EA016648B1

EA016648B1 - Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген cs возбудителя малярии, и белкового антигена, содержащего белок cs или его фрагмент, для лечения или профилактики малярии

Info

Publication number: EA016648B1
Application number: EA200700849A
Authority: EA
Inventors: Мария Грация Пау; Яап Гоудсмит; Джозеф Д. Коэн; Патрис М. Дюбуа; В. Энн Стюарт; Доналд Хеппнер
Original assignee: Круселл Холланд Б.В.; Глаксосмитклайн Байолоджикалс, С.А.
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2005-10-13
Publication date: 2012-06-29
Also published as: JP5108521B2; CN101068568B; EA200700849A1; KR20070104881A; DK1802336T3; ATE523205T1; PL1802336T3; MX2007004031A; AU2005293572B2; US20090285879A1; HRP20110786T1; IL182357A0; HK1100121A1; CY1112749T1; RS52187B; US20120014994A1; IL214460A0; SI1802336T1; NO20072470L; WO2006040334A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген CS возбудителя малярии, и смешанного с адъювантом белкового антигена, содержащего белок CS или его иммуногенный фрагмент, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики малярии, где указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 или 50 и при этом используется для первичной вакцинации, а указанный смешанный с адъювантом белковый антиген используется для бустерной вакцинации, где указанный белковый антиген содержит гибридный белок, состоящий из белка CS или его иммуногенного фрагмента, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита B (HBsAg) в виде липопротеиновых частиц с HBsAg.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины. В частности, изобретение относится к новым стратегиям использования первичных/бустерных вакцин, используя полученные рекомбинантным способом аденовирусные векторы и смешанные с адъювантом очищенные белки для профилактики тропической малярии.

Уровень техники

В настоящее время малярия является одной из наиболее распространенных инфекций во всех тропических и субтропических областях мира. За год в развивающихся странах и странах с формирующейся экономикой в результате малярийной инфекции умирает до 2,7 млн человек. Широкое распространение и рост заболеваемости малярией являются следствием увеличения количества резистентных к лекарственным средствам паразитов и резистентных к инсектицидам паразитарных векторов. Другие факторы включают изменения окружающей среды и климатических условий, гражданские беспорядки и возросшую мобильность популяций.

Малярию вызывают переносимые комарами протозойные паразиты, принадлежащие роду Р1а§тойшт. У человека заболевание вызывают четыре вида простейших Р1а§тойшт (Р.ГаШрагит, Р.угуах, Р.оуа1е и Р.та1агхае); многие другие вызывают заболевание у животных, например Р.уоеШ и Р.Ьетдйеи, Р.ГаШратит является причиной большинства инфекций у людей и является причиной большинства летальных случаев. Жизненный цикл малярийных паразитов состоит из четырех отдельных стадий. Каждая из этих стадий может индуцировать специфические иммунные ответы против паразита и соответственно приводит к выработке антигенов, специфических для этой стадии, тем не менее, малярия, возникшая естественным образом, не защищает от повторной инфекции.

Малярийные паразиты передаются человеку несколькими видами самок комаров Лиорйе1е8. Инфицированные комары впрыскивают спорозоитную форму малярийного паразита в кровоток млекопитающего. В течение нескольких минут до внедрения в гепатоциты спорозоиты циркулируют в крови. На этой стадии паразиты находятся во внеклеточной среде и подвергаются атаке антител, в основном направленной на белок циркумспорозоита (С8), основной компонент поверхности спорозоита. Затем в печени паразит реплицируется и развивается в шизонт. Во время этой стадии внедрение паразита сопровождается бесполым размножением и продукцией до 20000 дочерних мерозоитов на инфицированную клетку. Во время этой внутриклеточной стадии паразита главными участниками иммунного ответа хозяина являются Т-лимфоциты, главным образом С.’Э8+ Т-лимфоциты (Вотего е1 а1., 1989). Примерно через одну неделю после инфицирования печени тысячи мерозоитов высвобождаются в кровоток и проникают в эритроциты (ВВС), которые становятся мишенями для антитело-опосредованного иммунного ответа и цитокинов, секретированных Т-клетками. После внедрения в эритроциты мерозоиты подвергаются нескольким стадиям репликации, трансформируясь в трофозоиты и шизонты. Эритроциты, разрываясь, дают новую генерацию мерозоитов, которые впоследствии инфицируют новые ВВС. Эритроцитарная стадия связана с явным клиническим проявлением заболевания. Небольшое число тропозоитов может развиться в мужские или женские гаметоциты, которые представляют собой половую стадию паразита. Когда восприимчивые комары засасывают гаметоциты, оплодотворение таких гамет приводит к образованию зигот и последующей их трансформации в оокинеты, затем в ооциты и, наконец, в спорозоиты, которые мигрируют в слюнные железы для завершения цикла.

Двумя основными формами патоген-специфического иммунного ответа, который возникает в ответ на внедрение паразита в организм, являются клеточный и гуморальный. С одной стороны - клеточный ответ, относящийся к СЭ8+ и СЭ4+ Т-клеткам, которые принимают участие в иммунном ответе. Цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ) экспрессируют СЭ8 и способны специфически убивать инфицированные клетки, которые экспрессируют на своей поверхности патогенные антигены. СЭ4+ Т-клетки или Тхелперные клетки поддерживают развитие СТЬ, продуцируют различные цитокины, а также стимулируют индуцию В-клеток, которые делятся и продуцируют антиген-специфические антитела. Во время гуморального ответа специфические в отношении конкретного антигена В-клетки активизируются, размножаются, дифференцируются и продуцируют антиген-специфические антитела.

Обе формы иммунного ответа относятся к защите против малярийной инфекции. Когда инфекционные спорозоиты мигрируют в печень и проникают в гепатоциты, спорозоиты становятся внутриклеточными патогенами, которые проводят некоторое время вне инфицированных клеток. На этой стадии особенно важны СЭ8+ Т-клетки и СЭ4+ Т-клетки, поскольку эти Т-клетки и их продукты цитокины, такие как интерферон-γ (ΙΡΝ-γ), участвуют в уничтожения инфицированных гепатоцитов хозяина. На мышиной модели малярии было обнаружено, что элиминация внутриклеточных паразитов в печени зависит от СЭ8+ Т-клеточного ответа, направленного против пептидов, экспрессируемых паразитами на печеночной стадии (НоГГтап аий Эоо1аи, 2000). Сокращение СЭ8+ Т-клеток снимает защиту от спорозоитной стимуляции, а адаптивный перенос СЭ8+ Т-клеток наивным животным, обеспечивает их защиту.

Когда малярийная инфекция достигает эритроцитарной стадии, в которой мерозоиты размножаются в ВВС, также обнаруживаются мерозоиты, свободно циркулирующие в кровяном потоке. Поскольку эритроцит не экспрессирует молекулы МНС ни класса I, ни класса II, которые необходимы для аутоиммунных взаимодействий с Т-клетками, было сделано предположение, что на этой стадии наиболее важ

- 1 016648 ным является гуморальный ответ. И, наконец, наиболее эффективным подходом в создании противомалярийной вакцины была бы индуция сильного клеточного иммунного ответа такой вакциной, а также сильного гуморального иммунного ответа на различных стадиях развития паразита в организме человека.

Современные подходы к созданию противомалярийной вакцины могут быть классифицированы в соответствии с различными стадиями развития паразита, как описано выше. Можно выделить три типа вакцин:

преэритроцитарные вакцины, которые направлены против гепатоцитов, инфицированных спорозоитами и/или шизонтами. Исторически этот подход доминирует в стратегиях, основанных на (С8). Поскольку преэритроцитарная фаза инфекции является бессимптомной, то преэритроцитарная вакцина должна идеально индуцировать стерильный иммунитет, опосредованный гуморальным и клеточным иммунными ответами, и полностью предотвращать латентную малярийную инфекцию;

вакцины, направленные на бесполую кровяную стадию, либо на инфицированный КВС, либо на сам мерозоит, созданы для минимизации клинических проявлений. Эти вакцины должны уменьшать заболеваемость и смертность, и предназначены для профилактики проникновения и/или развития паразита в эритроцитах;

вакцины, блокирующие трансмиссию, которые разработаны для задержки развития паразита в комаре-хозяине. Этот тип вакцин должен способствовать уменьшению скорости распространения малярийной инфекции.

Наконец, возможность разработки комбинированных малярийных вакцин, которые направлены на множество стадий жизненного цикла паразита, достигается благодаря так называемым многокомпонентным и/или многостадийным вакцинам.

В настоящее время отсутствуют коммерческие вакцины против малярии, хотя поиск вакцин против малярии начался более 30 лет назад. Иммунизация грызунов, нечеловеческих приматов и людей спорозоитами, ослабленными радиацией, обеспечивала защиту против последующего заражения жизнеспособными спорозоитами (№155Спх\усщ е! а1., 1967; С1убе е! а1., 1973). Однако до сих пор отсутствие поддержки и подходящей крупномасштабной культуральной системы для продукции облученных спорозоитов затрудняют широкое применение таких вакцин (Ъике и е! а1., 2003).

На сегодняшний день наиболее перспективные вакцины, протестированные на людях, были основаны на небольших количествах поверхностных антигенов спорозоита. Белок С8 является единственным антигеном Р.1а1с1ратит, в отношении которого была продемонстрирована способность к постоянному предупреждению малярии при его использовании как основы активной иммунизации людей против передаваемой комарами инфекции, хотя и зачастую на недостаточном уровне. Теоретический анализ показал, что масштаб действия вакцины, а также эффективность вакцины должны составлять более 85%, или иначе в эндемические районы могут ускользнуть мутанты, которые являются более вирулентными (Саибои е! а1., 2001).

Одним из способов индукции иммунного ответа у млекопитающего является введение инфекционного вектора, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую в своем геноме антиген. Одним из таких носителей является рекомбинантный аденовирус, который является дефектным по репликации в результате удаления областей внутри генома, которые, как правило, значимы для репликации, например, области Е1. В данной области техники известны примеры рекомбинантных аденовирусов, которые содержат гены, кодирующие антигены (\УО 96/39178). Например, было показано, что ВИЧ-производные антигенные компоненты вызывают иммунный ответ при доставке рекомбинантными аденовирусами (\УО 01/02607; \УО 02/22080; И8 6733993). В случае малярии были разработаны вакцины на основе рекомбинантных аденовирусов. Эти векторы экспрессируют полноразмерный белок С8 Р.уоеШ, одна из мышиных моделей малярии, и было показано, что в ответ на единичную дозу иммунизации эти векторы способны вызывать стерильный иммунитет у мышей (Втийа-Котего е! а1., 2001). Было показано, что такую защиту, индуцированную аденовирусом, главным образом, опосредуют СЭ8+ Т-клетки.

Поскольку высокий процент индивидуумов уже имеет иммунитет против обычно используемых аденовирусных векторов, таких как аденовирусный серотип 5 (Аб5), в данной области техники были разработаны новые методики, в которых рекомбинантные аденовирусы, дефектные по репликации, основаны на серотипах, которые уже вызывали иммунный ответ в виде нейтрализующих антител только у небольшого процента здоровых индивидуумов. Такие серотипы обычно называются слабо нейтрализуемыми серотипами или редкими серотипами. Было обнаружено, что Аб11, Аб24, Аб26, Аб34, Аб35, Аб48, Аб49 и Аб50 являются особенно эффективными (\УО 00/70071; XVО 02/40665; XVО 2004/037294; XVО 2004/083418; Уоде18 е! а1., 2003).

Вакцины на основе ДНК, содержащие плазмиды, которые экспрессируют белок С8, РТаШрашт, были разработаны Уюа1, 1пс. 8аи Э|едо. СА, США и Ыауа1 Меб1са1 Яекеатсй СеШет (Нот е! а1., 1995). Исследования на мышиной модели показали индукцию антиген-специфичного СТЬ и гуморального ответов после иммунизации плазмидной ДНК (Эоо1ап е! а1., 1998). Однако на сегодняшний день доказано, что одиночное применение ДНК-вакцин является недостаточным для индукции защитного иммунного ответа у людей. Было обнаружено, что при вакцинации ДНК-вакцины добровольцам антитела против белка С8 не вырабатывались, что было определено непрямым анализом с иммунофлуоресцентными антителами

- 2 016648 (непрямой ИФА) к высушенным на воздухе спорозоитам и ЕЫ8А к рекомбинантным и синтетическим пептидам (\Уапд с1 а1., 2001), хотя их СТЬ-ответы были значительными.

Напротив, подход, основанный на малярийной вакцине с К.Т8,8 (очищенный белок) (Согбоп с1 а1., 1995; и§ 6306625; XVО 93/10152), способен индуцировать устойчивый гуморальный ответ на белок С8 (Ке51ег с1 а1., 2001; 81ои1с с1 а1., 1997 и 1998), хотя она, вероятно, также вызывает клеточный иммунитет типа ТЫ и гуморальный иммунитет. Наиболее важным является тот факт, что такая вакцина повторно защищает приблизительно половину реципиентов. Однако защита, возникающая под действием КТ8,8, имеет короткий период действия (81ои1е е1 а1., 1998). Иммунизация КТ8,8 индуцирует геморальный ответ на С8 и СЭ4+ Т-зависимый ΙΕΝ-γ ответ, но слабо индуцирует СЭ8+ Т-зависимые СТЬ или ΙΕΝ-γ ответы (Ьа1уаш е1 а1., 1999). Тем не менее, в клинических тестах на людях было показано, что такие минимальные продуцируемые СЭ8+ ответы вызывают защиту (8ип е1 а1., 2003). Таким образом, было бы целесообразно сосредоточить попытки на усиление индукции СЭ8+ Т-клеточного ответа на С8, вызванного КТ8,8.

Остается нерешенной задача создания вакцины против тропической малярии, которая имеет эффективность защиты по меньшей мере 85%. Эта задача является особенно трудной, поскольку в отличие от других заболеваний со смертельным исходом, таких как корь или оспа, в случае малярии даже после перенесения заболевания и выработки естественного иммунитета отсутствует защита против повторной малярийной инфекции. Из всех вероятных кандидатов и подходов для доставки вакцины, протестированных на настоящий момент, только К.Т8,8 имеет некоторый постоянный уровень защиты. Другие протестированные кандидаты были либо неадекватно иммуногенными, либо иммуногеннными, но не обеспечивающими адекватную защиту. В настоящей заявке описаны стратегии объединения вакцинных композиций, созданные на преимуществе оптимальной серологической иммуногенности белок/адъювантного подхода наряду с прекрасной индукцией клеточного ответа, обеспечиваемого рекомбинантными аденовирусными векторами, дефектными по репликации.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - гетерологичные режимы первичной/бустерной вакцинации, за которыми следует измерение Т-клеточного ответа на С-терминальный конец С8 при помощи ΙΕΝ-γ ЕЬ18РОТ анализа. Ответ измеряли через две недели после последней бустерной вакцинации. Горизонтальные столбцы представляют среднее геометрическое;

фиг. 2 - Т-клеточный ответ на С-терминальный конец С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЬ18РОТ анализа. Ответ измеряли через три месяца после последней бустерной вакцинации. Горизонтальные столбцы представляют среднее геометрическое;

фиг. 3 - гуморальный ответ на область повтора С8, измеренный при помощи ЕЬ18А, через две недели после бустерной вакцинации. Горизонтальные столбцы представляют среднее геометрическое;

фиг. 4 - гуморальный ответ на область повтора С8, измеренный при помощи ЕЫ8А, через три месяца после бустерной вакцинации. Горизонтальные столбцы представляют среднее геометрическое;

фиг. 5 - Т-клеточный ответ в экспериментах первичной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и бустерной вакцинации ЕТ8.8 или А635-С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЬ18РОТ анализа через две недели (слева) или три месяца (справа). В качестве контроля использовали гомологичный режим первичной/бустерной/бустерной вакцинации К.Т8,8/К.Т8,8/К.Т8,8;

фиг. 6 - гуморальный ответ в экспериментах первичной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и бустерной вакцинации К.Т8,8 или А635-С8, измеренный при помощи ЕЫ8А анализа через две недели (слева) или три месяца (справа). В качестве контроля использовали гомологичный режим первичной/бустерной/бустерной вакцинации ВТ8,8/ВТ8,8/КТ8,8;

фиг. 7 - Т-клеточный ответ в экспериментах бустерной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и первичной вакцинации К.Т8,8 или А65-С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЫ8РОТ анализа через две недели (слева) или три месяца (справа), В качестве контроля использовали гомологичный режим первичной/бустерной/бустерной вакцинации К.Т8,8/К.Т8,8/К.Т8,8;

фиг. 8 - гуморальный ответ в экспериментах бустерной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и первичной вакцинации К.Т8,8 или А65-С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЫ8РОТ анализа через две недели (слева) или три месяца (справа). В качестве контроля использовали гомологичный режим первичной/бустерной/бустерной вакцинации К.Т8,8/К.Т8,8/К.Т8,8;

фиг. 9 - Т-клеточный ответ на Ν-терминальный конец С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЫ8РОТ анализа через две недели после бустерной вакцинации. Горизонтальные линии представляют среднее геометрическое;

фиг. 10 - Т-клеточный ответ на Ν-терминальный конец С8, измеренный при помощи ΙΕΝ-γ ЕЫ8РОТ анализа через три месяца после бустерной вакцинации. Горизонтальные линии представляют среднее геометрическое;

фиг. 11 - Т-клеточный ответ на Ν-терминальный конец в экспериментах первичной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и бустерной вакцинации К.Т8,8 или А635-С8, измеренный через две недели (слева) или три месяца (справа). В качестве контроля использовали гомологичный режим первич

- 3 016648 ной/бустерной/бустерной вакцинации ΚΤδ,δ/ΚΤδ,δ/ΚΤδ,δ;

фиг. 12 - Τ-клеточный ответ на Ν-терминальный конец в экспериментах бустерной вакцинации рекомбинантным вектором А635-С8 и первичной вакцинации ΚΤδ,δ или А65-С8, измеренный через две недели (слева) или три месяца (справа). В качестве контроля использовали гомологичный режим первичной/бустерной/бустерной вакцинации Κ.Τ§,§/Κ.Τ8,§/ΚΤ§,§.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к составному набору, содержащему дефектный по репликации рекомбинантный аденовирус с подходящим наполнителем, где указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген циркумспорозоита (С8), возбудителя малярии; и смешанный с адъювантом белковый антиген, предпочтительно также из возбудителя малярии; при этом указанный рекомбинантный аденовирус выбран из группы, состоящей из серотипов 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50 аденовируса человека. Предпочтительный белковый антиген содержит ΡΤ8,8. Предпочтительным возбудителем малярии является Р1а§тобшт Га1с1ратит.

В другом варианте осуществления изобретение также относится к применению дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии; и смешанный с адъювантом белковый антиген предпочтительно возбудителя малярии, такого как Р1а§тобшт Га1с1ратит, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики малярии, где указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой аденовирус обезьяны или серотип 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 или 50 аденовируса человека.

В настоящем изобретении описаны определенные предпочтительные режимы первичной бустерной вакцинации, где предпочтительными являются режимы, использующие дефектный по репликации рекомбинантный аденовирус в качестве композиции для первичной вакцинации, а смешанный с адъювантом белковый антиген используется в качестве композиции для бустерной вакцинации.

Настоящее изобретение также относится к способу вакцинации млекопитающего против малярийной инфекции, в котором предусмотрены этапы первичной вакцинации указанного млекопитающего рекомбинантным аденовирусом с нарушенной репликацией в соответствующем наполнителе, причем указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии; и бустерной вакцинации указанного млекопитающего смешанным с адъювантом белковым антигеном, предпочтительно ΒΤδ,δ.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к составному набору, содержащему дефектный по репликации рекомбинантный аденовирус в фармацевтически приемлемом наполнителе, причем указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген циркумспорозоита (С8) возбудителя малярии; и смешанный с адъювантом белковый антиген; при этом указанный рекомбинантный аденовирус выбран из группы, состоящей из серотипов 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50 аденовируса человека. Предпочтительно указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой серотип 35 аденовируса человека. Также предпочтительным является набор по настоящему изобретению, в котором указанный белковый антиген содержит белок С8 возбудителя малярии или его иммуногенный фрагмент. Указанный белковый антиген предпочтительно содержит гибридный белок, состоящий из белка С8, или его иммуногенный фрагмент слитого с ним с поверхностного антигена вируса гепатита В (НВхАд) в форме липопротеиновых частиц с НВхАд. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления белковый антиген содержит ΒΤδ,δ. Также предпочтительно, чтобы указанный белковый антиген был смешан с адъювантами 0821 и 3Ό-ΜΡΤ предпочтительно в композиции с липосомами, содержащими холестерин.

Хотя в данной области техники известно, что у человека малярию вызывают различные паразиты, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к составному набору по настоящему изобретению, в котором указанный возбудитель малярии представляет собой Р1а§тобшт ГаШрагит.

Для надлежащего иммунного ответа предпочтительным является, чтобы указанная гетерологичная нуклеиновая кислота была кодон-оптимизированной для усиленной продукции кодируемого белка у млекопитающего, предпочтительно у человека. Рекомбинантный аденовирус может находиться в смеси с адъювантом.

Тот факт, что аденовирусы обезьян могут использоваться в вакцинах или генной терапии людей, хорошо известен специалистам в данной области техники. Кроме того, было обнаружено, что другие нечеловеческие аденовирусы, например аденовирусы собаки или быка, инфицируют клетки человека ίη νίίτο и, следовательно, также применимы у человека, поскольку доминирование их серотипа в человеческих образцах является низким. Таким образом, изобретение также относится к составному набору, содержащему рекомбинантный аденовирус обезьяны, собаки или быка с нарушенной репликацией в фармацевтически приемлемом наполнителе, причем указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую кодон-оптимизированный антиген циркумспорозоита (С8) Р1а§тобшт Га1с1рагит; и смешанный с адъювантом белковый антиген, содержащий ΡΤ8,8, при этом указанный белковый антиген смешан с адъювантами 0821 и 3Ό-ΜΡΤ предпочтительно в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин.

В настоящем изобретении описано, что определенные режимы первичной бустерной вакцинации

- 4 016648 давали неожиданный и поразительный результат относительно иммунного ответа, если различные компоненты описанного составного набора вводили в определенном порядке. Таким образом, изобретение также относится к составному набору по настоящему изобретению, в котором указанный дефектный по репликации рекомбинантный аденовирус представляет собой композицию для первичной вакцинации, а белковый смешанный с адъювантом антиген представляет собой композицию для бустерной вакцинации. Иммунный ответ, вызываемый единичным (первичным) введением вакцины, часто не является достаточно сильным и/или устойчивым для обеспечения эффективной защиты. Повторное введение (бустерное) может значительно усилить гуморальный и клеточный ответы на антигены вакцины (например, см. ΕβΙсоий е! а1., 2002).

Изобретение также относится к применению дефектного по репликации аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии, и смешанный с адъювантом белковый антиген, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики малярии, причем указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой обезьяний, собачий, бычий аденовирус или серотип 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 или 50 аденовируса человека, где предпочтительно указанный дефектный по репликации аденовирус используется в качестве композиции для первичной вакцинации, а указанный смешанный с адъювантом белковый антиген используется в качестве композиции для бустерной вакцинации. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретение относится к применению по настоящему изобретению, в котором белковый антиген содержит белок С8 возбудителя малярии, предпочтительно Р1а8шобшш ГаШрагит. или его иммуногенный фрагмент. Указанный белковый антиген предпочтительно содержит гибридный белок, состоящий из белка С8 или его иммуногенного фрагмента, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита В (НВвАд), в виде липопротеиновых частиц с НВвАд. К.Т8,8 представляет собой предпочтительный смешанный с адъювантом белковый антиген, при этом предпочтительный адъювант представляет собой 0821 и ЗИ-МРЬ предпочтительно в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин.

Для оптимальной экспрессии, за которой следует оптимальный иммунный ответ у млекопитающих, предпочтительно людей, гетерологичная нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении, является кодон-оптимизированной для усиленной продукции кодируемого белка у млекопитающего, предпочтительно человека.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу вакцинации млекопитающего против малярийной инфекции, в котором предусмотрены этапы первичной вакцинации указанного млекопитающего рекомбинантным аденовирусом с нарушенной репликацией, находящимся в фармацевтически приемлемом наполнителе, причем указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии; и бустерной вакцинации указанного млекопитающего смешанным с адъювантом белковым антигеном, содержащим гибридный белок, состоящий из белка С8 или его иммуногенного фрагмента, слитого с НВвАд, в виде липопротеиновых частиц с НВвАд. Предпочтительно белковый антиген содержит К.Т8,8, причем предпочтительный адъювант представляет собой 0821 и ЗО-МРЬ предпочтительно в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин, где предпочтительным возбудителем малярии является Р1а8тобшт Га1с1рагит.

Предпочтительные аденовирусы, которые используются для получения рекомбинантного аденовируса и которые используются в способе по настоящему изобретению, могут быть аденовирусами человека или нечеловеческими аденовирусами, такими как аденовирусы обезьяны, собаки и быка, при этом особенно предпочтительным является использование аденовирусов, на которые не выработан иммунитет у (человека) хозяина, которому вводят рекомбинантный вирус. Очень подходящими в этом случае являются аденовирусы обезьян и некоторые серотипы аденовирусов человека, как описано в настоящем описании. Предпочтительные аденовирусы человека, которые используются для способа, применения и составного набора по настоящему изобретению, представляют собой серотипы 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50 аденовируса человека.

Изобретение также относится к способу вакцинации млекопитающего против малярийной инфекции при помощи составного набора по настоящему изобретению. Если составной набор по настоящему изобретению используется для вакцинации млекопитающего против малярийной инфекции с использованием предпочтительного режима первичной бустерной вакцинации, как описано в настоящем описании, то вслед за бустерной вакцинацией предпочтительно следует одна или несколько последующих бустерных вакцинаций.

Настоящее изобретение относится к применению рекомбинантного аденовируса в качестве носителя по меньшей мере одного малярийного антигена, который используется в гетерологичной комбинации с одним из смешанных с адъювантом белков в режиме первичной/бустерной вакцинации. Обнаружено, что комбинация вирусного вектора и смешанного с адъювантом белка в гетерологичном режиме первичной/бустерной вакцинации дает эффективный иммунный ответ у приматов в единицах исходного Тклеточного ответа и продолжительности иммунного ответа. В частности, было обнаружено, что первичная вакцинация млекопитающего вирусным вектором, несущим нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, вслед за которой следует бустерная вакцинация либо одной, либо многократной инъекцией смешанного с адъювантом белкового антигена, дает хорошие результаты в качественных и/или количе

- 5 016648 ственных показателях иммунного ответа. Предпочтительные вирусные векторы представляют собой аденовирусные векторы, более предпочтительно аденовирусные векторы человека и еще более предпочтительно аденовирусные векторы человека, которые вызывают низкий уровень нейтрализующей активности у млекопитающего-хозяина, которому он введен. Наиболее предпочтительными серотипами являются аденовирусы 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 и 50.

Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления белковый антиген и антиген, кодируемый вирусным вектором, представляют собой малярийный антиген, более предпочтительно белок циркумспорозоита (С8) Р1актобшт £а1с1рашт или его иммуногенные производные/фрагменты. В качестве иллюстрации этой концепции полипептид, кодируемый вирусным вектором, содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок С8 Р.£а1с1ратит, включая Ν-терминальную часть, область повтора центральной части и С-терминальную часть (с делецией 14 аминокислот, наиболее близко расположенных к С-терминальной части: СР1 якорной последовательности), при этом белковый антиген содержит конструкцию К.Т8,8, в которой отсутствует Ν-терминальная часть.

Смешанный с адъювантом белковый антиген, использующийся в любом или всех аспектах изобретения, может содержать белок С8 Р.£а1с1ратит или его иммуногенный фрагмент, который может находиться в виде слитого белка. Например, антиген может содержать гибридный белок, состоящий из белка С8 или его иммуногенного фрагмента, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита В (НВкАд), где гибридный белок может экспрессироваться прокариотическими или эукариотическими клеткамихозяевами и может принимать форму липопротеиновых частиц. Слитый белок может содержать, например, по существу, всю С-терминальную часть белка С8, четыре или более тандемных повтора иммунодоминантной области и поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд). Например, гибридный белок содержит последовательность, которая содержит по меньшей мере 160 аминокислот и которая, по существу, гомологична С-терминальной части белка С8 и может быть лишена концевых аминокислот Стерминальной части белка С8, например последних 10-12 аминокислот. Гибридный белок может находиться в форме смешанных липопротеиновых частиц, например с НВкАд.

В частности, таким белком является гибридный белок, описанный в ν0 93/10152, обозначенный как К.Т8*, но в настоящем описании упоминаемый как К.Т8, который может находиться в форме смешанных липопротеиновых частиц с НВкАд, в настоящем описании обозначаемых как К.Т8,8. Отношение гибридный белок: антиген 8 в этих смешанных частицах составляет, например, 1:4.

Гибридный белок, обозначаемый в настоящем описании К.Т8, получен используя генную последовательность белка С8 Р.£а1с1ратит ΝΓ54 (клон 3Ό7; Сакрегк е! а1., 1989) и содержит, по существу, всю область 207-395 белка С8 Р.£а1с1ратит ΝΓ54. Часть последовательности белка С8 ΝΓ54 (3Ό7), которая включена в К.Т8, представляет собой нижеследующую последовательность, состоящую из 189 аминокислот:

ΟΡΝΑΜΡΝΑΝΡ ΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ ΝΡΝΑΝΡΝΆΝΡ ΝΑΝΡΝΑΙ'ΤΡΗΑ ΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡ

ΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ ΝΡΝΆΝΡΝΑΝΡ ЫАЫРЫЮШОС ΝΟΟΟΗΝΜΡΝΟ ΡΠΡΙΓΤΌΞΝΆΝ ΑΝΒΑνΚΗΝΝΝ ΕΕΡ8ΏΚΗΙΚΕ УЮПСТрМЗЬЗ ТЕСТЕРСЕУТЕ ΕΠαϊΏνΚΙΚΡ (ЗЗАЫКРКОЕЬ ϋΥΑΝΏΙΕΚΚΙ СКМЕКСЗЗУЕ ЩЛШЗЗЮЬ (ЗЕ<2 ТО N0:1} .

В частности, К.Т8 представляет собой метиониновый остаток, кодируемый нуклеотидами 1059-1061, полученными из генной последовательности ТОН3 8ассйатотусек сегеуыае (нуклеотиды 1-1058 в этой рамке считывания составляют промотер собственно ТЭН3) (Микй е! а1., 1983);

три аминокислоты: Ме!, А1а, Рго, полученные из нуклеотидной последовательности (1062-1070), созданной процедурой клонирования, которая используется для конструирования гибридного гена;

отрезок из 189 аминокислот (приведенны выше, 8ЕО Ш N0:1), кодируемый 1071-1637, соответствующий аминокислотам 207-395 белка С8 линии ΝΓ54 Р.£а1с1ратит (клон 3Ό7; Сакрегк е! а1., 1989);

аминокислоту (С1у), кодируемую нуклеотидами 1638-1640, созданными процедурой клонирования, которая используется для конструирования гибридного гена;

четыре аминокислоты Рго Уа1 Тйт Акп, кодируемые нуклеотидами 1641-1652, которые представляют четыре карбоксиконцевых остатка белка рге82 вируса гепатита В (Уа1еп2ие1а е! а1., 1979);

отрезок из 226 аминокислот, кодируемых нуклеотидами 653-2330, определяющий белок 8 вируса гепатита В (серотип аб\т) (Уа1еп2ие1а е! а1., 1979).

К.Т8 может находиться в форме смешанных частиц, К.Т8,8, где отношение К.Т8:8 составляет, например, 1:4.

Хотя изобретение не ограничивается малярийными антигенами, далее оно будет подробно описано на примере использования вирусных векторов, кодирующих малярийный антиген в комбинации со смешанным с адъювантом белковым малярийным антигеном. Специалисты в данной области техники могут модифицировать общую методику, представленную в настоящем описании, используя различные антигенные вставки и соответствующие белковые антигены других патогенных агентов, включая паразитов, бактерий, вирусы, дрожжи и даже сами антигены, включая, без ограничений, раковые антигены (например, Р8А, др100, СЕА, МИС1, Нег2/пеи и т.п.).

- 6 016648

Настоящее изобретение относится к дефектному по репликации рекомбинантному аденовирусному вектору, содержащему последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген Р1а§то6шт ГаШрагит. В предпочтительном варианте осуществления указанный вирусный вектор представляет собой аденовирус, полученный из серотипа, выбранного из группы, состоящей из Л611, Л624, А626, Л634, Л635, Л648, Л649 и Л650. Причина такого выбора аденовирусов человека заключается в сложности широкого использования аденовирусов в качестве вакцинных векторов вследствие регулярного инфицирования людей аденовирусом дикого типа, который вызывает легкую или бессимптомную форму заболеваний, таких как простуда. Иммунный ответ, возникающий во время такой инфекции исходным серотипом дикого типа, может негативно повлиять на эффективность серотипа рекомбинантного аденовируса при его использовании в качестве последующего рекомбинантного вакцинного вектора, например вакцины против малярии, в которой используются аденовирусы. Распространенность различных аденовирусных серотипов в мировой человеческой популяции изменяется от одной географической области к другой. Как правило, предпочтительными серотипами являются серотипы, вызывающие низкую нейтрализующую активностью у большинства людей в мире, как отмечается в некоторых сообщениях, относящихся к данной области техники.

Авторы настоящего изобретения разработали новую комбинацию рекомбинантного аденовируса с очищенным белком в схеме последовательной вакцинации, названной гетерологичной первичной/бустерной, причем в схеме используются разные иммунные ответы, индуцируемые разными компонентами первичной/бустерной вакцины. Выбор рекомбинантного вектора связан с серотипами, которые вызывают нейтрализующей активностью у небольшого процента человеческой популяции, нуждающейся в вакцинации. Неожиданно было обнаружено, что комбинация антигена, кодируемого аденовирусным вектором, и смешанного с адъювантом белкового антигена обеспечивает значительное усиление иммунного ответа по сравнению с иммунным ответом, наблюдаемым при применении каждой вакцины по отдельности. Усиление иммунного статуса продемонстрировано посредством ίη νίΐτο обнаружения иммунного ответа ίη νίνο у макак-резус, как описано в настоящем описании.

В другом варианте осуществления дефектный по репликации рекомбинантный аденовирус представляет собой аденовирус обезьяны, такой как аденовирус, выделенный из шимпанзе. Примерами таких подходящих аденовирусов являются С68 (также известный, как Рап 9; И8 6083716) и Рап 5, 6 и 7 (νθ 03/046124).

В одном конкретном аспекте изобретения дефектный по репликации рекомбинантный вирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок С8 или его иммуногенную часть или фрагмент. Предпочтительно указанная последовательность гетерологичной нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для усиления экспрессии у млекопитающего, предпочтительно у человека. Оптимизация кодонов основана на требуемом содержании аминокислот, обычном использовании оптимального кодона у представляющего интерес млекопитающего и ряде аспектов, которые следует учитывать для гарантии надлежащей экспрессии. Такие аспекты могут представлять собой сплайсирование донорных или акцепторных сайтов, стоп-кодонов, СЫ-сайтов, поли(Л) отрезков, ОС- и ЛТ-богатых последовательностей, внутренних ТЛТЛ-боксов и т.д. Способы оптимизации кодонов у млекопитающих-хозяев хорошо известны специалистам в данной области техники, и их можно найти в публикациях по молекулярной биологии.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к дефектному по репликации рекомбинантному аденовирусному вектору по настоящему изобретению, в котором содержание аденина плюс тимина в указанной гетерологичной нуклеиновой кислоте по сравнению с содержанием цитозина плюс гуанина ниже 87%, предпочтительно ниже 80%, более предпочтительно ниже 59% и наиболее предпочтительно равно приблизительно 45%. В одном из вариантов осуществления изобретение предоставляет дефектный по репликации рекомбинантный аденовирусный вектор, в котором белок С8 представляет собой любой белок С8, как раскрыто в νθ 2004/055187, более предпочтительно белок С8 Р.ГаШрагит или его иммуногенный фрагмент.

Создание рекомбинантных аденовирусных векторов, содержащих гетерологичные гены, хорошо известно в данной области техники и обычно включает использование пакующей клеточной линии, адапторных конструкций и космид и делеции по меньшей мере части генома (см. также ниже пакующие системы и предпочтительные клеточные линии).

Изобретение также относится к наборам, содержащим в качестве компонентов, с одной стороны, рекомбинантный аденовирусный вектор, который вызывает низкую нейтрализующую активность у хозяина, а с другой стороны, очищенный белок, причем предпочтительным является случай, когда очищенный белок находится в смеси с адъювантом. Предпочтительным адъювантом является 0821 и 3ΌМРЬ предпочтительно в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин. Компоненты используются в стратегии доставки гетерологичной первичной/бустерной вакцины, в которой предпочтительным является введение первым рекомбинантного вирусного вектора в качестве первичного агента, а затем очищенного белка в качестве бустерного агента, причем бустерная вакцинация может повторяться более одного раза. Компоненты обычно находятся в фармацевтически приемлемых носителях. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники и имеют достаточно ши

- 7 016648 рокую область применений в терапевтических продуктах. Предпочтительно используются носители, которые эффективны для вакцин. Более предпочтительными являются вакцины, дополнительно содержащие адъювант. Адъюванты хорошо известны в данной области техники как дополнительно усиливающие иммунный ответ на используемый антиген. Изобретение также относится к использованию набора по настоящему изобретению в терапевтическом, профилактическом или диагностическом лечении малярии.

Настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего от малярийной инфекции или защиты млекопитающего от малярийной инфекции, причем в указанном способе (в любом порядке или одновременно) предусмотрены этапы введения рекомбинантного аденовируса, несущего антиген Р. Га1с1рагит; и введение по меньшей мере одного очищенного белка Р.ГаШратит, при этом указанный белок смешан с адъювантом. Предпочтительно рекомбинантный аденовирус выбран из группы, состоящей из А611, А624, А626, А6З4, А6З5, А648, А649 и А650, при этом предпочтительным случаем также является случай, когда рекомбинантный аденовирус содержит ген, кодирующий белок С8 или его иммуногенный фрагмент. Предпочтительный очищенный белок, который используется в комбинации с рекомбинантным аденовирусом, представляет собой ΒΤ8,8, при этом предпочтительным адъювантом является 0821 и ЗО-МРЬ предпочтительно в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин.

Движущей силой после развития иммунного ответа являются цитокины, некоторые идентифицированные белки-мессенджеры, которые оказывают содействие клеткам иммунной системы и направляют возможное развитие иммунного ответа либо по типу ΤΕ1, либо по типу Τ112. Таким образом, высокие уровни цитокинов типа Τ111 способствуют индукции клеточно-опосредованного иммунного ответа на данный антиген, в то время как уровни цитокинов типа Τ112 способствуют индукции гуморального иммунного ответа на указанный антиген. Интересно отметить, что разница между иммунным ответом типа Τ111 и типа Τ112 не является абсолютной. В действительности, у индивидуума может быть иммунный ответ, который описывается, иммунный ответ с преобладанием компонента Τ111 или компонента Τ112. Однако обычно семейство цитокинов рассматривается в терминах, как это описано у Моктапп и СоГГтап (1989) для мышиных СЭ4+ Τ-клеточных клонов. Обычно, ответ типа ΤΗ1 связан с продукцией Тлимфоцитами цитокинов ΙΝΤ-γ и 1Ь-2. Другие цитокины, которые часто связаны непосредственно с индукцией иммунного ответа типа 1Ы, не продуцируются Τ-клетками, например Ш-12. Напротив, ответ типа Τ112 связан с секрецией 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Б-10 и фактора некроза опухоли (ΤΝΡ-55).

Подходящие адъюванты для использования по изобретению включают соль алюминия, например гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированные сахара, катионные или анионные полисахариды, полифосфазены или липосомы с монтанидами.

В лекарственной форме вакцин для использования по изобретению в контексте аденовирусного вектора адъювант может вводиться или нет. В случае белкового компонента комбинации композицию адъюванта можно выбирать так, чтобы индуцировать предпочтительно Τ111 ответ. Однако также могут быть индуцированы другие типы ответа, включая гуморальный ответ других типов.

Определенные адъюванты, использующиеся в вакцинах, являются особенно подходящими для стимуляции ответа посредством цитокинов либо типа 1Ы, либо типа Τ112. Обычно, лучшие индикаторы баланса Τ1ι1:Τ1ι2 иммунного ответа после вакцинации или инфекции включают непосредственное измерение уровня продуцирования ίη νίΐτο Τ-лимфоцитами цитокинов ΤΗ1 или Τ112 после повторной стимуляции антигеном и/или измерение отношения 1дО1:1дО2а антиген-специфического гуморального ответа. Таким образом, адъювант типа Τ111 представляет собой адъювант, который стимулирует изолированные Τ-клеточные популяции продуцировать высокие уровни цитокинов типа Τ111 при повторной стимуляции ίη νίΐτο антигеном и индуцирует антиген-специфический иммуноглобулиновый ответ, связанный с изотипом типа 1Ы. Например, иммуностимуляторы типа ΤΕ1, которые могут быть включены в лекарственную форму для продукции адъювантов, подходящих для применения в настоящем изобретении, могут включать монофосфориллипид А, в частности З-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (ЗП-МРЬ). 30-МРБ представляет собой хорошо известный адъювант, который производится ΡίΝ 1ттипосйет, МоШапа. С точки зрения химического состава он часто используется в виде смеси З-де-Оацилированного монофосфориллипида А либо с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Он может быть очищен и получен способами, описанными в ОВ 2122204 В, который в качестве ссылки также раскрывает получение дифосфориллипида А и его З-О-деацилированные варианты. Описаны другие очищенные и синтетические липополисахариды (патент США 6005099, ЕР 072947З В1, ЕР 0549074 В1). В одном из вариантов осуществления ЗО-МРБ находится в виде мелкодисперсной лекарственной формы, содержащей небольшие частицы, диаметр которых меньше чем 0,2 мкм, и этот способ производства раскрыт в ЕР 0689454.

Сапонины представляют собой другой пример иммуностимуляторов 1Ы, которые могут использоваться в изобретении. Сапонины являются хорошо известными адъювантами. Например, Οιιίΐ А (получаемый из коры хинного дерева Ош11а)а 8аропапа Мойпа, произрастающего в Южной Америке) и его фракции описаны в патенте США 5057540 и ЕР 0З62279 В1. Гемолитические сапонины 0821 и 0817 (ВЭЖХ-очищенные фракции Οιιίΐ А) описаны как потенциальные системные адъюванты, и способ их

- 8 016648 получения раскрыт в патенте США 5057540 и ЕР 0362279 В1. Также в этих ссылках описывается применение 087 (негемолитическая фракция Οιιίΐ-Λ). который действует как потенциальный адъювант для системных вакцин. Также хорошо известны комбинации 0821 и полисорбата или циклодекстрина (XVО 99/10008). Мелкодисперсные адъювантные системы, содержащие фракции ΟιιίΙΛ. такие как 0821 и 087. описаны в νθ 96/33739 и νθ 96/11711.

Другим примером иммуностимулятора является иммуностимуляторный олигонуклеотид. содержащий неметилированные динуклеотиды СрО. СрО является аббревиатурой мотива динуклеотида цитозингуанозин. присутствующего в ДНК. СрО известен в данной области техники как адъювант как для системного. так и мукозального способа введения (νθ 96/02555. ЕР 0468520). Было обнаружено. что фракция ДНК бациллы Са1теИе-Оиепп (ВСО) может оказывать противораковый эффект. В дальнейших исследованиях было показано. что синтетические олигонуклеотиды. полученные из генных последовательностей ВСО. способны индуцировать иммуностимуляторные эффекты (как ίη νίΐτο. так и ίη νΐνο). Авторы этих исследований пришли к заключению. что определенные палиндромные последовательности. включая центральный мотив СО. обладают такой активностью. Подробный анализ показал. что мотив СО должен находиться в контексте определенной последовательности и что такие последовательности обычно встречаются в бактериальных ДНК. но являются редкими для ДНК позвоночных. Иммуностимуляторная последовательность часто представляет собой пурин. пурин. С. О. пиримидин. пиримидин; где мотив СО не является метилированным. но известно. что другие неметилированные СрО последовательности являются иммуностимуляторными и могут использоваться в настоящем изобретении.

В определенных комбинациях шести нуклеотидов может присутствовать палиндромная последовательность. В одном и том же нуклеотиде могут присутствовать некоторые из таких мотивов либо в виде повторов одного мотива. либо в виде комбинации разных мотивов. Наличие одного или нескольких из таких олигонуклеотидов. содержащих иммуностимуляторные последовательности. может активировать различные иммунные поднаборы. включая естественные клетки-киллеры (которые продуцируют γинтерферон и имеют цитолитическую активность) и макрофаги. Показано. что другие неметилированные СрО. содержащие последовательности. не имеющие этой консенсусной последовательности. также могут быть иммуномодуляторными. При составлении лекарственной формы вакцины СрО обычно вводят в виде свободного раствора вместе со свободным антигеном (νθ 96/02555. 68) или ковалентно конъюгированным с антигеном (νθ 98/16247). или в составе лекарственной формы с носителем. таким как гидроксид алюминия (поверхностный антиген гепатита).

Иммуностимуляторы. такие как описано выше. могут находиться в лекарственной форме совместно с носителями. такими как. например. липосомы. эмульсии масло-в-воде. и/или солями металлов. включая соли алюминия (такие как гидроксид алюминия). Например. 30-МРБ может находиться в лекарственной форме с гидроксидом алюминия (ЕР 0689454) или эмульсиями масло-в-воде (νθ 95/17210); 0821 преимущественно может находиться в лекарственной форме с липосомами. содержащими холестерин (νθ 96/33739). с эмульсией масло-в-воде (νθ 95/17210) или с квасцами (νθ 98/15287); СрО может находиться в лекарственной форме с квасцами или с другими катионными носителями.

Также могут использоваться комбинации иммуностимуляторов. такие как комбинация монофосфориллипида А и производного сапонина (νθ 94/00153; νθ 95/17210; νθ 96/33739; νθ 98/56414; νθ 98/05355; νθ 99/12565; νθ 99/11241) или комбинация 0821 и 3Ό-ΜΡΕ. как раскрыто в νθ 94/00153. В качестве альтернативы в настоящем изобретении также может быть использована комбинация СрО плюс сапонин. такой как 0821. Таким образом. подходящие адъювантные системы включают. например. комбинацию монофосфориллипида А. такого как 3Ό-ΜΡΕ. с солью алюминия. В другом варианте осуществления объединены монофосфориллипид А и производное сапонина. например комбинация 0821 и 3ΌМРЬ. как раскрыто в νθ 94/00153. или менее реактивная композиция. в которой 0821 находится внутри липосом. содержащих холестерин (Ό0). как раскрыто в νθ 96/33739. Другая лекарственная форма адъюванта. включающая 0821. 30-МРБ и токоферол в эмульсии масло-в-воде. описана в νθ 95/17210. В другом варианте осуществления олигонуклеотиды СрО используются отдельно или совместно с солью алюминия.

Подходящий адъювант для использования в настоящем изобретении предпочтительно представляет собой адъювант. стимулирующий ТМ. например адъювант. содержащий сапонин. такой как 0821. или производное монофосфориллипида А. такое как 30-МРБ. или адъювант. содержащий оба компонента необязательно вместе с липосомами. содержащими холестерин. Комбинация 0821 и 30-МРБ в лекарственной форме с липосомами. содержащими холестерин. раскрыта. например. в νθ 96/33739.

Преимущества настоящего изобретения многочисленны. Рекомбинантные вирусы. такие как рекомбинатные аденовирусы. могут вырабатываться в очень высоких титрах путем использования клеток. которые считаются безопасными и которые могут расти в суспензии до больших объемов. используя среду. которая не содержит никаких компонентов животного или человеческого происхождения. Также известно. что рекомбинантные аденовирусы вызывают сильный иммунный ответ против белка. кодируемого последовательностью гетерологичной нуклеиновой кислоты в аденовирусном геноме. Настоящее изобретение объединяет эти особенности путем использования вектора. содержащего ген циркумспорозоита Р.1а1е1рагит. и использования смешанного с адъювантом белка для бустерных ответов. Более того. ген

- 9 016648 является кодон-оптимизированным, обеспечивая уровень экспрессии, который является подходящим для того, чтобы вызвать присущий людям иммунный ответ. Настоящее изобретение относится к вакцине против малярийных инфекций с использованием аденовирусов, которые не встречаются с высокими титрами нейтрализующих антител. Более предпочтительные антивирусы для этой цели представляют собой серотипы 11 и 35 (А611 и А635, см. АО 00/70071 и АО 02/40665).

Содержание нуклеиновой кислоты у патогена возбудителя малярии, такого как Р.ГаЮрагиш. сильно отличается от ее содержания у представляющего интерес хозяина, такого как Ното 5ар1еп5. Изобретение предоставляет кодон-оптимизированные нуклеиновые кислоты, обеспечивающие более высокие уровни экспрессии у млекопитающих, таких как человек.

Использование различных сущностей для режимов первичной/бустерной вакцинации, как раскрыто в настоящем описании, предоставляет способ вакцинации, который обеспечивает надлежащий иммунный ответ, как клеточной, так и гуморальной формы ответов иммунной системы. Он включает СЭ8+ Тклетки, СЭ4+ Т-клетки и антитела. Ни одна из этих вакцин при использовании по отдельности не дает устойчивого иммунного ответа, который вызывает оптимальные уровни антиген-специфических СЭ8+ Т-клеток, СЭ4+ Т-клеток и антител. Более того, порядок, в котором вводят различные компоненты, может изменять иммунный ответ и может давать в результате различные периоды возможной защиты против будущих инфекций. Способы и наборы настоящего изобретения позволяют вызывать иммунный ответ, который воздействует на все различные стадии жизненного цикла паразита в организме человека, от свободных спорозоитов и мерозоитов до инфицированных гепатоцитов и ВВС. Кроме того, изобретение обеспечивает устойчивую защиту против малярийных инфекций в течение более длительного периода времени.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению рекомбинантных аденовирусов, которые дефектны по репликации в результате удаления в аденовирусном геноме по меньшей мере части области Е1, поскольку область Е1 необходима для процессов репликации, транскрипции, трансляции и упаковки вновь образованного аденовируса. Векторы с удаленной Е1 обычно получают на клеточных линиях, которые комплементарны функциям удаленной Е1. Такие клеточные линии и их использование для продукции рекомбинатных вирусов достаточно широко описаны и хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно клетки РЕВ.С6©, представленные клетками, хранящимися под депозитным номером ЕСАСС 96022940 в европейской коллекции животных клеточных культур (ЕСАСС) в СегШе Гог Арр11е6 М1стоЫо1о§у аиб Векеагсй (САМЕ, ИК) или их производные используются для того, чтобы предотвратить продуцирование аденовирусов с компетентной репликацией (гса). В другом предпочтительном варианте осуществления используются клетки, которые поддерживают рост рекомбинантных аденовирусов, отличных от аденовирусов, полученных для серотипа 5 аденовируса (А65). В публикациях АО 97/00326, АО 01/05945, АО 01/07571, АО 00/70071, АО 02/40665 и АО 99/55132 раскрыты способы и средства получения штаммов аденовирусов без гса для А65, а также другие серотипы аденовирусов, которые могут продуцироваться в клетках НЕЕ, иммортализованных Е1 из А635, или клетках С6©, которые дополнительно содержат гены Е1 из А635 для обеспечения надлежащей комплементации аденовирусов В-типа.

Необходимо отметить, что в опубликованных документах АО 00/03029, АО 02/24730, АО 00/70071 и АО 02/40665 А650 ошибочно назван А651. Серотип А651, на который ссылаются в вышеуказанных публикациях, является таким же, как серотип А650 в статье Эе 1ои§ е1 а1. (1999), в которой он обозначен как аденовирус группы В. Для ясности, А650, как используется в настоящем описании, представляет собой серотип А650 группы В, как упоминается у Ое 1ои§ е1 а1. (1999).

Вакцины настоящего изобретения обычно используются в первичных/бустерных наборах, например А6/белок; белок/А6; белок/А6/А6; А6/белок/А6; А6/А6/белок, А6/белок/белок/белок, А6/белок/вирусный вектор/белок и т.д. Можно предположить, что использование комбинации с другим видом вакцины (такой как голая ДНК или рекомбинантный вирусный вектор, отличный от аденовируса) может использоваться в сочетании с первичными/бустерными агентами настоящего изобретения. Также могут использоваться дополнительные малярийные антигены или (поли)пептиды.

Последовательность получена, как используется в настоящем описании, если нуклеиновая кислота может быть получена путем прямого клонирования из последовательностей дикого типа, полученных из вирусов дикого типа, хотя они, например, также могут быть получены при помощи ПЦР с использованием различных участков ДНК, в качестве матрицы. Это также означает, что такие последовательности могут находиться в виде дикого типа, а также в измененном виде. Другим вариантом получения такого же результата является комбинирование синтетической ДНК. Также следует отметить, что полученная не означает исключительно прямое клонирование ДНК дикого типа. Специалистам в данной области техники также известны возможности молекулярной биологии для получения мутантных форм определенных участков нуклеиновой кислоты. Термины функциональная часть, ее производное и/или аналог следует рассматривать как эквиваленты нуклеиновой последовательности, к которой они относятся. Специалистам в данной области техники известен тот факт, что определенные делеции, замены, (точечные) мутации, вставки и т.п., тем не менее, могут приводить к последовательности нуклеиновой

- 10 016648 кислоты, которая имеет функцию, аналогичную последовательности исходной нуклеиновой кислоты, и будут продуцировать аналогичные или даже идентичные полипептиды после трансляции. Следовательно, также является очевидным, что такие изменения, которые незначительно изменяют функциональность последовательностей нуклеиновых кислот, входят в объем настоящего изобретения. Если определенный аденовирусный вектор получен из определенного предпочтительного аденовирусного серотипа, также является очевидным, что конечный продукт может быть получен опосредованными способами, такими как прямое клонирование или синтез определенных участков геномной ДНК, используя методики, известные в данной области техники. Определенные делеции, мутации и другие изменения содержимого генома, которые не изменяют специфические аспекты изобретения, тем не менее, рассматриваются как часть изобретения. Примерами таких замен являются, например, делеции в каркасе вируса для получения возможности клонировать большие участки гетерологичных нуклеиновых кислот. Примерами таких мутаций являются, например, делеции Е3 или делеции и/или замены в областях, кодирующих белки Е2 и/или Е4 аденовируса. Такие изменения, применяемые в отношении каркаса аденовируса, известны в данной области техники и часто используются, поскольку длина представляет собой лимитирующий фактор для упаковки аденовируса; это является основной причиной удаления определенных частей аденовирусного генома. Другие причины изменения областей Е2, Е3 и/или Е4 генома могут относиться к стабилизации или целостности аденовирусного вектора, как, например, описано в XVО 03/104467 и ХУО 2004/001032. Такие применения относятся, помимо прочего, к использованию гена Е4огГ6 из серотипа из одной подгруппы в каркасе аденовируса из другой подгруппы для того, чтобы гарантировать совместимость активности Ε4οτί6 с Е1В-55К активностью во время репликации и упаковки в пакующей клеточной линии. Они также относятся к использованию надлежащего функционирующего промотора р1Х для получения более высоких уровней экспрессии р1Х и более стабильного рекомбинантного аденовирусного вектора.

Дефектный по репликации, как используется в настоящем описании, означает, что вирусные векторы не реплицируются в некомплементарных клетках. В комплементарных клетках функции, необходимые для репликации, и, следовательно, продукции вирусного вектора, обеспечиваются комплементарной клеткой. Дефектные по репликации вирусные векторы настоящего изобретения не содержат все элементы, предоставляющие возможность для репликации в любой клетке-хозяине, отличной от комплементарной клетки.

Гетерологичный, как используется в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот, означает, что последовательность нуклеиновой кислоты получена из исходного источника, отличного от варианта дикого типа вирусных векторов, в которые клонирована гетерологичная нуклеиновая кислота. Например, в случае аденовирусов гетерологичная нуклеиновая кислота, которая клонирована в аденовирусный вектор с нарушенной репликацией, не является последовательностью нуклеиновой кислоты аденовируса, а происходит из другого представляющего интерес патогенного агента.

Гетерологичный, как используется в настоящем описании в отношении стратегий первичнойбустерной вакцины, означает, что два или более отдельных компонента, представленные, например, одним рекомбинантным нереплицирующимся аденовирусным вектором и одним смешанным с адъювантом белком, используемые в заданной комбинации, а не в виде одного компонента, вводятся многократно, как в настоящее время обычно происходит в данной области.

Антиген, как используется в настоящем описании, означает любой антиген, полученный из источника, который вызывает иммунный ответ у хозяина, в который доставлен (введен) детерминант. Антиген может быть антигеном внешнего источника, например патогеном, паразитом или даже может представлять собой аутоантиген. Примеры антигенов Иакшобшш, которые могут быть доставлены при помощи рекомбинантных вирусов с нарушенной репликацией, настоящего изобретения представляют собой белок циркумспорозоита (С8), полипептид 8Е36, С-терминальный полипептид поверхностного белка-1 мерозоита 19 кЭа (М8Р-1р19), М8Р-1, М8Р-1р42, антиген-1 апикального мерозоита (АМА-1), антиген 1 печеночной фазы (Ь8А-1), или антиген 3 печеночной фазы (Ь8А-3), или фрагмент любого из вышеуказанных. В предпочтительном аспекте изобретение относится к белку циркумспорозоита (С8) Р.Га1с1рагиш.

Кодон-оптимизированный, как используется в настоящем описании, означает, что содержимое последовательности нуклеиновой кислоты изменено для поддержания достаточно высоких уровней экспрессии представляющего интерес белка в организме-хозяине, которому доставлен ген, кодирующий указанный белок. Достаточно высокие уровни экспрессии в этом контексте означают, что уровни белка должны быть достаточно высокими для того, чтобы вызвать иммунный ответ у хозяина для защиты от инфекции или болезни. В данной области техники известно, что некоторые вакцины вызывают у людей иммунный ответ, благодаря которому приблизительно 60% вакцинированных индивидуумов защищены от заболеваний, индуцируемых последующей стимуляцией патогеном (например, спорозоитами). Следовательно, считается, что уровни экспрессии являются достаточными, если 60% или более подвергнутых обработке индивидуумов защищены от последующих инфекций. Предполагается, что такой процент можно получить путем комбинации аденовирусных аспектов, которые могут быть применены, и выбора антигена, как раскрыто в настоящем описании. Предпочтительно защищенными являются 85% индиви

- 11 016648 дуумов, хотя наиболее предпочтительна защита от последующего заражения более 90% вакцинированных хозяев. Нуклеиновые кислоты, раскрытые в настоящем описании, являются кодоноптимизированными для экспрессии в организме человека. Согласно Нагит с1 а1. (2001) содержание аденина плюс тимина (А+Т) в ДНК у Ното 8ар1еи8 составляет приблизительно 59% по сравнению с процентом цитозина плюс гуанина (С+С). Содержание аденина плюс тимина в Р.1а1с1ратит составляет примерно 80%. Содержание аденина плюс тимина в С8 гене Р.1а1с1ратит составляет примерно 87%. Для получения достаточной защиты считается, что необходимо улучшить уровни продукции у хозяина. Одним из способов достижения этого является настройка использования кодона, сохраняя при этом ту же самую окончательную аминокислотную последовательность, но используя последовательности кодонов, более типичные для экспрессии у млекопитающих. Для этого рекомбинантные вирусные векторы, дефектные по репликации, по изобретению имеют содержание аденина плюс тимина в гетерологичных нуклеиновых кислотах настоящего изобретения менее 87%, предпочтительно менее 80% и более предпочтительно менее или равное приблизительно 59%. Основываясь на использовании кодона у человека и содержимом аминокислотной последовательности генов С8 Р.1а1с1ратит и уоеШ, указанное процентное содержание в кодон-оптимизированных генах было даже ниже и достигало приблизительно 45% содержания данных аминокислот, как описано в настоящем изобретении. Следовательно, если рассматриваются гены С8, предпочтительно, чтобы содержание аденина плюс тимина составляло приблизительно 45%. Необходимо отметить, что если обрабатываются другие виды, отличные от человека, которые могут иметь другую концентрацию аденина плюс тимина (меньше или больше 59%) и/или другое использование кодона, то такие гены, кодирующие белки С8 настоящего изобретения, могут быть откорректированы таким образом, чтобы они соответствовали требуемому содержанию и давали увеличение до подходящих уровней экспрессии для данного конкретного хозяина. Конечно, нельзя исключить то, что небольшие изменения в содержании могут привести к слабым изменениям в уровнях экспрессии в различных географических областях мира. Также следует отметить, что слабые изменения в количестве повторов в аминокислотной последовательности белков могут изменить соответственно процентное содержание. Другие представляющие интерес антигены могут быть модифицированы аналогичным способом. Все такие откорректированные содержания представляют собой часть настоящего изобретения.

Белок, обозначенный К.Т8,8, представляет собой слитый белок, состоящий из С-терминальной половины белка С8 РТаШратит (17 из центральных 41 ΝΑΝΡ-повторов плюс большая часть Стерминального участка), экспрессируемого в виде слитого белка с поверхностным антигеном гепатита В.

Одно из преимуществ, обеспечиваемых дефектными по репликации аденовирусными векторами, заключается в слабой патогенности родительских вирусов, и документально подтверждено отсутствие характерного заболевания, вызываемого этими векторами у любых индивидуумов, включая тех, кто находится в иммунодепрессивном состоянии. Работа с мышиной моделью малярии Р.уеоШ показала, что рекомбинантные аденовирусные конструкции, экспрессирующие белок С8, не только вызывают заметный клеточный иммунный ответ, но и обеспечивают хорошую защиту от инфекции. Следовательно, пытаясь улучшить интенсивность Т-клеточного ответа и продолжительность иммунного ответа на С8, авторы настоящего изобретения решили объединить аденовирусный подход с подходом рекомбинантных белков в новой гетерологичной первичной-бустерной стратегии.

К сожалению, мышь не является идеальной моделью для прогнозирования ответа у людей. В частности, это относится и к аденовирусу 35 (А635). Стандартный вектор с нарушенной репликацией представляет собой аденовирус 5 (А65), с которым возникли некоторые проблемы, связанные с оптимизацией производительности его вектора, вследствие широкой эндемичности этого вируса и того факта, что существенная часть глобальной популяции человека имеет уже существующий иммунитет к родительскому вирусу. А635 обладает потенциалом для увеличения эффективности в качестве вакцинного вектора. Пригодность С8Р-несущих конструкций как А65, так и А635 позволило оценить две последовательные иммунизации гетерологичными аденовирусами с разными конструкциями особенно относительно вопроса иммунитета к С8.

Дендритные клетки (ДК) представляют собой наиболее эффективные антиген-представляющие клетки в организме, и тот факт, что как А65, так и А635 нацелены на ДК человека и резуса, является одним из аспектов их биологии, делает их очень хорошими вакцинными векторами. Однако только А65 эффективно инфицирует мышиные ДК; А635 надежно инфицирует только ДК приматов. Таким образом, хотя ответы на основные вопросы эффективности, касающиеся конструкций А635, можно получить, используя модели небольших животных, ответы на актуальные вопросы, касающиеся иммуногенности, включая А635, можно получить, только используя нечеловеческих приматов.

Авторы настоящего изобретения решили проверить первичные-бустерные комбинации К.Т8,8 с аденовирусными векторами, содержащими ген С8, для определения, будут ли улучшены противомалярийные клеточный и/или гуморальный ответы по отношению к ответам, наблюдаемым только для КТ8,8. Кроме того, был оптимизирован режим введения двух доз только аденовирусной вакцины.

Примеры

Гетерологичная первичная/бустерная вакцинация макак резус с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов и смешанного с адъювантом очищенного белка.

- 12 016648

Целью эксперимента была оценка КТ8,8 с последующим АЙ35, и АЙ35 с последующим КТ8,8 при сравнении со стандартным режимом иммунизации тремя дозами КТ8,8 и стандартным режимом иммунизации двумя дозами АЙ35. Второй целью была оптимизация режима, содержащего две дозы аденовирусов. Изучали серологический и клеточный иммунные ответы во время и после нескольких различных режимов введения этих конструкций в комбинации.

Макак-резус (Масаса ти1а!!а) является хорошей моделью для человеческого иммунного ответа, благодаря очень близким филогенетическим связям. В частности, аллели МНС класса II хорошо сохранились; образование некоторых общих аллелей произошло по оценкам 25 миллионов лет назад до образования видов человека и резус. Таким образом, существует аналогичное использование эпитопа при наличии антигена к Тй-клеткам, что сильно увеличивает прогностическую ценность модели. Более важным является то, что модель макака-резуса, как ранее было доказано, является высокопрогностической в отношении ответа как против малярии, так и ВИЧ, другого человеческого заболевания, разработка вакцины против которого была затруднена из-за сложности иммунного ответа.

Предварительные эксперименты уже выполняли на мышах с аденовирусными-С8 конструкциями мышиной малярии Р.уеоШ, которые продемонстрировали хорошую иммуногенность и защитное действие. Однако долгая история безуспешных попыток прямой экстраполяции мышиной модели малярии на людей в вопросе разработки вакцин для малярии определяет необходимость промежуточного этапа в виде модели нечеловеческих приматов. Макак-резус представляет собой наилучший выбор из видов благодаря наличию обширной базы данных ранее полученной информации на эти вакцины у этих видов, благодаря филогенетической близости с человеком, благодаря тому, что их размер позволяет отбирать образцы крови в достаточном объеме для гарантии адекватной оценки иммунного ответа, и благодаря наличию реагентов и проб, которые для этого вида уже оптимизированы, и таким образом, не требуются дополнительные протоколы и многие годы для разработки. Кроме того, только у нечеловеческих приматов конструкции аденовируса 35 могут быть протестированы должным образом из-за невозможности эффективного внедрения этого вируса в дендритные клетки других млекопитающих.

Конструкции и продуцирование рекомбинантных аденовирусов с нарушенной репликацией, содержащих ген, кодирующий С8 Р.ГаШрагит (АЙ5С8 и АЙ35С8), использованные в этих исследованиях, более подробно описаны в примерах \¥О 2004/055187 (клон 02-659; см. фиг. 2). Кратко, эти аденовекторы содержат гетерологичный ген, кодирующий белок С8 с аминокислотной последовательностью, которая аналогична белку С8 штамма ΝΡ54 клона 3И7, имеющего среди прочих Ν-терминальную сигнальную последовательность 27 повторов ΝΑΝΡ, кластер из 3 повторов ΝΑΝΡ и один отдельный повтор ΝΑΝΡ, универсальный эпитоп (Боекуег е! а1., 1989; 2еуегшд е! а1., 1994; Ν;πάίη е! а1., 2001) и делецию последних 14 аминокислот (на С-конце). Отличие от белка КТ8,8 заключается в том, что у КТ8,8 отсутствуют Νтерминальная сигнальная последовательность и большой участок области повторов, а также большая часть С-терминально расположенной якорной сигнальной последовательности ΟΡΙ, которая также отсутствует в аденовирусных конструкциях.

Эксперимент представлял собой рандомизированное, слепое исследование иммуногенности различных комбинаций и временных стратегий для оптимизации первичных-бустерных стратегий для конструкций ЛЙ5 и ЛЙ35. несущих С8 с КТ8,8 (АЙ5С8 и АЙ35С8) и для оптимизации только АЙ5С8 и АЙ35С8. Существовавший наилучший режим, с которым сравнивали новые стратегии, представлял собой три внутримышечные дозы по 50 мкг смешанного с адъювантом КТ8,8, который вводили на 0, 1 и 3 месяц. Это была группа 1, группа положительного контроля. Все группы представлены в табл. 1А. Во всех случаях адъювант представлял собой 50 мкг 3И-МРЬ, 50 мкг 0821 в лекарственной форме с липосомами, содержащими холестерин, как описано в \УО 96/33739.

Группа 2 получала две дозы КТ8,8/адъювант на 0 и 1 месяц, за которыми следовала одна доза АЙ35С8 на 3 месяц. Группа 3 получала одну дозу АЙ35С8 на 0 месяц, за которой следовали две дозы К.Т8, 8/адъювант на 1 и 3 месяц. Группы 4, 5 и 6 получали только аденовирусные конструкции. Предыдущий эксперимент с двумя дозами конструкций аденовируса 5 при различных заболеваниях показал, что оптимальный серологический и клеточный иммунные ответы получали, если интервал между иммунизациями составлял по меньшей мере 6 месяцев. Поскольку существует необходимость в оценке конструкции АЙ35 в отношении людей или нечеловеческих приматов, оптимальное время между дозами для этого вектора еще не было установлено. Таким образом, группа 4 получала две дозы АЙ35С8 по графику на 0, 3 месяц (для прямого контроля белковых групп), а группа 5 получала две дозы по графику на 0, 6 месяц. Для изучения вопроса, зависят ли результаты введения двух доз одной и той же аденовирусной конструкции от изменения конструкции белка С8, группу 5 сравнивали с группой 6, которая получала АЙ5С8, а затем АЙ35С8 по графику на 0, 6 месяц. Наконец, группа 7 получала две дозы обычного (без вставки малярийного гена) АЙ35 на 0 и 3 месяц и служила в качестве контрольной группы иммунизации для оценки иммуногенности.

В участках инъекции выстригали шерсть, а участок метили, чтобы упростить наблюдение за реактогенностью вакцины. Дополнительно на животных воздействовали седативным средством, и участок инъекции осматривали на появление признаков уплотнения, набухания, увеличения температуры, покраснения или других отклонений от нормы на 24, 48 и 72 ч и на 7 и 14 дни после инъекции. Хотя при

- 13 016648 знаки системной токсичности не предполагались, животным также вводили седативное средство и осматривали в те же моменты времени, отслеживая появление лимфаденопатии, целлюлита, нагноений, артрита, потери аппетита и потери веса и изменения их гематологических и клинических показателей химии. Кровь отбирали во время инъекции, а также на 24, 48, 72 ч и на 7 и 14 день после каждой инъекции для проведения полного анализа крови (СВС) и для панели клинического химического анализа, который включал (без ограничений) определение ΒυΝ, креатинина, Л8Т, ЛЬТ, СОТ и СК. Чтобы подтвердить отсутствие выделения нерепликативного вектора, ежедневно с 0 по 10 дни для каждой аденовирусной инъекции собирали образцы фекалий и хранили при -70°С для тестирования на отсутствие аденовируса.

1-3 мл сыворотки собирали во время инъекций, а также на 1, 2 и 4 неделях после каждой инъекции и, по меньшей мере, через месяц после этого для определения природы и величины гуморального ответа на С8 К32 (область повтора белка С8, используемая для разработки стандартного анализа ЕБ18Л на белок С8, см. ниже) при помощи ЕЫ8Л. Образцы сыворотки хранили при -70°С до момента использования и образцы обрабатывали партиями ближе к концу эксперимента для минимизации внутритестовых изменений. Собранные объемы сыворотки были адекватны так, чтобы для каждой аденовирусной инъекции можно было использовать по 0,5-1,0 мл сыворотки, полученной на 0, 1, 7 и 14 день и по меньшей мере каждые 4 недели после этого для определения титра антител против аденовируса. Большие объемы (2040 мл) антикоагулированной ЭДТА или гепарином крови отбирали для урожая клеток до первой иммунизации, спустя 4 недели после второй иммунизации (если позволяли требуемые объемы), спустя 4 недели после третьей иммунизации и спустя 6 месяцев после третьей иммунизации. Мононуклеарные клетки периферийной крови (РВМС) концентрировали из этих образцов, используя стандартные способы разделения при помощи центрифугирования в градиенте плотности. Хотя количество клеток могло сильно меняться у разных животных, обычно больший объем образца соответствовал большему количеству восстановленных клеток. Из-за невозможности предсказания точного количества восстановленных клеток предпочтительно брать больший объем образца, где это возможно, для получения достаточного количества клеток для повторного анализа для обеспечения статистической достоверности. Клетки замораживали для обеспечения возможности пакетной обработки в более позднее время и таким образом улучшали контроль качества. Клетки замораживали в аутологической сыворотке с 10% ДМСО при управляемой скорости снижения температуры и хранили в парах жидкого азота в течение последней недели перед использованием.

Из более крупных животных, чьи данные СВС указывали на их высокую толерантность, отбирали дополнительные образцы для сбора клеток после первичной вакцинации, но перед бустерной вакцинацией. Поскольку было 14 обезьян (две группы), которые получали две дозы КТ8,8/адъювант, и 14 обезьян, которые получали одну дозу ЛЙ35С8 до наступления 8-й недели, предполагалось отбирать пробы, по меньшей мере, половины и, таким образом, поддерживать статистическую значимость. Урожай клеток собирали не ранее чем через 4 недели после инъекции. Поскольку группы, получавшие только аденовирусные конструкции, получали только две инъекции и, таким образом, имели менее напряженный график забора крови, чем обезьяны, получавшие три инъекции, предполагалось, что промежуточный сбор урожая клеток между двумя инъекциями не вызовет никаких затруднений.

Анализы клеточного иммунного ответа включали быстрые ЕЫ8РОТ анализы для количественного определения клеток, продуцирующих антиген-специфический ΙΕΝ-γ. Поточный цитометрический анализ антиген-стимулирующих клеток не смог подтвердить только данные, полученные в ЕЫ8РОТ анализах, но предоставил дополнительную информацию о фенотипе антиген-специфических клеток, которые отреагировали. Таким образом, также проводили определение поднабора антиген-специфических СИ8+, секретирующих ΙΕΝ-γ, при помощи внутриклеточного окрашивания и поточной цитометрии.

Дополнительные анализы, которые проводили, включали общие ЕЫ8РОТ анализы для дополнительных цитокинов, внутриклеточное окрашивание для подсчета поднабора Т-клеток, секретирующих дополнительные цитокины, другие анализы на основе поточной цитометрии для количественной оценки продуцирования цитокинов поднабором антиген-специфических Т-клеток и количественного ОТ-ПЦР для определения корреляции с другими способами.

Обезьян делили на две равные группы, отбирая по возрасту, полу, весу и географическому происхождению и затем группы подвергали рандомизации. Все виды клинического анализа и защитные конечные определения устанавливали без информации о том, к какой группе принадлежали обезьяны. Аналогично, все виды иммунологического анализа проводили без предварительной информации о группах, которым принадлежат отдельные образцы. Исключения политики работы вслепую касались животных, которые получали иммунизацию по графику на 0 и 6 месяцы, по сравнению с животными, которые получали иммунизацию по графику на 0, 1 и 3 месяцы; однако метод работы вслепую сохранялся в отношении введения конкретной инъекции.

Размер группы из 7 животных на тестовую группу (и четыре в контрольной группе) является идеальным с точки зрения минимизации размера группы, при котором все еще точно детектируются различия между группами на основе предварительных данных из аналогичных, но имеющих отдаленное от

- 14 016648 ношение экспериментов.

Геометрические средние результатов анализа ЕЫ8А сравнивали параметрически, используя стандартный анализ, такой как (-критерий Стьюдента, предполагая равные изменения и два хвоста, и ΑΝΟνΑ. Результаты анализов ЕЫ8РОТ, выраженные в пятнах на 200000 клеток, обрабатывали аналогичным образом и также оценивали, используя непараметрический анализ, такой как критерий КрускалаУоллиса. Там, где требовалось межгрупповое сравнение, использовали (-критерий Стьюдента для необработанных или логарифмически преобразованных данных для определения различий между любыми парами групп.

Перед проведением инъекции шерсть срезали и кожу очищали, протирая 70% спиртом и на коже очерчивали круг диаметром 2,5-3 см несмываемыми чернилами, чтобы упростить определение участка инъекции для последующей пальпации и оценки реактогенности. Инъекции КТ8,8 смешивали с адъювантом сразу перед введением. Объем последней инъекции составлял 0,5 мл и вводился через иглу размером 25-29 в мышцу передней поверхности бедра. Аденовирусные конструкции получали так, как описано в XV О 2004/055187, в забуференном физиологическом растворе и также вводили в том же самом месте внутримышечно с конечным объемом 0,5 мл.

Первичный биообразец представлял собой кровь для получения либо сыворотки, либо клеток. График отбора крови представлен в табл. 1В. Проводили мониторинг гематологического статуса животного; что указывало на то, способно ли конкретное животное выдержать повторное взятие образца, или на то, что запланированный график отбора крови следует сократить. Каждый раз при взятии крови проводили общий анализ крови (СВС) при помощи автоматизированного счетчика клеток крови Сои1(ег (требующего <50 мкл некоагулированной крови). При эксплуатации и техническом обслуживании выполняли СЬРподобные рекомендации производителя. Значения гематокрита, гемоглобина, среднего объема эритроцита (ΜΟν), число эритроцитов (КВС) и процент ретикулоцитов тщательно отслеживались, чтобы гарантировать то, что животные не становятся анемичными.

Венозную кровь отбирали из бедренной вены, подкожной вены ноги или головной вены, используя иглы 20-24 размера, либо шприцом, либо вакуумной трубкой. В общем случае, подкожная вена ноги или головная вена предпочтительно использовались для отбора менее 10 мл крови, а бедренную вену использовали, чтобы избежать гемолизиса и сократить общее время венопункции, если объемы отобранной крови превышали 10 мл.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) отбирали. У животных перед иммунизацией, через две недели после последней иммунизации и через три месяца после последней иммунизации. В этом протоколе РМВС выделяли стандартными способами при помощи центрифугирования в градиенте плотности и хранили в замороженном виде в 45% аутологической сыворотке (45% физиологический раствор и 10% ДМСО). Кратко, цельную кровь расслаивали в среде разделения клеток фикол-гепак Ьутркоргер® (Ах15-8ЫеИ, Ов1о, Норвегия) и центрифугировали при 650д в течение 20 мин. Слой клеток снимали и промывали два раза раствором 6РВ8 (Вю№Ы((акег, №а1кет8уШе, ΜΌ) при 400д в течение 15 мин. Жизнеспособные клетки подсчитывали, используя гемоцитометр Сои1(ег АСТ*10. Осадки ресуспендировали в 1х10⁷/мл в 50% 0РВ8, 50% физиологическом растворе. В конечный 10% объем по каплям добавляли ДМСО. Клетки замораживали в аликвотах по 0,55 мл, каждая из которых содержала точно по 5 млн клеток, в изопропаноловой бане с управляемой скоростью снижения температуры в -70°С морозильнике в течение ночи и до использования хранили в парах жидкого азота.

После последней вакцинации Т-клетки, секретирующие интерферон-гамма (ΙΝΕ-γ), в образцах крови от разных обезьян идентифицировали ферментно-опосредованным иммуноспот анализом (ЕЫ8РОТ) после стимуляции целыми антигенами и пулами С- и Ν-терминальных специфических пептидов (как более подробно описано ниже). Результаты приведены в виде диаграмм на фиг. 1 (2 недели после последней вакцинации) и на фиг. 2 (3 месяца после последней вакцинации) и представлены в табл. 2 и 4 соответственно в виде средних значений размеров пятен, образующих единицы на миллион клеток (8ЕИ); статистическое сравнение выполняли, используя дисперсионный анализ (ΑNΟVΑ) данных, подвергнутых логарифмическому преобразованию.

Сравнивали все группы. В случае выявления статистически значимых различий мог выполняться ров1-1юс анализ для погруппового сравнения (результаты не показаны).

Для сравнения результатов ЕЫ8РОТ между различными стратегиями обработки вычисляли отношение средних геометрических титров для стратегий с А635 в качестве первичной обработки. В этих отношениях средний геометрический титр, полученный обработкой только КТ8,8 (на 0, 2, 3 месяцы), использовали в качестве контрольной обработки (фиг. 5 и 6 и табл. 10). Аналогично, также вычисляли отношения для стратегий с А635 в качестве бустерной обработки (фиг. 7 и 8 и табл. 11).

Аналогичные оценки проводили для результатов анализа ЕЫ8РОТ для специфической стимуляции Т-клеток Ν-терминальным концом. Результаты показаны в виде диаграмм на фиг. 9 и 10 и в табл. 12 и 14 соответственно. Наконец, вычислили отношения и представили их на фиг. 11 (А635 первичная стратегия) и на фиг. 12 (А635 бустерная стратегия) и в табл. 16 и 17 соответственно.

ЕЫ8РОТ выполняли на размороженных РВМС в планшетах Ми1(18сгееп-1Р ЕЫ8РОТ, дно которых

- 15 016648 обрабатывали ПВДФ, используя стандартную методику. Стерильность строго соблюдалась до момента удаления клеток на 2-й день для последнего спот-окрашивания.

Используемая среда: полная среда (сРРМ1) была свежеприготовленной из РРМ1-1640 (Β^οVЫйаке^, \ν;·ι11<θΓ5νί1ο. МО) с добавлением 1:100 смеси пенициллин/стрептомицин, 1:100 Ь-глутамина, 1:200 ЫаНСОз (81дта, 81.Ьош5, МО), 1:100 второстепенных аминокислот, 1:100 пирувата и 1:300 2-МЕ (01Ьсо). Фетальную телячью сыворотку (РС8, НуС1опе, Ьодап, ИТ) из партии, ранее охарактеризованной при помощи анализа неспецифической пролиферации, для поддержания хорошего роста обезьяньих клеток при обеспечении небольшой фоновой стимуляции добавляли до 10% конечного объема для сКРМ1-10, 20% для сРРМ1-20 и т.п. Среду Ме61а-Р1и8 (М+) дополнительно дополняли антителами к СЭ28 и СЭ49Э обезьян в отношении 1:500 (ΒΌ Рйагттдеп, 8ап 1о§е, СЛ).

Нижеследующие стимуляторы были свежеприготовленными в двух заданных конечных концентрациях в М+ без добавления сыворотки.

Соп Л: конканавалин Л (81дта) по 2,5 мкг/мл (конечная 1,25 мкг/мл) в качестве положительного контроля для всех пробирок.

С8-С: пул 15-мерных полипептидов, перекрываемых 11 аминокислотами, покрывающих Стерминальный участок молекулы РГС8 (предоставленной О8К, Ктхепкай, Бельгия) по 2,5 мкг/мл каждого пептида (конечная 1,35 мкг/мл).

Ο8-Ν: аналогичный пул 15-мерных пептидов, перекрываемых 11 аминокислотами, покрывающих Ν-терминальный конец молекулы РГС8.

РТ8,8: очищенный полный белковый комплекс РТ8,8 антигена, подходящий для клеточной культуры (О8К), по 2 мкг/мл (конечная 1 мкг/мл).

НЕР: полный очищенный белок поверхностного антигена гепатита Β (НВ 8) (компонент 8 для РТ8,8), также подходящий для клеточной культуры (О8К), по 23,2 мкг/мл (конечная 11,6 мкг/мл).

НВ8-Р: пул 15-мерных пептидов НВ8 (О8К) по 2,5 мкг/мл каждого пептида (конечная 1,25 мкг/мл).

Отрицательный контроль представляет собой М+ без дополнительных добавок.

Планшеты подготавливали, как описано ниже. Планшеты покрывали 50 мкл/лунку 1:100 раствора стерильного 6РВ8 первичного моноклонального антитела к ΙΡΝ-γ обезьян (ИсуТесй #21-43-09, ийесЫ, Нидерланды) и инкубировали в пластиковом контейнере при 4°С в течение 5-6 ч. За 1 ч до использования покрывающие антитела удаляли и планшету блокировали сКРМ1-10 при 37°С в инкубаторе для клеточных культур с контролируемой влажностью в 5% СО₂. Непосредственно перед использованием блокирующую среду удаляли.

Оттаивание замороженных РВМС. Замороженные пробирки вращали под струей теплой воды из водопроводного крана (37-40°С до начала их оттаивания) и 0,55 мл содержимого сразу переносили в 8 мл КРМ1-20. Клетки промывали при 350д в течение 13 мин и осадок осторожно ресуспендировали в 2,0 мл сКРМ1-20. Затем отбирали 40 мкл стерильной аликвоты для определения количества жизнеспособных клеток и доводили объем до необходимого для получения суспензии из единичных 2х10⁶ клеток/мл.

Предварительная стимуляция: равные объемы клеточной суспензии в сКРМ1-20 и стимуляторы в М+ смешивали в полипропиленовых пробирках для клеточных культур для получения конечной желаемой концентрации всех реагентов. Затем клетки помещали в инкубатор по меньшей мере на 5 ч со свободно надетыми крышками и в наклонном положении для облегчения газообмена.

Конечная стимуляция: после 5-6-часовой инкубации клетки центрифугировали при 400д в течение 10 мин и сливали супернатанты. Затем клетки сразу ресуспендировали в смеси, наполовину состоящей из сКРМ1-20 и наполовину из стимулятора. Клетки возвращали в инкубатор на 10-20 мин для стабилизации рН. Затем клетки перемешивали в течение непродолжительного времени и осторожно отбирали пипеткой 200 мкл (200000 клеток) и переносили в соответствующие лунки в блокированных и пустых планшетах. На всех этапах следили за тем, чтобы лунки не высохли. Затем планшеты инкубировали в течение ночи (>16 ч) без какого-либо воздействия.

Окрашивание: 1:100 раствора вторичных поликлональных антител к ΙΝΡ-γ обезьян (ИСуТесй) приготовили в 6РВ8 с 2% РС8. Клетки и среду быстро извлекали из планшеты; лунки промывали 8 раз 6РВ8-0,5% Твин 20 (81дта) и заполняли 50 мкл разбавленных вторичных антител. Планшеты инкубировали на качающейся платформе в течение 3 ч при комнатной температуре в пластиковом контейнере. Планшеты снова промывали 8 раз 6РВ8-0,5% Твин 20 и заполняли 50 мкл/лунку раствора 1:1000 коньюгата стрептовидин-щелочная фосфатаза (8ои111егп Вю1ес11 #7100-04, В1гт1пйат, ЛЬ). Затем планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в пластиковом контейнере на качающейся платформе. Наконец, планшеты промывали 8 раз, как описано выше, затем один раз промывали дистиллированной водой и добавляли по 100 мкл/лунку хромогенного субстрата НВТ-ВСЧР (Р1егсе Вю1есй, РоскГогй, 1Ь). Окрашивание проявлялось в течение 10-20 мин, в то время как фон оставался темным. Затем планшеты промывали по меньшей мере два раза 300 мкл дистиллированной воды и сушили на воздухе в течение ночи перед считыванием.

Считывание планшеты: планшету считывали ЕЬ18РОТ-ридером ЛШ ЕЬНВ01, используя ЛШ ЕЬ18РОТ Веабег версии 3.1.1. Все лунки были оценены визуально и неподходящие подсчеты пятен (волокна

- 16 016648 или другие инородные вещества) исключали вручную. Данные сохраняли на рабочей странице программы Ехсе1. Значения лунок с двойными или тройными повторами усредняли и это количество умножали на 5 для получения конечных необработанных данных в пятна/миллион клеток.

Контроль качества: среднее количество жизнеспособных восстановленных клеток после процесса заморозка/оттаивание превышало 95%. Эксперименты повторяли, если средние значения для лунок с контрольной средой превышали 20 пятен/миллион или если значения для лунок с СоиА составляли менее 500 пятен/миллион. Также жизнеспособность как СЭ4+, так и СЭ8+, определенная при помощи поточной цитометрии с освобождением красителя 7-ААЭ и поверхностного окрашивания, должна была превышать 90%, иначе эксперимент повторяли (данные не включены).

Таблица 1А Экспериментальный режим для режима первичной/бустерной вакцинации макака-резус с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов на основе серотипов 5 и 35, содержащих ген, кодирующей белок С8 Р.Га1с1рагит, и с использованием смешанного с адъювантом ВТ8,8 в качестве белкового антигенного компонента

Группа	Первичная вакцинация	1 месяц	3 месяц	6 месяц
1	ПТЗ,5	КТЗ,3	ктз,з
2	кТЗ, 3	НТЗ, 3	А035-С5
3	Αά.3 5-СЗ	НТЗ, 3	НТЗ ,8
4	А035-С8		адзб-сз
5	АЙ35-С5			АЙ35-С5
6	Ά35-СЗ			А035-СЗ
7	Ас135-только		АсЯ3 5-только

Таблица 1В

График отбора крови. Для урожаев СВС и клеток требуется цельная кровь; для химического и ЕЫ8А анализа требуется сыворотка. Предполагается, что 1 мл сыворотки представляет 2 мл цельной крови. Указаны только объемы цельной крови. Области значений указывают на случаи, при которых у более крупных обезьян могли быть отобраны образцы в большем объеме. 0,5 в колонке СВС/хим. указывает только СВС, полученные в эти дни. * означает, что в этой временной точке кровь отбирали не у всех обезьян

- 17 016648

Неделя день	СВС/хим,	ЕЫЗА	Клетки	Общий объем цельной крови (мл)
Неделя -4 (прибл.)	1-3	2 _г 5-5	25-35	28-43
Неделя -1*	ι-з	2,5-5		3,5-8
НеделяО- деньО	1-3	2,5-5		3,5-8
0-1	1-3	2,5		3,5-5,5
0-2	1-3			1-3
0-3	1-3			1-3
1	1-3	2,5-5		3,5-8
2	1-3	2,5-5		3,5-8
4-0	1-3	2,5-5		3,5-8
4-1	1-3	2,5		3,5-5
4-2	1-3			1-3
4-3	1-3			1-3
5	1-3	2,5-5		3,5-8
6	1-3	2,5-5		3,5-8
8	0,5	2,5-5	15-35*	18-40
10	0,5	2,5-5		3-5,5
12-0	1-3	2,5-5		3,5-8
12-1	1-3	2,5		3,5-5,5
12-2	1-3			1-3
12-3	1-3			1-3
13	1-3	2,5-5		3,5-8
14	1-3	2,5-5		3,5-8
15	2,5			2,5
16	1-3	2,5-5	25-35	28-43

18	0,5	2,5-5		3-5,5
20	0,5	2,5-5		3-5,5
22	0,5	2,5-5		3-5,5
25-0	1-3	2,5-5		3-7,5
25-1·	1-5			1-5
25-2·	1-5			1-5
25-3·	1-5			1-5
26	2,5-7,5			1-5
27	0,5	2,5-5	25-35	28-43
28	2,5			2,5
29	0,5	5		5,5
31	0,5	5		5,5
33	0,5	5		5,5
35	0,5	5		5,5
38	0,5	Б	25-35*	5,5-43
39	0,5	7		7,5
40*		5-10*	20-35*	25-43*
41*	0,5*	7*		7,5*
44*	0,5*	2,5-5*		3-5,5*
48*	0,5*	5*		5,5*
51*	0,5*	5-10*	25-35*	28-43*
52*	0,5*	5*		5,5

В таблицах, приведенных ниже, КТ§,§ для простоты обозначен как КТ8.

- 18 016648

Таблица 2 Специфический Τ-клеточный иммунитет на С-терминальный РГС8 через две недели после бустерной вакцинации: средние значения и средние геометрические ΙΕΝ-γ Ε^I8ΡΟΤ (в 8ЕИ/миллион клеток) и сравнение по АNΟVА. Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

Таблица 3

Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения специфического ΙΕΝ-γ Ε^I8ΡΟΤ на С-терминальный РГС8, как показано в табл. 2, через две недели после бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

	ВТ8,КТЗ, В.Т8	ЯТ8,В.ТЗ, АЙЗ 5	АЙ35₍ЯТ5, КТЙ	Ааз5,лаз5 1 Аазв,лаз5 3 месяца 6 месяцев
КТ8,КТ8,КТ5				Γ·:.ΐ^;;Α5'ί
нтз,нтз,лазз	0_н05		-λ ·.
Аа35,НТ5,КТЗ	0,003	0,03

лазз,АО35 3 месяца	0 ,24	0,20	0,001
Άά35,Άά35 6 месяцев	0,70	0,015	<0,0001	°'^и 8¾¾
ΑΗ5,Αά35	0,16	0,24	0,0004	0,80 0,07
6 месяцев

Таблица 4 Специфический Τ-клеточный иммунитет посредством ΙΕΝ-γ на С-терминальный конец через три месяца после бустерной вакцинации: средние значения и средние геометрические Ε^I8ΡΟΤ (в 8ЕИ/миллион клеток) и сравнение по АNΟVА. Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

	Через 3 месяца после бустерной вакцинации
	Среднее значение	Среднее геометрическое
ЕТЗ,ЕТЗ,ЕТЗ	3	9
ЕТЗ,ЕТЗ,АЙЗ5	35	49
М3 5, ЕТЗ,ЕТЗ	123	156

Αά35,Αά35 (3 месяца)	25	25
Ай35,Аа35 (6 месяцев)	15	15
Αά5,Αά.3 5 (6 месяцев)	77	81

- 19 016648


Только Ас13 5	2	2

ΑΝΟΥΑ		РсО,0001

Таблица 5

Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения ЕЬ18РОТ, как показано в табл. 4, через три месяца после бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

	НТВ,НТЗ, КТ8	НТЗ,НТЗ, ДЦ35	А(235,КТ5, НТЗ	М35,Ас135 3 месяца	Αά35,Αΰ3 5 6 месяцев
НТ8,КТ8,НТЗ
КТ8,КТ8,АЙ35	0,03
АЙЗ5,НТЗ,НТЗ	0,003	о, сз

Αά35,Αά35 3 месяца	0,15	0, 26	0, 0009
Αά3Ξ,Αά35 6 месяцев	0, 4В	0,07	0,0009	0,36
Αά5,Αά35 6 месяцев	0,006	0,33	0,12	0,04	0,009

Таблица 6

В-клеточный иммунитет (титр антител к области повтора) через две недели после последней бустерной вакцинации: средние значения и средние геометрические титра ЕЬ18А и сравнение по АЫОУА. Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

	Через 2 недели после бустерной вакцинации
	Среднее значение	Среднее геометрическое
КТ5,ЙТЗ,НТЗ	3313	3385
НТ8,КТЗ,Аа35	3705	3400
АЙЗ5, НТЗ,НТЗ	1737	2059

Αά35,Αά35 (3 месяца)	295	336
Ас13 5_гАс135 (6 месяцев)	161	171
Αά5,Αά35 (δ месяцев)	339	347

Только Ас135	1	1


ΑΝΟΥΑ		Р<0,0001

- 20 016648

Таблица 7

Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения антител. как показано в табл. 6. через две недели после последней бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

	КТ8,КТ8, КТ8	ЕТЗ,ЕТЗ, АЙЗ 5	АЙ35,ЕТЗ, ЕТЗ	АЙ35,АЙ35 3 месяца	АЙЗ5,АЙЗ5 6 месяцев
ЕТЗ,ЕТ5,ЕТЗ ЕТЗ, ЕТЗ, М3 5	0 , 99	?<СЯч1Дц!*Я$1
АЙ35,НТЗ,ЕТЗ	0,07	0, 10	ГГ

АЙ35,АЙ35 3 месяца	< 0,0001	< 0,0001	< 0, 0001	ί\ »’?·*< ¹¹	Х-х * -> /*%, ί '
АЙ35,АЙ35 6 месяцев	< 0,0001	< 0,0001	< 0,0001	0,06
Ай5,Ай35 6 месяцев	< 0,0003	< 0,0001	0,0002	0,93	0,0В6

Таблица 8 В-клеточный иммунитет (титр антител) на С8 Р.£а1с1рагит через три месяца после бустерной вакцинации: средние значения и средние геометрические ЕЫ8А (в 8ЕИ) и сравнение по ΑΝΟνΑ.

Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

	Через 3 месяца после бустерной вакцинации
	Среднее значение	Среднее геометрическое
ЕТЗ,ЕТЗ,ЕТЗ	528	521
ЕТЗ,ЕТЗ,АЙЗ 5	437	357
АЙЗ 5, ЕТЗ,ЕТЗ	288	275

Ай35,Ай35 (3 месяца)	67	78
Ай35,Ай35 (6 месяцев)	70	65
АЙ5,АЙ35 (6 месяцев}	92	141

Только М35	0	1

АЫОУА		Р<0,0001

Таблица 9

Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения антител. как показано в табл. 8. через три месяца после бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

нтз,ктз,ктз^—	ЕТЗ,КТб, ЕТЗ	ЕТЗ,ЕТЗ, АЙЗ 5	АЙЗ5,ЕТЗ, ЕТЗ	АЙ35,АЙ35 АЙ35,АЙ35
ЕТЗ,ЕТЗ,АЙЗ5 АЙ35,КТЗ,ВТЗ	0,40 0, 12	0, 59	ВЙВМ

АЙ35,АЙ35 3 месяца	< 0, 0001	0,005	0,002
АЙ35,АЙ35 6 месяцев	< 0,0001	0,003	0,002	0,32 ·,. -, ','·:
АЙ5,АЙ35 б месяцев	0,01	0,088	0, 17	0,15 0,057

- 21 016648

Таблица 10

Отношение* значений средних геометрических. Т- и В-клеточные ответы. В качестве первичной вакцины использовали А635

	Т-клеточный ответ	В-клеточный ответ
	Отношение* (95% дов. инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца	Отношение* (95% дов. инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца
АЙЗ 5 , НТ5, КТ,5	17,7 (4,4-72,1)	17,8 (5,1-61,9)	0,61 (0,35-0,85)	0,53 (0,23-1,22)
АЙЗ5,АЙЗ5	2, 5	2,9	0, 10	0,15
(3 месяца)	(0,5-12,9)	(0,7-12,5)	(0,05-0,18)	(0,08-0,28)
АЙЗ 5,АЙЗ 5	1,3	1.7	0,05	0,12
(6 месяцев)	(0,3-6,0)	¢0,4-7,9)	(0,03-0,10)	(0,07-0,22)

* ВТ8,ВТ8,ВТ8 - в качестве контроля.

Таблица 11 Отношение* значений средних геометрических. Т- и В-клеточные ответы.

В качестве бустерной вакцины использовали А635

	Т-клеточный ответ	В-клеточный ответ
	Отношение* (95% дов, инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца	Отношение* (95% дов. инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца
ЯТЗ,ЕТЗ,АЙЗ 5	5,3 (1,0-29, 0)	5,6 (1,2-26,1)	1,0 (0,54-1,87)	0,69 (0,27-1,77)
АЙ5,АЙ35 (6 месяцев)	2, 8 (0,6-13,2)	9,2 (2,2-39,0)	0, 10 (0,05-0,22)	0,27 (0,11-0,68)

* ВТ8,ВТ8,ВТ8 - в качестве контроля.

Таблица 12 Специфический Т-клеточный иммунитет посредством ΙΡΝ-γ на Ν-терминальный РГС8 через две недели после последней вакцинации: средние значения и средние геометрические ЕЫ8РОТ (в 8РИ/миллион клеток) и сравнение по АNОVА. Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

	Через 2 недели после бустерной вакцинации
	Среднее значение	Среднее геометрическое
ЕТЗ,ЕТЗ,ЕТЗ	5	4
ЕТЗ,ЕТЗ,АЙЗ5	17	11
АЙЗ 5,ЕТЗ,ЕТЗ	130	126

АЙ35,АЙ35 (3 месяца)	68	78
АЙ35,АЙ35 (6 месяцев)	108	69
АЙ5,АЙ35 (6 месяцев)	68	72

Только АЙЗ5	1	2

АИОУА		Р<0,0001

- 22 016648

Таблица 13

Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения ЕЫ8РОТ, как показано в табл. 12, через две недели после последней бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

	НТВ, КТ8, НТ8	КТЗ,ЕТЗ, А035	АЙ35,КТ8, КТ8	А<ЗЗБ,АЦ35 3 месяца	АЙЗБ.АЙЗБ 6 месяцев
КТ8,КТ8,КТ8
Ε.Τ8,ΚΤ8,Αά35	0,12		ί ‘ АХАЛ	ХТ, ^Г?1
АЙЗ 5, НТВ, НТВ	< 0,0001	0,002

Αά35,Αά35 3 месяца	0,0002	0,012	0,39
АЦ35,АЙ35 6 месяцев	< 0, 0001	0,011	0,23	0,84
А<35,АЦ35 6 месяцев	< 0, 0001	0,007	0,22	0,88	0,94

Таблица 14 Специфический Т-клеточный иммунитет посредством ΙΕΝ-γ на Ν-терминальный Р£С8 через три месяца после бустерной вакцинации: средние значения и средние геометрические ЕЫ8РОТ (в δΕυ/миллион клеток) и сравнение по АNОVА. Даны различные режимы первичной/бустерной вакцинации (слева)

	Через 3 месяца после бустерной вакцинации
	Среднее значение	Среднее геометрическое
Р.ТЗ,ЕТ8,ЕТЗ	3	2
ЙТ8 , Р.ТЗ , АЙЗ 5	12	10
АЙ35,КТ8,КТЙ	32	40

АЙ35,АЙ35 (3 месяца)	25	32
АЙ35,АЙ35 (6 месяцев)	30	17
АЙ5,АЙ35 (6 месяцев)	63	55

Только АЙЗ 5	3	2

ΑΝΟΥΑ		Р<0,0001

Таблица 15 Т-критерий Стьюдента. р-значения для сравнения ЕЫ8РОТ, как показано в табл. 14, через три месяца после бустерной вакцинации (последняя вакцинация)

- 23 016648

Таблица 16 Отношение* средних геометрических Т-клеточного ответа на Ν-терминальный РГС8.

В качестве первичной вакцины использовали А635

	Т-клеточный ответ
	Отношение* (95¾ дов. инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца
А03 5,ЕТЗ,Р.ТЗ	32,4 (12,1-87,2)	16,5 (4,7-58,3)
Αΰ35,Αά35 (3 месяца)	20,0 (6,1-60,0)	13,2 (4,1-42,3)
Αά35,Αά33 (6 месяцев)	17,9 (6,5-49,4)	7,1 (1,7-29,3)

* КТ8,КТ8,КТ8 - в качестве контроля.

Таблица 17 Отношение* средних геометрических Т-клеточного ответа на Ν-терминальный С8.

	Т-клеточный ответ
	Отношение* (95% дов. инт.) через 2 недели	Отношение* (95% дов. инт.) через 3 месяца
КТ5,ЙТЗ,Αά3 5	2,8 (0,7-10,9)	4,1 (1,1-15,2)
Ай5,Ас(35(6 месяцев)	18,5 (7,4-46,2)	22,4 (9,8-51,1)

* КТ8,КТ8,КТ8 - в качестве контроля.

Ссылки

Вгипа-Когаего О еЪ а1. (2001) Сотпр1е£е, 1опд-1ае£хпд рго£ес£хоп ада+пзъ ша1аг1а о£ шхсе ргхтеб апб ЬоозЪеб νχ£1ι ίνο б1з£1пс£ νίχ·&1 уесЪога ехргеаз!пд ЪИе еате р1азтоб!а1 апЪхдеп. Ргос ЫаС1 Асаб За! ВЗА 98:11491-11496

Сазрегз Р е£ а1. (1989) тИе οίΓαυιηεροηοζοίϋβ рго£е!п депе £гот ΝΈ54, а Р1азтобхит £а1схрагит 1зо1а£е иэеб хп та1агха ν&οα1ηβ Сг1а1з. Мо1 ВхосЬет РагавзЛ:о1 35:185-189

С1убе ВР е£ а1, (1973) 1ттипхгаЪ1оп о£ теп адагизЬ ерогоголЛе-хпбисеб £а1с£рагит тпа1аг1а. Ат СТ Меб 5с± 266:169-177

Ве ГОпд ГО е£ а!» (1999) Абепоухгивез £гот Ьитап ±ттипобе£1ахепсу У1гче-1п£ес1:еб ίπ61νχ6υ&15, 1пс1иб1пд Ьтео зЬгахпз ЫхаЪ гергезепъ ηβν сапбАбаЪе зегоЬурез А650 апб Аб51 о£ зресхез В1 апб Г, гезресЫуе1у. <Г СЦц МхсгоЬхо1 37:3940-3945

Воо1ап ВЬ е£ а1. (1998) ΒΝΑ уассхпа^хоп аз ап арргоасЗх £о та1агха сопЬго!: сиггепЬ з£а£из апб з£га£ед1ез. Сигг Торхс М1сгоЫо1 1ттипо1 226:37-56

ЕзЪсоигЪ Мй а1. (2002) Рг1те-Ьооб£ 1ттип1за£:1оп депегаЬез а НхдИ £гедиепсу, Ыди-аУхбхЬу СО8+ су£о£охд.с Т 1утр1юсу£е рори1а£хоп. 1п£ 1ттипо1 14:31-37 (Запбоп 3 еЪ а1. (2001) 1щрег£ес£ уассхпез апб СЪе βνοίλΐύΐοη о£ раЫюдеп у!ги1епсе. Майиге 414:751-756

Согбоп ВМ аХ. (1995) За£е£у, хгшпиподепхсхЪу, апб е££хсасу о£ а гесотЬ1папЪ1у рагобисеб Р1азтпо<Иит £а!с!рагит с1гситзрогого1£е ргоъеХп-ЬераЪхЫз В эиг£асе ап£1деп зиЬипИ: уассхпе. ί 1п£ес£ Вхе 171:1576-1585

Но££тпапп ЗЬ апб. ОооХап ВЬ. (2000) Ма1агха уассхпезЪагдеЪхпд хп£ес£еб ЬераЪосуъез. ЕГайизге Ме<3 6:12181219

Нот ΝΑ е£ а1. (1995) Сапсег Сепе Ткегару изхпд рХазтахб ΌΝΑ: ригх£1са£хоп о£ ΒΝΆ £ог Ьитап С1хп1са1 Ъг1а1з. Нитап Сег.е ТЪегару 6:565-573

Кез£ег КБ е£ а1, (2001) КТЗ,3 Ма1аг±а Уассхпе ЕуаХиаЪхоп Сгоир. Е££хсасу о£ гесошЫпапЪ схгситпврогогохСе ргоЪехп уассхпе хедхтепз адагпас ехрегхтепЪа! Р1азтосНит £а1схрагит та1аг±а. 1п£ес£ В1з 183:640647

Киг£хз ГО еЬ а1. (2001) Рге-егуЪЬгосу£хс хттипхЪу £о ρΐάδϊαφάϊνπι Га2с1рагия1: ЬИе сазе £ог ап ЬЗА-1 уасс1пе. Тгепбз хп Рагазх£о1оду 17:219-223 ΐΑίνθίιί А е£ а1. (1999) РоЪеп£ хпбисСхоп о£ £осизеб Т111Ъуре се!1и1ах апб Ьитога! хглтипе гезропвез Ьу

- 24 016648

ΗΤ3.3/3ΒΑ32, а гесоглЫпапЬ РХазтойхит £аХсхрагит тлаХагха уассхпе, Л 1п£ес£ йхз 180:1656-1664

Ьоскуег МЛ е£ аХ. (1989) И11с1 хзоХаЬея о£ МазтосИшп ГаХсхрахищ з1юм ехЬепяхуе роХутогрЬхет ίη Т се!1 ерхкорев о£ ЬЬе с1гситзрогозо1£е ргоЪехп. МоХ ВхосЬет РагавХЬоХ 37:275-260

Ьике ТС апй Но££тап ЗЬ (2003) НаЬхопаХе апй р1апз £ог Йеуе1орхпд а поп-герХ1саЬхпд, текаЬоХхсаХХу асЫ'/е, гайхаСхоп-аЬСепиаЬей Р1азлюсИшп ^а1с1раги1п εροΓΟΖοΐύθ уассхпе. Л Εχρ ΒίοΧ 206:3803-3808

ЫагсНп ЕН е£ аХ. (2001) А ЬоЧаХХу вупЬЬеЫа ро1уоххя:е таХахТа уассхпе сопСахпхпд РХавтскйит £а1с1раги1й в сеХХ апй ипхуегваХ Т сеХХ ерхЬорев еПсИдз хттипе гезропеев ίη уоХипкеегв о£ йхуегяе НЬА Ъурез. СТ ХттипоХ 166:481-489

Мозтапп ТВ апй Со££тап Р.Ь. (1989) ТН1 Апй ТН2 сеХ18: йх££егеп£ раСЬегпэ о£ ХугпрЬокхпэ еесгеСхоп Хеай ко йх££егеп£ £ипсЫопаХ ргорегЬхев. Αηη Кеу о£ ТттипоХ 7:145-173 '

МивЪх АМ еЬ а!. (1983) ТгапвсгхркхопаХ таррхпд о£ уеавЬ депев сойхпд £ог дХусегаХйеЬуйез З-рЬозрЬаЬе ЙеЬуйгодепаве хяоХаЬей Ьу зедиепсе ЬотоХоду «1£Ь ЪЬе сЫскеп депе. Еепе 25:133-143

Ыахит Ы ек аХ. (2001) Сойоп орЪхтхгаЫоп о£ депе £гадтеп£я епсой1пд РХазтойхил: £а2слрагил1 теггохЬе ргокехпз епЬапсез ϋΝΑ уассхпе рго£е1п ехргеэяхоп апй хттиподепхсхку ίη тхсе. 1п£ес£ апй 1гтиип 69:72507253

Ыиввеп2ие1д КЗ ек. аХ. (1967) РгоЧеаЬхуе хпитхпхСу ргойисей Ьу СЬе хпзесЬхоп о£ Х-хггайхаЬей зрогогохкез о£ РХазтойхит ЬегдЬех. Нагите 216:160-162

Котего Р е£ аХ. (1989) С1опей суЬоеоххс Т се11з гесодп1ге ап ерхЪоре ίη СЬе схгситврогогохЬе рго£е!п апй ргосеск адад-пзе таХагха. ИаЬиге 341:323-326

ЗСоиЬе ЛА ек аХ. (1997) А ргеХхтхпагу еуаХиаЫоп о£ а гесотЬхпапЬ схгситзрсгогохСе ргокехп иассхпс адахпвС РХаятойхит £аХсхрагига та1агха. N Епд Л Мей 336:86-91

ЗЬоиСе ЛА еЬ а1. (1998) Ьопд-Ьегт е££хсасу апй хпипипе гезропзез £о11оихпд хгатип1гаЬ1оп тохЬЬ СЬе ЕТЗ.З та1ахха уассхпе. Л 1п£ес£ Οί.Ξ 173:1139-1144

Зип РЕ е£ аХ. (2003) РготесЫуе хттипхЬу хпйисей а!Ы1 та1агха уассхпе, ΚΤ3,3, хз Ххпкей Со РХавтосЦит £а1с1рагиш схгсиглврогозохСе ргоЪе1п-вресх£1с СЬ4(+) апй СВ8(+) т сеХХв ргойисхпд ιίΉ-даптаа. Л 1тшипо1 171:6961-6967

УаХепгиеХа Р еС аХ. (1979) МисХеоСхйе еедиепсе о£ ЬЬе депе сойхпд £ог СЬе гпадог ргоСехп о£ АераСхЬхв В -лхгиз зиг£асе апСХдеп. ЫаЬиге 280:815-819

УодеХэ К ек аХ. (2003) ЙерХхсаСхоп-йеСхсхепС китап айепоихгив Суре 35 ’/есЬогэ £ог депе Сгапв£ег апй уассхпаСхоп: е££хсхеп£ Ьитап се11 пЛегасЫоп апй

Ьуразя о£ рге-ехХэСйпд айепоуХгиз ХттипхСу. Л νίχοί 77:8253

Иапд Кеч а1. (2001) 1пйисСхоп о£ С04+ Т се1Х-йерепйепС СВ8+ Суре 1 гезропвев ίη Ъитапв Ьу а таХагха ЮНА уассХпе. Ргос ЫаС1 АсаЙ 3с1 иЗА 98:10817-10822 2еуегхпд У еС аХ. (1994) Е££есС о£ роХутпогрЫвгп о£ зрогогохСе апЫдепз оп Т-се11 асЧЬ/аЫоп. Нез ТттипоХ 145:469-476

- 25 016648

Список последовательностей <1Ю> СгисеН Но11ап<3 βν бЗахоЗтИзНкНпе В1о1од1са1в, Ξ.Α.

Иа1Ьег Кеей Агту ТпэМЬиСе о£ КеяеагсИ

Раи, Маг!а 6гааха боийвтхг, Даар СоЬеп, иое

ЦиЬо1з, РаЬг!се М.

ЗЬеиагЪ, V. Апп

Неррпег, Оопа1с1 с.

<120> Первичная/бустерная противомалярийные вакцины <130> 0116 ИО 00 ОКО <140> РСТ/ЕР 2005/055209 <141> 2005-10-13 <150> из 60/619,056 <151> 2004-10-14 <150> ЕР 04105035.2 <151> 2004-10-14 <160> 1 <170> РсЛепЫп νετείοη 3.3 <210> 1 <211> 1В9 <212> Белок с213> Р1авто<1!шп £а1с1рагип1 <400> 1

Аар 1

Рго Авп

А1а

Авп 5

Рго Азп А1а

Авп

РГО АЗП 10

А1а

Азп

Рго

Азп 15

А1а

Αδη

Рго

Азп

А1а

Азп

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Авп

А1а

Азп

Рго

Авп

А1а

20

25

30

Ав η

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Авп

А1а

Авп.

Рго

Авп

А1а

Азп

Рго

Авп

А1а

35

40

45

Авп

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Азп

А1а

Азп

Рго

АЗП

А1а

50

Б5

60

Ав η

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Авп

А1а

Авп

Рго

Азп

Ьуз

Азп

Θΐη

61у

65

70

75

80

Авп

С1у

С1п

С1у

ΗΪ5

Авп

МеЬ

Рго

Авп

АЭр

Рго

Азп

Агд

Азп

ν&ι

Азр

85

90

95

(31И

Авп

А1а

Авп

А1а

Авп

Зег

А1а

Уа1

Ьуз

Азп

αΐυ.

С1и

100

105

110

Рго Зег

Азр 115

Ъуз

н!э

11е Ьуз

61и Туг Ьей Азп Ьуз 120

Не <Э1п 125

Азп Зег

Ьей

Зег

ТНг

61и

Тгр

Зег

Рго

Суз

Зег

Уа1

ТНг

Суз

61у

Азп

<Э1у

Не

130

135

140

<Э1п

ν»1

Агд

Не

ьуз

Рго

61у

Зег

А1а

Азп

Ьуз

Рго

Ьуз

Азр

61и

Ьей

145

150

155

160

Азр

Туг

А1а

Азп

Азр

Не

61и

Ьуз

Не

Суз

ьуз

Мег

61и

Ьуз

Суз

165

170

175

Зег

Уа1

РЬе

Азп

Уа1

Азп

Зег

Не

<31у

Ьей

180

185

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение дефектного по репликации рекомбинантного аденовируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии, и смешанного с адъювантом белкового антигена, содержащего белок С8 или его иммуногенный фрагмент, для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики малярии, где указанный рекомбинантный аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 или 50 и при этом используется для первичной вакцинации, а указанный смешанный с адъювантом белковый антиген используется для бустерной вакцинации, где указанный белковый антиген содержит гибридный белок, состоящий из белка С8 или его иммуногенного фрагмента, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита В (НВкАд) в виде липопротеиновых частиц с НВкАд.
2. Применение по п.1, где указанный смешанный с адъювантом белковый антиген содержит КТ8,8.
3. Способ вакцинации млекопитающего против малярийной инфекции, в котором предусмотрены этапы проведения первичной вакцинации указанного млекопитающего дефектным по репликации рекомбинантным аденовирусом, выбранным из группы, состоящей из аденовируса человека серотипа 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49 или 50 в фармацевтически приемлемом наполнителе, где указанный аденовирус содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген С8 возбудителя малярии; и проведения бустерной вакцинации указанного млекопитающего смешанным с адъювантом белковым антигеном, содержащим гибридный белок, состоящий из белка С8 или его иммуногенного фрагмента, слитого с поверхностным антигеном вируса гепатита В (НВкАд) в виде липопротеиновых частиц с НВкАд.
4. Способ по п.3, где указанный белковый антиген содержит КТ8,8.
5. Способ по любому из пп.3, 4, где указанный белковый антиген смешан с адъювантом 0821 и 3ΌМРЬ.
6. Способ по любому из пп.3-5, где указанный возбудитель малярии представляет собой Р1а8тобшт Га1с1рагит.
7. Способ по любому из пп.3-6, где указанная гетерологичная нуклеиновая кислота кодоноптимизирована для усиленной продукции кодируемого белка у млекопитающего, предпочтительно у человека.