra o antígeno da malária em mamíferos. Assim, em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um método para induzir e/ou intensificar a resposta imunitária contra o antígeno da malária em um mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição conforme descrita acima.
[00144] Dado o sintoma de pacientes infectados com Chikungunya ou encefalite equina venezuelana, juntamente com grande molécula incomum de Chikungunya ou encefalite equina venezuelana, essa VLP pode agir com eficácia e eficiência para atingir macrófagos e sua composição, tais como citocinas e compostos imunomodulatórios.
[00145] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de apresentação de um antígeno em macrófagos, compreendendo administrar a um mamífero a partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana como descrita acima, e/ou a molécula de ácido nucleico tal como descrita acima. A partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana proporcionada pela presente invenção é boa para atingir macrófagos. Em uma modalidade de realização, a partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana proporcionada pela presente invenção é um tipo de sistema de administração do pelo menos um antígeno que está compreendido na partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana, em macrófagos.
[00146] Em uma modalidade de realização, a presente invenção proporciona um método para a produção de partícula semelhante a vírus Chikungunya ou vírus da encefalite equina venezuelana proporcionada no primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo preparar um vetor concebido para a expressão da partícula; cultivar uma célula que é transfectada com o vetor para expressar a partícula; e recuperar a partícula. Nessa modalidade de realização, a transfecção pode ser realizada utilizando um método convencional. Células usadas para a transfecção podem ser células 293. Recuperação de VLP pode incluir coletar um meio condicionado após as células serem transfectadas com um vetor, e pode incluir adicionalmente purificar VLP a partir do meio condicionado empregando ultracentrifugação.
[00147] A presente invenção será descrita em pormenores com referência ao exemplo a seguir, que, no entanto, não se destina a limitar o escopo da presente invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Preparação de partícula similar a vírus Chikungunya (CHIKV) compreendendo um polipeptídeo estrutural do vírus e um fragmento de antígeno da malária
[00148] São usados os seguintes polinucleotídeos de proteínas CSP1 da malária. Ligante de término N é SGG e ligante de término C é GGS.
[00149] VLP74 (seis repetições da sequência de aminoácidos NPNA) Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs (SEQ ID NO: 46) (Tccggaggaaacccgaatgccaatcccaacgcgaaccccaatgctaacccaaatgcca acccaaacgccaaccccaacgctggtggatcc) (SEQ ID NO: 47)
[00150] VLP78 (25 repetições da sequência de aminoácidos NPNA) Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpna npnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs NO: 48) (tccggaggaaacccgaatgccaatcccaacgcgaaccccaacgctaaccccaacgcca atccgaatgcaaacccgaacgttgacccaaacgccaacccgaatgccaatcccaacgcg aaccccaatgctaacccaaatgccaacccaaacgccaaccccaacgctaatccaaacgc caaccctaacgccaatcccaacgcgaatcctaacgctaatcccaacgcaaatcccaatg ctaatccgaacgcgaaccctaatgcaaaccccaacgccaacccgaacgctaacccgaac (SEQ ID NO: 49)
[00151] Os respectivos polinucleotídeos foram inseridos entre os códons que codificam a Ser na posição 531 e Asn na posição 532 de SEQ ID NOs: 15 ou 16 (SEQ ID NOs: 1 ou 2) para a construção de um plasmídeo (daqui por diante referido como CHIKV-VLP74 ou 78) para expressar partícula semelhante a vírus Chikungunya na qual o peptídeo modificado VLP74 ou derivado de 78 é inserido em E2 do polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya.
[00152] Células 293F (Lifetechnology) foram transfectadas com o plasmídeo usando PEI (GE Healthcare) ou Genex (ATCC). Quatro dias após a transfecção, o meio condicionado foi recolhido e centrifugado a 3.000 rpm durante 15 minutos para separá-lo de células. O sobrenadante foi filtrado usando filtro de 0,45 μm para obter partículas semelhantes a vírus. As partículas semelhantes a vírus foram concentradas usando uma coluna TFF e purificadas utilizando uma coluna QXL (GE Healthcare) para obter partículas semelhantes a vírus purificadas. Quando animais foram imunizados com partículas semelhantes a vírus, as partículas semelhantes a vírus purificadas foram adicionalmente concentradas utilizando uma coluna de centrifugação (peso molecular de corte: 100 kDa) para preparar as partículas semelhantes a vírus para a imunização.
[00153] A expressão de VLP compreendendo VLP74 ou 78 conjugada com polipeptídeo estrutural do vírus Chikungunya foi confirmada por Western Blot utilizando um anticorpo específico para CHIKV (ATCC: VR-1241AF) e um anticorpo específico para VLP74 ou 78.
EXEMPLO 2: Preparação de partícula similar a vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) compreendendo um polipeptídeo estrutural do vírus e um fragmento de antígeno da malária
[00154] São usados os mesmos polinucleotídeos de proteínas CSP1 da malária (VLP74 e VLP78) usados no EXEMPLO 1. Ligante de término N é SGG e ligante de término C é GGS.
[00155] Os respectivos polinucleotídeos foram inseridos entre os códons que codificam a Ser na posição 518 e Ser na posição 519 de SEQ ID NOs: 19 ou 20 (SEQ ID NO: 3) para a construção de um plasmídeo (daqui por diante referido como VEEV-VLP74 ou 78) para expressar partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana na qual o peptídeo modificado VLP74 ou derivado de 78 é inserido em E2 do polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana partícula.
[00156] Células 293F (Lifetechnology) foram transfectadas com o plasmídeo usando PEI (GE Healthcare) ou Genex (ATCC). Quatro dias após a transfecção, o meio condicionado foi recolhido e centrifugado a 3.000 rpm durante 15 minutos para separá-lo de células. O sobrenadante foi filtrado usando filtro de 0,45 μm para obter partículas semelhantes a vírus. As partículas semelhantes a vírus foram concentradas usando uma coluna TFF e purificadas utilizando uma coluna QXL (GE Healthcare) para obter partículas semelhantes a vírus purificadas. Quando animais foram imunizados com partículas semelhantes a vírus, as partículas semelhantes a vírus purificadas foram adicionalmente concentradas utilizando uma coluna de centrifugação (peso molecular de corte: 100 kDa) para preparar as partículas semelhantes a vírus para a imunização.
[00157] A expressão de VLP compreendendo VLP74 ou 78 conjugada com polipeptídeo estrutural do vírus da encefalite equina venezuelana foi confirmada por Western Blot utilizando um anticorpo específico para VEEV e um anticorpo específico para VLP74 ou 78.
EXEMPLO 3: Imunogenicidade em Primata Não Humanos (Macaco)
[00158] Os macacos foram imunizados com x25-CHI (80 μg) na semana 0 e x6-VEE (80 μg) na 3a semana por injeção intramuscular, com ou sem adjuvante (Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322). X25- CHI significa 25 vezes repetição do aminoácido NPNA de CSP da malária sobre partícula CHIKV VLP (VLP78_15). X6-VEE significa seis vezes repetição do aminoácido NPNA de CSP da malária sobre partícula VEEV VLP (VLP74_25). O sangue é retirado na 2a e 5a semanas após a primeira imunização.
[00159] Placa ELISA de 96 poços foi revestida com 50 ng de proteína recombinante de circum-esporozoíto (rCSP) (Proteínas Reagentes, ATG-422) em 100 μL de tampão PBS por poço. As placas após duas horas de incubação foram lavadas três vezes com tampão TBS contendo Tween-20 0,05% e bloqueadas com tampão TBS contendo Tween-20 0,05% e leite seco a 5%. O soro diluído inativado por calor proveniente de macacos foi adicionado ao tampão de bloqueio e incubado durante 1 h a temperatura ambiente. Depois de lavar três vezes, IgG anti-humana ou IgG anti-rato de cabra marcada com peroxidase foi adicionada sob diluição de 1:4.000 e incubada durante 1 h a temperatura ambiente. Após lavagem por três vezes, adicionou-se substrato de peroxidase para desenvolvimento e incubou-se durante dez minutos, e H2SO4 2N foi adicionado para parar o desenvolvimento. Os dados foram analisados usando Gen5 (BioTek) e GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc.).
[00160] As imunogenicidades são mostradas nas Figuras 4 a 6.
[00161] Indução de anticorpos contra CSP foi encontrada no soro de todos os macacos imunizados com VLPs da malária (ver Figura 4). Os valores médios de densidade óptica DO indicando título de anticorpos contra CSP são mostrados na Figura 5. A Figura 5 mostra que o soro de macacos imunizados induziu elevado título de anticorpos contra CSP.
[00162] Como se pode ver na Figura 6, título mais elevado de anticorpos contra CSP foi alcançado quando partícula CHIKV VLP compreendendo NPNA e partícula VEEV VLP compreendendo NPNA foram usadas para imunização inicial e imunização de reforço, respectivamente, em comparação com quando apenas partícula CHIKV VLP compreendendo NPNA foi utilizada tanto para a imunização inicial quanto para a imunização de reforço. Além disso, a Figura 6 mostra que o uso de adjuvante aumentou ainda mais o título de anticorpos contra CSP. Além disso, a Figura 6 mostra que a administração de 25 unidades de repetição de NPNA induz maior título de anticorpos contra CSP em comparação com a administração de 6 unidades de repetição de NAPA.
[00163] O título de anticorpos CSP anti-Pf no soro de macacos imunizados com x25-CHI (80 μg) na semana 0 e x6-VEE (80 μg) na 3a semana sem o uso de adjuvante foi medido por ELISA no Setor de Vacina da Malária do Laboratório de Sorologia da Malária, WRAIR. No ELISA realizado no Setor de Vacina da Malária do Laboratório de Sorologia da Malária, WRAIR, as placas foram revestidas com CSPrp ((NPNA)6 Peptídeo) [0,2 μg/μL] (fornecedor: Eurogentec EP070034) e IgG α-humana de cabra (KPL/074-1002 LOT N° 120714) foi usada como segundo anticorpo. O título final foi determinado pelo fator de diluição que produz uma DO de 1,0 (414 nm).
[00164] Como resultado, o título de anticorpos CSP anti-Pf no soro dos macacos aumentou após 2a imunização em comparação com a 1a imunização (ver Tabela 2). Em comparação com o título de anticorpos CSP anti-Pf no soro dos macacos imunizados com RTS, S (GlaxoSmithKline), o título de anticorpos CSP anti-Pf no soro dos macacos imunizados com x25-CHI (80 μg) e X6-VEE (80 μg) na ausência de adjuvante foi considerado maior embora RTS, S (GlaxoSmithKline) contivesse adjuvante. Tabela 2
Figure img0003
EXEMPLO 4: Imunogenicidade em camundongo
[00165] Os camundongos imunizados com 10 μg de VLP78_15 na semana 0, 10 μg de VLP74_25 na 3a semana e 10 μg de VLP78_15 na 6a semana, com ou sem adjuvante (Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322) por injeção intramuscular.
[00166] O título de anticorpos CSP anti-Pf no soro dos camundongos imunizados foi medido por ELISA no Setor de Vacina da Malária do Laboratório de Sorologia da Malária, WRAIR, no qual placas foram revestidas com CSPrp ((NPNA)6 Peptídeo) [0,2 μg/μL] (Fornecedor: Eurogentec EP070034) e IgG de cabra α-rato (KPL/074- 1806 LOTE N° 100.737) foi usada como segundo anticorpo para detectar os anticorpos no soro.
[00167] O título final foi determinado pelo fator de diluição que produz uma densidade óptica DO de 1,0 (414nm).
[00168] As imunogenicidades são apresentadas nas Tabelas 3 e 4.
[00169] As Tabelas 3 e 4 mostram que maior titulação de anticorpos contra CSP foi conseguida após a imunização três vezes com partícula semelhante a vírus. Além disso, as Tabelas 3 e 4 mostram que o uso de adjuvante aumentou o título de anticorpos contra CSP. Tabela 3
[00170] Rato 3a Semana (após a primeira imunização)
Figure img0004
QNS = Quantidade não suficiente para teste Tabela 4
[00171] Rato 9a Semana (após a primeira imunização)
Figure img0005
EXEMPLO 5: Imunogenicidade de VLP inserido em CSP de P. yoelii' em camundongos
[00172] QGPGAP visto no CSP da malária em roedor (CSP de P. yoelii) foi usado como antígeno. 6x QGPGAP foi inserido em CHIKV VLP. Os camundongos foram imunizados com VLPs CHIKV duas vezes na semana 0 e na 8a semana (20 μg de VLP por camundongo) mediante injeção intramuscular com ou sem Adjuvante de Ribi.
[00173] A imunogenicidade foi confirmada na 4a, 6a, 10a e 14a semanas após a primeira imunização. Os anticorpos CSP anti-P. yoelii foram medidos por ELISA. O ELISA foi realizado da mesma maneira que o ELISA descrito no Exemplo 3, exceto que as placas foram revestidas com peptídeo da sequência de repetição de CSP de P. yoelii sob 0,1 ng/μl. O anticorpo secundário foi HRP de IgG anti- camundongo (sinal celular, N° 7076S). Os resultados são mostrados nas Figuras 7-9.
[00174] As Figuras 7-9 mostram que o maior título de anticorpos contra CSP foi obtido por administração intramuscular de CHIKV VLP compreendendo 6X QGPGAP. Além disso, as Figuras 7-9 mostram que o uso de adjuvante aumentou o título de anticorpos contra CSP.
EXEMPLO 6: Proteção de camundongos contra a malária por injeção intramuscular de CHIKV VLP compreendendo epítopo de CSP de P. yoelii: 6x QGPGAP
[00175] 6x QGPGAP foi inserido em CHIKV VLP. Os camundongos (n = 5) foram imunizados com CHIKV VLP duas vezes na semana 0 e na 8a semana (20 μg de VLP por camundongo) mediante injeção intramuscular com ou sem Adjuvante de Ribi (ver Figura 10). Malária em roedor: desafio com P. yoelii (i.v.) foi realizado em 17 semanas (ver Figura 10).
[00176] Infecção por malária foi confirmada por PCR. DNA genômico foi purificado a partir do sangue de camundongos no 6° dia após desafio. DNA de malária 18S foi amplificado por PCR. A Figura 11 mostra os resultados da PCR, indicando que todos os cinco camundongos de controle (injeção de PBS) foram infectadas com malária; todos os cinco camundongos imunizados com VLP de controle foram infectados com malária; entre os cinco camundongos imunizados com CHIKV VLP compreendendo 6x QGPGAP, dois camundongos foram infectados com malária e três camundongos não foram infectadas com malária; e entre cinco camundongos imunizados com CHIKV VLP compreendendo 6x QGPGAP com Adjuvante de Ribi, um camundongo foi infectado com malária e quatro camundongos não foram infectados com malária.
EXEMPLO 7: Preparação de composição de vacina compreendendo partícula similar a vírus Chikungunya (CHIKV) contendo repetição de NPNA ou partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) compreendendo repetição de NPNA
[00177] Partícula similar a vírus Chikungunya (CHIKV) compreendendo 6x ou 25x NPNA foi preparada de acordo com o Exemplo 1, e partícula semelhante a vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) compreendendo 6x NPNA foi preparada de acordo com o Exemplo 2. Para preparar uma composição de vacina, 80 μg de cada uma das partículas preparadas foram misturados com 1 ml de Solução de Fosfato de Sacarose, pH 7,2, Sem Endotoxinas (Teknova, tampão SP).

Claims (10)

1. Partícula semelhante a vírus, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo estrutural viral e pelo menos um antígeno da malária, em que o referido polipeptídeo estrutural viral é um polipeptídeo do vírus Chikungunya (CHIKV) ou do vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e compreende o capsídeo e/ou as proteínas de envelope E1 e E2, em que o referido pelo menos um antígeno da malária é um antígeno que compreende (NPNA)n em que n é de 4 a 30, e/ou um antígeno que compreende (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)y em que y é de 1 a 6, e em que o referido pelo menos um antígeno de malária é inserido entre os resíduos 509-510, 510-511, 511-512, 519-520, 529530, 530-531 ou 531-532 do CHIKV E2 com a SEQ ID NO: 1 ou 2, ou entre os resíduos 515-516, 516-517, 517-518, 518-519, 519-520, 536537, 537-538 ou 538-539 do VEEV E2 com a SEQ ID NO: 3.
2. Partícula semelhante a vírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo estrutural viral é um polipeptídeo do vírus Chikungunya (CHIKV).
3. Partícula semelhante a vírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido pelo menos um antígeno da malária é um antígeno que compreende (NPNA)n em que n é de 4 a 30.
4. Partícula semelhante a vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um antígeno de malária é inserido entre os resíduos 531 e 532 das SEQ ID NOs: 1 ou 2, ou entre os resíduos 518 e 519 da SEQ ID NO: 3.
5. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos para a expressão da partícula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a molécula de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 26-27, 29-30, 32-33, 35-36, 38, 40 ou 42
6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 5, em que o vetor compreende opcionalmente uma sequência de controle de expressão ligada operacionalmente à molécula de ácido nucleico.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (a) a partícula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 5, e/ou vetor como definido na reivindicação 6; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção ou tratamento de malária em um mamífero.
9. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula semelhante a vírus como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
10. Composição de vacina de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 5, e/ou um vetor como definido na reivindicação 6.
BR112015030229-7A 2013-06-03 2014-06-02 Partícula semelhante a vírus compreendendo um polipeptídeo e um antígeno da malária, vetor, composições farmacêutica e de vacina, bem como molécula de ácido nucleico isolado BR112015030229B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361830436P 2013-06-03 2013-06-03
US61/830,436 2013-06-03
US201361906583P 2013-11-20 2013-11-20
US61/906,583 2013-11-20
PCT/JP2014/065166 WO2014196648A1 (en) 2013-06-03 2014-06-02 Malaria vaccine

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR112015030229A2 BR112015030229A2 (pt) 2017-08-22
BR112015030229A8 BR112015030229A8 (pt) 2023-04-11
BR112015030229B1 true BR112015030229B1 (pt) 2023-04-18

Family

ID=52005658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112015030229-7A BR112015030229B1 (pt) 2013-06-03 2014-06-02 Partícula semelhante a vírus compreendendo um polipeptídeo e um antígeno da malária, vetor, composições farmacêutica e de vacina, bem como molécula de ácido nucleico isolado

Country Status (16)

Country Link
US (3) US9512190B2 (pt)
EP (1) EP3004348B1 (pt)
JP (1) JP6734651B2 (pt)
KR (2) KR20160016856A (pt)
CN (1) CN105431535A (pt)
AP (1) AP2015008926A0 (pt)
AU (1) AU2014275772B2 (pt)
BR (1) BR112015030229B1 (pt)
CA (1) CA2913832C (pt)
IL (1) IL242656B (pt)
MX (1) MX2015016627A (pt)
RU (1) RU2702163C2 (pt)
SG (2) SG10201709917VA (pt)
TW (1) TWI687442B (pt)
WO (1) WO2014196648A1 (pt)
ZA (1) ZA201508642B (pt)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2863695C (en) 2012-02-16 2023-01-17 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle composition
TWI676636B (zh) 2013-07-12 2019-11-11 Ｖｌｐ醫療股份有限公司 包含ｐｄ－１抗原或ｐｄ－１配體抗原的類病毒粒子
US10385101B2 (en) 2014-08-08 2019-08-20 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising modified envelope protein E3
JP6824154B2 (ja) 2014-08-08 2021-02-03 ブイエルピー・セラピューティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ 修飾エンベロープタンパク質ｅ３を含むウイルス様粒子
CA2960102C (en) 2014-09-11 2023-10-24 Vlp Therapeutics, Llc Flavivirus virus like particle
US10166281B2 (en) * 2015-09-04 2019-01-01 Vlp Therapeutics, Llc Method and composition for modulating immune response
CA2998540C (en) * 2015-09-16 2024-04-02 Artificial Cell Technologies, Inc. Anti-malaria compositions and methods
BR112019023477A2 (pt) 2017-05-08 2020-06-30 Gritstone Oncology, Inc. vetores de neoantígeno de alfavírus
BR112020013679A2 (pt) 2018-01-04 2020-12-01 Iconic Therapeutics, Inc. anticorpos de fator antitecidual, conjugados anticorpo-fármaco e métodos relacionados
CN109536464B (zh) * 2018-12-10 2022-06-10 中国科学院武汉病毒研究所 一种缺失衣壳蛋白基因的基孔肯雅病毒感染性克隆及构建方法和在制备减毒疫苗中的应用
BR122024002387A2 (pt) 2019-05-30 2024-03-12 Gritstone Bio, Inc. Vetores de adenovírus, composição farmacêutica, sequência de nucleotídeo isolada, célula isolada, vetor, kit, usos de um vetor, método para fabricar o vetor, métodos para produzir um vírus e vetor viral
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
WO2023092143A1 (en) * 2021-11-22 2023-05-25 Novavax AB Methods and compositions for treating and preventing malaria

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010152A1 (en) * 1991-11-16 1993-05-27 Smithkline Beecham Biologicals S.A. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
EP1583500A4 (en) * 2002-11-13 2008-02-13 Us Navy METHODS AND COMPOSITIONS FOR INDUCING IMMUNE RESPONSES AND PROTEIN IMMUNITY BY PRIMARY IMMUNIZATION WITH ALPHAVIRUS REPLICON VACCINES
EA016648B1 (ru) * 2004-10-14 2012-06-29 Круселл Холланд Б.В. Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген cs возбудителя малярии, и белкового антигена, содержащего белок cs или его фрагмент, для лечения или профилактики малярии
GB0513421D0 (en) * 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
WO2008025067A1 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Hepgenics Pty Ltd Recombinant proteins and virus like particles comprising l and s polypeptides of avian hepadnaviridae and methods, nucleic acid constructs, vectors and host cells for producing same
MY161495A (en) 2008-11-26 2017-04-14 Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services Virus like particle compositions and methods of use
WO2011022002A1 (en) * 2009-08-18 2011-02-24 The Rockefeller University Modification of recombinant adenovirus with immunogenic plasmodium circumsporozoite protein epitopes
CA2774640C (en) * 2009-09-18 2019-11-26 Fraunhofer Usa Inc. Virus like particles comprising target proteins fused to plant viral coat proteins
WO2012006180A1 (en) * 2010-06-29 2012-01-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv immunogens
WO2012023995A1 (en) * 2010-08-18 2012-02-23 Takayuki Shiratsuchi Modification of recombinant adenovirus capsid protein with immunogenic plasmodium circumsporozoite protein epitopes
US9487563B2 (en) * 2011-01-31 2016-11-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Virus-like particles and methods of use
CA2863695C (en) * 2012-02-16 2023-01-17 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle composition
JP6824154B2 (ja) 2014-08-08 2021-02-03 ブイエルピー・セラピューティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＶＬＰ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ 修飾エンベロープタンパク質ｅ３を含むウイルス様粒子

Also Published As

Publication number Publication date
KR102494564B1 (ko) 2023-01-31
EP3004348A1 (en) 2016-04-13
TWI687442B (zh) 2020-03-11
CA2913832A1 (en) 2014-12-11
US20170035871A1 (en) 2017-02-09
US20190351041A1 (en) 2019-11-21
RU2015155821A (ru) 2017-06-29
CA2913832C (en) 2023-07-04
JP6734651B2 (ja) 2020-08-05
ZA201508642B (en) 2022-03-30
US20140363458A1 (en) 2014-12-11
SG10201709917VA (en) 2017-12-28
BR112015030229A8 (pt) 2023-04-11
KR20160016856A (ko) 2016-02-15
RU2015155821A3 (pt) 2018-06-05
TW201529605A (zh) 2015-08-01
AU2014275772B2 (en) 2020-01-02
MX2015016627A (es) 2016-04-04
AU2014275772A1 (en) 2015-12-03
US9512190B2 (en) 2016-12-06
EP3004348B1 (en) 2023-03-08
AP2015008926A0 (en) 2015-12-31
SG11201509614SA (en) 2015-12-30
NZ714285A (en) 2021-02-26
JP2016521539A (ja) 2016-07-25
IL242656B (en) 2022-07-01
IL242656A (pt) 2015-12-31
BR112015030229A2 (pt) 2017-08-22
WO2014196648A1 (en) 2014-12-11
KR20210116712A (ko) 2021-09-27
CN105431535A (zh) 2016-03-23
EP3004348A4 (en) 2016-08-03
RU2702163C2 (ru) 2019-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190351041A1 (en) Malaria vaccine
US9969986B2 (en) Virus like particle comprising modified envelope protein E3
US10464986B2 (en) Virus like particle comprising PD-1 antigen or PD-1 ligand antigen
Denis et al. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis C virus epitope: evidence for the critical function of multimerization
RU2705301C2 (ru) Композиция вирусоподобных частиц
US10385101B2 (en) Virus like particle comprising modified envelope protein E3
Kingston et al. Hepatitis B virus-like particles expressing Plasmodium falciparum epitopes induce complement-fixing antibodies against the circumsporozoite protein
JP6675185B2 (ja) 免疫誘導剤およびその製造方法
CN117222734A (zh) 靶向半乳凝素的免疫疗法
RU2811991C2 (ru) Субъединичная вакцина для лечения или предотвращения инфекции дыхательных путей
OA17590A (en) Malaria Vaccine
NZ714285B2 (en) Malaria vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: VLP THERAPEUTICS, INC. (US)

B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 02/06/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS